ITTO20110333A1 - Biosensore elettrochimico a dna - Google Patents

Description

Biosensore Elettrochimico a DNA

DESCRIZIONE

La presente invenzione ha per oggetto un sensore elettrochimico, biosensore, a DNA, dotato di una configurazione a triodo e atto ad essere utilizzato in scala sub-micrometrica.

Un biosensore à ̈ un particolare dispositivo costituito da un elemento sensibile biologicamente attivo (enzimi, cellule, anticorpi ecc.) e da una parte elettronica. L'elemento biologico interagisce con il substrato da analizzare e un sistema di trasduzione (sensore) converte la risposta biochimica in un segnale elettrico. I biosensori sono apparecchiature di monitoraggio e di controllo che possono misurare, in tempi molto brevi, paramenti fondamentali relativi a processi biologici e/o processi chimici. La caratteristica fondamentale di un biosensore à ̈ l'interazione tra materiale biologico (rappresentato da un enzima, un anticorpo, un filamento di DNA, una cellula, ecc.) ed un trasduttore di segnale. L'interazione tra il materiale biologico ed il campione sottoposto ad esame modifica uno o più parametri chimico-fisici, il trasduttore capta la variazione nel sistema e produce un segnale elettrico che può essere opportunamente amplificato, elaborato e quindi letto dall'operatore. In generale i sensori, in quanto interfaccia tra l'ambiente esterno e i sistemi di elaborazione e gestione, sono un elemento essenziale ad esempio per il controllo e la diagnostica in settori come la medicina, l'automazione industriale, le telecomunicazioni, l'ambiente, l'agricoltura. Lo sviluppo di microprocessori e circuiti integrati specificamente dedicati ha poi reso l'elaborazione a basso costo, accurata ed affidabile, aumentando dunque l'intelligenza del sistema. La ricerca in questo campo à ̈ sempre più diretta alla miniaturizzazione del trasduttore, alla produzione su larga scala, e alla creazione di biosensori multiparametrici per il controllo della qualità dei prodotti, dell'ambiente e della salute, allo scopo di determinare un generale miglioramento della qualità della vita. Le applicazioni dei biosensori spaziano in campi molto diversi: dal settore ambientale (con biosensori in grado di monitorare inquinamenti ambientali), al settore agro-alimentare (con sensori per la valutazione della qualità dei cibi o per la ricerca di OGM), al settore industriale (con sensori posizionati all'interno delle linee di produzione in grado di valutare il raggiungimento di obiettivi specifici), al settore bio-medicale (con sensori diagnostici in grado di evidenziare malattie e/o predisposizioni genetiche in tempi brevi e a basso costo).

Negli ultimi 10 anni l’interesse nei biosensori à ̈ molto cambiato e si à ̈ focalizzato, in particolare, sulla possibilità di ottenere analisi in real-time e nella creazione di dispositivi in grado di rilasciare farmaci. In particolare i biosensori a DNA sono in grado di rilevare la presenza di segmenti specifici di DNA/RNA o di proteine responsabili di possibili alterazioni. I sensori a DNA possono quindi essere impiegati per l’identificazione di geni, di reazioni cinetiche che coinvolgono DNA, di patologie, per il monitoraggio dell’ambiente e per molte altre applicazioni specifiche. La presente invenzione riguarda un particolare sensore elettrochimico a DNA dotato di una configurazione a triodo in cui l’elettrodo di lavoro viene inserito tra un controelettrodo ed un elettrodo ausiliario. Sebbene siano noti allo stato dell’arte biosensori con una simile configurazione, una caratteristica innovativa del presente trovato risiede nel particolare layout del biosensore che à ̈ in grado di sfruttare la scalabilità dimensionale, consentendo una riduzione della distanza tra contro-elettrodo ed elettrodo di riferimento allo scopo di diminuire l’effetto parassita nell’acquisizione del segnale. In particolare, considerando la necessità di definire geometrie sub-micrometriche di distanza tra gli elettrodi, vengono applicate attrezzature litografiche di ultima generazione ad elevata “apertura numerica†, in grado di risolvere pitch (definizione di linea-spazio) dell’ordine di 90 nm (un esempio di tecnologia utilizzata per tale scopo à ̈ la litografia 193nm ad immersione). Per effettuare un buon allineamento tra le diverse geometrie si utilizzano poi tecniche di integrazione di processo “damascene†che attraverso l’ottimizzazione di step di litografia, attacco e deposizioni di strati dielettrici rendono possibile la riduzione dei problemi di allineamento litografico tra i diversi piani di definizione delle strutture. Non ultimo, sempre per consentire una maggiore scalabilità delle dimensioni si utilizzano processi di definizione “double patterning†che attraverso l’alternanza di deposizioni di dielettrici ed attacchi in plasma consentono di ridurre ulteriormente le distanze.

