ITTO20110233A1

ITTO20110233A1 - Metodo in vitro di diagnosi, prognosi e trattamento di disordini ematopoietici

Info

Publication number: ITTO20110233A1
Application number: IT000233A
Authority: IT
Inventors: Erik Evensen; Maria Teresa Scupoli
Original assignee: Nodality Inc; Uni Degli Studi Di Verona
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2011-03-14
Publication date: 2012-09-15

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

"METODO IN VITRO DI DIAGNOSI, PROGNOSI E TRATTAMENTO DI DISORDINI EMATOPOIETICI"

La presente invenzione è relativa ad un metodo in vitro di classificazione, diagnosi, prognosi e/o previsione dell'esito di una condizione neoplastica e/o ematopoietica.

Molte condizioni sono caratterizzate da alterazioni dei meccanismi cellulari che portano, per esempio, ad un controllo aberrante di processi cellulari, o ad una crescita non controllata e ad una proliferazione delle cellule. Queste alterazioni sono spesso causate da cambiamenti dell'attività di molecole che partecipano a meccanismi cellulari. Per esempio, sono state descritte specifiche alterazioni di vie di trasduzione del segnale in molti tumori. Nonostante le crescenti evidenze che dimostrano che alterazioni delle vie di trasduzione mediano la trasformazione neoplastica, non sono stati ancora spiegati i precisi eventi molecolari che sottostanno a queste trasformazioni. Come risultato, i farmaci non possono essere efficaci nel trattamento di condizioni che coinvolgono vie di trasduzione che non sono ben comprese. Quindi, una diagnosi corretta di una condizione e l'uso di terapie richiederanno la conoscenza degli eventi cellulari che sono responsabili della condizione patologica.

Inoltre, i pazienti che soffrono di diverse condizioni seguono decorsi clinici eterogenei. Per esempio, è stata osservata una notevole variabilità clinica tra le guarigioni dei pazienti con tumore, anche in quelle che si ottengono dopo un ciclo di terapia. Alcuni pazienti leucemici sopravvivono per periodi prolungati senza una terapia specifica, mentre altri muoiono rapidamente nonostante un trattamento aggressivo. I pazienti che sono resistenti alla terapia hanno un tempo di sopravvivenza molto ridotto, qualsiasi sia il momento dell'insorgenza della resistenza. Nonostante siano stati sviluppati vari sistemi di stadiazione per affrontare questa eterogeneità clinica, questi non possono predire accuratamente se un paziente in uno stadio precoce o intermedio avrà un decorso patologico indolente o aggressivo.

Di conseguenza, c'è la necessità di un indicatore affidabile per predire il decorso patologico di un individuo per aiutare i medici ad identificare quei pazienti che risponderanno ad un trattamento, quei pazienti che progrediranno ad uno stato più avanzato della malattia e quei pazienti che svilupperanno resistenza al trattamento.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire un nuovo metodo per predire il decorso patologico di un individuo con disordini ematopoietici.

Tale scopo è raggiunto mediante un metodo secondo la rivendicazione 1 e un kit secondo la rivendicazione 14.

Secondo un aspetto, l'invenzione fornisce un metodo in vitro per la classificazione, diagnosi, prognosi e/o predizione di un risultato di una condizione neoplastica e/o ematopoietica in un individuo. In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende: mettere in contatto una cellula con almeno un modulatore, in cui detto modulatore è H2O2, uno o più reticolanti del recettore delle cellule B (BCR), o una loro combinazione; determinare la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili in detta cellula, in cui detti uno o più elementi attivabili sono selezionati nel gruppo costituito da JNK1, p38, Erkl, Syk e NF-KB, e inoltre in cui detta presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di detti uno o più elementi attivabili è correlato ad un risultato clinico; e classificare, diagnosticare, pronosticare e/o predire un esito di detta condizione basato su detta presenza o assenza di detto aumento del livello di attivazione di detti uno o più elementi attivabili. In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili, da solo o in combinazione, stratifica i soggetti in una pluralità di soggetti in un gruppo avente uno o più risultati clinici e un gruppo che non ha detti uno o più risultati clinici, con un valore p minore o uguale a 0,1. In alcune forme di realizzazione, detta combinazione comprende uno o più covariate cliniche, come lo stato mutazionale dei geni della catena pesante variabile dell'immunoglobulina (IgVH), l'espressione di superficie di CD38, l'espressione di ZAP-70 e la stadiazione o la classificazione di una condizione neoplastica e/o ematopoietica.

In alcune forme di realizzazione, la cellula è una cellula tumorale. In alcune forme di realizzazione, la cellula è una cellula di derivazione ematopoietica. In alcune forme di realizzazione, la cellula di derivazione ematopoietica è selezionata nel gruppo costituito da cellule staminali ematopoietiche pluripotenti , cellule progenitrici della linea B-linfocitaria, cellule derivate della linea B-linfocitaria cellule progenitrici della linea T-linfocitaria cellule derivate della linea T-linf ocitaria, cellule progenitrici della linea cellulare NK, cellule derivate della linea cellulare NK, cellule progenitrici della linea granulocitaria, cellule derivate della linea granulocitaria, cellule progenitrici della linea monocitaria, cellule derivate della linea monocitaria, cellule progenitrici della linea megacariocitaria, cellule derivate della linea megacariocitaria, cellule progenitrici della linea eritrocitaria e cellule derivate della linea eritrocitaria. In alcune forme di realizzazione, la cellula di derivazione ematopoietica è una cellula progenitrice o derivata della linea B-linf ocitaria, per esempio una cellula pro-B precoce, una cellula pro-B tardiva, una cellula pre-B grande, una cellula pre-B piccola, una cellula B immatura, una cellula B matura, una plasmacellula, una cellula B di memoria, una cellula B CD5+ o una cellula B che esprime ZAP-70 .

In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è la prognosi e/o la diagnosi di una condizione neoplastica e/o ematopoietica. In alcune forme di realizzazione, il risultato clinico è la presenza o l'assenza di una condizione neoplastica o ematopoietica. In alcune forme di realizzazione, la condizione neoplastica e/o ematopoietica è una malattia che interessa le cellule B o la linea delle cellule B, come la leucemia linfatica cronica (LLC), la leucemia della linea dei linfociti B, il linfoma della linea dei linfociti B, il mieloma multiplo, o disordini delle plasmacellule (per esempio amiloidosi, macroglobulinemia di Waldenstrom, malattie mielodisplastiche, malattie mieloproliferative, mielofibrosi o linfoproliferazioni immunitarie atipiche). In alcune forme di realizzazione, la condizione è la LLC. In alcune forme di realizzazione, la LLC è definita da una popolazione di cellule B monoclonali che co-esprime CD5 con CD19, CD23 con CD20, CD5 con CD20, CD23 con una debole espressione delle immunoglobuline di superficie, CD5 con CD19 e CD23 o CD5 con CD20 e CD23 e una debole espressione di superficie delle immunoglobuline.

In alcune forme di realizzazione, il risultato clinico è la stadiazione o la classificazione di una condizione neoplastica e/o ematopoietica. Esempi di stadiazione nei metodi forniti dall'invenzione includono, ma non sono ad essi limitati, aggressiva, indolente, benigna, refrattaria, stadiazione in numeri romani, stadiazione TNM, stadiazione Rai, stadiazione Binet, classificazione WHO, classificazione FAB, punteggio IPSS, punteggio WPSS, stadio limitato, stadio esteso, stadiazione sulla base di marcatori cellulari come ZAP-70 e CD38, stadiazione sulla base dello stato mutazionale di geni come il gene per la catena pesante variabile delle immunoglobuline, inclusa l'informazione che può dare indicazioni sul tempo della progressione, la sopravvivenza senza progressione, la sopravvivenza complessiva o la sopravvivenza senza eventi.

In alcune forme di realizzazione dei metodi in vitro dell'invenzione, la risposta clinica (per esempio il tempo di progressione, la sopravvivenza complessiva) alla quale è correlata la presenza o l'assenza di un aumento nel livello di attivazione di uno o più elementi attivabili è una risposta del paziente ad un trattamento, come una risposta completa, una risposta parziale, una risposta parziale nodulare, nessuna risposta, una malattia progressiva, una malattia stabile, una recidiva o una reazione avversa. Il metodo può inoltre comprendere la determinazione di un metodo di trattamento, ad esempio chemioterapia, terapia biologica, terapia con radiazioni, trapianto di midollo osseo, trapianto di cellule staminali periferiche, trapianto di sangue del cordone ombelicale, trapianto di cellule staminali autologhe, trapianto di cellule staminali allogeniche, trapianto di cellule staminali singeniche, chirurgia, terapia per induzione, terapia di mantenimento, attesa vigile, o terapia alternativa/olistica.

In alcune forme di realizzazione del metodo in vitro dell'invenzione, la classificazione comprende classificare la cellula come una cellula che sia correlata ad una malattia residua minima o ad insorgenza di resistenza .

In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il livello di attivazione di uno o più elementi attivabili nella cellula è selezionato nel gruppo costituito da clivaggio mediante esposizione a proteasi extracellulari o intracellulari, formazione di nuovi etero-oligomeri, livello di glicosilazione, livello di fosforilazione, livello di acetilazione, livello di metilazione, livello di biotinilazione, livello di glutamilazione, livello di glicilazione, livello di idrossilazione, livello di isomerizzazione, livello di prenilazione, livello di miristilazione, livello di lipoilazione, livello di fosfopanteteinilazione, livello di soliatazione, livello di ISGlazione, livello di nitrosilazione, livello di palmitoilazione, livello di SUMOlizzazione, livello di ubiquitinazione, livello di neddilazione, livello di citrullinazione, livello di deamilazione, livello di formazione del legame disulfidico, livello di clivaggio proteolitico, livello di traslocazione, cambi nel turnover delle proteine, livello del complesso multi-proteico, livello di ossidazione, complesso multi-lipide e cambiamenti biochimici della membrana cellulare. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione è un livello di fosforilazione. In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di detto uno o più elementi attivabili è confrontata con una cellula normale messa a contatto con almeno un detto modulatore.

In alcune forme di realizzazione dei metodi in vitro dell'invenzione, il modulatore con il quale la cellula è messa a contatto è un attivatore o un inibitore. In alcune forme di realizzazione, il modulatore è un modulatore del recettore della cellula B, ad esempio un attivatore del recettore della cellula B come un reticolante del complesso del recettore della cellula B o un complesso del corecettore della cellula B. In alcune forme di realizzazione, il reticolante è un anticorpo, o un'entità molecolare di legame. In alcune forme di realizzazione, il legante è un anticorpo come un anticorpo multivalente. In alcune forme di realizzazione, 1'anticorpo è un anticorpo monovalente, bivalente o multivalente reso più multivalente mediante l'attacco ad una superficie solida o legato sulla superficie di una nanoparticella per aumentare la valenza locale del dominio legante l'epitopo. In alcune forme di realizzazione, il legante è una un'entità molecolare di legame, come un'entità che agisce su o lega il complesso del recettore della cellula B mediante carboidrati o un epitopo del complesso. In alcune forme di realizzazione, l'entità molecolare di legame è un'entità molecolare di legame monovalente, bivalente o multivalente che è resa multivalente mediante l'attacco ad una superficie solida o legato sulla superficie di una nanoparticella per aumentare la valenza locale del dominio legante l'epitopo. In alcune forme di realizzazione in cui il modulatore è un modulatore del recettore della cellula B, ad esempio un attivatore del recettore della cellula B come un reticolante del complesso del recettore della cellula B o un complesso del corecettore della cellula B, la reticolazione comprende il legame di un anticorpo o di un'entità di legame molecolare alla cellula e poi l'induzione della sua reticolazione mediante interazione della cellula con una superficie solida che causa la reticolazione del complesso BCR attraverso un anticorpo o un'entità di legame molecolare. In alcune forme di realizzazione, uno o più reticolanti sono selezionati nel gruppo costituito da F(ab)2IgM, F(ab)2IgG, F(ab)2IgD, anticorpi BCR policlonali, anticorpi BCR monoclonali, elementi di legame derivati dal recettore Fc, anticorpi IgM policlonali, anticorpi IgM monoclonali, F(ab)2IgCM biotinilate, anticorpi IgM policlonali biotinilati, e anticorpi IgM monoclonali biotinilati. In alcune forme di realizzazione, l'Ig è derivato da una specie selezionata nel gruppo costituito da topo, capra, coniglio, maiale, ratto, cavallo, mucca, squalo, pollo o lama.

In alcune forme di realizzazione dei metodi in vitro dell'invenzione, il modulatore al quale è sottoposta la cellula è un inibitore di un fattore cellulare o di una pluralità di fattori che partecipa alla cascata di segnali nella cellula.

In alcune forme di realizzazione dei metodi in vitro dell'invenzione, la cellula è messa in contatto con due o più modulatori, ad esempio la cellula può essere sottoposta ad un attivatore del recettore B e ad un inibitore della fosfatasi, come F(ab)2IgM o F(ab)2IgM biotinilato e H202.

In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione per ciascuno dei due o più detti elementi attivabili in combinazione è correlata con l'esito clinico. In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di ciascuno degli uno o più elementi attivabili, da solo o in combinazione e combinato con una o più covariate cliniche, è correlata con un'altra covariata clinica e/o un esito clinico. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è una covariata clinica, inclusa ma non limitata allo stato mutazionale del gene per IgVH, l'espressione di CD38, l'espressione della tirosin-chinasi ZAP-70 (ZAP-70), e la stadiazione o la classificazione di una condizione neoplastica e/o ematopoietica. In alcune forme di realizzazione, il risultato clinico è il tempo della progressione (TTP) o la sopravvivenza complessiva (OS). In alcune forme di realizzazione, la correlazione è espressa come un'abilità della presenza o dell'assenza di un aumento del livello di attivazione di ciascuno degli uno o più elementi attivabili, da solo o in combinazione, a stratificare i soggetti aventi una particolare covariata clinica da soggetti che non hanno una particolare covariata.

Secondo un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo in vitro per la classificazione, la diagnosi, la prognosi e/o la predizione di un risultato di una condizione neoplastica e/o ematopoietica in un individuo. In una forma di realizzazione, il metodo comprende mettere in contatto una cellula con almeno un modulatore; determinare la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili in detta cellula, in cui un modello di rischi proporzionali comprendente detta presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di detto uno o più elementi attivabili ha un valore di indice C di almeno 0,6; e classificare, diagnosticare, pronosticare e/o predire un risultato di detta condizione basato su detta presenza o assenza di detto aumento del livello di attivazione di detto uno o più elementi attivabili. In alcune forme di realizzazione, il modello di rischi proporzionali comprende una regressione di rischi proporzionali Cox. In alcune forme di realizzazione, il modello di rischi proporzionali comprende una o più covariate cliniche, come lo stato mutazionale dei geni della catena pesante variabile delle immunoglobuline (IgVH), l'espressione superficiale di CD38, l'espressione di ZAP-70, e la stadiazione o la classificazione di una condizione neoplastica e/o ematopoietica. In alcune forme di realizzazione, il modello di rischi proporzionali fornisce una predizione dell'esito clinico, come la stadiazione o la classificazione di una condizione neoplastica e/o ematopoietica.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Le caratteristiche innovative dell'invenzione sono illustrate in modo dettagliato nelle rivendicazioni allegate. Una migliore comprensione delle caratteristiche e dei vantaggi della presente invenzione si otterrà riferendosi alla descrizione dettagliata seguente che evidenzia forme di realizzazione illustrative in cui vengono utilizzati i principi dell'invenzione e alle figure di accompagnamento, di cui:

La Figura 1 illustra gli anticorpi utilizzati per le misure del segnale del BCR e il delineamento di sottogruppi cellulari.

La Figura 2 riassume i dati dell'analisi dei profili della rete cellulare in singola cellula.

La Figura 3 riassume il tempo di progressione di differenti sottogruppi clinici di pazienti.

La Figura 4A rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (var), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 4B rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP che possiedono significatività statistica, utilizzando due nodi (vari e var2), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 4C rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (vari) e una covariata clinica (var2, combinata con var3 per lo stadio di Binet), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 5A rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (vari) e due covariate cliniche (var2 e var 3; var 3 combinata con var4 per lo stadio di Binet), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 5B rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP che possiedono significatività statistica, utilizzando due nodi (vari e var2) e una covariata clinica (var 3, combinata con var4 per lo stadio di Binet), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 6A rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP per i pazienti allo stadio A di Binet che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (var), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 6B rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP per i pazienti allo stadio A di Binet che possiedono significatività statistica, utilizzando due nodi (vari e var2), con nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 6C rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP per i pazienti allo stadio A di Binet che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (vari) e una covariata clinica (var2), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 7A rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP per i pazienti allo stadio A di Binet che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (vari) e due covariate cliniche (var2 e var3), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 7B rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP per i pazienti allo stadio A di Binet che possiedono significatività statistica, utilizzando due nodi (vari e var2) e una covariata clinica (var3), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile).

La Figura 8 rappresenta i modelli selezionati di regressione dei rischi proporzionali di Cox per TTP che possiedono significatività statistica, utilizzando un nodo (vari) e facoltativamente una covariata clinica (var2), con i nodi espressi come (modulatore^elemento attivabile), e la capacità predittiva del modello misurato con l'indice C.

La Figura 9A tabula i valori β,pp,LRT e PLRTottenuti attraverso l'applicazione della regressione dei rischi proporzionali alle singole covariate cliniche selezionate nei dati dei pazienti allo stadio A di Binet.

La Figura 9B tabula i valori β,pp,LRT e PLRTottenuti attraverso l'applicazione della regressione dei rischi proporzionali alle combinazioni selezionate di due covariate cliniche nei dati dei pazienti allo stadio A di Binet.

La Figura 10A illustra i risultati della comparazione delle proteine di segnalamento del BCR nei loro stati non modulati (cioè basali) tra donatori sani e pazienti affetti da LLC-B (stratificati per lo stato IGHV).

La Figura 10B illustra i risultati della comparazione della fosforilazione delle proteine di segnalamento del BCR modulata da anti-IgM tra donatori sani e pazienti affetti da LLC-B (stratificati per lo stato IGHV).

La Figura 10C illustra i risultati della comparazione della fosforilazione delle proteine di segnalamento del BCR modulata da H2O2 tra donatori sani e pazienti affetti da LLC-B (stratificati per lo stato IGHV).

La Figura 11 illustra una risposta delle LLC-B e delle cellule B normali dopo stimolo del BCR.

La Figura 12 illustra un confronto della MFI basale e modulata delle proteine di segnalamento del BCR tra sottogruppi di LLC-B e cellule B normali.

La Figura 13 illustra la fosforilazione basale delle proteine di segnale del BCR in LLC-B e cellule B normali.

La Figura 14 rappresenta le curve per i pazienti allo stadio A di Binet.

La Figura 15 illustra una risposta delle cellule LLC-B e delle cellule B normali alla modulazione con H2O2.

La Figura 16A tabula i valori del coefficiente β e i loro corrispondenti valori di p (pp) così come i valori del test del rapporto log (LRT) e i corrispondenti valori di p (PLRT), ottenuti applicando la regressione dei rischi proprorzionali alle singole varibili.

La Figura 16B tabula i valori β,pp,LRT e PLRTottenuti applicando la regressione dei rischi proporzionali a combinazioni selezionate di due covariate cliniche.

La Figura 17 rappresenta i pazienti affetti da LLC-B raggruppati sulla base della risposta al BCR utilizzando il metodo di raggruppamento dei medoidi k.

In alcune forme di realizzazione, questa invenzione è relativa a metodi in vitro e composizioni di classificazione, diagnosi, prognosi, trattamento e/o previsione dell'esito di una condizione neoplastica e/o ematopoietica. In alcune forme di realizzazione, lo stato fisiologico delle cellule presenti in un campione (per esempio un campione clinico), viene usato, per esempio, per la diagnosi o la prognosi di una condizione, per la selezione dei pazienti per la terapia, per monitorare il trattamento, per modificare regimi terapeutici e per ottimizzare la scelta di agenti terapeutici che possono essere somministrati da soli o in combinazione. Quindi, i regimi terapeutici possono essere personalizzati e adattati al paziente sulla base dei dati ottenuti prima della terapia e a tempi diversi durante trattamento, in modo da somministrare un trattamento adeguato per ogni singolo individuo .

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione è relativa a metodi in vitro per classificare un campione derivato da un individuo che ha, o si sospetta che abbia, una certa condizione, per esempio una condizione neoplastica e/o ematopoietica. L'invenzione permette di identificare sottogruppi di condizioni rilevanti da un punto di vista prognostico e terapeutico e di predire il decorso clinico di un individuo. I metodi in vitro dell'invenzione forniscono strumenti utili nel trattamento di un individuo affetto da una condizione, compresi, ma non limitati a, metodi per assegnare l'individuo a gruppi di rischio, metodi per predire un aumentato rischio di ricaduta, metodi per predire un aumentato rischio di sviluppare una complicanza secondaria, metodi per la scelta della terapia adatta ad un individuo, metodi per predire la risposta di un individuo alla terapia, metodi per determinare l'efficacia della terapia in un individuo e metodi per determinare la prognosi di un individuo. La presente invenzione fornisce metodi che possono servire come un indicatore prognostico per predire il decorso di una condizione, per esempio se il decorso di una condizione neoplastica o ematopoietica in un individuo sarà aggressivo o indolente, aiutando in tal modo il clinico nella gestione del paziente e nella valutazione della modalità del trattamento da usare.

