ITTO20110901A1

ITTO20110901A1 - Composizione sinergica per la prevenzione ed il trattamento di disturbi connessi all'invecchiamento

Info

Publication number: ITTO20110901A1
Application number: IT000901A
Authority: IT
Inventors: Giulia Federica Merizzi
Original assignee: Medestea Biotech S P A
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2011-10-10
Publication date: 2013-04-11
Also published as: WO2013054267A1

Description

"Composizione sinergica per la prevenzione ed il trattamento di disturbi connessi all'invecchiamento"

DESCRIZIONE

Campo dell'invenzione

L'invenzione concerne una composizione da impiegarsi nel campo della prevenzione e del trattamento dei problemi/disturbi connessi all' invecchiamento generale dell'organismo e alle patologie croniche ad esso collegate, quali i disordini neurodegenerativi del sistema nervoso centrale e periferico, le patologie cardiovascolari, l'invecchiamento cutaneo e i disturbi metabolici. In particolare l'invenzione concerne una miscela di composti capaci di attivare in maniera specifica dei fattori di trascrizione collegati all'espressione di una famiglia di geni e proteine ad attivitÃ antiinfiammatoria e antiossidante, in grado di aumentare le capacitÃ di difesa e rigenerazione delle cellule, di specifici tessuti e dell'intero organismo.

Sommario dell'invenzione

L'oggetto dell'invenzione Ã ̈ una formulazione somministrabile per via orale, esente da particolari controindicazioni, sia in relazione ai soggetti cui puÃ² essere somministrata, sia in relazione alle quantitÃ somministrate, avente un effetto di prevenzione, nell'assunzione sistematica a lungo termine, nel ritardare e prevenire parzialmente la degenerazione cellulare dovuta all'invecchiamento.

La formulazione oggetto dell'invenzione ed il suo impiego sono definiti nelle rivendicazioni annesse.

Tale formulazione si caratterizza per il fatto che comprende, in qualitÃ di agenti attivi, curcumina o una miscela di curcuminoidi, in associazione con astaxantina.

La curcumina (1,7-bis[-idrossi-3-metossifenil]-1,6-eptadiene-3,5-dione) Ã ̈ un composto appartenente alla classe dei composti polifenolici. E' una spezia gialla, estratta dal rizoma di Curcuma longa (Zinziberacee), un'erba perenne, ampiamente coltivata in Asia. E' comunemente utilizzata come agente aromatizzante e colorante negli alimenti.

Sono ben note le sue proprietÃ antinfiammatorie e di prevenzione dei tumori e piÃ¹ recentemente ne Ã ̈ stato proposto l'impiego come agente neuroprotettivo (cfr. WO2004/075883).

Con il termine di curcuminoidi, si intende comprendere la curcumina, sia essa naturale o di sintesi, sia suoi derivati, quali in particolare demetossicurcumina e bisdemetossicurcumina, naturalmente presenti negli estratti di Curcuma longa.

Nelle formulazioni secondo l'invenzione, l'estratto di Curcuma longa costituisce la fonte preferita di curcumina o curcuminoidi.

L'astaxantina Ã ̈ un pigmento rosso-arancione naturalmente presente in animali acquatici. Chimicamente Ã ̈ una xantofillina, appartenente alla famiglia dei carotenoidi, di formula 3,3'-diidrossi-[Î²],[Î²]'-carotene-4,4'-dione.

Grazie alle sue caratteristiche strutturali, l'astaxantina presenta un'elevata attivitÃ antiossidante.

Nelle formulazioni secondo l'invenzione, l'astaxantina puÃ² essere utilizzata sia in forma di composto puro, o preferibilmente in forma di estratto ottenuto ad esempio dall'alga Haematococcus pluvialis.

L'estratto di Curcuma longa e l'astaxantina, hanno dimostrato inaspettatamente la capacitÃ di attivare in un modo sinergico e specifico il sistema del fattore di trascrizione Nrf2 ed i geni ad esso correlati, incrementando le difese cellulari.

Inoltre, Ã ̈ stata dimostrata la loro capacitÃ di attivare la biogenesi mitocondriale in diverse cellule e tessuti. Grazie a tale azione, la formulazione oggetto dell'invenzione Ã ̈ efficace nel promuovere la vitalitÃ e le funzioni di cellule e tessuti dell'organismo ed Ã ̈ particolarmente efficace nella protezione di cellule endoteliali, cutanee e del sistema nervoso dal deterioramento e dalla morte correlata a processi degenerativi ed all'invecchiamento in generale.

Stato della tecnica

Secondo la piÃ¹ recente teoria moderna che mira a spiegare il fenomeno biologico dell'invecchiamento, una serie di meccanismi parzialmente endogeni (che si sviluppano all'interno dell'organismo) e parzialmente esogeni (ambientali) causano alterazioni cellulari nel corso della vita (ad esempio nella membrana delle cellule, in enzimi, in proteine, nel DNA e RNA).