Tali requisiti non sono ancora soddisfatti completamente dalla tecnologia che supporta i biosensori attualmente in commercio. Inoltre, grazie alla specifica architettura del biosensore oggetto del presente trovato, gli effetti parassiti vengono limitati tramite utilizzando elettrodi esterni come nei sistemi potenziometrici convenzionali. Questi ed altri vantaggi saranno meglio evidenziati nella descrizione dettagliata dell’invenzione che riferimento specifico alle Tavole 1-3, figure da 1 a 4, nelle quali à ̈ rappresentato un esempio di realizzazione preferenziale del presente trovato assolutamente non limitativo. In particolare:

• la Fig. 1 mostra la struttura del biosensore con architettura a triodo;

• la Fig. 2 mostra il sistema di circuiti integrato al biosensore;

• la Fig. 3 mostra il sistema integrato comprendente il biosensore e i componenti della tecnologia CMOS (complementary metal-oxide semiconductor);

• la Fig.4 mostra un esempio di integrazione di un biosensore con la componentistica CMOS di gestione del segnale.

Con riferimento alle suddette figure, in particolare alla Fig.1, la caratteristica architettura a triodo del biosensore definisce una sorta di “tunnel†con i 3 elettrodi, un elettrodo di lavoro (3) in posizione trasversale e due elettrodi (1 e 2) in posizione verticale e paralleli tra loro. Questi 2 elettrodi sono definiti come elettrodo ausiliario (1) e contro-elettrodo (2). Quest’ultimo rappresenta l’elettrodo a massa sia dell’elettrodo di lavoro sia dell’elettrodo ausiliario. L’elettrodo ausiliario (1) può essere alimentato sia con corrente continua che alternata, mentre l’elettrodo di lavoro e’ alimentato con corrente alternata. L’elettrodo di lavoro (3) e l’elettrodo ausiliario sono indipendenti, ma interagiscono tramite la soluzione ed in dipendenza del campo applicato. In particolare l’elettrodo ausiliario (1) ha la funzione di limitare l’accumulo di correnti parassite sull’elettrodo di lavoro. In generale questi biosensori utilizzano la variazione di capacità o di impedenza sulla superficie dell’elettrodo di lavoro come elemento di detenzione. Questo à ̈ noto come EIS (Electrochemical Impedante Spettroscopy) per cui sulla superficie dell’elettrodo di lavoro viene immobilizzato un biorecettore ed a seguito dell’interazione tra il biorecettore e la molecola target nella soluzione si modifica la capacità superficiale.

La configurazione a triodo consente la scalabilità del dispositivo permettendo di ridurre le dimensioni tra gli elettrodi in prossimità della lunghezza di Debye. Detta lunghezza rappresenta la distanza tra gli elettrodi a cui gli effetti parassiti nell’acquisizione del segnale, dovuti all’interazione degli elettroliti presenti nelle soluzioni biologiche ed il campo elettrico applicato agli elettrodi, risultano trascurabili. L’intervallo contemplato va da pochi nanometri (tipicamente nell’ordine di 10-100 nm) a qualche micron (tipicamente ≤1mm). In fig. 2 si rappresenta una schematizzazione del sensore che à ̈ caratterizzato da un potenziale elettrolitico stabile, controllato da un potenziostato (4), connesso al contro-elettrodo (2), e dall’elettrodo ausiliario (1), tramite un feedback negativo continuo. Quello che si realizza à ̈ un sistema in cui la corrente che fluisce nel sistema elettrodi – soluzione, à ̈ la minore possibile e per questa ragione viene utilizzato un sistema potenziometrico che attraverso un terzo elettrodo controbilancia la differenza di potenziale tra elettrodo di lavoro ed elettrodo di riferimento impedendo il passaggio di corrente. La corrente che si forma tra elettrodo di lavoro (3) ed elettrodo ausiliario (1) viene detta “corrente di leakage†. Le strutture note quindi sono essenzialmente delle strutture a diodo (elettrodo ausiliario ed elettrodo di lavoro) con un elettrodo supplementare esterno (contro-elettrodo) alla struttura principale e quindi non direttamente integrato, atto a bilanciare il passaggio di corrente tra il diodo principale. La struttura a triodo proposta, permette di effettuare la riduzione della “corrente di leakage†diminuendo la distanza tra gli elettrodi ed in questo modo riducendo l’effetto di separazione di carica all’interno della soluzione elettrolitica, presupposto per cui si verifica il passaggio di corrente. La distanza limite a cui tale corrente diventi teoricamente 0 e’ appunto la lunghezza di Debye. Quindi la struttura, oggetto del presente trovato, prevede due elettrodi paralleli (contro-elettrodo (1) ed elettrodo ausiliario (2) che sostengono il campo elettrico trasversale e che vengono utilizzati allo scopo di assorbire la maggior parte della corrente parassita che si forma. Ortogonalmente al campo elettrico tra questi 2 elettrodi disponiamo l’elettrodo di lavoro (3), anch’esso alimentato e che quindi impone un campo elettrico verticale. Le caratteristiche dei campi applicati, la dimensione dell’elettrodo di lavoro ed eventualmente le frequenze a cui vengono alimentati gli elettrodi possono essere a questo punto ottimizzati allo scopo di abbattere le correnti parassite ed aumentare il rapporto segnale/rumore sull’elettrodo di lavoro. Una struttura compatta con l’architettura proposta non à ̈ nota in letteratura. La differenza sostanziale risiede nella teoria attraverso cui viene impedito il passaggio di corrente in soluzione: nel caso noto tramite l’utilizzo di un terzo elettrodo, nel nostro caso ottimizzando la distanza tra gli elettrodi.