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione è relativa a metodi in vitro per determinare il livello di attivazione di uno o più elementi attivabili in una cellula a seguito di trattamento con uno o più modulatori. L'attivazione di un elemento attivabile in una cellula dopo il trattamento con uno o più modulatori può rivelare vie attive in una condizione che possono essere usate, per esempio, come un indicatore per predire il decorso di una condizione, identificare gruppi di rischio, predire un aumentato rischio di sviluppare complicanze secondarie, scegliere una terapia per un individuo, predire la risposta di una terapia in un individuo, determinare l'efficacia di una terapia in un individuo, e determinare la prognosi di un individuo.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione è relativa a metodi in vitro per classificare una cellula mediante contatto della cellula con un inibitore, per determinare la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella cellula e per classificare la cellula in base alla presenza o assenza dell'aumento dell'attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione è relativa a metodi per determinare la presenza o assenza di una condizione in un individuo sottoponendo una cellula dell'individuo all'azione di un modulatore o di un inibitore, per determinare il livello di attivazione di un elemento attivabile nella cellula e per determinare la presenza o assenza di una condizione sulla base del livello di attivazione dopo trattamento con un modulatore o un inibitore.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione è relativa a metodi per determinare un profilo fenotipico di una popolazione cellulare dopo trattamento della popolazione cellulare con una pluralità di modulatori in colture separate, dove almeno uno dei modulatori è un inibitore, per determinare la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella popolazione cellulare in ciascuna delle colture separate e per classificare la popolazione cellulare sulla base della presenza o assenza dell'aumento dell'attivazione dell'elemento attivabile in ciascuna delle colture separate.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione è relativa a metodi per classificare una popolazione cellulare ponendo la popolazione cellulare in contatto con almeno un modulatore, dove il modulatore è F(ab)2 IgM, H202, PMA, BAFF, Aprii, SDFla, CD40L, IGF-1, Imiquimod, polyCpG, IL-7, IL-6, IL-10, IL-27, IL-4, IL-2, IL-3, tapsigargina e/o una loro combinazione, per determinare la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella popolazione cellulare e per classificare la popolazione cellulare sulla base della presenza o assenza dell'aumento dell'attivazione dell'elemento attivabile.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione è relativa a metodi per correlare e/o classificare uno stato di attivazione di una cellula di LLC con l'esito clinico in un individuo, sottoponendo la cellula di LLC all'azione di un modulatore, dove la cellula di LLC esprime un recettore della cellula B (BCR), per determinare i livelli di attivazione di una pluralità di elementi attivabili e per identificare un modello dei livelli di attivazione della pluralità degli elementi attivabili al fine di determinare la presenza o assenza di un'alterazione nel segnalamento prossimale del BCR, dove la presenza dell'alterazione è indicativa dell'esito clinico.

La presente invenzione fornisce anche kit da usare nella determinazione dello stato fisiologico delle cellule in un campione, il kit contiene uno o più elementi di legame specifici per molecole del segnalamento e può contenere anche uno o più agenti terapeutici. Il kit può contenere inoltre un pacchetto software per l'analisi dei dati dello stato fisiologico che può includere profili di riferimento da comparare con i profili del test.

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione comprendono l'analisi di uno o più campioni prelevati da un individuo. Un individuo è un organismo pluricellulare; in alcune forme di realizzazione l'individuo è un animale, per esempio un mammifero. In alcune forme di realizzazione l'individuo è un essere umano.

Il campione può essere di ogni tipo purché adatto a permettere l'analisi di una o più cellule. I campioni possono essere prelevati da un individuo una o più volte. Più campioni possono essere prelevati da sedi differenti dell'individuo (per esempio campioni di sangue, campioni di midollo osseo e/o campioni di linfonodo), a tempi differenti (per esempio una serie di campioni prelevati per monitorare la risposta al trattamento o per monitorare la ricaduta in una condizione patologica) o con una combinazione di queste modalità di campionamento. Queste ed altre possibili combinazioni di campionamento basate sul tipo di campione, sede e tempo di campionamento consentono la determinazione della presenza di cellule pre-patologiche o patologiche, la misura della risposta al trattamento ed il monitoraggio della malattia.

Quando i campioni sono ottenuti in serie, per esempio una serie di campioni di sangue ottenuti dopo il trattamento, i campioni possono essere ottenuti ad intervalli fissi, ad intervalli determinati dallo stato del campione o dei campioni più recenti o da altre caratteristiche dell'individuo o da una combinazione di queste condizioni. Per esempio, i campioni possono essere ottenuti ad intervalli di circa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 giorni, ad intervalli di circa 1, 2, 3, o 4 settimane, ad intervalli di circa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o 11 mesi, ad intervalli di circa 1, 2, 3, 4, 5, o più di 5 anni, o da loro combinazioni. Si terrà conto del fatto che un intervallo può non essere esatto, a seconda della disponibilità dell'individuo al prelievo del campione e a seconda della disponibilità della struttura a prelevare il campione; così, sono considerati nell'invenzione intervalli approssimati che corrispondono ad uno schema prefissato di intervallo. Per esempio, un individuo che ha subito un trattamento per un tumore può essere controllato (per esempio tramite un prelievo di sangue) relativamente di frequente (per esempio ogni mese o ogni tre mesi) per i primi sei mesi fino a un anno dopo il trattamento; se non vengono riscontrate anomalie, in seguito può essere controllato meno di frequente (per esempio a tempi compresi tra sei mesi e un anno). Se, tuttavia, vengono riscontrate delle anomalie o altre circostanze durante questi intervalli o durante il campionamento, gli intervalli di campionamento possono essere modificati.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi che comprendono metodi per determinare lo stato patologico di una cellula, per esempio determinando il livello di attivazione di un elemento attivabile dopo contatto con uno o più modulatori. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi che comprendono metodi per classificare una cellula in base allo stato di un elemento attivabile in una via cellulare. L'informazione può essere usata nella prognosi e nella diagnosi, ivi compresi la suscettibilità alla(e) malattia(e), lo stato di una condizione patologica e la risposta alle variazioni ambientali, quali il passare del tempo, il trattamento con farmaci o altro. Lo stato fisiologico delle cellule presenti in un campione (per esempio un campione clinico) può essere classificato sulla base dell'attivazione delle vie cellulari di interesse. Le cellule possono essere classificate in base alla loro capacità di rispondere ad agenti terapeutici e trattamenti.

Una o più cellule, o campioni contenenti una o più cellule, possono essere isolate da campioni corporei, quali, ma non limitati a, strisci, saliva, biopsie, secrezioni, fluidi cerebrospinali, bile, sangue, linfa, urine e feci, o tessuti che sono stati rimossi da organi, quali mammella, polmone, intestino, pelle, cervice, prostata e stomaco. Per esempio, un campione di tessuto può comprendere una regione con cellule connesse funzionalmente o cellule adiacenti. In genere, i campioni ottenuti più facilmente sono campioni fluidi. I campioni fluidi comprendono fluidi corporei normali e patologici e aspirati di quei fluidi. I campioni di fluidi comprendono anche lavaggi di organi e cavità (lavaggi e perfusioni). I fluidi corporei comprendono sangue intero, aspirato di midollo osseo, fluido sinoviale, fluido cerebrospinale, saliva, lacrime, sperma, saliva, muco, sangue mestruale, latte materno, urine, fluido linfatico, liquido amniotico, liquido placentare ed effusioni, quali versamento cardiaco, versamento articolare, versamento pleurico, e versamento nella cavità peritoneale (ascite) . I lavaggi possono essere ottenuti da numerosi organi, cavità del corpo, condotti, dotti e ghiandole. I siti che possono essere sottoposti a lavaggi comprendono i polmoni (lavaggio bronchiale), lo stomaco (lavanda gastrica), il tratto gastrointestinale (lavanda gastrointestinale), il colon (lavaggio del colon), la vagina, la vescica (irrigazione della vescica), i dotti mammari (lavaggio duttale) , la cavità orale, nasale, dei seni e la cavità peritoneale (perfusione della cavità peritoneale) . In alcune forme di realizzazione, il campione (o i campioni) è il sangue. Possono essere utilizzati anche campioni di tessuto solido, da soli o in combinazione con campioni fluidi. I campioni solidi possono essere ottenuti dagli individui con qualsiasi metodo noto nell'arte, compresi campioni chirurgici, biopsie e raschiamento dei tessuti, incluso il raschiamento della guancia. I campioni chirurgici comprendono campioni ottenuti durante intervento chirurgico esplorativo, estetico, ricostruttivo, o terapeutico. I campioni bioptici possono essere ottenuti con numerosi metodi tra cui biopsia morso, a spazzola, a cono, "core", citologica, mediante aspirazione, endoscopica, escissionale, esplorativa, mediante aspirazione con ago sottile, incisionale, percutanea, con pugno, stereotattica e di superficie.

In alcune forme di realizzazione, il campione è un campione di sangue. In alcune forme di realizzazione, il campione è un campione di midollo osseo. In alcune forme di realizzazione, il campione è un campione di linfonodo. In alcune forme di realizzazione, il campione è liquido cerebrospinale. In alcune forme di realizzazione, sono usate combinazioni di uno o più campioni di sangue, midollo osseo, liquido cerebrospinale e linfonodo.

Questi campioni possono contenere popolazioni complesse di cellule che possono essere analizzate come popolazioni uniche o distinte in sottogruppi. Un tale campione cellulare e acellulare può essere separato mediante centrifugazione, elutriazione, separazione su gradiente di densità, aferesi, selezione per affinità, lavaggio, FACS, centrifugazione con Hypaque, ecc. Si può ottenere una popolazione relativamente omogenea di cellule utilizzando anticorpi specifici per marcatori che identificano particolari tipi cellulari. In alternativa, si può utilizzare una popolazione eterogenea di cellule. Le cellule possono essere separate anche utilizzando dei filtri. Ad esempio, il sangue intero può essere posto su filtri che sono stati progettati per contenere pori di dimensioni tali da selezionare la cellula desiderata per tipo o classe. Cellule patogenetiche rare possono essere filtrate da sangue intero diluito, dopo lisi dei globuli rossi, utilizzando filtri con pori di dimensioni comprese tra 5 e 10 micron, come indicato nella domanda di brevetto US numero 09/790,673. Una volta ottenuto il campione, questo può essere utilizzato direttamente, congelato o mantenuto nel mezzo di coltura adatto per brevi periodi di tempo. I metodi per isolare una o più cellule da utilizzare secondo i metodi di questa invenzione sono eseguiti seguendo tecniche standard e protocolli ben consolidati nell'arte.

Le cellule adatte agli scopi della presente invenzione comprendono tipi cellulari associati ad una vasta varietà di condizioni patologiche, compreso uno stato non patologico. Di conseguenza, tipi adatti di cellule eucariotiche comprendono, ma non sono limitati a, cellule tumorali di ogni tipo (ad esempio, melanoma, leucemia mieloide, carcinoma del polmone, del seno, delle ovaie, del colon, del rene, della prostata, del pancreas e dei testicoli), cardiomiociti , cellule dendritiche, cellule endoteliali, cellule epiteliali, linfociti (cellule T e cellule B), mastociti, eosinofili, cellule vascolari dell'intima, macrofagi, cellule naturai killer, eritrociti, epatociti, leucociti compresi i leucociti mononucleati, cellule staminali quali ematopoietiche, neurali, della cute, dei polmoni, dei reni, del fegato e cellule staminali di miociti (da usare per screening dei fattori di differenziazione e di de-differenziazione), osteoclasti, condrociti e altre cellule del tessuto connettivo, cheratinociti, melanociti, cellule epatiche, cellule renali e adipociti. Cellule adatte comprendono anche cellule dello stato primario della malattia, quali le cellule del tumore primario. Cellule adatte comprendono anche cellule usate di solito nella ricerca, tra cui, ma non solo, cellule T Jurkat, cellule NIH3T3, CHO, COS, ecc. Si veda il catalogo delle linee cellulari ATCC.

In alcune forme di realizzazione, dopo il prelievo, le cellule sono coltivate in un mezzo adatto a rivelare il livello di attivazione di un elemento attivabile (per esempio, RPMI, DMEM), in presenza o assenza di siero quale siero fetale bovino, siero bovino, siero umano, siero, siero suino, siero di cavallo o di siero di capra. Quando il siero è presente nel mezzo, questo può essere presente in una percentuale compresa tra 0,0001% e 30%.

In alcune forme di realizzazione, la determinazione della presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili richiede quasi, o minimo quasi, o massimo quasi lxlO<3>, 5xl0<3>, lxlO<4>, 2x10<4>, 5x10<4>, 1x10<s>, 2x10<s>, 2,5x10<s>, 3x10<s>, 3,5x10<s>, 4xl0<5>, 4,5x10<5>, 5x10<5>, 6x10<5>, 7xl0<5>, 8xl0<5>, 9xl0<5>, lxlO<6>, lxlO<7>o più cellule. In alcune forme di realizzazione in cui è utilizzata la citometria a flusso, la determinazione della presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili richiede quasi, o minimo quasi, o massimo quasi 100, 500, 1000, 5000, 7500, 10000, 12500, 15000, 25000, 50000, 75000, 100000 o più eventi selezionati elettronicamente, dove un evento selezionato elettronicamente rappresenta una cellula che soddisfa le condizioni per un criterio particolare di selezione o una loro combinazione.

In alcune forme di realizzazione, la cellula è un cellula ematopoietica. Esempi di cellule ematopoietiche comprendono, ma non sono limitati a, cellule staminali ematopoietiche pluripotenti, cellule proqenitrici o cellule derivate della linea dei linfociti B, cellule proqenitrici o cellule derivate della linea dei linfociti T, cellule progenitrici o cellule derivate della linea delle cellule NK, cellule progenitrici o cellule derivate della linea dei granulociti, cellule progenitrici o cellule derivate della linea dei monociti, cellule progenitrici o cellule derivate della linea dei megacariociti , cellule progenitrici o cellule derivate della linea degli eritrociti.

In alcune forme di realizzazione, le cellule utilizzate nella presente invenzione sono ottenute da un paziente.

Il termine "paziente" o "individuo ", come utilizzato nel presente documento, comprende gli esseri umani come pure altri mammiferi. Generalmente i metodi sono relativi alla determinazione dello stato di un elemento attivabile. I metodi inoltre sono relativi alla determinazione dello stato di una pluralità di elementi attivabili.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo per classificare una cellula determinando la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella cellula dopo trattamento con uno o più modulatori e per classificare una cellula in base alla presenza o assenza dell'aumento di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il livello di attivazione dell'elemento attivabile è determinata dal contatto della cellula con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, una cellula è classificata sulla base del livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili dopo che la cellula è stata sottoposta all'azione di un modulatore. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, i livelli di attivazione di una pluralità di elementi attivabili sono determinati dal contatto di una cellula con una pluralità di elementi di legame, dove ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile .

La classificazione di una cellula in base allo stato di un elemento attivabile, ad esempio in una via di segnalamento, può comprendere la classificazione della cellula come una cellula che è correlata ad un esito clinico. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è la prognosi e/o la diagnosi di una condizione. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è la presenza o l'assenza di una condizione neoplastica o ematopoietica come il linfoma non-Hodgkin, il linfoma di Hodgkin o altri linfomi, le leucemie acute o croniche, le policitemie, le trombocitemie, il mieloma multiplo o malattie delle plasmacellule, come ad esempio l'amiloidosi e la macroglobulinemia di Waldenstrom, malattie mie lodispiasti che, malattie mieloprolif erative, mielof ibrosi , o linfoproliferazioni atipiche immunitarie. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è la presenza o assenza di una condizione neoplastica o ematopoietica, come la leucemia linfatica cronica (LLC), leucemie della linea dei linfociti B, linfomi della linea dei linfociti B, il mieloma multiplo o malattie delle plasmacellule, come ad esempio l'amiloidosi e la macroglobulinemia di Waldenstrom. In alcune forme di realizzazione, la condizione è la LLC. In alcune forme di realizzazione, il risultato clinico è la stadiazione o la classificazione di una condizione neoplastica o ematopoietica. Esempi di stadiazione nei metodi forniti dall'invenzione includono, ma non sono limitati a, aggressiva, indolente, benigna, refrattaria, stadiazione in numeri romani, stadiazione TNM, stadiazione Rai, stadiazione Binet, classificazione WHO, classificazione FAB, punteggio IPSS, punteggio WPS, stadio limitato, stadio estensivo, stadiazione basata su marcatori cellulari come ZAP-70 e CD38, compresa l'informazione che può dare indicazioni sul tempo della progressione, sulla sopravvivenza senza progressione, sulla sopravvivenza complessiva, o sulla sopravvivenza senza eventi. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico può comprendere il decorso di una condizione neoplastica o ematopoietica e/o la risposta del paziente alla terapia.

La classificazione di una cellula in base allo stato di un elemento attivabile può comprendere la classificazione di una cellula come una cellula che è correlata alla risposta di un paziente ad un trattamento. In alcune forme di realizzazione, la risposta del paziente è selezionata nel gruppo costituito da risposta completa, risposta parziale, risposta parziale nodulare, nessuna risposta, malattia progressiva, malattia stabile e reazione avversa.

La classificazione di una cellula in base allo stato di un elemento attivabile può comprendere la classificazione della cellula come una cellula che è correlata con malattia minima residua o con l'insorgenza di resistenza .

La classificazione di una cellula in base allo stato di un elemento attivabile può comprendere la scelta di un metodo di trattamento. Esempi di metodi di trattamenti comprendono, ma non sono limitati a, chemioterapia, terapia biologica, radioterapia, trapianto di midollo osseo, trapianto di cellule staminali periferiche, trapianto di sangue del cordone ombelicale, trapianto di cellule staminali autologhe, trapianto di cellule staminali allogeniche, trapianto di cellule staminali singeniche, chirurgia, terapia di induzione, terapia di mantenimento, vigile attesa, e terapia alternativa/olistica.

I modulatori possono essere un attivatore, un inibitore o un composto capace di influenzare le reti di segnalamento cellulare. I modulatori possono assumere la forma di una vasta varietà di segnali e stimoli ambientali. Esempi di modulatori includono, ma non sono limitati a, fattori di crescita, citochine, molecole di adesione, farmaci, ormoni, piccole molecole, polinucleotidi, anticorpi, composti naturali, lattoni, agenti chemioterapici, immunomodulatori , carboidrati, proteasi, ioni, specie reattive dell'ossigeno, radiazioni, parametri fisici come caldo, freddo, radiazioni UV, peptidi, frammenti proteici, sia da soli sia nel contesto cellulare, cellule stesse, virus e complessi biologici e non biologici (per esempio, biglie, piastre, capsule virali, molecole che presentano 1'antigene come il complesso maggiore di istocompatibilità) .

In alcune forme di realizzazione il modulatore è un attivatore. In alcune forme di realizzazione il modulatore è un inibitore. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce i metodi per classificare una cellula mettendo a contatto la cellula con un inibitore, per determinare la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella cellula e per classificare la cellula in base alla presenza o assenza dell'aumento di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, una cellula è classificata sulla base del livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili dopo che la cellula è stata sottoposta ad un inibitore. In alcune forme di realizzazione, 1'inibitore è un inibitore di un fattore cellulare o di una pluralità di fattori che fanno parte di una cascata di segnali nella cellula. In alcune forme di realizzazione, 1'inibitore è un inibitore di chinasi o fosfatasi, esempi non limitanti dei quali comprendono adaphostin, AG 490, AG 825, AG 957, SA 1024, aloisine, aloisine A, alsterpaullone, aminogenisteina, API-2, apigenina, arctigenina, AY-22.989, BAY 61-3.606, bisindolilmaleimide IX, cheleritrina, 10 - cloridrato [4'-(N, N-Dietilammino) butil]-2-clorofenssazina, dasatinib, 2-dimetilammino-4, 5,6,7 - tetrabromo-lH-benzimidazolo, 5,7-dimetossi-3- (4-piridinilbisfosfonato) dicloridrato di chinolina, edelfosina, acido ellagico, enzastaurin, ER 27.319 maleato, erlotinib, ET180CH3, Fasudil, flavopiridolo, gefitinib, GW 5074, H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, idrossifasudil, indirubin-3'-ossima, 5-iodotubercidina, kenpaullone, KN-62, KY12420, LEM-A13, lavendustin Olomoucine A, luteolina, LY-294.002, LY294002, mallotossina, ML-9, NSC-154020, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, olomucina, ossindolo I, PD-153035, PD-98059 PD-169316, floretina florizina, piceatannolo, picropodoffilina, PKI, PP1, PP2, purvalanolo A, quercetina, R406, R788, Rapamune, rapamicina, Ro 31-8.220, Roscovitina, rottlerin, SB202190, SB203580, sirolimus, sorafenib, SL327, SP600125, staurosporina, STI-571, SU-11274, SU1498, SU4312, SU6656, 4,5,6,7-Tetrabromotriazole, TG101348, Triciribine, tirfostina AG 490, tirfostina AG 825, tirfostina AG 957, tirfostina AG 1024, tirfostina SU1498, U0126, VX-509, VX-667, VX-680, W-7, wortmannina , XL-019, XL-147, XL-184, XL-228, XL-281, XL-518, XL-647, XL-765, XL-820, XL-844, XL-880, Y-27.632, ZD -1.839, ZM-252.868, ZM-447.439, H202, siRNA, miRNA, Cantaridina, (-)-p-bromotetramisolo, microcistina LR, sodio ortovanadato, sodio pervanadato, vanadil solfato, ossodiperosso (1,10-fenantrolina)vanadato di sodio, bis(maltolato)ossovanadio (IV), sodio molibdato, sodio permolibdato, tartrato di sodio, imidazolo, sodio fluoruro, β-glicerofosfato, sodio pirofosfato decaidrato, caliculina A, Discodermia calyx, bpV (phen), mpV(pic), DMHV, cipermetrina, Dephostatin, acido okadaico, NIPP-1, N-(9,10-Diosso-9,10-diidro-fenantren-2-il) -2,2-dimetilpropionamide, a-Bromo-4-idrossiacetofenone, Bromo 4-idrossifenacile, a-Bromo-4-metossiacetof enone, 4-metossifenacil Br, a-Bromo-4-(carbossimetossi)acetofenone, Bromo 4-(Carbossimetossi)fenacile, and bis(4-Trifluorometilsulfonamidofenil )-1,4-diisopropilbenzene, ossido di fenilarsina, Pirrolidinditiocarbamato e fluoruro di alluminio. In alcune forme di realizzazione 1'inibitore della fosfatasi è H2O2.