Queste alterazioni porterebbero rapidamente all'invecchiamento ed alla morte se il nostro organismo non possedesse rilevanti meccanismi di difesa, la cui efficienza Ã ̈ geneticamente controllata.

Quantunque vi siano diversi meccanismi che portano allo stress ossidativo ed all'infiammazione, numerosi studi suggeriscono un ruolo importante per i meccanismi di segnale mediati dal fattore di trascrizione nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) nell'attivazione della protezione cellulare. Nrf2 Ã ̈ un membro della famiglia Cap'n'Collar dei fattori di trascrizione, Ã ̈ sequestrato nel citoplasma mediante legame alla proteina Kelch ECH-associata proteina 1 (Keap1) in condizioni non stimolate. Keap1 gioca un ruolo centrale nella regolazione della risposta di Nrf2.

In condizioni normali, Nrf2 Ã ̈ bersaglio da parte di Keap1, che promuove la degradazione proteasomica di Nrf2 tramite interazioni con ubiquitina ligasi. Keap1 inoltre funziona come sensore di segnali di stress, mediante ossidazione stress-indotta di residui chiave di cisteina che conducono a variazioni di conformazione ed all'incapacitÃ di legare Nrf2. Diversi stimoli, includenti stress ossidativo e composti elettrofili, quali polifenoli, conducono alla distruzione del complesso Nrf2/Keap1, liberando Nrf2 per traslocazione al nucleo, ove interagisce con fattori di trascrizioni zipper di leucina, quali i membri della famiglia Maf e Jun e si lega ad un elemento cis-agente, elemento di risposta antiossidante (ARE, anche denominato EpRE o OSRE).

Nrf2-ARE Ã ̈ una via primaria che regola le risposte antiossidanti di fase 2, innescando la simultanea espressione di numerosi enzimi protettivi e scavenger. ARE si trova in diversi geni citoprotettivi inducibili, correlati alla cosiddetta risposta di stress cellulare, quali glutatione-S-transferasi, eme ossigenasi 1 (HO-1), glutammato cisteina ligasi, ferritina, Î³-glutamil cisteina sintetasi, NAD(P)H chinone ossidoriduttasi tioredossina e periredossine, e ciÃ² enfatizza Nrf2 con il nodo centrale nella risposta di sopravvivenza cellulare.

Mediante l'attivazione costante di questo complesso macchinario genetico, Ã ̈ cosÃ¬ possibile riparare gradualmente tutti i danni quando essi hanno origine. Sulla base di tali evidenze, la modulazione di Nrf2 e HO-1 in contesto differente, incluso il cervello, la pelle ed i vasi, Ã ̈ stato recentemente suggerito come potenziale strategia farmaceutica per il trattamento e la prevenzione di disordini degenerativi ed invecchiamento patologico.

Molti studi epidemiologici negli anni passati hanno indicato una diretta correlazione tra il tipo di dieta e l'incidenza e la gravitÃ di malattie croniche correlate all'invecchiamento, dando cosÃ¬ origine all'idea che, stimolando l'attivitÃ di geni e proteine, composti chimici contenuti negli alimenti possano influenzare l'equilibrio tra la condizione sana e la condizione malata in un individuo e cosÃ¬ influenzare la qualitÃ dell'invecchiamento, la condizione di benessere e l'inizio di patologie degenerative.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Oggetto dell'invenzione Ã ̈ perciÃ² una formulazione che comprende una combinazione di curcumina o curcuminoidi, eventualmente in forma di estratto di Curcuma longa, ed asta xantina o un estratto che la contiene.

E' stato scoperto che la formulazione oggetto dell'invenzione, quando utilizzata in modo sistematico, dÃ origine ad un effetto preventivo protettivo sui processi degenerativi indotti dall'invecchiamento.

Inoltre, tale effetto protettivo Ã ̈ piÃ¹ efficace se la somministrazione inizia prima dell'inizio del processo di invecchiamento. Pertanto, l'impiego della formulazione dell'invenzione Ã ̈ raccomandata ad individui di qualsiasi etÃ , non soltanto nell'individuo senile.

L'estratto di Curcuma longa e l'astaxantina sono indubbiamente tra i composti naturali bioattivi piÃ¹ interessanti per i quali recentemente sono state proposte proprietÃ antinvecchiamento, con dati in vivo ed in vitro riportati in diverse pubblicazioni scientifiche.

L'invenzione si fonda sull'individuazione da parte della richiedente di un effetto sinergico tra i due composti attivi in relazione a specifici parametri biologici misurabili, sia a livello cellulare, sia a livello dell'organismo.

Prima di riportare i risultati conseguiti, Ã ̈ necessario definire ciÃ² che si intende nella presente descrizione per "sinergismo farmacologico" e per "parametri cellulari direttamente rilevanti in relazione all'invecchiamento cellulare".