Questa specifica struttura a triodo del biosensore, che comprende i tre elettrodi, permette la connessione di questi in maniera interdigitale alle componenti CMOS che serviranno per fornire le corrette rampe di corrente agli elettrodi, verificare i cambi di capacità/impedenza sull’elettrodo di lavoro e raccogliere l’informazione che verrà successivamente trasferita al sistema connesso con “la station†esterna. Su tale elettrodo di lavoro viene immobilizzato a mezzo di tecniche note un filamento di una molecola complessa (DNA, RNA, proteina) in grado di identificare in maniera specifica l’agente che si vuole riconoscere. Per effetto dell’interazione che si instaura tra la molecola target all’interno della soluzione campione, le proprietà elettriche superficiali variano, in particolare si intende monitorare la variazione della capacità e/o impedenza dell’elettrodo di lavoro. Il trasduttore, in grado di rivelare la variazione delle proprietà elettriche superficiali à ̈ costituito da componenti CMOS, atte a convertire la variazione di capacità e/o impedenza all’elettrodo di lavoro in segnale elettrico che viene poi trasmesso ad un detector (Fig.3). Tale tecnologia contempla l’utilizzo di transistor ad elevate performance a partire da materiali di normale utilizzo nell’industria dei semiconduttori (Si, B, P, As AlCu, Cu, Co, Ni, Ti, W) fino ad arrivare anche a materiali innovativi come il grafene, allo scopo di massimizzare il rapporto segnale/rumore e le prestazioni del dispositivo.

Il sistema integrato al biosensore come mostrato in Fig. 3 comprende, un array di sensori (1, 2 e 3), un circuito di interfaccia (4), convertitore analogico-digitale (5) e un processore del segnale digitale (6). Per spiegare meglio come il segnale viene gestito, tentiamo di simularne il caso di un’indagine analitica: tra soluzione campione e biosensore si stabilisce un’interazione dovuta all’iperconiugazione del DNA immobilizzato sulla superficie e la molecola target nella soluzione; questo produce una variazione della capacità (o impedenza) della superficie che viene letta dal circuito CMOS a cui la superficie à ̈ collegata come uno sbilanciamento delle caratteristiche del componente (Interfacing Circuit, 4) che di conseguenza genera un segnale elettrico analogico che viene convertito in segnale digitale (A/D Converter, 5) per essere gestito da un processore (DSP, 6) che dopo averlo ripulito ed amplificato lo trasferisce ad un convertitore di segnale da digitale ad analogico (D/A Converter, 7) per dare la lettura finale del valore o nel caso in cui non fosse necessaria quest’ultima conversione lo stesso processore digitale può direttamente trasferire il segnale alla “working station†esterna per la lettura finale.

Un esempio di configurazione di un dispositivo a biosensore con interfaccia CMOS si può ritrovare in Fig. 4. Partendo dall’alto dove à ̈ presente la struttura schematizzata in Fig.1 (1, 2, 3), si trova il sistema di connessione dell’elettrodo di lavoro con il source della struttura di due transistors Φte ΦD(4) che sono deputati alla conversione della variazione di capacità superficiale in variazione di corrente dei transistor che attraverso un circuito periferico viene misurata e rilevata.