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione forniscono metodi per determinare la presenza o l'assenza di una condizione in un individuo sottoponendo una cellula di un individuo ad un modulatore e ad un inibitore, per determinare il livello di attivazione di un elemento attivabile nella cellula e per determinare la presenza o l'assenza di una condizione in base al livello di attivazione. In alcune forme di realizzazione viene misurato il livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili nella cellula. L'inibitore può essere un inibitore di quelli descritti nel presente documento. In alcune forme di realizzazione, 1'inibitore è un inibitore di fosfatasi. In alcune forme di realizzazione l'inibitore è H2O2. Il modulatore può essere uno qualsiasi dei modulatori descritti nel presente documento. In alcune forme di realizzazione, il modulatore è un modulatore del recettore delle cellule B. In alcune forme di realizzazione, il modulatore del recettore delle cellule B è un attivatore del recettore delle cellule B. Un esempio di attivatore dei recettori delle cellule B è un reticolante del complesso del recettore delle cellule B o del complesso del co-recettore delle cellule B. In alcune forme di realizzazione, il reticolante è un anticorpo o un'entità molecolare di legame. In alcune forme di realizzazione, il reticolante è un anticorpo. In alcune forme di realizzazione, 1'anticorpo è un anticorpo multivalente. In alcune forme di realizzazione, 1'anticorpo è un anticorpo monovalente, bivalente o multivalente reso più multivalente tramite fissaggio su una superficie solida o legato ad una superficie di nanoparticelle per aumentare la valenza locale dell'epitopo nel dominio di legame.

Il reticolante può essere un'entità molecolare di legame. In alcune forme di realizzazione, l'entità molecolare di legame agisce su o si lega al complesso del recettore delle cellule B attraverso i carboidrati o un epitopo del complesso. In alcune forme di realizzazione, l'entità molecolare di legame è monovalente, bivalente o multivalente reso più multivalente tramite fissaggio su una superficie solida o legato ad una superficie di nanoparticelle per aumentare la valenza locale dell'epitopo nel dominio di legame.

La reticolazione del complesso del recettore delle cellule B o del complesso del co-recettore delle cellule B può comprendere il legame di un anticorpo o di un'entità molecolare di legame alla cellula che provoca quindi la sua reticolazione mediante interazione della cellula con una superficie solida che a sua volta causa la reticolazione del complesso del BCR attraverso 1'anticorpo o l'entità molecolare di legame.

Il reticolante può essere F(ab)2, IgM, IgG, IgD, anticorpi BCR policlonali, anticorpi BCR monoclonali, elementi di legame derivati dal recettore Fc e/o una loro combinazione. L'Ig può essere derivata da una specie selezionata nel gruppo composto da topo, capra, coniglio, maiale, ratto, cavallo, mucca, squalo, pollo o lama. In alcune forme di realizzazione, il reticolante è IgM F(ab)2, anticorpi IgM policlonali, anticorpi IgM monoclonali, IgCM F(ab)2 biotinilati, anticorpi IgM policlonali biotinilati, anticorpi IgM monoclonali biotinilati e/o una loro combinazione .

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione prevedono l'uso di più di un modulatore. In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione utilizzano un attivatore del recettore delle cellule B e un inibitore delle fosfatasi. In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione utilizzano IgM F(ab)2 o IgM F(ab)2 biotinilato e H2O2.

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro l'invenzione forniscono metodi per classificare una popolazione cellulare esponendo la popolazione di cellule ad una pluralità di modulatori in colture separate e per determinare lo stato di un elemento attivabile nella popolazione cellulare. In alcune forme di realizzazione viene determinato lo stato di una pluralità di elementi attivabili nella popolazione cellulare. In alcune forme di realizzazione almeno uno dei modulatori della pluralità dei modulatori è un inibitore. Il modulatore può essere uno qualsiasi dei modulatori descritti nel presente documento. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, lo stato di un elemento attivabile è determinato dal contatto della popolazione cellulare con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, lo stato di una pluralità di elementi attivabili è determinato dal contatto della popolazione cellulare con una pluralità di elementi di legame, dove ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile .

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione forniscono metodi per classificare una popolazione di cellule mettendo a contatto la popolazione di cellule con almeno un modulatore e per determinare lo stato di un elemento attivabile nella popolazione cellulare. In alcune forme di realizzazione, viene determinato lo stato di una pluralità di elementi attivabili nella popolazione cellulare. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, lo stato di un elemento attivabile è determinato dal contatto della popolazione cellulare con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, lo stato di una pluralità di elementi attivabili è determinata dal contatto della popolazione cellulare con una pluralità di elementi di legame, dove ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile.

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione forniscono metodi per determinare un profilo fenotipico di una popolazione cellulare esponendo la popolazione cellulare a una pluralità di modulatori in colture separate, dove almeno uno dei modulatori è un inibitore, per determinare la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella popolazione cellulare in ciascuna delle distinte culture e per classificare la popolazione cellulare in base alla presenza o assenza dell'aumento di attivazione dell'elemento attivabile in ogni coltura separata. In alcune forme di realizzazione, viene determinato lo stato di una pluralità di elementi attivabili nella popolazione cellulare. In alcune forme di realizzazione, il profilo fenotipico di una popolazione cellulare viene utilizzato per classificare la popolazione, come descritto nel presente documento. In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile è determinata dal contatto della popolazione di cellule con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, lo stato di una pluralità di elementi attivabili è determinata dal contatto della popolazione cellulare con una pluralità di elementi di legame, dove ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo per classificare una cellula progenitrice o derivata dei linfociti B, come descritto nel presente documento, mediante contatto della cellula con un modulatore, per determinare la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile nella cellula e per classificare la cellula in base alla presenza o assenza dell'aumento di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile è determinata dal contatto della cellula con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, una cellula progenitrice o derivata dei linfociti B è classificata in base al livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili dopo che la cellula è stata sottoposta ad un modulatore. In alcune forme di realizzazione, la presenza o l'assenza di un aumento dei livelli di attivazione di una pluralità di elementi attivabili è determinata dal contatto della popolazione cellulare con una pluralità di elementi di legame, dove ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, la cellula progenitrice o derivata dei linfociti B è associata ad una condizione quale una condizione neoplastica o ematopoietica. Così, in alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per classificare una cellula progenitrice o derivata dei linfociti B associata ad una condizione (per esempio una condizione neoplastica o ematopoietica) mettendo a contatto la cellula con un modulatore, per determinare la presenza o l'assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili nella cellula e per classificare la cellula in base alla presenza o assenza di aumento di attivazione di uno o più elementi attivabili.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per correlare e/o classificare uno stato di attivazione di una cellula di LLC con un esito clinico in un individuo, sottoponendo le cellule di LLC dell'individuo all'azione di un modulatore, dove la cellula di LLC-B esprime il Recettore delle Cellule B (BCR), per determinare i livelli di attivazione di una pluralità di elementi attivabili e per individuare un profilo dei livelli di attivazione della pluralità di elementi attivabili al fine di determinare la presenza o l'assenza di un'alterazione del segnalamento prossimale al BCR, dove la presenza dell'alterazione è indicativo di un dato esito clinico. In alcune forme di realizzazione, i livelli di attivazione di una pluralità di elementi attivabili sono determinati dal contatto della cellula con una pluralità di elementi di legame, in cui ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile. L'esito clinico può essere un esito clinico qualsiasi descritto nel presente documento.

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione forniscono metodi per determinare lo stato tonico del segnalamento di una cellula dopo avere sottoposto la cellula all'azione di un modulatore, per determinare il livello di attivazione di un elemento attivabile che partecipa ad una via di segnalamento tonico nella cellula e per determinare lo stato di una via di segnalamento tonico nella cellula dal livello di attivazione. In alcune forme di realizzazione viene determinato lo stato di una pluralità di elementi attivabili nella popolazione cellulare. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di un elemento attivabile è determinata dal contatto della cellula con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione dell'elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili è determinata mettendo a contatto la cellula con una pluralità di elementi di legame, dove ogni elemento di legame è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile. In alcune forme di realizzazione, il segnalamento tonico è il segnalamento tonico di un recettore cellulare. In alcune forme di realizzazione, il segnalamento tonico è un segnalamento tonico del recettore delle cellule T (TCR). In alcune forme di realizzazione, il segnalamento tonico è un segnalamento tonico del BCR. In alcune forme di realizzazione, lo stato di segnalamento tonico viene utilizzato per classificare la cellula, come descritto nel presente documento.

I modelli e i profili di uno o più elementi attivabili vengono rivelati con i metodi noti nell'arte compresi quelli descritti nel presente documento. In alcune forme di realizzazione, i modelli e i profili di elementi attivabili che sono componenti cellulari di una via cellulare vengono rivelati con i metodi descritti nel presente documento. In alcune forme di realizzazione, i modelli e i profili di elementi attivabili che sono componenti cellulari di una via di segnalamento vengono rivelati con i metodi descritti nel presente documento In alcune forme di realizzazione, i modelli e i profili di elementi attivabili che sono componenti cellulari di una via di segnalamento tonico vengono rivelati con i metodi descritti nel presente documento. Ad esempio, i modelli e i profili di uno o più polipeptidi fosforilati vengono rivelati con i metodi noti in arte, tra cui quelli descritti nel presente documento.

In alcune forme di realizzazione, le cellule (per esempio le cellule normali) diverse dalle cellule associate ad una condizione (per esempio le cellule tumorali) o una combinazione di cellule sono utilizzate, per esempio, per assegnare un gruppo di rischio, per prevedere un aumento del rischio di ricaduta, per prevedere un maggior rischio di sviluppare complicanze secondarie, per scegliere la terapia per un individuo, per prevedere la risposta di un individuo ad una terapia, per determinare l'efficacia di una terapia in un individuo e/o per determinare la prognosi per un individuo. Cioè, cellule diverse dalle cellule associate ad una condizione (per esempio cellule tumorali) riflettono in realtà lo sviluppo di quella condizione. Ad esempio, nel caso di un tumore, cellule del sistema immunitario che infiltrano il tumore possono determinare l'esito della malattia. Alternativamente, una combinazione di informazioni provenienti dalla cellula tumorale e dalle cellule del sistema immunitario che stanno rispondendo alla malattia o che stanno reagendo alla malattia, può essere utilizzata per la diagnosi o la prognosi del tumore.

I metodi in vitro dell'invenzione sono applicabili a qualsiasi condizione che coinvolge l'individuo, che sia indicata o derivata, in tutto o in parte, da uno stato fisiologico alterato della cellula. Il termine "stato fisiologico" comprende funzioni meccaniche, fisiche e biochimiche in una cellula. In alcune forme di realizzazione lo stato fisiologico di una cellula è determinato misurando le caratteristiche di componenti cellulari di una via cellulare. Le vie cellulari sono ben conosciute nell'arte. In alcune forme di realizzazione la via cellulare è una via di segnalamento. Anche le vie di segnalamento sono ben note nell'arte (si veda per esempio, Hunter T., Celi 100(1): 113-27 (2000); Celi Signaling Technology, Ine., 2002 Catalogo, Pathway Diagrams pgg. 232-253). Una condizione che coinvolge, o è caratterizzata da, uno stato fisiologico alterato può essere facilmente identificata, per esempio, determinando in una cellula lo stato di uno o più elementi attivabili, come qui descritto.

In alcune forme di realizzazione, la condizione neoplastica o ematopoietica è una malattia delle cellule B o di cellule derivate dalla linea delle cellule B. Esempi di condizione neoplastica o ematopoietica delle cellule B o di cellule derivate dalla linea delle cellule B comprendono, ma non sono limitati a, leucemia linfatica cronica (LLC), leucemia della linea dei linfociti B, linfoma della linea dei linfociti B, mieloma multiplo e malattia delle plasmacellule, tra cui amiloidosi e macroglobulinemia di Waldenstrom. In alcune forme di realizzazione la condizione è la LLC. In alcune forme di realizzazione la LLC è definita da una popolazione di cellule B monoclonali che co-esprime CD5 con CD19, oppure CD5 con CD19 e CD23, oppure CD5 con CD20 e CD23 e una debole espressione di superficie delle immunoglobuline.

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione è relativa a metodi per classificare una o più cellule in un campione derivato da un individuo che ha, o si sospetta anche abbia, una certa condizione patologica. In alcune forme di realizzazione l'invenzione permette di identificare sottogruppi di detta condizione che siano rilevanti da un punto di vista prognostico e terapeutico e di predire il decorso clinico di un individuo. In alcune forme di realizzazione l'invenzione fornisce un metodo per classificare una cellula sulla base del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili presenti in una cellula proveniente da un individuo che ha, o che si sospetta che abbia, una condizione patologica. In alcune forme di realizzazione la classificazione comprende la classificazione della cellula come una cellula che è correlata con il risultato clinico. Il risultato clinico può essere la prognosi e/o diagnosi di una condizione, e/o la stadiazione o la classificazione di una condizione. In alcune forme di realizzazione la classificazione della cellula comprende la classificazione della cellula come una cellula che è correlata alla risposta di un paziente ad un trattamento. In alcune forme di realizzazione, la classificazione della cellula include la classificazione della cellula come una cellula che è correlata con la malattia minima residua o l'insorgenza di resistenza.

I metodi e composizioni dell'invenzione possono essere impiegati per esaminare e definire lo stato di qualsiasi elemento attivabile in una via cellulare o di insiemi di tali elementi attivabili. Possono essere definite (sequenzialmente o simultaneamente) distinte vie singole o multiple o possono essere esaminati (ancora una volta, sequenzialmente o simultaneamente) sottogruppi di elementi attivabili all'interno di una singola via o all'incrocio di molteplici vie.

Lo stato di attivazione di un singolo elemento attivabile è in uno stato acceso o spento. Come esempio illustrativo, e senza l'intenzione di limitarsi a qualsiasi teoria, un singolo sito fosforilabile di una proteina sarà fosforilato, e quindi sarà nello stato "acceso", o non sarà fosforilato, e quindi sarà nello stato "spento". I termini "acceso" e "spento", quando applicati ad un elemento attivabile che è parte di un componente cellulare, sono qui usati per descrivere lo stato di un elemento attivabile (per esempio fosforilato è "acceso" e non fosforilato è "spento") e non lo stato qenerale delle componenti cellulari di cui fa parte. Tipicamente, una cellula possiede una molteplicità di una particolare proteina o di altre componenti contenenti un particolare elemento attivabile, e questa molteplicità di proteine o componenti comprende comunemente alcune proteine o componenti il cui sinqolo elemento attivabile è nello stato acceso e altre proteine o componenti il cui sinqolo elemento attivabile è nello stato spento. Poiché lo stato di attivazione di oqni elemento attivabile è misurato attraverso l'uso di un elemento di leqame che riconosce uno specifico stato di attivazione, solo queqli elementi attivabili nello specifico stato di attivazione riconosciuti dall'elemento di leqame, che rappresentano alcune frazioni del numero totale deqli elementi attivabili, saranno leqati dall'elemento di leqame per qenerare un seqnale misurabile. Il seqnale misurabile corrispondente alla somma di sinqoli elementi attivabili di un particolare tipo che sono attivati in una sinqola cellula è il "livello di attivazione" per quel dato elemento attivabile in quella cellula .

I livelli di attivazione di un particolare elemento attivabile possono variare tra singole cellule così che, quando è analizzata una molteplicità di cellule, i livelli di attivazione seguono una distribuzione. La distribuzione può essere una distribuzione normale, conosciuta come una distribuzione Gaussiana, o può essere di altro tipo. Popolazioni cellulari differenti possono avere differenti distribuzioni dei livelli di attivazione, che possono quindi servire per distinguere tra loro le popolazioni.

In alcune forme di realizzazione, la classificazione delle cellule si basa sul fatto che la distribuzione dei livelli di attivazione di uno o più specifici elementi attivabili sarà differente tra differenti fenotipi. Un certo livello di attivazione, o più tipicamente un intervallo di livelli di attivazione per uno o più elementi attivabili osservati in una cellula o popolazione cellulare, è indicativa del fatto che quella cellula o popolazione cellulare appartiene ad un fenotipo caratteristico. Per classificare le cellule, oltre al livello di attivazione di elementi attivabili possono essere utilizzate anche altre misure, come i livelli cellulari (ad esempio i livelli di espressione) di biomolecole che possono non contenere elementi attivabili; ci si renderà conto che, in modo simile agli elementi attivabili, anche questi livelli seguiranno una distribuzione. Così, il livello o i livelli di attivazione di uno o più elementi attivabili in una cellula o in una popolazione cellulare, in combinazione o no con i livelli di una o più biomolecole che possono non contenere elementi attivabili, possono essere utilizzati per classificare una cellula o una popolazione cellulare in un gruppo. Una volta che è noto il livello di attivazione degli elementi attivabili nelle singole cellule, queste possono essere assegnate ad una o più classi, per esempio ad una classe che corrisponde ad un fenotipo. Una classe comprende un gruppo di cellule in cui ogni cellula ha lo stesso, o sostanzialmente lo stesso, livello di attivazione o intervallo di livelli di attivazione, di uno o più elementi attivabili intracellulari. Per esempio, se vengono analizzati i livelli di attivazione di cinque elementi attivabili intracellulari, possono essere generate classi definite che comprendono uno o più dei cinque elementi attivabili intracellulari, sulla base del livello di attivazione o di intervalli dei livelli di attivazione di ciascuno di questi cinque elementi. Resta inteso che i livelli di attivazione possono esistere come una distribuzione e che un livello di attivazione di un particolare elemento utilizzato per classificare una cellula può essere un particolare punto della distribuzione ma più tipicamente può essere una porzione della distribuzione .

Oltre ai livelli di attivazione di elementi attivabili intracellulari, per la classificazione cellulare possono essere utilizzati i livelli di espressione di biomolecole intracellulari o extracellulari, ad esempio proteine, da soli o in combinazione con gli stati di attivazione di elementi attivabili. Inoltre, per la classificazione cellulare qui descritta possono essere utilizzati elementi cellulari aggiuntivi, ad esempio biomolecole o complessi molecolari con RNA, DNA, carboidrati, metaboliti e simili, in combinazione con gli stati attivabili o con i livelli di espressione .

In alcune forme di realizzazione, per classificare una cellula possono inoltre essere utilizzate altre caratteristiche che influenzano lo stato di un componente cellulare. Esempi di ciò comprendono la traslocazione di biomolecole o variazioni nella loro velocità di turnover e la formazione e dissociazione di complessi biomolecolari. Tali complessi possono comprendere complessi multiproteici, complessi multilipidici, omo- ed eterodimeri o oligomeri e combinazioni di questi. Altre caratteristiche includono il clivaggio proteolitico, ad esempio per esposizione di una cellula ad una proteasi extracellulare, o per clivaggio proteolitico intracellulare di una biomolecola.

Per classificare una cellula possono essere utilizzati ulteriori elementi, quali il livello di espressione di marcatori extracellulari o intracellulari, antigeni nucleari, attività enzimatica, espressione e localizzazione proteica, analisi del ciclo cellulare, analisi dei cromosomi, volume cellulare e caratteristiche morfologiche come granulosità e dimensione del nucleo o altre caratteristiche distintive. Per esempio, le cellule B possono essere classificate ulteriormente sulla base sull'espressione di marcatori cellulari come CD19, CD20 o CD22.