A riguardo, si adotta la definizione scientificamente piÃ¹ rigorosa di sinergismo biologico che deriva dallo studio dell'azione dei farmaci. Il sinergismo farmacologico si verifica quando due farmaci interagiscono in modo da incrementare o ampliare uno o piÃ¹ effetti, o loro effetti collaterali. In altre parole, due farmaci che producono in modo manifesto due effetti similari, in qualche caso producono effetti esagerati o ridotti quando utilizzati in uso concomitante ed una valutazione quantitativa Ã ̈ necessaria per distinguere questi casi dalla semplice azione additiva (Tallarida RJ. Drug synergism: its detection and applications, J. Pharmacol. Exp. Ther. settembre 2001; 298(3):865-72).

Gli effetti biologici sui quali ci focalizziamo sono la modulazione positiva dei sistemi difensivi e riparativi cellulari, con un effetto rilevante sulla sopravvivenza delle cellule e sulla longevitÃ , sia in termini di singola cellula sia di popolazioni cellulari.

Prima di tutto, Ã ̈ necessario considerare che la definizione farmacologica di sinergismo, quando tradotta in termini di eventi molecolari, spesso si riferisce alla capacitÃ di due sostanze bioattive, che generano il sinergismo, di incrementare le funzioni cellulari, elicitando vie che sono originariamente distinte, ma che convergono a piÃ¹ alti livelli nelle attivitÃ cellulari elementari che concorrono allo stesso primario programma cellulare.

In altre parole, se vi sono due modi per una cellula per evitare la morte, controllati da due vie non correlate o minimamente correlati A e B, l'incremento di soltanto A o soltanto B da parte di due composti probabilmente produrrÃ saturazione della via alle dosi piÃ¹ elevate e pertanto un effetto combinato che Ã ̈ inferiore a quello additivo.

La completa stimolazione di A e B, invece, potrebbe produrre l'additivitÃ e persino il sinergismo (a) in quanto tutte le attivitÃ che portano a quella risposta sono impegnate, (b) in quanto le interazioni che si verificano quando le due vie convergono, possono diventare mutuamente potenzianti o, infine, (c) poichÃ© l'attivazione sincrona di entrambi permette alla cellula di muoversi verso fasi discrete, ma sequenziali di attivitÃ .

Il modello utilizzato dalla richiedente ha permesso di determinare che la curcumina, o lâ€™estratto di Curcuma longa, e lâ€™astaxantina esplicano un'azione sinergica nel prevenire il danno indotto da ROS (Reactive Oxygen Species) e piÃ¹ in generale il danno correlato alla morte cellulare, in quanto ciascuno di essi attiva una via di risposta cellulare al danno.

PiÃ¹ specificatamente, tali agenti attivi presentano una capacitÃ specifica di attivare in modo sinergico il fattore di trascrizione nucleare Nrf2. Nrf2 interagisce con la sequenza di ARE a livello di promotore di diversi geni inducibili, dotati di proprietÃ critiche di difesa e di riparazione, risultando in una sovraespressione cellulare di tali geni, in un incremento delle difese cellulari ed in un'inibizione della morte cellulare.

E' stato dimostrato che molti polifenoli elettrofili attivano la via Nrf2-ARE, incluso l'estratto di Curcuma longa (Scapagnini et al., Mol. Neuribiol. 2011). I carotenoidi, quali l'astaxantina, a causa dei loro estesi sistemi di coniugazione, sono scavenger molto efficienti dell'ossigeno singoletto e, sotto bassa tensione di ossigeno, di radicali perossile.

Studi di intervento nell'uomo con diete ricche di carotenoidi hanno dimostrato la fotoprotezione della pelle, misurata mediante decrementata sensibilitÃ ad eritema indotto da radiazione UV. E' stata dimostrata precedentemente la capacitÃ di alcuni carotenoidi di indurre enzimi citoprotettivi di fase 2. La richiedente ha dimostrato per la prima volta la capacitÃ di astaxantina di migliorare fortemente la capacitÃ della curcumina o del relativo estratto e di attivare la via Nrf2 e, conseguentemente, di causare l'espressione di geni difensivi e riparativi, quali HO-1. Senza voler dimostrare uno specifico meccanismo molecolare per spiegare tale effetto, il fenomeno potrebbe essere dovuto al fatto che i carotenoidi dietetici ed i loro metaboliti condividono con tutte le altre classi di induttori di fase 2, quali i polifenoli elettrofili, una comune proprietÃ chimica, la capacitÃ di reagire con gruppi sulfidrile che sono i sensori specifici dell'attivazione di Nrf2.

Inoltre, la richiedente ha determinato mediante modello sperimentale la capacitÃ dei due composti di attivare la biogenesi mitocondriale, un meccanismo direttamente correlato alla longevitÃ cellulare ed all'efficienza metabolica dell'organismo. La biogenesi mitocondriale Ã ̈ un processo cellulare elaborato che si fonda sullo stretto legame di diversi controlli regolatori, dalla trascrizione nucleare di geni alla produzione sito specifica di proteine. Le vie che regolano la biogenesi mitocondriale sono state recentemente considerate come bersagli terapeutici potenziali per il miglioramento di disfunzioni endoteliali e malattie vascolari osservate in malattie metaboliche.