Il sistema lavora a bassi campi elettrici variabili (10 mVolt – 10Volt) per avere il minore passaggio di corrente possibile nell’elettrodo di lavoro che à ̈ connesso al contro-elettrodo. Un sistema così costituito, contro – elettrodo /elettrodo di lavoro/ elettrodo ausiliario, con la possibilità della connessione esterna di un elettrodo di riferimento per misure potenziometriche, deve essere in grado di gestire il segnale in uscita, trasformarlo in modo da renderlo stabile e leggibile, processarlo affinché diventi una misura quantitativa decodificabile da un detector che infine provvederà a darne lettura. Questo viene realizzato dal microcontrollore a valle del biosensore. La misura potrebbe avere come risposta anche la semplice conferma o negazione della presenza della sostanza incognita, senza necessariamente darne lettura della quantità.

Un esempio di applicazione di tale tecnologia à ̈ rappresentato dall’impiego dello stesso all’interno di dispositivi e vettori in grado di effettuare analisi in situ nel corpo umano e di trasmettere i dati raccolti attraverso la modalità wireless ad una stazione informatica (computer). Un dispositivo noto ed utilizzato per analisi gastrointestinali à ̈ il microelectronic pill, che dispone di un sensore in grado di registrare temperatura, pH,concentrazione di O2, e conduttività. Tale dispositivo potrebbe essere impiegato utilizzando il biosensore oggetto della presente invenzione, per analisi in situ e real-time.

Un ulteriore impiego del dispositivo a biosensore a DNA, come descritto nella presente invenzione, può essere dato dall’impiego dello stesso in combinazione con i “drug release device†per la cura di patologie mediante il rilascio di farmaci specifici in corrispondenza della rilevazione della patologia di interesse. Tale vettore potrà essere dotato di un sistema atto ad alimentare le diverse componenti, trattare e/o effettuare la campionatura della soluzione da analizzare, memorizzare i risultati e/o trasferire l’esito delle analisi ad un sistema che processa gli esiti della analisi in situ e/o in remoto. Queste applicazioni sono compatibili con il layout del biosensore proposto per via delle dimensioni estremamente compatte del dispositivo e per effetto del principio di diminuire la distanza tra gli elettrodi in prossimità della lunghezza di Debye per minimizzare le correnti parassite.

Claims (9)

1. R I V E N D I C A Z I O N I 1) Sensore elettrochimico a DNA comprendente un elettrodo di ausiliario, un contro-elettrodo e un elettrodo di lavoro caratterizzato da una configurazione a triodo in cui l’elettrodo di lavoro viene inserito tra il contro-elettrodo e l’elettrodo ausiliario in modo da ottenere una riduzione, a livello sub-micrometrico, della distanza tra gli elettrodi tale da ridurre l’effetto parassita nell’acquisizione del segnale.
2. 2) Sensore secondo la rivendicazione 1 in cui detto controelettrodo ed elettrodo ausiliario sono paralleli tra loro e sostengono un campo elettrico trasversale.
3. 3) Sensore secondo le rivendicazioni 1 e 2, in cui tra controelettrodo ed elettrodo ausiliario à ̈ disposto ortogonalmente l’elettrodo di lavoro imponendo un campo elettrico verticale.
4. 4) Sensore secondo una delle la rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta distanza tra gli elettrodi à ̈ compresa tra 10 nm e 1mm.
5. 5) Sensore secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui detto elettrodo di lavoro immobilizza sulla sua superficie un filamento di una molecola complessa in grado di identificare in modo specifico l’agente che si vuole riconoscere.
6. 6) Sensore secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui l’interazione tra la molecola immobilizzata sulla superficie e la molecola target, varia le proprietà elettriche superficiali dell’elettrodo di lavoro quali la capacità e impedenza dell’elettrodo.
7. 7) Sensore secondo una delle rivendicazioni precedenti caratterizzato da un potenziale elettrolitico stabile, controllato da un potenziostato, connesso ad un controelettrodo, e dall’elettrodo ausiliario, tramite un feedback negativo continuo.
8. 8) Sensore secondo una delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dall’utilizzo di componenti della tecnologia complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) atta a convertire la variazione di capacità e impedenza dell’elettrodo di lavoro in segnale elettrico misurabile.
9. 9) Sistema integrato a biosensore comprendente: - un array di sensori - un circuito di interfaccia - convertitore analogico-digitale - un processore del segnale digitale 10) Uso del sensore all’interno di un vettore per analisi in situ, in real-time e homemade. 11) Uso del sensore secondo la rivendicazione 10 per applicazione in dispositivi per il rilascio di sostanze atte a interagire con la soluzione che si vuol analizzare o utilizzabili a scopo terapeutico.