In alternativa, classi cellulari predefinite possono essere raggruppate sulla base di caratteristiche condivise che possono comprendere l'inclusione in una o più ulteriori classi predefinite o la presenza di marcatori extracellulari o intracellulari, profili simili di espressione genica, antigeni nucleari, attività enzimatica, espressione e localizzazione proteica, analisi del ciclo cellulare, analisi dei cromosomi, volume cellulare e caratteristiche morfologiche come granulosità e dimensione del nucleo o altre caratteristiche distintive.

In alcune forme di realizzazione, lo stato fisiologico di una o più cellule è determinato attraverso l'esame e la definizione del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili in una via cellulare. In alcune forme di realizzazione, una cellula è classificata sulla base del livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili. In alcune forme di realizzazione una cellula ematopoietica è classificata sulla base del livello di attivazione di una pluralità di elementi attivabili. In alcune forme di realizzazione, i livelli di attivazione di uno o più elementi attivabili di una cellula ematopoietica sono correlati con una certa condizione. In alcune forme di realizzazione il livello di attivazione di uno o più elementi attivabili di una cellula ematopoietica sono correlati con una condizione neoplastica o ematopoietica come qui descritto.

In alcune forme di realizzazione viene determinato il livello di attivazione di uno o più elementi attivabili nelle singole cellule di un campione. I componenti cellulari che possono contenere elementi attivabili comprendono, ma non sono limitati a, proteine, carboidrati, lipidi, acidi nucleici e metaboliti. Un elemento attivabile può essere una porzione di un componente cellulare, per esempio un residuo aminoacidico in una proteina che può andare incontro a fosforilazione, o può essere il componente cellulare stesso, per esempio una proteina che è attivata da traslocazione, da variazione conformazionale (dovuta ad esempio a cambiamenti del pH o della concentrazione ionica), da clivaggio proteolitico e simili.

Dopo attivazione, si verifica una variazione nell'elemento attivabile, quale una modificazione covalente dell'elemento attivabile (ad esempio il legame di una molecola o di un gruppo all'elemento attivabile, come la fosforilazione) o una variazione coniormazionale . Tali variazioni generalmente contribuiscono a cambiamenti di particolari proprietà biologiche, biochimiche o fisiche dei componenti cellulari che contengono gli elementi attivabili. Lo stato di un componente cellulare che contiene elementi attivabili è determinato in qualche misura, anche se non necessariamente completamente, dallo stato di un particolare elemento attivabile del componente cellulare stesso. Per esempio, una proteina può avere molteplici elementi attivabili e i particolari stati di attivazione di questi elementi possono complessivamente determinare lo stato di attivazione della proteina; lo stato di un singolo elemento attivabile non è necessariamente determinante. Anche altri fattori, come il legame ad altre proteine, il pH, la concentrazione ionica, l'interazione con altri componenti cellulari e simili, possono inoltre influenzare lo stato dei componenti cellulari.

In alcune forme di realizzazione vengono determinati i livelli di attivazione di una pluralità di elementi attivabili intracellulari nelle singole cellule. In alcune forme di realizzazione, vengono determinati minimo circa 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 o più elementi attivabili intracellulari.

Gli stati di attivazione degli elementi attivabili possono derivare da addizioni chimiche o modificazioni di biomolecole e comprendere processi biochimici come glicosilazione, fosforilazione, acetilazione, metilazione, biotinilazione, glutamilazione, glicilazione, idrossilazione, isomerizzazione, prenilazione, miristilazione, lipoilazione, fosfopanteteinilazione, soliatazione, ISGilazione, nitrosilazione, palmitoilazione, SUMOlizzazione, ubiquitinazione, neddilazione, citrullinazione, deamilazione, formazione del legame disulfidico e riduzione del legame disulfidico. Altre possibili addizioni chimiche o modificazioni di biomolecole comprendono la formazione di carbonili proteici, modificazioni dirette di catene laterali proteiche, come otirosina, cloro-, nitrotirosina e ditirosina e addotti proteici derivati da reazioni con derivati di carboidrati e lipidi. Altre modificazioni possono essere non covalenti, come ad esempio il legame di un ligando o il legame di un modulatore allosterico.

Esempi di proteine che possono contenere elementi attivabili comprendono, ma non sono limitati a, chinasi, fosfatasi, molecole lipidiche di segnalamento, proteine adattatrici / di sostegno, citochine, regolatori di citochine, enzimi di ubiquitinazione, molecole di adesione, proteine del citoscheletro/contrattili, proteine G eterotrimeriche, GTPasi a piccolo peso molecolare, fattori di scambio di nucleotidi guaninici, proteine attivanti GTPasi, caspasi, proteine coinvolte nell'apoptosi, regolatori del ciclo cellulare, chaperoni molecolari, enzimi metabolici, proteine di trasporto vescicolare, idrossilasi, isomerasi, deacetilasi, metilasi, demetilasi, geni soppressori tumorali, proteasi, canali ionici, trasportatori molecolari, fattori di trascrizione/fattori che legano il DNA, regolatori della trascrizione, e regolatori della traduzione. Esempi di elementi attivabili, stati di attivazione e metodi di determinazione del livello di attivazione di elementi attivabili sono descritti nella domanda di brevetto US Numero 20060073474 dal titolo "Metodi e composizioni per la rivelazione dello stato di attivazione di proteine multiple in singole cellule" e nella domanda di brevetto US Numero 20050112700 dal titolo "Metodi e composizioni per la stratificazione del rischio".

In alcune forme di realizzazione la proteina, per esempio una proteina di segnalamento, è selezionata in un gruppo costituito da chinasi, recettori HER, recettori PDGF, recettori Kit, recettori FGF, recettori Eph, recettori Trk, recettori IGF, recettore dell'insulina, recettore Met, recettore Ret, recettori VEGF, TIE1, TIE2, FAK, Jakl, Jak2, Jak3, Tyk2, Sre, Lyn, Fyn, Lek, Fgr, Yes, Csk, Abl, Btk, ZAP-70, Syk, IRAK, cRaf, ARaf, BRAF, Mos, chinasi Lim, ILK, Tpl, ALK, recettori TGFP, recettori BMP, MEKK, ASK, MLK, DLK, PAK, Mek 1, Mek 2, MKK3/6, MKK4/7, ASK1, Cot, NIK, Bub, Myt 1, Weel, Casein-chinasi, PDK1, SGK1, SGK2, SGK3, Aktl, Akt2, Akt3, p90Rsks, chinasi p70S6, Prks, PKC, PKA, ROCK 1, ROCK 2, Auroras, CaMK, MNK, AMPK, MELK, MARK, Chkl, Chk2, LKB-1, MAPKAPK, Pimi, Pim2, Pim3, IKK, Cdk, Jnk, Erk, IKK, GSK3a, GSK3p, CLKs, PKR, chinasi PI3 classe 1, classe 2, classe 3, PIKK, mTor, SAPK/JNK1,2,3, p38, PKR, DNA-PK, ATM, ATR, fosfatasi, recettori protein-tirosina fosfatasi (RPTP), fosfatasi LAR, CD45, Non-recettori protein tirosina fosfatasi (NPRTPs), SHP, fosfatasi della chinasi MAP (MKP), fosfatasi a specificità duplice (DUSPs), fosfatasi CDC25, tirosinfosfatasi a basso peso molecolare, Eyes absent (EYA) tirosin-fosfatasi, fosfatasi Slingshot (SSH), serinfosfatasi, PP2A, PP2B, PP2C, PP1, PP5, fosfatasi dell'inositolo, PTEN, SHIPs, miotubularine (myotubularins), segnalamento lipidico, fosfoinositide chinasi, fosfolipasi, prostaglandina sintetasi, 5-lipossigenasi, sfingosina chinasi, sfingomielinasi, proteine adattatrici / di sostegno, Shc, Grb2, BLNK, LAT, adattatore delle cellule B per la chinasi PI3 (BCAP), SLAP, Dok, KSR, MyD88, Crk, CrkL, GAD, Nck, il ligando associato a Grb2 (GAB), il dominio di morte associato a Fas (FADD), TRADD, TRAF2, RIP, famiglia delle leucemie a cellule T, citochine, IL-2, IL-4, IL-8, IL-6, interferone γ, interferone a, regolatori di citochine, soppressori del segnalamento delle citochine (SOCs), enzimi di ubiquitinazione, Cbl, complesso SCF ubiquitinazione ligasi, APC/C, molecole d'adesione, integrine, molecole d'adesione simili alle immunoglobuline, selectine, caderine, catenine, chinasi d'adesione focale, pl30CAS, proteine del citoscheletro / contrattili, fodrina, actina, paxillina, miosina, proteina che lega la miosina, tubulina, eg5/KSP, CENP, proteine G eterotrimeriche , recettori β-adrenergici , recettori muscarinici, recettori dell 'adenilil-ciclasi , GTPasi a basso peso molecolare , H-Ras, K-Ras, N-Ras, Ran, Rac, Rho, Cdc42, Arfs, RABs, RHEB, fattori di scmabio del nucleotide guanina, Vav, Tiam, Sos, Dbl, PRK, TSC1,2, proteine che attivano GTPase, Ras-GAP, Arf-GAPs, Rho-GAPs, caspasi, Caspasi 2, Caspasi 3, Caspasi 6, Caspasi 7, Caspasi 8, Caspasi 9, proteine coinvolte nell 'apoptosi , PARP, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL, Bcl-w, Bcl-B, Al, Bax, Bak, Bok, Bik, Bad, Bid, Bim, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, IAP, XIAP, Smac, regolatori del ciclo cellulare, Cdk4, Cdk 6, Cdk 2, Cdkl, Cdk 7, Ciclina D, Ciclina E, Ciclina A, Ciclina B, Rb, pl6, pl4Arf, p27KIP, p21CIP, chaperoni moleculari, Hsp90s, Hsp70, Hsp27, enzimi metabolici, Carbossilasi Acetil-CoAa, ATP citrato liasi,

61 Francesco FIUSSELLO (Iscrizione Albo nr. 1099/B) sintetasi dell'ossido nitrico, proteine del trasporto vescicolare, caveoline, proteine richieste per il trasporto del complesso di selezione endosomica (ESCRT), selezione delle proteine vescicolari (Vsps), idrossilasi, prolilidrossilasi PHD-1, 2 e 3, tranferasi asparagina idrossilasi FIH, isomerasi, Pini prolil isomerasi, topoisomerasi, deacetilasi, Istone-deacetilasi, sirtuine, acetilasi, Istone-acetilasi, famiglia CBP/P300, famiglia MYST, ATF2, metilasi, DNA metil transferasi, demetilasi, Istone H3K4 demetilasi, H3K27, JHDM2A, UTX, geni soppressori tumorali, VHL, WT-1, p53, Hdm, PTEN, proteasi, ubiquitina proteasi, attivatore del plasminogeno tipo urochinasi (uPA) e sistema del recettore uPA (uPAR), catepsine, metalloproteinasi, esterasi, idrolasi, separasi, canali ionici, canali potassio, canali sodio, trasportatori molecolari, proteine della resistenza multipla ai farmaci, Glicoproteine P, trasportatori di nucleosidi, fattori di trascrizione/proteine che legano il, Ets, Elk, SMADs, Rei-A (p65-NFKB), CREB, NFAT, ATF-2, AFT, Myc, Fos, Spi, Egr-1, T-bet, HIF, FOXO, E2F, SRF, TCF, Egr-1, β-catenina, fattore di trascrizione FOXO, STATI, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, p53, WT-1, HMGA, regolatori della traduzione, pS6, 4EPB-1, proteina che lega eIF4E, regolatori della trascrizione, RNA polimerasi, fattori di inizio e fattori di elongazione. Le proteine possono avere una o più isoforme. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, una o più isoforme di una proteina sono distinte da una o più altre isoforme.

In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, i metodi descritti nel presente documento sono utilizzati per determinare il livello di attivazione di un elemento attivabile, ad esempio, in una via cellulare. Sono forniti i metodi e le composizioni per la classificazione di una cellula in base al livello di attivazione di un elemento attivabile in una via cellulare. La cellula può essere una cellula ematopoietica. Esempi di cellule ematopoietiche includono, ma non sono limitati a, cellule staminali ematopoietiche pluripotenti , cellule progenitrici o derivate della linea dei linfociti B, cellule progenitrici o derivate della linea dei linfociti T, cellule progenitrici o derivate della linea delle cellule NK, cellule progenitrici o derivate della linea dei granulociti, cellule progenitrici o derivate della linea dei monociti, cellule progenitrici o derivate della linea dei megacariociti e cellule progenitrici o derivate della linea eritroide.

In alcune forme di realizzazione, sono forniti i metodi e le composizioni per la classificazione di una cellula in base al livello di attivazione di un elemento attivabile, ad esempio in una via cellulare, per cui la classificazione comprende la classificazione di una cellula come una cellula che è correlata alla risposta di un paziente al trattamento. In alcune forme di realizzazione, la risposta del paziente è selezionata nel gruppo costituito da risposta completa, risposta parziale, risposta parziale nodulare, nessuna risposta, malattia progressiva, malattia stabile e reazione avversa.

In alcune forme di realizzazione, sono forniti i metodi e le composizioni per la classificazione di una cellula in base al livello di attivazione di un elemento attivabile, ad esempio in una via cellulare, per cui la classificazione implica il definire la cellula come correlata con la malattia residua minima o l'insorgenza di resistenza .

In alcune forme di realizzazione, sono forniti i metodi e le composizioni per la classificazione di una cellula in base al livello di attivazione di un elemento attivabile, ad esempio in una via cellulare, per cui la classificazione implica la selezione di un metodo di trattamento. Esempi di metodi di trattamenti includono, ma non sono limitati a, chemioterapia, terapia biologica, radioterapia, trapianto di midollo osseo, trapianto di cellule staminali periferiche, trapianto di sangue del cordone ombelicale, trapianto di cellule staminali autologhe, trapianto di cellule staminali allogeniche, trapianto di cellule staminali singeniche, chirurgia, terapia di induzione, terapia di mantenimento e vigile attesa.

In generale, i metodi in vitro dell'invenzione implicano la determinazione dei livelli di attivazione di un elemento attivabile in una pluralità di singole cellule in un campione.

A. Vie di segnalamento

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione sono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile in una via di segnalamento. In alcune forme di realizzazione, una cellula è classificata, come descritto nel presente documento, sulla base del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili in una o più vie di segnalamento. Le vie di segnalamento ed i loro membri sono stati ampiamente descritti. Vedi (Celi T. Hunter Gen. 7, 2000, 100 (1): 13-27). Vie di segnalamento esemplificative e loro membri sono: la via delle chinasi MAP che comprende Ras, Raf, MEK, ERK ed Elk; la via di PI3K/Akt che comprende la chinasi PI-3, PDK1, Akt e Bad; la via di NF-κΒ che comprende IKKS, IKB e NF-KB e la via di Wnt che comprende i recettori "frizzled", la beta-catenina, APC e altri cofattori e TCF (vedi Celi Signaling Technology, Ine. 2002 pagine 231-279 del Catalogo e Hunter T., supra). In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, gli elementi correlati attivabili che vengono misurati (o le proteine di segnalamento in esame) sono membri delle vie di segnalamento delle chinasi MAP, di Akt, di NF-KB, di WNT, di STAT e/o di PKC.

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione sono impiegati per determinare lo stato di una proteina di segnalamento in una via di segnalamento nota nell'arte, comprese quelle descritte nel presente documento. Tipi esemplificativi di proteine di segnalamento nell'ambito di applicazione della presente invenzione includono, ma non sono limitati a, chinasi, substrati di chinasi (i.e. substrati fosforilati), fosfatasi, substrati di fosfatasi, proteine di legame (quali 14-3-3), ligandi di recettori e recettori (recettori tirosin-chinasici della superficie cellulare e recettori nucleari). Sono state ben descritte, per esempio, chinasi e domini di legame proteico (vedi, ad esempio, Celi Signaling Technology, Ine., 2002 Catalogo "The Human Protein Kinases "e "Protein Interaction Domains " pp. 254-279).

In alcune forme di realizzazione, la proteina è selezionata dal gruppo che consiste di chinasi PI3 (p85, pllOa, pllOb, pllOd), Jakl, Jak2, SOCs, Rac, Rho, Cdc42, Ras-GAP, Vav, Tiam, Sos, Dbl, Nck, Gab, PRK, SHP1 e SHP2, SHIP1, SHIP2, sSHIP, PTEN, Shc, Grb2, PDK1, SGK, Aktl, Akt2, Akt3, TSC1,2, Rheb, mTor, 4EBP-1, chinasi p70S6, S6, LKB-1, AMPK, PFK, DokS, Rafs, Mos, Tpl2, MEK1/2, MLK3, TAK, DLK, MKK3/6, MEKK1 ,4, MLK3 , ASK1, MKK4/7, SAPK/JNK1 ,2,3, p38s, Erkl/2 , Syk, Btk, BLNK, LAT, ZAP-70, Lek, Cbl, SLP-76, PLCyl, PLCy2, FAK, pl30CAS, PAKs , LIMK1/2, Hsp90, Hsp7 0, Hsp27, istone H2B, HAT, HDACs, PKR, Rb, Cdk4, Cdk6, Cdk7 , Cdkl, Cdk2, Cdk9, Cdc25,A/B/C, Abl, E2F, FADD, TRADD, TRAF2 , RIP, Myd88, BAD, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL, IAPs, Smac, Fodrina, Actina, Sre, Lyn, Fyn, Lek, NIK, ΙκΒ, p65 (RelA), ΙΚΚα, PKA, PKCa, ΡΚΟβ, PKC0, PKCd, CAMK, Elk, AFT, Myc, Egr-1, NFAT , ATF-2, Mdm2, p53, DNA-PK, Chkl, Chk2, ATM, ATR, CrkL, GSK3a, GSK33 e FOXO.

Via delle chinasi MAP: in alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione sono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile nella via delle chinasi MAP. Senza voler essere limitati ad una qualsiasi teoria, la via delle chinasi MAP è una via di trasduzione del segnale intracellulare che accoppia risposte intracellulari al legame dei fattori di crescita con recettori della superficie cellulare. Questa via è molto complessa e include molte componenti proteiche. In molti tipi cellulari, l'attivazione di questa via promuove la divisione cellulare.

Tirosin chinasi legate a recettori come il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono attivate da ligandi extracellulari. Il legame del fattore di crescita epidermico (EGF) all'EGFR attiva l'attività tirosin chinasica del dominio citoplasmatico del recettore. L'EGFR viene fosforilato a livello di residui di tirosina. Proteine adattatrici come GRB2 contengono domini SH2 che si legano alla fosfotirosine del recettore attivato. GRB2 si lega al fattore di scambio del nucleotide guanina, SOS, per mezzo di un dominio SH3 di GRB2. Quando il complesso GRB2-SOS si associa all'EGFR fosforilato, SOS si attiva. La forma attivata di SOS promuove la rimozione del GDP da Ras. Ras può quindi legarsi al GTP e diventare attivo. Altre piccole proteine G possono essere attivate in modo simile, ma non saranno ulteriormente discusse qui. La forma attivata di Ras stimola l'attività protein chinasica della chinasi RAF, una protein chinasi selettiva per serina/treonina . La chinasi RAF fosforila e attiva MEK, un'altra serina/treonina chinasi. MEK fosforila e attiva le protein chinasi attivate da mitogeni (MAPK).

Tecnicamente, Raf, MEK e MAPK sono tutte chinasi attivate da mitogeni, come MNK. MAPK era originariamente chiamata "chinasi extracellulare regolata dal segnale" (ERK) e protein chinasi associata ai microtubuli (MAPK). Una delle prime proteine note per essere fosforilate da ERK è stata una proteina associata ai microtubuli. Sono stati scoperti ulteriori numerosi bersagli molecolari dell'attività di fosforilazione di MAPK e la proteina è stata ribattezzata "protein chinasi attivata da mitogeni" (MAPK). La serie di chinasi da RAF a MEK a MAPK è un esempio di cascata di proteine chinasi. Queste serie di chinasi prevedono la possibilità di regolazioni retroattive e di amplificazione del segnale. RAS è attivato in una vasta gamma di tumori (vedi Catalogo Celi Signaling Technology, Ine., supra. alle pagine 231-279 e T Hunter, supra. e riferimenti ivi riportati).