L'azione protettiva ed antinvecchiamento dell'estratto di Curcuma longa, di astaxantina e della miscela dei due ingredienti attivi, da cui risulta l'effetto sinergico, Ã ̈ stata effettuata mediante la sperimentazione che segue.

Attivazione dell'espressione di Nrf2 in cellule diverse

Tre diverse colture di linee cellulari, neuroni corticali, fibroblasti della pelle e cellule endoteliali sono stati esposti all'estratto di Curcuma longa, ad astaxantina o ad una combinazione dei due composti ad una concentrazione finale di 25 µM, per valutare l'espressione della proteina Nrf2 nel tempo.

Come illustrato nella fig. 1, il trattamento con l'estratto di Curcuma longa ha causato un significativo incremento tempo dipendente nell'espressione di Nrf2 negli estratti nucleari. La quantificazione di tre indipendenti western blot ha mostrato che, dopo un'ora di esposizione a 25 µM di estratto di Curcuma longa, l'espressione di Nrf2 Ã ̈ incrementata in modo significativo ed Ã ̈ rimasta sovraregolata fino a 12 ore, mentre il livello del fattore di trascrizione housekeeping Sp1 era stabile. L'astaxantina ha indotto un incremento inferio re di Nrf2 nucleare. La combinazione dei due composti ha indotto in modo massivo l'espressione di Nrf2.

Sovraregolazione di HO-1 e di enzimi di detossificazione di fase II in diverse cellule L'esposizione di tre diverse colture di linee cellulari, neuroni corticali, fibroblasti della pelle e cellule endoteliali per 6 ore a diverse concentrazioni di estratto di Curcuma longa, astaxantina o ad una combinazione dei due composti (5, 15, 25 e 50 µM) Ã ̈ risultata in un significativo incremento (p < 0,05) di HO-1 mRNA, misurato mediante PCR real time quantitativa, con un valore massimo a 25 µM (figg. 2a, b).

L'estratto di Curcuma longa provoca un incremento dose-dipendente di HO-1 mRNA, misurato rispetto al gene paralogo HO-2 non inducibile, per raggiungere il massimo (circa sei volte) a 25 µM, e decresce successivamente a 50 µM. L'astaxantina Ã ̈ indubbiamente molto meno attiva nell'induzione dell'espressione del gene HO-1 alle stesse concentrazioni e raggiunge il massimo di nuovo a 25 µM.

Per confermare che l'espressione del gene HO-1 misurata a livello di mRNA corrispondeva ad un incremento equivalente di attivitÃ di eme ossigenasi, si Ã ̈ misurata quest'attivitÃ alle stesse dosi di estratto di Curcuma longa e di astaxantina dopo 6 e 24 ore dalla somministrazione. L'andamento dell'incremento di attivitÃ era confrontabile ai risultati ottenuti esaminando gli mRNA cellulari, confermando la significativitÃ funzionale dei dati ottenuti mediante le determinazioni con PCR real time (figg.

2c, d, e).

Effetti neuro protettivi dell'invenzione

Il campo selezionato di sperimentazione per testare la capacitÃ dei composti di migliorare la sopravvivenza delle cellule Ã ̈ stato un modello di morte cellulare indotta in neuroni corticali del ratto esposti a stress ossidativo.

I neuroni sono altamente sensibili a stimolo pro-ossidante e gli effetti biologici focalizzati in questo esperimento sono stati la capacitÃ dei composti di promuovere una modulazione positiva di sopravvivenza neuronale e modulazione positiva di riparazione neuronale e plasticitÃ , sia in termini di singoli neuroni, sia di popolazione neuronale.

La richiedente ha pertanto deciso di utilizzare la combinazione dei due composti, estratto di Curcuma longa ed astaxantina, entrambi a 25 µM, prima di esporre le cellule per 2 ore a glucosio ossidasi (50 mU/ml). Il sistema ossidante di glucosio ossidasi genera perossido di idrogeno a portata costante ed Ã ̈ noto produrre un'adesione cellulare in vitro.

Dopo trattamento con glucosio ossidasi, le cellule sono state lavate ed esposte al terreno completo contenente 1% di Alamar blu per 5 ore, secondo le istruzioni del produttore, allo scopo di determinare la vitalitÃ cellulare.

Dopo il periodo di incubazione, la densitÃ ottica nel terreno di ciascun pozzetto era misurata utilizzando un lettore di piastra. Il saggio Ã ̈ basato sulla rivelazione dell'attivitÃ metabolica di cellule viventi, utilizzando un indicatore redox che modifica la sua forma da ossidato (blu) a ridotto (rosso). L'intensitÃ del colore rosso Ã ̈ proporzionale alla vitalitÃ delle cellule.