Via PI3K/AKT: in alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione sono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile in una via PI3K/AKT. Senza voler essere limitati a una qualsiasi teoria, il percorso PI3K/AKT svolge un ruolo nel determinare alterazioni in una vasta gamma di funzioni cellulari in risposta a segnali extracellulari. Un effettore a valle di PI3K è la serina/treonina chinasi Akt che, in risposta all'attivazione di PI3K, fosforila e regola l'attività di un certo numero di bersagli molecolari tra cui chinasi, fattori di trascrizione e altre molecole regolatrici. La serina/treonina chinasi Akt funziona a livello intracellulare come un punto nodale per una costellazione di vie di segnalamento che convergono a monte (fra cui la stimolazione di recettori tirosin chinasi quali IGF-1R, HER2/neu, VEGF-R, PDGF-R), per l'assemblaggio dei complessi recettore-PI3K localizzati a livello di membrana e per l'attivazione stessa di Akt attraverso il secondo messaggero PIP3. L'integrazione di questi segnali intracellulari a livello di Akt e la sua attività chinasica regola la fosforilazione di diversi suoi effettori a valle, come NF-κΒ, mTOR, Forkhead, Bad, GSK-3 e MDM-2. Questi eventi di fosforilazione a loro volta mediano gli effetti di Akt sulla crescita cellulare, la proliferazione, la protezione da stimoli pro-apoptotici, e la stimolazione della neoangiogenesi. Akt e i suoi regolatori a monte sono deregolati in una vasta gamma di tumori solidi e neoplasie ematologiche. La via Akt è la via centrale che regola la sopravvivenza cellulare attivata da eventi oncogenici quali la sovraespressione della tirosina chinasi di un recettore a monte, come EGFR (ibid), o la perdita di una proteina regolatrice a monte, come PTEN (ibid).

Via di NF-κΒ: in alcune forme di realizzazione i metodi in vitro dell'invenzione vengono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile nella via di NF-κΒ. Senza l'intenzione di limitarsi a qualsiasi teoria, la via di NF-κΒ è coinvolta nella regolazione di molti aspetti dell'attività cellulare, nello stress, nel danno cellulare ed in particolare nelle vie della risposta immune. Alcuni esempi sono la risposta a e l'induzione di IL-2, l'induzione di TAPI e delle molecole MHC da parte di NF-κΒ e molti aspetti della riposta infiammatoria, per esempio l'induzione di IL-1 (alfa e beta), di TNF-alpha e delle molecole di adesione leucocitaria (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1). Inoltre, NF-KB è coinvolto in molti aspetti della crescita cellulare, della differenziazione e della proliferazione attraverso l'induzione di alcuni fattori di crescita e trascrizionali (per esempio c-myc, ras e p-53). La via di trasduzione del segnale mediata da NF-κΒ è alterata in una serie di neoplasie umane, in particolare in quelle di origine linfoide. E' noto che diverse cellule tumorali umane di origine linfoide hanno mutazioni o amplificazioni di geni che codificano per fattori di trascrizione di NF-KB. In molte cellule tumorali NF-KB è costitutivamente attivo e risiede nel nucleo. In alcuni casi, ciò può essere dovuto alla stimolazione cronica della via di IKK mentre in altri casi il gene che codifica per IKBa può essere deficitario. L'attività continua di NF-KB nel nucleo non solo preserva le cellule neoplastiche dall'apoptosi, ma può anche aumentarne la crescita. Lo studio di agenti anti-tumorali in grado di bloccare l'attività di NF-κΒ O di aumentare la loro sensibilità ad agenti chemioterapici convenzionali può avere un grande valore terapeutico.

Via di WNT: in alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione vengono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile della via di WNT. Senza l'intenzione di limitarsi a qualsiasi teoria, la via di trasduzione del segnale di Wnt definisce una complessa rete di proteine, la maggior parte ben conosciute per i loro ruoli nell'embriogenesi e nel cancro ma anche nei normali processi fisiologici degli animali adulti. La via canonica di Wnt definisce una serie di eventi che accadono quando le proteine Wnt si legano ai recettori di superficie della famiglia Frizzled, permettendo ai recettori di attivare le proteine della famiglia Dishevelled il che risulta infine in un cambiamento della quantità di β-catenina che raggiunge il nucleo. Dishevelled (DSH) è un componente chiave del complesso recettoriale di Wnt associato alla membrana il quale, una volta attivato dal legame di Wnt, inibisce un secondo complesso di proteine che include axin, GSK-3 e la proteina APC . Il complesso axin/GSK-3/APC normalmente promuove la degradazione proteolitica della molecola di segnalamento intracellulare β-catenina. Dopo che "il complesso di distruzione della β-catenina" viene inibito, un insieme di molecole di β-catenine si stabilizzano e alcune β-catenine sono in grado di entrare nel nucleo e interagire con i fattori di trascrizione della famiglia TCF/LEF per promuovere l'espressione di geni specifici.

Via di PKC: in alcune forme di realizzazione i metodi in vitro dell'invenzione vengono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile della via di PKC. Senza l'intenzione di limitarsi a qualsiasi teoria, la via di PKC è associata alla proliferazione cellulare, alla differenziazione e all'apoptosi. Sono stati descritti almeno undici isozimi PKC strettamente correlati, che differiscono per struttura, proprietà biochimiche, distribuzione tissutale, localizzazione subcellulare e specificità di substrato. Essi sono classificati come isoenzimi convenzionali (α, βΐ, β2, γ), nuovi (δ, ε, η, θ, μ), e atipici (ζ, λ). Gli isoenzimi PKC convenzionali sono dipendenti da Ca<2+>, mentre gli isoenzimi nuovi e atipici non richiedono Ca<2+>per la loro attivazione. Tutti gli isoenzimi PKC, ad eccezione di ζ e À, vengono attivati dal diacilglicerolo (DAG). Gi isoenzimi PKC regolano positivamente o negativamente i passaggi critici del ciclo cellulare compresa l'entrata e l'uscita dal ciclo ed i punti di controllo Gl e G2. L'alterazione dell'attività di PKC è stata associata a vari tipi di tumori. Livelli più alti di PKC e l'attivazione differenziale dei vari isoenzimi è stata riportata nei tumori della mammella, nell'adenoma ipofisario, nel carcinoma della tiroide, in cellule leucemiche e nel tumore del polmone. L'iporegolazione di PKCa viene descritta nella maggior parte degli adenocarcinomi del colon e nelle fasi precoci della carcinogenesi intestinale. Per questo, gli inibitori di PKC sono diventati importanti strumenti nel trattamento del cancro. Il coinvolgimento di PKC nella regolazione dell'apoptosi aggiunge un'altra dimensione allo sforzo teso a sviluppare farmaci che hanno come bersaglio specifico PKC. Si pensa che l'attivazione della via PKC giochi un ruolo anche in patologie cardiovascolari e nel diabete.

In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, i metodi descritti qui di seguito vengono impiegati per determinare lo stato di un elemento attivabile in una via del segnalamento. Sono forniti i metodi e le composizioni per la classificazione di una cellula sulla base dello stato di un elemento attivabile nella via del segnalamento. La cellula può essere una cellula emopoietica.

In alcune forme di realizzazione, sono forniti i metodi e le composizioni per classificare una cellula sulla base dello stato di un elemento attivabile in una via del segnalamento, dove la classificazione consiste nel classificare una cellula come una cellula che è correlata alla risposta di un paziente al trattamento. In alcune forme di realizzazione, la risposta del paziente viene selezionata nel gruppo che comprende risposta completa, risposta parziale, risposta nodulare parziale, nessuna risposta, malattia in progressione, malattia stabile e reazione avversa.

In alcune forme di realizzazione, sono forniti dall'invenzione i metodi e le composizioni per classificare una cellula a seconda dello stato di un elemento attivabile nella via di segnalamento, per cui la classificazione consiste nel classificare la cellula come una cellula che è correlata con la malattia minima residua o l'insorgenza di resistenza .

In alcune forme di realizzazione, sono forniti i metodi e le composizioni per la classificazione di una cellula sulla base dello stato di un elemento attivabile nella via di segnalamento, dove la classificazione consiste nel selezionare un metodo di trattamento. Esempi di metodi di trattamento sono, sebbene non limitati a questi, la chemioterapia, la terapia biologica, la terapia radiante, il trapianto di midollo, il trapianto di cellule staminali periferiche, il trapianto di sangue cordonale, il trapianto autologo di cellule staminali, il trapianto allogenico di cellule staminali, il trapianto singenico di cellule staminali, la terapia chirurgica, la terapia di induzione, la terapia di mantenimento, la vigile attesa e la terapia olistica/alternativa .

L'invenzione non è limitata alle vie del segnalamento e alle proteine di trasduzione del segnale finora illustrate e comprende vie di segnalamento e proteine descritte di seguito.

B. Via del Recettore della Cellula B

In alcune forme di realizzazione, i metodi e le composizioni dell'invenzione possono essere impiegati per esaminare e definire il profilo dello stato di qualsiasi elemento attivabile della via di segnalamento del Recettore delle Cellule B o di insiemi di questi elementi attivabili in una cellula progenitrice o derivata della linea dei linfociti B. In alcune forme di realizzazione, lo stato fisiologico di una o più cellule progenitrici o derivate della linea dei linfociti B viene definito dall'esame e dalla determinazione del profilo dello stato di uno o più elementi attivabili nella via di segnalamento del BCR. In alcune forme di realizzazione, una cellula progenitrice o derivata della linea dei linfociti B è classificata, come descritto nel presente documento, sulla base del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili nel segnalamento di BCR. Esempi di cellule derivate dalla linea B linfocitaria comprendono, ma non sono limitati a, cellule pro-B precoci, cellule pro-B tardive, cellule grandi pre-B, cellule piccole pre-B, cellule B immature, cellule B mature, plasmacellule, cellule B memoria, cellule B CD5+ e cellule B che esprimono ZAP-70. In alcune forme di realizzazione, una cellula progenitrice o derivata della linea dei linfociti B è una cellula associata ad una condizione, come descritto nel presente documento. In alcune forme di realizzazione, lo stato di uno o più elementi attivabili è combinato con uno o più variabili cliniche che identificano la diagnosi o la prognosi di una condizione. Le variabili cliniche possono includere, ma non sono limitate a, stato mutazionale dei geni delle catene pesanti delle immunoglobuline ed espressione di superficie di CD38 e di ZAP-70.

Senza volersi limitare ad alcuna teoria, la reticolazione del BCR attiva la fosforilazione di residui di tirosina all'interno dei domini ITAM di Iga e IgP attraverso tirosin chinasi della famiglia Sre (per esempio Lyn, Lek, Blk, Fyn). Le sequenze ITAM fosforilate di IgaP reclutano ed aumentano la fosforilazione di Syk (direttamente) e di Btk (attraverso Syk). La reticolazione del BCR raggruppa inoltre numerose molecule regolatrici e adattatrici (per esempio SLP-65/BLNK, Grb2, CD22, SHP-1) e compartimentalizza il BCR con i corecettori CD19 e CD21 all'interno di zattere lipidiche. Successivamente all'attivazione di Syk e Btk, gli enzimi fosfolipasi-Cy2 (PLCy2) e PI3K propagano il segnalamento del BCR. L'attivazione di PLCy2 genera un flusso di calcio, inositolo-1,4,5-trifosfato e diacilglicerolo e risulta nell'attivazione della protein Kinasi C e NF-|B. Syk interagisce con PLCy2 attraverso molecole adattatrici mentre Btk può interagire direttamente, ciascuno dei due è necessario per l'attività di PLCy2 dopo la reticolazione del BCR. Sia Syk sia Btk possono attivare PI3K dopo la reticolazione del BCR. L'attivazione di PI3K promuove la via di segnalamento della sopravvivenza cellulare mediata da Akt, PI3K è inoltre necessaria per la sopravvivenza mediata dal BCR durante lo sviluppo delle cellule B. PLCy2 e PI3K iniziano inoltre la cascata chinasica che porta alla fosforilazione delle proteine ERK1/2 e p38 della famiglia MAPK. L'attivazione della cascata del segnalamento di Ras-Raf-ERKl/2 è considerato un evento centrale nel segnalamento del BCR e la diminuita attivazione di Ras dovuta alla perdita di RasGRPl e RasGRP3 riduce la proliferazione delle cellule B nei topi. Al contrario, p38 è una proteina di risposta allo stress cellulare che interagisce con p53 e regola le fasi di controllo del ciclo cellulare. L'attivazione differenziale di ERK1/2 e p38 può permettere al BCR di svolgere diverse funzioni cellulari, ma la questione è se una data cellula B attivi queste due vie in modo simultaneo o se favorisca una via a seconda di addizionali contesti di segnalamento.

Un'efficiente attivazione del segnalamento di BCR dipende dalla generazione di H2O2 e dall'inattivazione di protein tirosin fosfatasi con funzione di regolazione negativa (PTP). Dopo la reticolazione del BCR, il reclutamento e l'attivazione di proteine ossidasi calciodipendenti (NOX), come N0X5, favoriscono la produzione di H2O2e abbassano la soglia di segnalamento del BCR. L/H2O2indotta dal BCR inattiva transitoriamente le PTP prossimali alla membrana, inclusa SHP-1, attraverso l'ossidazione reversibile della cisteina catalitica in acido sulfenico. Un elegante lavoro che ha ricostituito la via di segnalamento del BCR in cellule di insetto ha suggerito l'esistenza di un modello ciclico di regolazione redox retroattiva in cui H2O2inattiva PTP e permette l'amplificazione di eventi precoci del segnalamento, come la fosforilazione di Syk e il legame ad ITAM. Un recente lavoro ha individuato ΙΉ2Ο2prodotta in via endogena come la specie redox primaria generata dal segnalamento del BCR ed ha indicato che la produzione di H2O2dipendente da NOX è fondamentale per avviare la cascata del segnalamento del BCR in cellule B di topi A20.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo per classificare una cellula progenitrice o derivata della linea dei linfociti B dopo trattamento con un modulatore e/o inibitore. Esempi di cellule progenitrici della linea dei linfociti B includono, ma non sono limitati a, una cellula pro-B precoce, una cellula pro-B tardiva, una cellula pre-B grande, una cellula pre-B piccola, una cellula B immatura, una cellula B matura, una plasmacellula e una cellula B memoria, o una cellula B CD5+, o una cellula B che esprime ZAP-70.

In alcune forme di realizzazione, la classificazione consiste nel classificare la cellula sulla base dello stato di un elemento attivabile nella via del BCR come una cellula che è correlata con l'andamento clinico. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per classificare una cellula progenitrice o derivata della linea dei linfociti B sulla base di un'alterazione nel segnalamento prossimale del BCR. In alcune forme di realizzazione, l'andamento clinico è la prognosi e/o la diagnosi di una condizione. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è la presenza o l'assenza di una condizione neoplastica o ematopoietica, come la leucemia linfatica cronica (LLC), leucemie della linea dei linfociti B, linfomi della linea dei linfociti B, mieloma multiplo o malattie delle plasmacellule come per esempio l'amiloidosi o la macroglobulinemia di Waldenstrom. In alcune forme di realizzazione, la condizione è la LLC. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per classificare una cellula di LLC sulla base dell'alterazione del segnalamento prossimale del BCR. La presenza dell'alterazione è indicativa dell'andamento clinico. La LLC consiste in una popolazione di cellule B monoclonali che co-esprimono CD5 e CD19, CD5, CD19 e CD23 o CD5, CD20 e CD23 e ridotta espressione delle immunoglobuline di superficie.

In alcune forme di realizzazione dei metodi in vitro dell'invenzione, la classificazione delle cellule progenitrici o derivate della linea dei linfociti B basata sul livello di attivazione di un elemento attivabile nella via del BCR comprende la classificazione della cellula come una cellula che è correlata alla risposta di un paziente al trattamento, come risposta completa, risposta parziale, risposta parziale nodulare, nessuna risposta, malattia in progressione, malattia stabile, ricaduta o reazione avversa. Il metodo può inoltre comprendere la determinazione di un metodo di trattamento, per esempio chemioterapia, terapia biologica, terapia radiante, trapianto di midollo, trapianto di cellule staminali periferiche, trapianto di cellule cordonali, trapianto autologo di cellule staminali, trapianto allogenico di cellule staminali, trapianto singenico di cellule staminali, chirurgia, terapia di induzione, terapia di mantenimento, la vigile attesa o la terapia olistica/alternativa .

In alcune forme di realizzazione dei metodi in vitro dell'invenzione, la classificazione delle cellule progenitrici o derivate della linea dei linfociti B basata sul livello di attivazione di un elemento attivabile nella via del BCR comprende la classificazione della cellula come una cellula che è correlate con la malattia minima residua o l'insorgenza di resistenza.

Elemento di legame

In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il livello di attivazione di un elemento attivabile è determinato dal contatto di una cellula con un elemento di legame che è specifico per uno stato di attivazione di un elemento attivabile. Il termine "elemento di legame" comprende qualunque molecola, per esempio un peptide, un polipeptide (incluso un anticorpo), un acido nucleico, una piccola molecola organica, che sia capace di rivelare uno stato di attivazione di un elemento attivabile rispetto ad un altro stato di attivazione dell'elemento attivabile. Si veda U.S.S.N 12/229,976.

In alcune forme di realizzazione, l'elemento di legame è un peptide, un polipeptide, un oligopeptide o una proteina. Il peptide, il polipeptide, 1'oligopeptide o la proteina possono essere costituiti da amminoacidi presenti in natura e legami peptidici o da strutture sintetiche peptidomimetiche . Così i termini "amminoacido" o "residuo peptidico", sono utilizzati nel presente documento per indicare amminoacidi sia presenti in natura sia sintetizzati chimicamente. Per esempio, per gli scopi dell'invenzione omo-fenilalanina, citrullina e norleucina sono considerati amminoacidi. Le catene laterali possono essere nella configurazione (R) o nella configurazione (S).

In alcune forme di realizzazione, gli amminoacidi sono nella configurazione (S) o L. Se vengono utilizzate catene laterali non presenti in natura, possono essere utilizzati sostituenti non amminoacidici per impedire o ritardare, per esempio, la degradazione in vivo. Le proteine che comprendono amminoacidi non presenti in natura possono essere sintetizzate o, in alcuni casi, essere prodotte per ricombinazione; si veda van Hest et al., FEBS Lett 428:(1-2) 68-70 22 maggio 1998 and Tang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218: U138 Parte 222 agosto 1999.

I metodi della presente invenzione possono essere usati per rivelare qualsiasi particolare elemento attivabile in un campione purché sia rivelabile e distinguibile da un punto di vista antigenico da un altro elemento attivabile presente nel campione. Per esempio, come dimostrato (vedi, per esempio gli Esempi) e descritto nel presente documento, gli anticorpi specifici per lo stato di attivazione della presente invenzione possono essere utilizzati nei metodi qui descritti per identificare cascate di segnalamento distintive di un sottogruppo o di una sottopopolazione nell'ambito di popolazioni cellulari complesse; e per identificare l'ordine di attivazione proteica (per esempio attivazione di chinasi) in gerarchie potenziali di segnalamento. Quindi, in alcune forme di realizzazione, l'espressione e la fosforilazione di uno o più polipeptidi vengono rivelate e quantificate utilizzando i metodi della presente invenzione. In alcune forme di realizzazione, utilizzando i metodi della presente invenzione è possibile rivelare e quantificare l'espressione e la fosforilazione di uno o più polipeptidi che sono componenti cellulari di una via cellulare. Il termine "anticorpo specifico per stato di attivazione" o "anticorpo di stato di attivazione" o altri termini equivalenti si riferiscono ad un anticorpo che si lega specificamente ad un antigene specifico corrispondente. Preferibilmente, 1'antigene specifico e corrispondente é una specifica forma di un elemento attivabile. Inoltre, preferibilmente, il legame di un anticorpo specifico per lo stato di attivazione è indicativo di uno specifico stato di attivazione di uno specifico elemento attivabile.

In alcune forme di realizzazione, l'elemento attivabile è un anticorpo. In alcune forme di realizzazione, l'elemento di legame è un anticorpo specifico per stato di attivazione. In alcune forme di realizzazione, l'elemento di legame è un anticorpo fosfospecifico.

Mentre gli anticorpi specifici per lo stato di attivazione possono essere utilizzati per rivelare l'attività chinasica, nella presente invenzione vengono forniti mezzi addizionali per determinare l'attivazione chinasica. Per esempio, substrati che sono riconosciuti specificamente da proteine chinasiche ed in tal modo individuabili nella forma fosforilata. Per determinare la presenza di chinasi attivate in un campione, possono essere utilizzati anticorpi che legano specificamente tali substrati fosforilati ma non si legano a substrati non fosforilati (anticorpi anti-fosfosubstrati).

Sono stati prodotti molti anticorpi, molti dei quali sono commercialmente disponibili (per esempio, si veda Celi Signaling Technology, www.cellsignal.com, Millipore, eBioscience, Caltag, Santa Cruz Biotech, Abcam, BD Biosciences, Sigma and Anaspec) che si legano specificamente ad una isoforma fosforilata di una proteina ma non alla sua isoforma non fosforilata. Molti di questi anticorpi sono stati prodotti per lo studio di proteine di trasduzione del segnale che vengono fosforilate reversibilmente. In particolare, sono stati prodotti molti di questi anticorpi che legano specificamente le isoforme fosforilate, attivate, di una proteina.

Nella presente invenzione possono inoltre essere usati anticorpi per lo stato di non attivazione. In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi per lo stato di nonattivazione si legano ad epitopi presenti in un elemento sia nelle forme attivate che non attivate. Tali anticorpi possono inoltre essere usati per determinare la quantità dell'elemento attivato insieme a quello non attivato in un campione. In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi per lo stato non attivato si legano ad epitopi presenti nelle forme non attivate di un elemento ma assenti nelle forme attivate di un elemento. Tali anticorpi possono essere usati per determinare la quantità di un elemento non attivato in un campione. Entrambi i tipi di anticorpi per lo stato di non attivazione possono essere usati per determinare se una variazione nella quantità dello stato di attivazione dell'elemento, per esempio in campioni prima e dopo il trattamento con un possibile agente bioattivo come descritto nel presente documento, coincide con variazioni nella quantità dello stato di non attivazione dell'elemento. Per esempio, tali anticorpi possono essere usati per determinare se un aumento dell'elemento attivato è dovuto all'attivazione dello stato non attivato dell'elemento o è dovuto ad una aumentata espressione dell'elemento o ad entrambi gli eventi.

A. Marcature

I metodi e le composizioni della presente invenzione forniscono elementi di legami che comprendono marcatori o marcatori terminali. Per marcatore si intende una molecola che si può rivelare direttamente (cioè marcatore primario) o indirettamente (cioè marcatore secondario); per esempio, un marcatore può essere visualizzato e/o misurato o identificato in modo che la sua presenza o assenza possa essere nota. Un composto può essere coniugato direttamente o indirettamente ad un marcatore che fornisce un segnale rivelabile, per esempio, radioisotopi, molecole fluorescenti, enzimi, anticorpi, particelle quali particelle magnetiche, molecole chemoluminescenti, molecole di legame specifico, ecc. Le molecole di legame specifico comprendono coppie molecolari quali biotina e streptavidina, digossina e antidigossina ecc. Esempi di marcatore comprendono, ma non sono limitati a, fluorescenti ottici e coloranti cromogenici tra cui enzimi e radioisotopi .

In alcune forme di realizzazione, uno o più elementi di legame sono marcati in modo univoco. Usando l'esempio di anticorpi specifici per due stati di attivazione, per "marcato in modo univoco" si intende che 1'anticorpo del primo stato di attivazione che riconosce un primo stato di attivazione contiene un primo marcatore, ed un anticorpo del secondo stato di attivazione che riconosce un secondo elemento attivato contiene un secondo marcatore, laddove il primo ed il secondo marcatore sono rivelabili e distinguibili, il che rende il primo ed il secondo anticorpo marcati in modo univoco.

In genere si distinguono quattro classi di marcatori: a) marcatori isotopici, che possono essere isotopi radioattivi o isotipi pesanti; b) marcatori magnetici, elettrici, termici; c) marcatori colorati, ottici, che includono coloranti luminescenti, fosforici e fluorescenti o loro parti; d) partner di legame. I marcatori possono anche includere enzimi (per esempio la perossidasi di rafano, ecc.) e particelle magnetiche. In alcune forme di realizzazione, il marcatore è un marcatore primario. Un marcatore primario è un marcatore che può essere rivelato direttamente, come un fluoroforo.

I marcatori includono marcatori ottici come coloranti fluorescenti o loro parti. I fluorofori possono essere "piccole molecole" fluorescenti, o proteinacei fluorescenti (per esempio proteine a fluorescenza verde e tutte le varianti di queste).

Marcatori fluorescenti adatti per gli scopi della presente invenzione comprendono, ma non sono limitati a, fluoresceina, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarina, pirene, verde di Malacite, stilbene, Lucifer Yellow, Cascade Blue™, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 e verde Oregon. I coloranti ottici adatti sono descritti in: Molecular Probes Handbook del 1996 di Richard P. Haugland. Coloranti fluorescenti adatti per gli scopi della presente invenzione comprendono inoltre, ma non sono limitati a, proteine a fluorescenza verde (GFP; Chalfie, et al., Science 263(5148):802-805 (11 Feb. 1994); ed EGFP; Clontech--Genbank Accession Number U55762), proteine a fluorescenza blu (BFP; 1. Quantum Biotechnologies, Ine.

1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal (Quebec) Canada H3H 1J9; 2. Stauber, R. H. Biotechniques 24 (3):462-471 (1998); 3. Heim, R. and Tsien, R. Y. Curr. Biol. 6:178-182 (1996)), proteine ad aumentata fluorescenza gialla (EYFP; 1. Clontech Laboratories, Ine., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, Calif. 94303), luciferasi (Ichiki, et al., J. Immunol. 150(12):5408-5417 (1993)), beta-galattosidasi (Nolan, et al., Proc Nati Acad Sci USA 85 (8):2603-2607 (Aprile 1988)) e Renilla WO 92/15673; WO 95/07463; WO 98/14605; WO 98/26277; WO 99/49019; brevetto U.S. No. 5,292,658; brevetto U.S. No. 5,418,155; brevetto U.S. No. 5,683,888; brevetto U.S. No. 5,741,668; brevetto U.S. No. 5,777,079; brevetto U.S. No. 5,804,387; brevetto U.S. No. 5,874,304; brevetto U.S. No. 5,876,995; e brevetto U.S. No. 5,925,558).

In alcune forme di realizzazione, i marcatori per l'uso nella presente invenzione includono: coloranti Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes) (Eugene, Oreg.) FITC, Rodamina, e Texas Red (Pierce Rockford, 111.), Cy5, Cy5.5, Cy7 (M ersham Life Science, Pittsburgh, Pa.). I protocolli per la coniugazione di molecole tandem di Cy5PE, Cy5.5PE, Cy7PE, Cy5.5APC e Cy7APC sono noti nell'arte. Si può misurare la quantità di sonda fluorescente coniugata per determinare il livello di marcatura ed i protocolli contenenti le proprietà spettrali del colorante sono ben noti nell'arte.

In alcune forme di realizzazione, il colorante fluorescente è una GFP e, più preferibilmente, una Renilla, un Ptilosarcus o una specie Aequorea di GFP.

In alcune forme di realizzazione, viene usato un marcatore secondario. Un marcatore secondario è un marcatore che viene rivelato indirettamente; per esempio, un marcatore secondario può legare o reagire con un marcatore primario per la rivelazione, può agire su un prodotto addizionale per generare una marcatura primaria (per esempio enzimi), ecc. I marcatori secondari includono, ma non sono limitati a, un partner di una coppia di legame, parti di molecole modificabili chimicamente, inibitori di nucleasi, enzimi come la perossidasi di rafano, la fosfatasi alcalina, la luciferasi, ecc.

In alcune forme di realizzazione, il marcatore secondario è una coppia di legame. Per esempio, il marcatore può essere un aptene o un antigene che si legherà al suo partner di legame. Per esempio, coppie di legame adatte comprendono, ma non sono limitate a: antigeni (come ad esempio proteine (compresi peptidi) e piccole molecole) ed anticorpi (compresi frammenti di questi (FAbs, ecc.)); proteine e piccole molecole, fra cui biotina/streptavidina; enzimi e substrati o inibitori; altre coppie che interagiscono con legami proteina-proteina; recettoriligandi; e carboidrati e loro partner di legame. Sono adatte per gli scopi dell'invenzione anche le coppie molecolari formate da acido nucleico e proteine che legano l'acido nucleico. Coppie di legame comprendono inoltre, ma non sono limitate a, biotina (o imino-biotina) e streptavidina, digossigenina ed Abs, e reagenti ProlinxTM .

In alcune forme di realizzazione, la coppia di legame comprende un antigene ed un anticorpo che si legherà specificamente all'antigene. Per "legare specificamente" si intende che i partner si legano con una specificità sufficiente a discriminare tra la coppia e altri componenti o contaminanti del sistema. Il legame dovrebbe essere sufficiente a rimanere stabile alle condizioni del saggio, che implicano fasi di lavaggio per rimuovere il legame non specifico. In alcune forme di realizzazione, le costanti di dissociazione della coppia saranno inferiori a circa 1CT<4>-1CT<9>M<_1>, con i valori inferiori a circa 1CT<5>-1CT<9>M<_1>preferibili ed i valori inferiori a circa 1CT<7>-1CT<9>M<_1>particolarmente preferibili.

In alcune forme di realizzazione, il marcatore secondario è una parte di una molecola modificabile chimicamente. In questa forma di realizzazione, i marcatori che comprendono gruppi reattivi funzionali sono incorporati nella molecola che deve essere marcata. Il gruppo funzionale può quindi essere marcato successivamente (per esempio prima o dopo il saggio) con un marcatore primario. Gruppi funzionali adeguati includono, ma non sono limitati a, gruppi amminici, gruppi carbossilici, gruppi maleimidici, ossi-gruppi e gruppi tiolici, dove i gruppi amminici e tiolici sono particolarmente preferibili. Per esempio, i marcatori primari che contengono gruppi amminici possono essere attaccati a marcatori secondari che contengono gruppi amminici, utilizzando per esempio agenti leganti che sono noti nell'arte; per esempio, sono ben noti gli agenti leganti omo- od etero-bifunzionali (si veda il catalogo del 1994 della Pierce Chemical Company, sezione tecnica sui reticolanti, pagine 155-200, allegato nel presente documento come referenza).

In alcune forme di realizzazione, nei metodi e nelle composizioni della presente invenzione sono utilizzati marcatori multipli fluorescenti. In alcune forme di realizzazione, ogni marcatore è distinto e distinguibile dagli altri marcatori.

Come riconosciuto nell'arte, la coniugazione marcatore-anticorpo può essere eseguita utilizzando procedure standard o usando kit di coniugazione proteinaproteina/proteina-colorante della Molecular Probes (Eugene, Oreg .).

In alcune forme di realizzazione, sono utilizzati anticorpi marcati per l'analisi funzionale di proteine attivabili nelle cellule. Nell'eseguire questo tipo di analisi vengono considerati diversi aspetti dell'esperimento: (1) l'identificazione della giusta combinazione di cocktail anticorpali per le marcature (2), l'identificazione della sequenza di procedure per la marcatura degli antigeni (cioè la proteina attivabile) ed i cloni degli anticorpi di interesse, e (3) la valutazione accurata dell'effetto delle condizioni della coltura cellulare sulla stimolazione cellulare. La selezione del clone dell 'anticorpo è di particolare importanza per gli antigeni di superficie delle cellule umane, poiché cloni differenti di anticorpi portano ad un risultato differente e non marcano in maniera simile seguendo differenti protocolli. Inoltre, la selezione dei tipi cellulari e l'ottimizzazione delle condizioni della coltura costituisce un fattore critico per rivelare differenze. Per esempio, alcune linee cellulari hanno la capacità di adattarsi alle condizioni della coltura e possono produrre risposte eterogenee .

In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi specifici per uno stato di attivazione sono marcati con "quantum dot" come illustrato da Chattopadhyay, P.K. et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nat. Med. 12, 972-977 (2006). I marcatori "quantum dot" sono disponibili commercialmente attraverso Invitrogen (Carlsbad, Calif.).

Gli anticorpi marcati con "quantum dot" possono essere utilizzati da soli o possono essere impiegati in combinazione con anticorpi organici coniugati con fluorocromi per aumentare il numero complessivo di marcatori disponibili. Con l'aumento del numero di anticorpi marcati aumenta anche la capacità di caratterizzare sottopopolazioni cellulari note. Inoltre, gli anticorpi specifici per lo stato di attivazione possono essere marcati utilizzando lantanidi chelati o ingabbiati, come illustrato da Erkki, J. et al. Lanthanide chelates as new fluorochome labels for cytochemistry. J. Histochemistry Cytochemistry, 36:1449-1451, 1988, e brevetto U.S. No.

7,018850, intitolato Salicylamide-Lanthanide Complexes for Use as Luminescent Markers. Possono inoltre essere usati altri metodi per rivelare la fluorescenza, per esempio metodi "quantum dot" (si veda per esempio Goldman et al., J. Am. Chem. Soc. (2002) 124:6378-82; Pathak et al. J. Am.

Chem. Soc. (2001) 123:4103-4; e Remade et al., Proc. Nati. Sci. USA (2000) 18:553-8), così come la microscopia confocale .

In alcune forme di realizzazione, gli elementi attivabili sono marcati con marcatori terminali adatti per lo Spettrometro di Massa a Plasma Accoppiato Induttivamente (ICP-MS), come illustrato in: Tanner et al. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 2007 Mar;62 (3):188-195. Ornatsky et al, mRNA Detection in Leukemia Celi lines by Novel Metal-Tagged in situ Hybridization using Inductively Coupled Plasma Mass Spectometry, Translational Oncogenomics (2006):1, 1-9; Ornatsky et al, Multiple Cellular Antigen Detection by ICP-MS, J. Imm. Methods 308 (2006) 68-76; and Lou et al., Polymer-Based Elemental Tags for Sensitive Bioassays, Angew. Chem. Int. Ed., (2007) 46, 6111-6114.

In alternativa, possono essere utilizzati sistemi di rivelazione basati sul FRET, discussi in dettaglio di seguito. Il FRET trova applicazione nella presente invenzione, per esempio, nel rivelare stati di attivazione che implicano il raggruppamento di molecole o la multimerizzazione nei quali la vicinanza di due marcatori FRET è alterata a causa dell'attivazione. In alcune forme di realizzazione, vengono usati almeno due marcatori fluorescenti che sono membri di una coppia di trasferimento dell'energia di fluorescenza per risonanza (FRET).

Il FRET è un fenomeno conosciuto nell'arte in base al quale l'energia di eccitazione di un colorante fluorescente viene trasferita ad un altro senza emissione di fotoni. Una coppia FRET consiste di un fluoroforo donatore ed un fluoroforo accettore. Lo spettro di emissione di fluorescenza del donatore e lo spettro di assorbimento di fluorescenza dell 'accettore devono sovrapporsi e le due molecole devono essere in stretta vicinanza. La distanza tra donatore ed accettore alla quale il 50% dei donatori sono deattivati (energia di trasferimento all'accettore ) è definita dal raggio di Forster (Ro), che è tipicamente 10-100 A. Le variazioni dello spettro di emissione di fluorescenza delle coppie FRET possono essere misurate ed indicano variazioni del numero delle coppie FRET che sono in stretta vicinanza. Tipicamente ciò dipenderà dal legame o dalla dissociazione delle due molecole, una delle quali è marcata con un FRET donatore e l'altra marcata con un FRET accettore, dove il legame tra le molecole porta la coppia FRET in stretta vicinanza. Il legame di queste molecole risulterà in una aumentata emissione di fluorescenza dell 'accettore e/o nello spegnimento dell'emissione di fluorescenza del donatore.

Le coppie FRET (donatore/accettore) utili per gli scopi dell'invenzione comprendono, ma non sono limitate a, EDANS/ fluoresceina, IAEDANS/fluoresceina, fluoresceina/ tetrametilrodamina, fluoresceina/LC Red 640, fluoresceina/ Cy 5, fluoresceina/Cy 5.5 e fluoresceina/LC Red 705.

In alcune forme di realizzazione che utilizzano il FRET, possono essere impiegate una molecola donatrice fluorescente ed una molecola accettrice non fluorescente ("quencher"). In questa applicazione, l'emissione di fluorescenza del donatore aumenterà quando il quencher verrà allontanato dal donatore e l'emissione di fluorescenza diminuirà quando il quencher verrà portato in stretta prossimità del donatore. Molecole quencher adatte all'invenzione comprendono, ma non sono limitati a, TAMRA, DABCYL, QSY 7 e QSY 33. Coppie fluorescenti donatore/ accettore adatte comprendono, ma non sono limitati a, EDANS/DABCYL, Texas Red/DABCYL, BODIPY/DABCYL, Lucifer Yellow/DABCYL, cumarina/DABCYL e fluoresceina/colorante QSY 7.

L'esperto del settore noterà che il FRET e lo spegnimento della fluorescenza permettono di monitorare nel tempo il legame delle molecole marcate, fornendo un'informazione continua sulla cinetica delle reazioni di legame.

I cambiamenti nel grado di FRET vengono determinati preferibilmente come funzione del cambiamento del rapporto della quantità di fluorescenza del donatore e dell'accettore, un processo definito come "ratioing." Alla lunghezza d'onda di eccitazione, le variazioni della quantità assoluta di substrato, dell'intensità di eccitazione e della torbidità o di altre assorbanze di fondo nel campione influenzano le intensità di fluorescenza sia del donatore sia dell'accettore approssimativamente in parallelo. Quindi, il rapporto delle due intensità di emissione è una misura più robusta e preferibile rispetto alla sola intensità.

Il sistema raziometrico di espressione della fluorescenza descritto nel presente documento ha notevoli vantaggi rispetto ai sistemi esistenti per l'analisi di integrazione delle proteine, poiché consente una rivelazione sensibile e l'isolamento di singole cellule vitali che esprimono o non esprimono la proteina in esame. In alcune forme di realizzazione, il sistema di saggio utilizza un substrato fluorescente non tossico, non polare che viene facilmente caricato e dopo intrappolato all'interno della cellula. La modificazione del substrato fluorescente da parte di un peptide affine porta ad uno spostamento dell'emissione di fluorescenza mentre il substrato viene convertito in prodotto. Poiché il risultato è espresso in modo raziometrico, questo è unico tra i saggi proteici per il fatto che controlla variabili come ad esempio la quantità di substrato caricato nelle singole cellule. La lettura intracellulare stabile, facilmente rivelabile, elimina la necessità di allestire linee cellulari clonali prima dell'analisi di espressione. Questo ed altri sistemi analoghi di selezione in flusso possono essere utilizzati per isolare cellule che presentano un particolare raggruppamento di elementi recettoriali e/o un particolare profilo di attivazione da milioni di cellule vitali .

I metodi e la composizione della presente invenzione possono inoltre utilizzare enzimi marcati. Per enzima marcato si intende un enzima che può essere reattivo in presenza di un substrato dell'enzima stesso che produce un prodotto rivelabile. Enzimi marcati adeguati per gli scopi della presente invenzione comprendono, ma non sono limitati a, perossidasi di rafano, fosfatasi alcalina e glucosioossidasi. Metodi per l'uso di tali substrati sono ben noti nell'arte. La presenza dell'enzima marcato è generalmente rivelata attraverso la catalisi enzimatica di una reazione con un substrato dell'enzima marcato, che produce un prodotto identificabile. Tali prodotti possono essere opachi, come ad esempio la reazione della perossidasi di rafano con la tetrametilbenzidina, e possono avere una varietà di colori. Sono stati sviluppati altri substrati dell'enzima marcato, come il Luminolo (disponibile dalla Pierce Chemical Co.), che producono prodotti di reazione fluorescenti. Metodi per l'identificazione di enzimi marcati con substrati di enzimi marcati sono ben noti nell'arte e sono disponibili molti kit commerciali. Esempi e metodi per l'utilizzo di diversi enzimi marcati sono descritti in Savage et al., Previews 247:6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24:227-236 (1989).

Per radioisotopo si intende qualunque molecola radioattiva. Radioisotopi idonei per gli scopi dell'invenzione comprendono, ma non sono limitati a,<14>C,<3>H,<32>P, 33P,<35>S,<125>I, e<131>I. L'utilizzo di radioisotopi come marcatori è ben noto nell'arte.

Come già menzionato, i marcatori possono essere rivelati indirettamente, cioè il marcatore terminale può essere un partner di una coppia di legame. Per "partner di una coppia di legame" si intende una parte di una prima parte o di una seconda parte della coppia, dove la prima e la seconda parte hanno una specifica affinità di legame l'una per l'altra. Coppie di legame adatte agli scopi dell'invenzione comprendono, ma non sono limitate a, antigeni/anticorpi (per esempio, digossigenina/antidigossigenina, dinitrofenile (DNP)/anti-DNP, dansile/antidansile, fluoresceina/anti-f luoresceina, Lucifer Yellow/ anti-Lucifer Yellow, rodamina/anti-rodamina), biotina/ avidina (o biotina/streptavidina) e proteina che lega la calmodulina (CBP)/calmodulina. Altre coppie di legame adatte comprendono polipeptidi come ad esempio il peptide FLAG [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; il peptide epitopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; il peptide epitopo tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; ed il marcatore terminale del peptide della proteina 10 del gene T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)] e gli anticorpi relativi a ciascuno di loro. Come sarà noto agli esperti nel settore, partner di coppie di legame possono essere utilizzati in altre applicazioni diverse dalla marcatura, come descritto nel presente documento.

Come sarà noto agli esperti del settore, un partner di una coppia di legame può essere anche un partner in un'altra coppia di legame. Per esempio, un antigene (prima parte) può legare un primo anticorpo (seconda parte) che può, a sua volta, essere un antigene per un secondo anticorpo (terza parte). Ci si renderà conto inoltre che una tale circostanza permette il legame indiretto di una prima frazione con una terza frazione attraverso una seconda frazione intermedia che è partner della coppia di legame per entrambi.

Come sarà noto agli esperti del settore, un partner di una coppia di legame può comprendere un marcatore, come descritto sopra. Ci si renderà conto inoltre che questo consente ad un marcatore terminale di essere marcato indirettamente dal legame con un partner di legame che contiene a sua volta un marcatore. L'attacco di un marcatore ad marcatore terminale che è il partner di una coppia di legame, come appena descritto, è qui riferito come "marcatura indiretta".