Il trattamento di cellule per 2 ore con glucosio ossidasi Ã ̈ risultato nel 27% di vitalitÃ cellulare residuale (fig. 3a). L'esposizione di cellule per 12 ore all'estratto di Curcuma longa 25 µM ha ridotto il danno mediato da glucosio ossidasi, incrementando la vitalitÃ cellulare del 55% (28% piÃ¹ del controllo).

L'astaxantina alla concentrazione di 25 µM era meno efficace nella protezione delle cellule dal danno ossidativo, dando una vitalitÃ del 43% (15% superiore al controllo). L'associazione dei due composti ha conferito alle cellule una protezione in modo sinergico, dando un grado di sopravvivenza neuronale del 91% (64% superiore al controllo, che Ã ̈ superiore all'effetto additivo atteso del 43%).

Per cercare di stimare il contributo dell'attivazione di Nrf2 agli effetti sinergici globali, il primo esperimento Ã ̈ stato ripetuto, rappresentando prova del principio dell'effetto, addizionando anche protoporforina IX di stagno (SnPP), un composto noto per inibire potentemente in modo specifico l'attivitÃ di HO-1.

Come dimostrato nella fig. 3b, l'inibizione dell'attivitÃ di HO-1 causata da SnPP ha ridotto gli effetti neuroprotettivi della combinazione dei due composti del 35%, portandoli a circa il livello ottenuto con l'estratto di Curcuma longa da solo. Un'interpretazione di quest'ultimo risultato Ã ̈ che il meccanismo innescato principalmente da astaxantina sia "capacitativo", permissivo, per la via elicitata dall'estratto di Curcuma longa nel proteggere i neuroni primari dal danno e morte indotti da glucosio ossidasi.

Induzione di biogenesi mitocondriale

Le cellule sono state trattate con estratto di Curcuma longa (25 µmoli/l per 48 ore), astaxantina (25 µmoli/l per 48) o con estratto di Curcuma longa ed astaxantina. La massa mitocondriale nelle cellule endoteliali Ã ̈ stata determinata caricando selettivamente i mitocondri con il colorante fluorescente rosso Mitotracker red (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Il colorante fluorescente calceina (verde) e Hoechst 33258 (blu) sono stati utilizzati per colorare il citoplasma ed il nucleo, rispettivamente. Sezioni ottiche di HUVAs sono state catturate con ingrandimento al 60% ed il rapporto delle densitÃ di area mitocondriale rispetto al volume citoplasmatico Ã ̈ stato calcolato utilizzando il software di visualizzazione Zeiss Axiovision.

Nell'analisi sono state incluse solo cellule con colorazione di calceina citoplasmica intatta. Il DNA totale Ã ̈ stato isolato dalle cellule endoteliali (DirectPCR; Viagen Biotech). Il copy number del DNA mitocondriale (mtDNA) Ã ̈ stato determinato mediante QRT-PCR come giÃ descritto, utilizzando citocromo ossidasi III e Î²-actina come marcatori per i copy number di mtDNA e di DNA genomico, ri spettivamente.

E' stato determinato l'impatto del trattamento con estratto di Curcuma longa, astaxantina o di estratto di Curcuma longa ed astaxantina.

La colorazione con Mitotracker ha mostrato che i mitocondri sono localizzati nella regione perinucleare in cellule endoteliali (fig. 4). Il rapporto di densitÃ di area mitocondriale a volume citoplasmico nelle cellule endoteliali marcate con Mitotracker era significativamente incrementato dal trattamento con estratto di Curcuma longa (fig. 4).

L'analisi delle intensitÃ di fluorescenza di Mitotracker in EC ha confermato che il trattamento con estratto di Curcuma longa incrementa la massa mitocondriale in modo significativo nelle cellule trattate a confronto con le cellule non trattate.

L'astaxantina non era efficace in termini di attivazione della massa mitocondriale, ma l'estratto di Curcuma longa in combinazione con astaxantina era significativamente piÃ¹ efficace a confronto con l'estratto di Curcuma longa da solo (fig. 4). La formulazione dell'invenzione era anche in grado di migliorare fortemente i livelli di mtDNA, come illustrato nella fig. 4.

La biogenesi mitocondriale implica l'integrazione di cammini trascrizionali multipli che controllano l'espressione genica nucleare mitocondriale. Il coattivatore PPAR- PGC-1 Î±, Nrf1 e Tfam sono considerati regolatori chiave della biogenesi mitocondriale in tessuti multipli.

La richiedente ha utilizzato una tecnica QRT-PCR per determinare l'effetto dell'estratto di Curcuma longa, astaxantina ed estratto di Curcuma longa in combinazione con astaxantina (25 µmoli/l per 24 ore) sull'espressione di mRNA dei fattori di biogenesi mitocondriale fattore-1 respiratorio nucleare (Nrf1), fattore A di trasmissione mitocondriale (Tfam) e perossizoma proliferatore-recettore attivato (PPAR)-Î± coattivatore-1 (PGC-1 Î±) in cellule endoteliali utilizzando Strategen MX3000 come riportato.

RNA totale Ã ̈ stato isolato con una mini RNA I-solation Kit (Zymo Rsearch, Orange, CA) ed Ã ̈ stato trascritto inversamente utilizzando Superscript III RT (Invitrogen) come precedentemente descritto. L'efficienza della reazione di PCR Ã ̈ stata determinata utilizzando serie di diluizione di un campione standard. La quantificazione Ã ̈ stata effettuata utilizzando un metodo CT regolato in efficienza. Il gene housekeeping HPRT Ã ̈ stato utilizzato per normalizzazione interna.

La fedeltÃ della reazione PCR Ã ̈ stata determinata mediante analisi della temperatura di fusione e visualizzazione del prodotto in gel di agarosio a 2%. Le misurazioni QRT-PCR hanno rivelato che l'espressione dei fattori di biogenesi mitocondriale PGC-1 Î±, Nrf1 e Tfam nelle cellule endoteliali (fig. 5) era significativamente incrementata nel trattamento con la formulazione oggetto dell'invenzione.

La formulazione della presente invenzione puÃ² inoltre contenere altri ingredienti, come negli esempi che seguono. Sulla base degli studi preliminari che hanno dimostrato l'effetto sinergico tra l'estratto di Curcuma longa e l'astaxantina, la richiedente ha condotto un'ampia ricerca su cellule endoteliali e neuronali di ratto coltivate, esponendole a diverse concentrazioni (10, 25, 50 µM/ml) della formulazione sopra citata secondo l'invenzione, per 6, 12 e 24 ore.

Lo studio ha dimostrato la capacitÃ della formulazione oggetto dell'invenzione di indurre fortemente l'espressione di eme ossigenasi-1 (HO-1), una proteina altamente protettiva nella difesa da stress ossidativo (Poon HF, Calabrese V, Scapagnini G, Butterfield DA (2004) J. Gerontol., A Biol. Sci.. Med. Sci. 59(5): 478-493), in cellule trattate e perciÃ² nel proteggere le cellule dal danno causato dall'esposizione a radicali liberi.

Eme ossigenasi Ã ̈ il principale enzima per il catabolismo di eme che Ã ̈ degradato da biliverdinabilirubina, monossido di carbonio (CO) e ferro. Questi prodotti sono molecole aventi un'attivitÃ biologica particolarmente significativa: biliverdina e bilirubina hanno potenti attivitÃ antiossidanti (Scapagnini G et al. (2002) Brain Res. 654(1): 51-59); CO attua funzioni di segnale fondamentali e si comporta come modulatore gassoso nella funzione dei vasi (Abraham NG, Scapagnini G, Kapas A (2003) J Cell. Biochem. 90(6): 1098-111 1); il ferro Ã ̈ un noto regolatore dei geni (Smith MA et al. (1998) Brain Res. 788, 232-236).

Oltre a generare molecole attive contro lo stresso ossidativo, HO-1 decrementa i livelli di eme che Ã ̈ intrinsecamente un potente induttore di perossidazione lipidica e formazione di radicali liberi. La sua attivazione pare rappresentare un importante meccanismo di difesa per neuroni esposti a danno ossidativo in situazioni acute, quali infarto, o condizioni croniche, quali invecchiamento cerebrale, o durante malattie neurodegenerative, quali il morbo di Alzheimer.

Indubbiamente, sia il danno ossidativo, sia i processi infiammatori sono particolarmente elevati nel cervello di pazienti affetti da morbo di Alzheimer, suggerendo un potenziale beneficio per una terapia a lungo termine con un composto fornito indubbiamente di una potente azione antiossidante ed antinfiammatoria. Lo studio ha anche mostrato che l'induzione di HO-1 mediante la formulazione dell'invenzione Ã ̈ correlata alla capacitÃ di attivare Nrf2. Questo fattore di trascrizione Ã ̈ in grado di indurre fortemente l'espressione di altri geni protettivi, quali enzimi detossificanti di tipo 2, aventi un'elevata attivitÃ antiossidante ed antitumorale.

Inoltre, nelle stesse condizioni sperimentali, la formulazione secondo l'invenzione Ã ̈ capace di attivare considerevolmente la biogenesi mitocondriale. I dati sperimentali supportano il fatto che la formulazione incrementa il contenuto mitocondriale in cellule endoteliali (fig. 4a).

L'incrementata biogenesi mitocondriale in cellule trattate con la formulazione Ã ̈ anche indicata dall'incrementato contenuto di mtDNA cellulare (fig. 4b). I meccanismi multipli possono spiegare la biogenesi mitocondriale indotta dalla formulazione ed il suo contributo alla salute cellulare.

Per determinare se il numero incrementato di mitocondri nelle cellule endoteliali trattate con la formulazione Ã ̈ conseguenza dell'induzione di fattori di biogenesi mitocondriale, si Ã ̈ utilizzato QRT-PCR per esaminare l'espressione di Nrf1, Tfam e PGC-1 Î±. Nrf1 attiva la trascrizione di numerosi componenti codificati dal nucleo della catena di trasporto elettronico e regola anche Tfam che Ã ̈ responsabile per la trascrizione di geni mtDNA codificati.