Per "molecola di legame per un substrato di superficie" o "marcatura terminale di attacco" e loro locuzioni di significato equivalente, si intende una molecola con un'affinità di legame per uno specifico substrato di superficie, il quale substrato è generalmente un membro di una coppia di legame, applicata, incorporata o altrimenti attaccata alla superficie. Molecole di legame per substrati di superficie idonee e loro substrati di superficie comprendono, ma non sono limitati a, il marcatore terminale di poli-istidina (poly-his) o poliistidina-glicina (poly-his-gly) e il substrato di Nichel; il marcatore terminale Glutatione-S Transferasi ed il suo substrato anticorpale (disponibile da Pierce Chemical); il marcatore terminale polipeptidico flu HA ed il suo substrato anticorpale 12CA5 [Field et al., Mol. Celi. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; il marcatore terminale c-myc e i substrati anticorpali relativi 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; il marcatore terminale glicoproteina D (gD) del virus Herpes Simplex ed il suo substrato anticorpale [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. In generale, le molecole di legame per substrati di superficie utili agli scopi della presente invenzione comprendono, ma non sono limitati a, strutture di poliistidina (His-tags) che legano substrati di nichel, antigeni che legano substrati di superficie contenenti anticorpi, apteni che legano substrati di avidina (per esempio la biotina) e CBP che legano substrati di superficie contenenti la calmodulina.

La produzione di substrati che incorporano anticorpi è ben nota; si veda Slinkin et al., Bioconj. Chem., 2:342-348 (1991); Torchilin et al., supra; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3:323-327 (1992); King et al., Cancer Res.

54:6176-6185 (1994); e Wilbur et al., Bioconjugate Chem.

5:220-235 (1994), e l'attacco o la produzione di proteine con antigeni è descritta sopra. I substrati che incorporano la calmodulina sono commercialmente disponibili, e la produzione di proteine con CBP è descritta in Simcox et al., Strategies 8:40-43 (1995).

Come sarà noto agli esperti del settore, le combinazioni dei marcatori terminali con i componenti dell'invenzione possono essere prodotte in differenti modi, che dipendono in larga misura dalla forma del marcatore terminale. I componenti dell'invenzione ed i marcatori terminali sono preferibilmente uniti da un legame covalente .

Di seguito è descritta la produzione di polipeptidi combinati con marcatori terminali mediante metodi di ricombinazione genica, quando il marcatore è un polipeptide. La produzione di proteine marcate terminalmente è ben nota nell'arte e sono disponibili commercialmente kit per tale produzione (per esempio, da Kodak e Sigma) . Esempi di proteine marcate terminalmente includono, ma non sono limitati a, polipeptide Flag e polipeptide His. Metodi per la produzione e l'uso di proteine marcate terminalmente si trovano, ad esempio, in Winston et al., Genes and Devel. 13:270-283 (1999), così come anche nei manuali dei prodotti, forniti insieme ai kit sopracitati .

La biotinilazione di molecole e substrati bersaglio è ben nota, per esempio, sono noti numerosi agenti biotinilanti , compresi agenti reattivi amminici e tiolici, agenti per la biotinilazione delle proteine, degli acidi nucleici, dei carboidrati, degli acidi carbossilici ; si veda capitolo 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996. Un substrato biotinilato può essere attaccato ad un componente biotinilato attraverso l'avidina o la streptavidina . In modo simile, sono noti anche numerosi reagenti di aptenilazione (Id.) .

I metodi per la marcatura di proteine con radioisotopi sono noti nell'arte. Ad esempio, tali metodi si trovano in Ohta et al., Molec. Celi 3:535-541 (1999).

È ben nota la produzione di proteine aventi marcatori terminali di origine ricombinante e in commercio sono disponibili kit per la produzione di tali proteine. Esempi di questi kit e dei loro usi sono descritti nel manuale QIAexpress Handbook di Qiagen di Joanne Crowe et al..

La funzionalizzazione della marcatura con gruppi chimici reattivi come tioli, ammine, carbossili, ecc. è generalmente nota nell'arte. In alcune forme di realizzazione, il marcatore terminale è funzionalizzato per facilitare il legame covalente. L'attacco covalente del marcatore terminale può essere sia diretta sia tramite un agente legante. In una forma di realizzazione, l'agente legante è una parte relativamente corta, usata per unire le molecole. Questa parte accoppiante può essere sintetizzata direttamente in un componente dell'invenzione e contiene almeno un gruppo funzionale per facilitare il legame del marcatore terminale. In alternativa, la parte accoppiante può avere almeno due gruppi funzionali che, per esempio, possono usati per unire un componente funzionalizzato a un marcatore terminale funzionalizzato. In un'altra forma di realizzazione, l'agente legante è un polimero. In questa forma di realizzazione, l'unione covalente del componente o del marcatore terminale al polimero viene fatta direttamente o attraverso l'uso di parti accoppianti. In alcune forme di realizzazione, l'unione covalente è diretta, cioè non viene utilizzato nessun agente legante. In questa forma di realizzazione, il componente contiene preferibilmente un gruppo funzionale, come ad esempio un acido carbossilico, che è utilizzato per l'attacco diretto al marcatore terminale funzionalizzato. È chiaro che il componente e il marcatore terminale possono essere uniti in vari modi, tra cui quelli elencati sopra. In alcune forme di realizzazione, il marcatore terminale è unito al gruppo amminoterminale o carbossiterminale del polipeptide. Come sarà noto agli esperti del settore, la descrizione di cui sopra dell'unione covalente di un marcatore si riferisce virtualmente all'unione di due molecole qualsiasi della presente trattazione.

Come sottolineato sopra, in alcune forme di realizzazione, il marcatore terminale è funzionalizzato per facilitare l'unione covalente. Sono quindi disponibili in commercio un'ampia varietà di marcatori terminali che contengono gruppi funzionali, tra cui, ma non solo, gruppi isotiocianati, gruppi amminici, gruppi aioacetici, maleimidi, esteri di succinimidile e sulfonil alogenuri, ognuno dei quali può essere utilizzato per unire covalentemente il marcatore terminale a una seconda molecola, come fin qui descritto. La scelta del gruppo funzionale del marcatore terminale dipenderà dal sito di attacco ad un agente legante, come sopra evidenziato, o ad un componente dell'invenzione. Così, per esempio, per il legame diretto ad un gruppo carbossilico di una proteina sarà utilizzato un marcatore terminale modificato con un gruppo amminico o con un gruppo idrazina per formare un legame mediante chimica carbodiimidica, usando per esempio l-etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimide (EDAC), come noto nell'arte (vedi Set 9 e Set 11 del Molecular Probes Catalog, supra; vedi anche il Pierce 1994 Catalog and Handbook, da pagina T-155 a T-200). In una forma di realizzazione, il carbodiimide viene prima unito al marcatore terminale, molti marcatori terminali descritti nel presente documento sono disponibili commercialmente in questa forma.

Indicatori alternativi dello stato di attivazione Un indicatore alternativo dello stato di attivazione utile per la presente invenzione permette la rivelazione dell'attivazione indicando il risultato di tale attivazione. Per esempio, la fosforilazione di un substrato può essere usata per rivelare l'attivazione della chinasi responsabile della fosforilazione di quel substrato. In modo simile, il clivaggio di un substrato può essere utilizzato come indicatore dell'attivazione di una proteasi responsabile di tale clivaggio. Nell'arte sono ben noti i metodi che permettono l'associazione di queste indicazioni con segnali rivelabili, come i marcatori e i marcatori terminali sopra descritti in relazione agli elementi di legame. Per esempio, il clivaggio di un substrato può causare la rimozione di una parte capace di spegnere un segnale, permettendo così a un segnale rivelabile di essere generato dal marcatore che prima era spento.

Modulatori

In alcune forme di realizzazione, i metodi e la composizione dell'invenzione utilizzano un modulatore. Un modulatore può essere un attivatore, un inibitore o un composto capace di influenzare una via cellulare. I modulatori possono prendere la forma di input e stimoli ambientali .

La modulazione può essere eseguita in un varietà di ambienti. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono esposte all'azione di un modulatore immediatamente dopo la raccolta. In alcune forme di realizzazione, in cui è prevista una popolazione eterogenea di cellule, la purificazione delle cellule è eseguita dopo la modulazione. In alcune forme di realizzazione, il modulatore è aggiunto al sangue intero. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono modulate dopo che sono state processate per ottenerne una sospensione di singole cellule o frazioni purificate di singole cellule. Come esempio illustrativo, il sangue può essere raccolto e processato per ottenere una frazione arricchita in linfociti che è poi esposta al modulatore. La modulazione può includere l'esposizione delle cellule a più di un modulatore. Ad esempio, in alcune forme di realizzazione, le cellule sono esposte almeno a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 modulatori.

In alcune forme di realizzazione, dopo la raccolta le cellule sono coltivate in un mezzo idoneo prima dell'esposizione a un modulatore. In alcune forme di realizzazione, il mezzo è un mezzo di crescita. In alcune forme di realizzazione, il mezzo di crescita è un mezzo complesso che può contenere siero. In alcune forme di realizzazione, il mezzo di crescita contiene siero. In alcune forme di realizzazione, il siero è selezionato nel gruppo costituito da siero bovino fetale, siero bovino, siero umano, siero porcino, siero equino e siero di capra. In alcune forme di realizzazione, la percentuale di siero è compresa tra 0,0001% e 30%. In alcune forme di realizzazione, il mezzo di crescita è un mezzo minimo definito chimicamente ed è senza siero. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono coltivate in un mezzo di differenziazione .

I modulatori comprendono entità chimiche e biologiche e stimoli fisici o ambientali. I modulatori possono agire a livello extracellulare o intracellulare. I modulatori chimici e biologici comprendono fattori di crescita, citochine, neurotrasmettitori, molecole di adesione, ormoni, piccole molecole, composti inorganici, polinucleotidi, anticorpi, composti naturali, lectine, lattoni, agenti chemioterapici, modificatori della risposta biologica, carboidrati, proteasi e radicali liberi. I modulatori comprendono composti complessi e composizioni biologiche indefinite che possono comprendere estratti cellulari o botanici, secrezioni cellulari o ghiandolari, fluidi fisiologici come siero, fluido amniotico o veleno. Gli stimoli fisici e ambientali comprendono radiazioni elettromagnetiche, ultraviolette, infrarosse o particellari, potenziale redox e pH, presenza o assenza di nutrienti, cambiamenti di temperatura, cambiamenti della pressione parziale di ossigeno, cambiamenti nella concentrazione di ioni e applicazione di stress ossidativo. I modulatori possono essere endogeni o esogeni e possono produrre differenti effetti in base alla concentrazione e durata dell'esposizione delle singole cellule o se sono utilizzati in combinazione, o sequenzialmente, con altri modulatori. I modulatori possono agire direttamente su elementi attivabili o indirettamente attraverso l'interazione con una o più biomolecole intermediarie. La modulazione indiretta comprende alterazioni dell'espressione genica in cui il prodotto dell'espressione genica è l'elemento attivabile o è un modulatore dell'elemento attivabile.

In alcune forme di realizzazione, il modulatore è selezionato nel gruppo che comprende fattori di crescita, citochine, modulatori di molecole di adesione, farmaci, ormoni, piccole molecole, polinucleotidi, anticorpi, composti naturali, lattoni, agenti chemioterapici, immunomodulatori, carboidrati, proteasi, ioni, specie reattive dell'ossigeno, peptidi e frammenti di proteine, da soli o nel contesto cellulare, le stesse cellule, virus e complessi biologici e non biologici (per esempio biglie, piastre, capsule virali, molecole presentati 1'antigene come il complesso maggiore di istocompatibilità). In alcune forme di realizzazione, il modulatore è uno stimolo fisico come il caldo, il freddo, i raggi UV e le radiazioni.

In alcune forme di realizzazione, il modulatore è un attivatore. In alcune forme di realizzazione, il modulatore è un inibitore. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono esposte a uno o più modulatori. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono esposte ad almeno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 modulatori. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono esposte ad almeno due modulatori, di cui un modulatore è un attivatore e un modulatore e un inibitore. In alcune forme di realizzazione, le cellule sono esposte ad almeno 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 9, o 10 modulatori, di cui almeno uno è un inibitore.

In alcune forme di realizzazione, il modulatore è un modulatore del recettore delle cellule B. In alcune forme di realizzazione, il modulatore del recettore delle cellule B è un attivatore del recettore delle cellule B. Un esempio di attivatore del recettore delle cellule B è un ligando del complesso del recettore delle cellule B o del complesso del co-recettore delle cellule B. In alcune forme di realizzazione, il ligando è un anticorpo o un entità molecolare di legame. In alcune forme di realizzazione, il ligando è un anticorpo. In alcune forme di realizzazione, 1'anticorpo è un anticorpo multivalente. In alcune forme di realizzazione, 1'anticorpo è un anticorpo monovalente, bivalente o multivalente reso multivalente mediante il legame a una superficie solida o alla superficie di nanoparticelle per incrementare la valenza locale del dominio che lega l'epitopo.

In alcune forme di realizzazione, il ligando è una entità molecolare di legame. In alcune forme di realizzazione, l'entità molecolare di legame agisce su o lega il complesso del recettore delle cellule B attraverso i carboidrati o un epitopo presente nel complesso. In alcune forme di realizzazione, l'entità molecolare di legame è monovalente, bivalente o multivalente o è resa multivalente mediante il legame ad una superficie solida o ad una superficie di nanoparticelle per incrementare la valenza locale del dominio che lega l'epitopo.

In alcune forme di realizzazione, la reticolazione del complesso del recettore delle cellule B o del complesso del co-recettore delle cellule B implica il legame di un anticorpo o di un entità molecolare di legame alle cellule causando quindi la sua reticolazione mediante interazione della cellula con un superficie solida che causa la reticolazione del complesso del BCR attraverso 1'anticorpo o l'entità molecolare di legame.

In alcune forme di realizzazione, il ligando che induce la reticolazione è F(ab)2 IgM, IgG, IgD, anticorpi BCR policlonali, anticorpi BCR monoclonali, elementi di legame derivati dal recettore Fc e/o una combinazione di questi. Le Ig possono derivare dalle specie selezionate nel gruppo che comprende topo, capra, coniglio, maiale, ratto, cavallo, mucca, squalo, pollo o lama. In alcune forme di realizzazione, il ligando che induce la reticolazione è F(ab)2 IgM, anticorpi IgM policlonali, anticorpi IgM monoclonali, F(ab)2 IgM biotinilati, anticorpi IgM policlonali biotinilati, anticorpi IgM monoclonali biotinilati e/o una loro combinazione.

In alcune forme di realizzazione, 1'inibitore è un inibitore di un fattore cellulare o di una pluralità di fattori che partecipano ad una via cellulare (ossia, una cascata di segnalamento) . In alcune forme di realizzazione, 1'inibitore è un inibitore di fosfatasi. Esempi di inibitori di fosfatasi comprendono, ma non sono limitati a, H202, siRNA, miRNA, Cantaridina, (-)-p-Bromo tetramisolo, Microcistina LR, Sodio Ortovanadato, Sodio Pervanadato, Vanadil solfato, Sodio ossodiperosso (1,10-fenantrolina) vanadato, bis (maltolato)ossovanadio (IV), Sodio Molibdato, Sodio Perm olibdato, Tartrato di Sodio, Imidazolo, Sodio Fluoride, β-Glicerophosfato, Sodio Pirofosfato Decaidrato, Caliculina A, Discodermia calyx, bpV (phen), mpV(pic), DMHV, Cipermetrina, Defostatina, Acido Okadaico, NIPP-1, N- (9,10-Diosso-9,10-diidro-fenantren-2-il) -2,2-dimetil-propionamide, a-Bromo-4-idrossiacetof enone, Bromo 4-Idrossif enacile, a-Bromo-4-metossiacetof enone, Bromo 4-Metossif enacile, a-Bromo-4- (carbossimetossi ) acetofenone, Bromo 4- (Carbossimetossi )fenacile, e bis (4-Trif luorometilsulfonamidof enil)-1, 4-diisopropilbenzene, Ossido di fenilarsina, Pirrolidina Ditiocarbamato, e Fluoruro di Alluminio. In alcune forme di realizzazione, 1'inibitore delle fosfatasi è H2O2.

In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di un elemento attivabile in una cellula è determinato mettendo la cellula a contatto con almeno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 modulatori. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di un elemento attivabile in una cellula è determinato mettendo la cellula a contatto con almeno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 modulatori dove almeno uno dei modulatori è un inibitore. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di un elemento attivabile in una cellula è determinato mettendo la cellula a contatto con un inibitore e un modulatore, dove il modulatore può essere un inibitore o un attivatore. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di un elemento attivabile in una cellula è determinato mettendo la cellula a contatto con un inibitore e un attivatore. In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di un elemento attivabile in una cellula è determinato mettendo la cellula a contatto con due o più modulatori.

In alcune forme di realizzazione, un profilo fenotipico di una popolazione di cellule è determinata misurando il livello di attivazione di un elemento attivabile quando la popolazione di cellule è esposta a una pluralità di modulatori in colture separate. Per esempio una popolazione di cellule può essere esposta a uno o più modulatori contemporaneamente o sequenzialmente. In alcune forme di realizzazione, il profilo fenotipico della popolazione di cellule è utilizzato per classificare la popolazione come descritto nel presente documento.

Rivelazione

Mettendo in pratica i metodi di questa invenzione, la rivelazione dello stato di uno o più elementi attivabili può essere condotta da una persona come un tecnico di laboratorio. In alternativa, la rivelazione dello stato di uno o più elementi attivabili può essere condotta utilizzando un sistema automatizzato. In entrambi i casi la rivelazione dello stato di uno o più elementi attivabili per gli usi previsti dai metodi di questa invenzione, viene condotta seguendo le tecniche standard e protocolli consolidati nell'arte.

Uno o più elementi attivabili possono essere rivelati e/o quantificati con qualsiasi metodo che può rivelare e/o quantificare la presenza dell'elemento attivabile d'interesse. Questi metodi possono comprendere un saggio radioimmunologico (RIA) oppure un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), 1'immunoistochimica, 1'istochimica immunofluorescente con o senza microscopia confocale, saggi a fase inversa, immunosaggi enzimatici omogenei e tecniche non enzimatiche relative, Western blot, colorazione dell'intera cellula, microscopia immunoelettronica, amplificazione degli acidi nucleici, array genici, array proteici, spettrometria di massa, "patch clamp", elettroforesi su gel bidimensionale, elettroforesi su gel a visualizzazione differenziale, saggi proteici multiplex basati su microsfere, saggi cellulari senza marcatori e citometria a flusso, ecc. Il brevetto U.S. No. 4,568,649 descrive sistemi di rivelazioni di ligandi che impiegano la scintillazione. Queste tecniche sono particolarmente utili per parametri proteici modificati. Le letture cellulari per proteine e altri determinanti cellulari possono essere ottenuti utilizzando molecole marcate con fluorescenza o altro. I metodi di citometria a flusso sono utili per misurare i parametri intracellulari .

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione fornisce i metodi per la determinazione di un profilo d'attivazione di un elemento attivabile per una singola cellula. I metodi possono comprendere l'analisi delle cellule in citometria a flusso in base al livello di attivazione di almeno due elementi attivabili. Per analizzare le cellule in base al livello di attivazione dell'elemento attivabile vengono utilizzati elementi di legame (per esempio anticorpi specifici dello stato di attivazione) e la rivelazione può essere fatta come riportato di seguito. In alternativa, possono essere utilizzati sistemi di elementi non leganti, come riportato sopra, in uno qualsiasi dei sistemi descritti nel presente documento.

Quando nei metodi e nelle composizioni della presente invenzione, si utilizzano componenti marcati con fluorescenza, si può riconoscere che, per gli scopi previsti dall'invenzione, possono essere utilizzati tipi differenti di sistemi di monitoraggio della fluorescenza, per esempio apparati per misure citometriche. In alcune forme di realizzazione, vengono utilizzati sistemi di citometria o sistemi dedicati a screening ad alto rendimento, per esempio piastre per microtitolazione a 96 o più pozzetti. I metodi per i saggi condotti con materiali fluorescenti sono ben noti nell'arte e sono descritti, per esempio, in Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Parte B, Methods in Celi Biology, voi. 30, ed. Taylor, D. L. & Wang, Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), pp. 219-243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Ine. (1978), pp. 296-361.

La fluorescenza in un campione può essere misurata utilizzando un fluorimetro. In generale, la radiazione di eccitazione emessa da una sorgente d'eccitazione con una data lunghezza d'onda, passa attraverso ottiche di eccitazione. Mediante le ottiche di eccitazione la radiazione di eccitazione eccita il campione. Come risposta, le proteine fluorescenti nel campione emettono una radiazione che ha una lunghezza d'onda differente dalla lunghezza d'onda d'eccitazione. Le ottiche di raccolta quindi raccolgono la radiazione emessa dal campione. L'apparato può includere un dispositivo di controllo della temperatura per mantenere il campione ad una specifica temperatura mentre viene esaminato. In una forma di realizzazione dell'invenzione, una struttura a traslazione multiassiale muove la piastra da microtitolazione contenente numerosi campioni per permettere l'esposizione dei pozzetti in differenti posizioni. La struttura a traslazione multiassiale, il dispositivo di controllo della temperatura, la configurazione di messa a fuoco automatica e le elettroniche associate con la raccolta di immagini e di dati può essere gestita da un computer digitale appropriatamente programmato. Il computer può inoltre trasformare i dati raccolti durante il saggio in un formato per la presentazione. In generale, possono essere utilizzati i sistemi e i componenti di robotica noti.