La funzione regolatoria di Nrf1 e di altri fattori di biogenesi mitocondriale Ã ̈ modulata da PGC-1 Î±. Si Ã ̈ dimostrato che la formulazione oggetto dell'invenzione induceva Nrf1, Tfam e PGC-1 Î± (fig.

5).

E' stato dimostrato che l'espressione alterata di questi fattori modula l'attivitÃ di biogenesi mitocondriale e migliora la longevitÃ cellulare.

Le composizioni della presente invenzione sono preparate in forme di dosaggio idonee alla somministrazione concomitante di vari componenti entro i seguenti dosaggi espressi come mg/die:

a) estratto di Curcuma longa da 10 a 12000

b) astaxantina da 0,25 a 25.

Secondo un aspetto preferito, le forme di dosaggio della presente invenzione comprenderanno i vari componenti entro i seguenti dosaggi espressi come mg/die:

a) estratto di Curcuma longa: da 60 a 1100;

b) astaxantina: da 0,5 a 4.

Le forme di dosaggio possono comprendere quantitÃ dei suddetti componenti a) e b) che sono sottomultipli da 2 a 5 delle quantitÃ sopracitate.

Estratti commerciali di Curcuma longa possono presentare un contenuto curcuminoidi fino al 95% in peso, per cui le quantitÃ ed i dosaggi sopra riportati riferiti allâ€™estratto valgono parimenti in relazione a quantitÃ e dosaggi di curcuminoidi fino al 95% del dato riportato.

Una formulazione adatta, particolarmente come integratore alimentare, contiene vantaggiosamente i seguenti ingredienti nelle seguenti dosi unitarie: - estratto di Curcuma longa o contenuto di curcuminoidi da 50 a 600 mg,

- astaxantina da 0.5 a 4 mg.

Secondo un aspetto preferito dell'invenzione l'estratto di Curcuma longa Ã ̈ presente in forma di complesso con un fosfolipide di soia, come lecitine, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilserina e simili, in particolare distearoilfosfatidilicolina di soia. Questi complessi, noti come fitosomi, sono descritti per esempio in EP 0 441 279 e disponibili commercialmente sotto la denominazione commerciale di Fitosoma®.

La porzione lipofila di tale complesso, il fosfolipide della soia, permette una migliore interazione dell'ingrediente attivo con gli acidi colici preposti all'emulsione e alla cattura delle sostanze da veicolare, per assorbimento, alla circolazione sistemica. Studi tossicologici eseguiti sull'animale e farmacocinetici sull'uomo hanno in effetti dimostrato la mancanza di tossicitÃ e il maggiore assorbimento dell'ingrediente somministrato come fitosoma rispetto all'ingrediente somministrato in forma libera.

Secondo un aspetto preferito della presente invenzione, le composizioni in oggetto potranno contenere componenti addizionali, ad azione curativa, o complementare, o comunque utile ai fini che l'invenzione si propone. Esempi di tali componenti addizionali sono estratti vegetali, vitamine, sostanze nutrienti, oligoelementi, e simili.

Tali componenti addizionali saranno presenti in quantitÃ corrispondenti alle loro dose giornaliera raccomandata (o a sottomultipli o multipli di questa). Esempi di tali componenti addizionali sono gli estratti di pepe nero, rosmarino, Vitis vinifera, Boswellia serrata, Melyssa officinalis, Ginkgo biloba; sostanze nutrienti come i nucleotidi da pesce o da lievito, resveratrolo, licopene; le vitamine del gruppo B, vitamina D, vitamina C, vitamina K e vitamina E; oli essenziali come il D-limonene e oligoelementi come il Mg, il Mn, il K nelle varie salificazioni con sali inorganici, organici e nelle forme aminochelate.

Le composizioni dell'invenzione potranno essere formulate in una qualunque forma adatta alla somministrazione orale, ad esempio come capsule di gelatina dura o molle, compresse, compresse effervescenti o masticabili, granulari o polveri in bustina, forme solide a rilascio controllato, gomme da masticare e simili.

Le composizioni della presente invenzione potranno essere formulate in modo adatto alla somministrazione per via orale e saranno preparate secondo metodi convenzionali ben noti in tecnica farmaceutica, come quelli descritti in "Remington's Pharmaceutical Handbook", Mack Publishing Co., N.Y., USA, utilizzando eccipienti, diluenti, agenti di carica, antiagglomeranti accettabili per il loro uso finale.

ESEMPI FORMULATIVI (dose/unitÃ o trattamento)

Esempio 1 - COMPRESSE 1

Estratto di Curcuma longa complessata con fosfolipidi 350 mg

Astaxantina 2 mg

Microcel ® 40 mg

Magnesio stearato 5 mg

Aerosil ® 10 mg

Esempio 2 - COMPRESSE FILMATE

Estratto di Curcuma longa complessata con fosfolipidi 350 mg

Astaxantina 2 mg

Microcel ® 340 mg

Dicaphos ® 333 mg

Magnesio stearato 10 mg

Aerosil ® 8 mg

Explocel ® 18 mg

Sepifilm ® 22,8 mg

Gomma lacca 7 mg

Colorante 0,2 mg

Esempio 3 - COMPRESSE FILMATE

Estratto di Curcuma longa complessata con fosfolipidi 450 mg

Astaxantina 1 mg

Estratto di Melissa officinalis 60 mg

Estratto di Boswellia serrata 100 mg

Estratto di ratania 5 mg

Vitamina D3

Microcel® 340 mg

Dicaphos® 333 mg

Magnesio stearato 10 mg

Aerosil ® 8 mg

Explocel® 18 mg

Sepifilm® 22,8 mg

Gomma lacca 7 mg

Colorante 0,2 mg

Esempio 5 - BUSTINE

Estratto di Curcuma longa complessata con fosfolipidi 200 mg

Astaxantina 4 mg

Limonene microincapsulato per coacervazione 75 mg Estratto di rosmarino 10 mg

Fruttosio 1873 mg

Aerosil® 15 mg

Aroma arancia 180 mg

Acido citrico 220 mg

Acesulfame K 25 mg

E102 2 mg

Esempio 6 - FORMULATO ORO-DISPERSIBILE

Estratto di Curcuma longa complessata con fosfolipidi 50 mg

Astaxantina 1 mg

Vitamina E

Limonene o.e. 5 mg

Sorbitolo 160 mg

Aroma arancia 20 mg

Aroma mandarino 5 mg

Acesulfame K 2 mg

Aerosil® 5 mg

Fruttosio 1530 mg

Esempio 7 - CAPSULE GELATINA MOLLE

Estratto di Curcuma longa complessata con fosfolipidi 350 mg

Astaxantina 0,5 mg

Licopene 0.3 mg

Piperina 2,5 mg

Estratto di rosmarino 10 mg

Resveratrolo 5,50 mg

Nucleotidi 3,50 mg

Limonene o.e. 130 mg

Vitamina E 6 mg Vitamina D3 2,50 mg Olio alimentare q.b.

LEGENDA

Fig. 2 Heme oxygenase activity (pmol bilirubin/mg proteins

AttivitÃ di eme ossigenasi (pmoli bilirubina/mg proteine)

Control

Controllo

Hours

Ore

Fig. 4 Mitotracker

Mitotracker

Fluorescence intensity

IntensitÃ di fluorescenza

Relative mtDNA content

Contenuto relativo di mtDNA

Fig. 5 mRNA expression

Espressione di mRNA

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica o di integratore alimentare, comprendente, come principi attivi con effetto combinato o sinergico, curcumina ed astaxantina, per l'impiego nella prevenzione e trattamento di disturbi connessi all'invecchiamento dell'organismo.
2. Composizione secondo la rivendicazione 1, comprendente estratto di Curcuma longa come fonte di curcumina.
3. Composizione secondo le rivendicazioni 1 o 2, comprendente, come fonte di curcumina, un estratto di Curcuma longa in forma di complesso con un fosfolipide di soia.
4. Composizione secondo la rivendicazione 3, in cui detto fosfolipide di soia Ã ̈ scelto dal gruppo che consiste di lecitina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilserina e distearoilfosfatidilcolina di soia.
5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, comprendente, come fonte di astaxantina, un estratto di Haematococcus pluvialis.
6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in forma di dosaggio, comprendente da 0,5 mg a 4 mg di astaxantina e da 50 mg a 600 mg di un estratto di Curcuma longa o di un estratto di Curcuma longa complessato con un fosfolipide di soia.
7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, per l'impiego nel trattamento e prevenzione di disordini neurodegenerativi del sistema nervoso centrale e periferico, di patologie cardiovascolari, o di disturbi metabolici.
8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, per l'impiego in somministrazione orale, ove detto impiego comprende la somministrazione combinata, concomitante o sequenziale, di un estratto di Curcuma longa in quantitÃ da 10 mg a 12000 mg/die e di astaxantina in quantitÃ da 0,25 mg a 25 mg/die.
9. Composizione secondo la rivendicazione 8, per la somministrazione combinata, concomitante o sequenziale, di un estratto di Curcuma longa in quantitÃ da 60 mg a 1100 mg/die ed astaxantina in quantitÃ da 0,5 mg a 4 mg/.
10. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre uno o piÃ¹ estratti scelti dal gruppo che consiste di estratto di pepe nero, di rosmarino, di Vitis vinifera, di Boswellia serrata, di Melyssa officinalis, e/o Ginkgo biloba.
11. Composizione secondo la rivendicazione 10, comprendente inoltre sostanze nutrienti scelte dal gruppo che consiste di nucleotidi da pesce o da lievito, resveratrolo, licopene, vitamine del gruppo B, vitamina D, vitamina C, vitamina K e vitamina E.
12. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre oli essenziali e/o oligoelementi.