Possono essere utilizzati anche altri sistemi per il rivelamento della fluorescenza, per esempio metodi "Quantum dot" (si veda , e.g., Goldman et al., J. Am. Chem. Soc. (2002) 124:6378-82; Pathak et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123:4103-4; e Remade et al., Proc. Nati. Sci. USA (2000) 18:553-8), così come la microscopia confocale. In generale, la citometria a flusso implica il passaggio di singole cellule attraverso il cammino del raggio di un laser. La diffusione del raggio e l'eccitazione di qualunque molecola fluorescente che è stata attaccata o che si trova all'interno della cellula è rivelata da tubi fotomoltiplicatori che creano un parametro leggibile, per esempio la dimensione, la granulosità o l'intensità di fluorescenza .

Le fasi di rivelamento, separazione o isolamento presenti nei metodi di questa invenzione possono comprendere tecniche di separazione di cellule attivate dalla fluorescenza (FACS), dove il FACS è utilizzato per selezionare, dalla popolazione cellulare, cellule che contengono un particolare marcatore di superficie, in alternativa la fase di selezione può comportare l'uso di particelle magnetiche come supporti per il recupero delle cellule desiderate e/o la rimozione di cellule non desiderate .

In alcune forme di realizzazione, viene utilizzato un separatore cellulare FACS (per esempio un FACSVantageTM Celi Sorter, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Calif.) per separare e raccogliere le cellule, in base al loro profilo di attivazione (cellule positive), in presenza o assenza di una variazione del livello di attivazione di un elemento attivabile in risposta a un modulatore. In alcune forme di realizzazione, la variazione è una riduzione. In alcune forme di realizzazione la variazione è un aumento.

In alcune forme di realizzazione, le cellule vengono prima messe in contatto con elementi di legame specifici dello stato di attivazione (per esempio anticorpi), marcati mediante fluorescenza e diretti verso uno specifico stato di attivazione di uno specifico elemento attivabile. In questa forma di realizzazione, la quantità di elementi di legami legati a ciascuna cellula può essere misurata facendo passare goccioline contenenti le cellule attraverso il separatore di cellule. Le cellule possono essere separate dalle altre cellule impartendo una carica elettromagnetica alle goccioline contenenti le cellule positive. Le cellule selezionate positivamente possono poi essere raccolte in contenitori sterili. Queste procedure di separazione di cellule sono descritte in dettaglio, per esempio nel FACSVantageTM. Training Manual, con particolare riferimento alle sezioni da 3-11 a 3-28 e da 10-1 a 10-17.

In un'altra forma di realizzazione, le cellule positive possono essere separate usando la separazione magnetica delle cellule sulla base della presenza di una isoforma di un elemento attivabile. In tali tecniche di separazione, per poter essere selezionate positivamente le cellule sono prima messe in contatto con un specifico elemento di legame (per esempio un anticorpo o un reagente che lega una specifica isoforma di un elemento attivabile). Le cellule sono poi messe in contatto con particelle recuperabili (per esempio particelle magnetiche) che sono accoppiate con un reagente che lega lo specifico elemento. Il complesso particella-elemento che lega la cellula può poi essere fisicamente separato da cellule non positive o non marcate utilizzando, per esempio, un campo magnetico. Quando si usano particelle magnetiche le cellule positive o marcate possono essere recuperate in un contenitore utilizzando un campo magnetico, mentre le cellule negative vengono eliminate. Queste e simili procedure di separazione sono descritte, per esempio, nel manuale pratico Baxter Immunotherapy Isolex.

In alcune forme di realizzazione, sono forniti i metodi per la determinazione del profilo dello stato di attivazione di un elemento recettoriale per una singola cellula. I metodi comprendono la dotazione di una popolazione di cellule e l'analisi della popolazione di cellule tramite citometria a flusso. In preferenza, le cellule sono analizzate sulla base del livello di attivazione di almeno due elementi attivabili. In alcune forme di realizzazione, viene utilizzata una molteplicità di anticorpi per lo stato di attivazione di elementi attivabili per determinare simultaneamente il livello di attivazione di una molteplicità di elementi.

In alcune forme di realizzazione, l'analisi cellulare tramite citometria a flusso basata sul livello di attivazione di almeno due elementi è combinata con la determinazione di altri risultati leggibili mediante citometria a flusso, come la presenza di marcatori di superficie, la granulosità e la dimensione cellulare, al fine di fornire una correlazione tra il livello di attivazione di una molteplicità di elementi e altre caratteristiche cellulari misurabili tramite citometria a flusso in singola cellula.

Come si valuterà, la presente invenzione prevede di mettere in ordine gli eventi di raggruppamento di elementi durante la trasduzione del segnale. In particolare, la presente invenzione permette all'operatore di ricostruire un raggruppamento di elementi e una gerarchia di attivazione sulla base della correlazione dei livelli di raggruppamento e attivazione di una molteplicità di elementi all'interno delle singole cellule. La realizzazione dell'ordinamento della sequenza di prevede il confronto del livello di attivazione di una cellula o di una popolazione cellulare con un controllo in un singolo punto temporale, oppure il confronto del livello di attivazione di una cellula o di una popolazione cellulare in multipli punti temporali per osservare l'emergere di una sottopopolazione rispetto alle altre.

La presente invenzione fornisce un metodo valutabile per determinare la presenza di sottogruppi cellulari all'interno delle popolazioni cellulari. Idealmente, le vie di trasduzione del segnale sono esaminate in popolazioni cellulari omogenee per assicurare che variazioni nel segnalamento tra cellule non mascherino né qualitativamente né quantitativamente gli eventi di trasduzione del segnale e altre alterazioni relative. Poiché il sistema omogeneo ultimo è la singola cellula, la presente invenzione permette la valutazione individuale di cellule per permettere di identificare le reali differenze in maniera significativa.

Quindi, l'invenzione fornisce metodi per distinguere un sottogruppo cellulare all'interno di una popolazione cellulare più vasta. Come evidenziato nel presente documento, questi sottogruppi cellulari spesso mostrano caratteristiche biologiche alterate (per esempio i livelli di attivazione, una risposta alterata ai modulatori) rispetto agli altri sottogruppi all'interno della popolazione. Per esempio, come evidenziato nel presente documento, i metodi in vitro dell'invenzione permettono l'identificazione di sottogruppi di cellule in una popolazione cellulare come le popolazioni cellulari primarie, per esempio cellule mononucleari di sangue periferico che mostrano risposte alterate (per esempio risposte associate alla presenza di una condizione) se comparate con altri sottogruppi. Inoltre, questo tipo di valutazione distingue tra differenti stati d'attivazione, tra risposte alterate ai modulatori, tra linee differenziative cellulari, tra stati di differenziamento cellulare, ecc.

Come si potrà notare, questi metodi sono relativi all'identificazione di distinte cascate di segnalamento a seguito di condizioni sia artificiali sia stimolatorie, in popolazioni cellulari complesse, come cellule mononucleate di sangue periferico, o linfociti nàive e memoria.

Quando necessario, le cellule sono disperse in una sospensione di singole cellule (per esempio tramite digestione enzimatica con idonee proteasi, collagenasi, dispasi e simili). Per la dispersione o sospensione viene utilizzata una soluzione appropriata. Tale soluzione sarà generalmente una soluzione salina bilanciata, per esempio salina normale, PBS, soluzione salina bilanciata di Hank, ecc., opportunamente integrata con siero bovino fetale o altri fattori presenti in natura insieme ad una soluzione tampone a bassa concentrazione, generalmente 5-25 mM. I tamponi opportuni includono HEPES, tamponi fosfato, tamponi lattato, ecc. Le cellule possono essere fissate, per esempio con paraiormaldeide al 3%, e solitamente permeabilizzate, per esempio con metanolo freddo; PBS tamponato con HEPES contenente 0.1% saponina, 3% BSA; ricoperte per 2 minuti in acetone a -200 °C; e trattate secondo procedure simili note nell'arte e in base ai metodi descritti nel presente documento.

In alcune forme di realizzazione, una o più cellule sono contenute in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti o altra piastra multi-pozzetto disponibile commercialmente. In una forma di realizzazione alternativa, la miscela di reazione o le cellule sono in un apparato di misura citometrica. Altre piastre multi-pozzetto utili agli scopi della presente invenzione comprendono, ma non sono limitati a, piastre da 384 pozzetti e piastre da 1536 pozzetti. Tuttavia, altri recipienti per contenere la miscela di reazione o le cellule, utili per la presente invenzione saranno evidenti all'operatore esperto.

L'aggiunta dei componenti del saggio per la rivelazione del livello di attivazione o dell'attività di un elemento attivabile, o per la modulazione di tale livello di attivazione o attività, può essere sequenziale o in un ordine predeterminato o raggruppato secondo condizioni appropriate per l'attività che viene misurata. Tali condizioni sono descritte qui e sono note nell'arte. Inoltre, ulteriori linee guida sono fornite di seguito (vedi per esempio negli Esempi)

In alcune forme di realizzazione, il livello di attivazione di elemento attivabile è misurato utilizzando lo spettrometro di massa a plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS). Un elemento di legame che è stato marcato con uno specifico elemento si lega all'elemento attivabile. Quando la cellula è introdotta nella ICP, viene atomizzata e ionizzata. Viene così misurata la composizione elementare della cellula, ivi compreso l'elemento di legame marcato che è legato all'elemento attivabile. La presenza e l'intensità dei segnali corrispondenti alle marcature dell'elemento di legame indicano il livello dell'elemento attivabile nella cellula (Tanner et al. Spectrochimica Acta Parte B: Atomic Spectroscopy, (2007), 62(3):188-195.).

Come sarà noto ad un esperto del settore, i metodi e le composizioni della presente invenzione trovano uso in una varietà di altri tipi di saggi oltre all'analisi di citometria a flusso. Per esempio, nei metodi della presente invenzione può essere utilizzato un chip analogo a un chip di DNA. Sono noti metodi di array e metodi per l'analisi di acidi nucleici con un chip in un array predefinito. Inoltre, sono noti chip di proteine e metodi per la sintesi. Questi metodi e materiali possono essere adottati col proposito di apporre elementi di legame dello stato di attivazione su un chip in un predefinito array. In alcune forme di realizzazione, tale chip comprende una molteplicità di elementi di legame di stati di attivazione ed è utilizzato per determinare un profilo di uno stato di attivazione di un elemento presente sulla superficie di una cellula.

In alcune forme di realizzazione, un chip comprende una molteplicità di "elementi di legame di un secondo set", in questo caso generalmente non marcati. Tale chip è messo in contatto con il campione, preferibilmente estratto cellulare, e una seconda molteplicità di elementi di legame comprendenti elementi di legame specifici dello stato di attivazione è utilizzata nel saggio a sandwich per determinare simultaneamente nel campione la presenza di una molteplicità di elementi attivati. Preferibilmente, ognuno dei molteplici elementi di legame specifici dello stato di attivazione è marcato in maniera univoca per facilitarne la rivelazione .

In alcune forme di realizzazione, la microscopia confocale può essere utilizzata per rivelare i profili di attivazione di singole cellule. La microscopia confocale si basa su una raccolta seriale di luce da punti del campione separati nello spazio, luce che è poi processata elettronicamente per restituire una immagine ingrandita del campione. Il processamento del segnale implicito nella microscopia confocale ha la capacità aggiuntiva di rivelare elementi di legame marcati all'interno di singole cellule, su questa base, in questa forma di realizzazione, le cellule possono essere marcate con uno o più elementi di legame. In alcune forme di realizzazione, gli elementi di legame utilizzati nella microscopia confocale sono anticorpi coniugati a un marcatore fluorescente; comunque sono possibili altri elementi di legame, come altre proteine o acidi nucleici.

In alcune forme di realizzazione, i metodi e le composizioni della presente invenzione possono essere utilizzati insieme ad un "Saggio Western In-Cell". In tale saggio le cellule vengono inizialmente fatte crescere in una fiasca standard per colture di tessuti, utilizzando tecniche standard di colture di tessuti. Una volta che sono cresciute alla confluenza ottimale, il mezzo di crescita è rimosso e le cellule lavate e tripsinizzate. Le cellule possono poi essere contate e piccoli volumi, sufficienti a trasferire l'appropriato numero di cellule, vengono aliquotati in micropiastre (per esempio piastre Nunc™ 96 Microwell™). Le cellule vengono fatte crescere nei singoli pozzetti fino ad una confluenza ottimale in mezzo completo, dopodiché il mezzo è sostituito con un mezzo senza siero. A questo punto i controlli non vengono trattati mentre i pozzetti dell'esperimento sono incubati con un modulatore, per esempio EGF. Dopo l'incubazione con il modulatore, le cellule sono fissate e colorate con anticorpi marcati per l'analisi degli elementi di attivazione. Una volta che le cellule sono marcate, le piastre possono essere scansite utilizzando un analizzatore di immagini come il Odyssey Imager (LiCor, Lincoln Nebr.), utilizzando le tecniche descritte in Odyssey Operator's Manual vi .2. I dati ottenuti dalla scansione delle micropiastre possono essere analizzati e possono essere determinati i profili di attivazione, come descritto di seguito.

In alcune forme di realizzazione, la rivelazione avviene tramite cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), per esempio HPLC a fase inversa, e in un'altra forma di realizzazione, la rivelazione avviene tramite spettrometria di massa.

Questi strumenti possono essere collocati sotto una cappa sterile a flusso laminare o aspirante oppure sono essi stessi sistemi chiusi, inglobati in contenitori propri per permettere la crescita e la trasformazione di colture cellulari in micropiastre o tubi, e per operazioni che comportano un rischio biologico. Le cellule viventi possono essere coltivate in condizioni controllate di crescita, con controllo della temperatura, dell'umidità e del gas per l'analisi nel tempo delle cellule vitali. La trasformazione automatizzata delle cellule e la raccolta automatizzata di colonie cellulari può facilitare il rapido screening delle cellule desiderate.

Formati di citometria a flusso o di elettroforesi capillare possono essere utilizzati per l'analisi singola di biglie magnetiche o altre particelle, cellule e organismi .

Hardware e software flessibili permettono l'adattabilità strumentale a molteplici applicazioni. I moduli del programma di software permettono la creazione, la modificazione e l'esecuzione dei metodi. I moduli di diagnostica del sistema permettono l'allineamento strumentale, le giuste connessioni e le operazioni automatizzate. Strumenti personalizzati, attrezzature da laboratorio e sistemi per il trasferimento di liquidi, particelle, cellule e organismi permettono di eseguire applicazioni diverse. Le banche di dati permettono l'immagazzinamento di metodi e parametri. Le interfacce robotiche e computerizzate permettono la comunicazione tra strumenti .

In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione includono l'uso di componenti per la manipolazione di liquidi. I sistemi per la manipolazione di liquidi possono consistere di sistemi automatizzati comprendenti un numero qualsiasi di componenti. Inoltre, uno o tutti i passaggi illustrati nel presente documento possono essere automatizzati; in questo modo, per esempio, i sistemi possono essere completamente o parzialmente automatizzati .

Come sarà noto agli esperti del settore, esiste un'ampia varietà di componenti che possono essere utilizzati tra cui, ma non solo, uno o più bracci elettronici; manipolatori di piastre per il posizionamento di micropiastre; manipolatori automatici di coperchi o di coperture per rimuovere e sostituire i coperchi dei pozzetti delle piastre al fine di evitare la contaminazione tra un pozzetto e l'altro; pipette usate per distribuire il campione con puntali usa e getta; pipette lavabili per distribuire il campione; blocchi per il caricamento di 96 pozzetti; scaffali refrigerati per reagenti; postazioni per pipette da micropiastre (raffreddate e non); strutture per impilare piastre e puntali; e sistemi computerizzati.

I sistemi completamente robotizzati o di microfluidica permettono la manipolazione automatizzata di liquidi, particelle, cellule e organismi, ed il pipettamento ad alto rendimento per eseguire tutti i passaggi delle applicazioni dello screening. Permettono inoltre le manipolazioni di particelle, cellule e organismi, come l'aspirazione, la distribuzione, il mescolamento, la diluizione, il lavaggio, il trasferimento di volumi precisi; il recupero e lo scarico di puntali per pipette; e il pipettamento ripetitivo di volumi identici per distribuire il campione aspirato in molte repliche. Queste manipolazioni consistono di trasferimenti di liquidi, particelle, cellule e organismi in assenza di contaminazioni tra campioni. Questo sistema esegue la replica automatizzata di campioni di micropiastre su filtri, membrane e/o piastre figlie, trasferimenti ad alta densità, diluizioni seriali nella piastra completa e operazioni di elevata abilità. Ulteriori esempi di automazione, raccolta e analisi automatizzata di campioni sono illustrati in US 61/048,657.

In alcune forme di realizzazione, vengono utilizzate particelle, piastre, cartucce, tubi, particelle magnetiche o altre matrici a fase solida derivatizzate chimicamente, con specificità per i componenti del saggio. Sono utili per gli scopi di questa invenzione le superfici di legame di micropiastre, tubi o qualsiasi matrice a fase solida che comprende superfici non polari, superfici altamente polari, rivestimenti con destrani modificati per promuovere il legame covalente, rivestimenti con anticorpi, mezzi di affinità per legare proteine di fusione o peptidi, proteine fissate sulla superficie come le proteine ricombinanti A o G, le resine o i rivestimenti con nucleotidi e altre matrici di affinità.

In alcune forme di realizzazione, i supporti per piastre a pozzetti multipli, per tubi multipli, per cartucce, per minitubi, per piastre con pozzetti profondi, per tubi da microcentrifuga, per fiale da congelamento, per piastre a pozzetti quadrati, per filtri, per chip, per fibre ottiche, per biglie e per altre matrici a fase solida o supporti con diversi spazi sono alloggiati su una piattaforma modulare a cui si possono aggiungere ulteriori spazi. Questa piattaforma modulare include un agitatore orbitale a velocità variabile e piani di lavoro a posizioni multiple per i campioni originali, per le diluizioni dei campioni e dei reagenti, per le piastre del saggio, per le riserve di campioni e reagenti, per i puntali per pipette e per una stazione di lavaggio attiva. In alcune forme di realizzazione, i metodi in vitro dell'invenzione includono l'uso di un lettore di piastre.

In alcune forme di realizzazione, vengono utilizzati sistemi di termociclazione e di termoregolazione per stabilizzare la temperatura di scambiatori di calore, come blocchi o piattaforme controllate, al fine di garantire un controllo accurato della temperatura per l'incubazione del campione tra 0°C e 100°C.

In alcune forme di realizzazione, i liquidi, le particelle, le cellule e gli organismi vengono manipolati automaticamente da teste intercambiabili di pipette (singole o multicanale) con sonde magnetiche singole o multiple, sonde di affinità o pipettatori. I liquidi, le particelle, le cellule e gli organismi, in forma di campioni singoli multipli, vengono manipolati da separatori magnetici o da piattaforme multi-pozzetto o multi-tubo.

In alcune forme di realizzazione, la strumentazione includerà un rivelatore, che può essere di vario tipo in base alle marcature e al saggio. In alcune forme di realizzazione, i rivelatori utili agli scopi della presente invenzione comprendono uno o più microscopi con canali multipli di fluorescenza; lettori per piastre che permettono la rivelazione spettrofotometrica della fluorescenza, della luce ultravioletta e visibile con possibilità di leggere lunghezza d'onda singola o doppia e di analizzare cinetiche, del trasferimento di energia per risonanza in fluorescenza, della luminescenza, dello spegnimento della fluorescenza, dell'eccitazione a due fotoni e della ridistribuzione di intensità; telecamere CCD per raccogliere e trasformare dati e immagini in formati quantificabili; e una postazione con computer.

In alcune forme di realizzazione, l'apparato robotizzato include un'unità centrale di processamento che comunica con una memoria e una serie di dispositivi (per esempio tastiera, mouse, monitor, stampante, ecc.) tramite un bus. Ancora una volta, come illustrato di seguito, questo può essere in aggiunta o in sostituzione della CPU per i dispositivi multiplex dell'invenzione. L'interazione generale tra un'unità centrale di elaborazione, una memoria, dispositivi di ingresso/uscita e un bus è noto nell'arte. Così, una varietà di procedure diverse, a seconda degli esperimenti da eseguire, vengono memorizzate nella memoria della CPU. Questi sistemi robotizzati per la manipolazione dei fluidi possono utilizzare un numero qualsiasi di reagenti diversi, tra cui tamponi, reagenti, campioni, lavaggi, componenti del saggio quali sonde marcate, ecc.

In particolari forme di realizzazione, i metodi automatizzati e/o semi-automatizzati per la preparazione e la valutazione di campioni ad alto rendimento in fase solida e liquida sono disponibili e supportati da dispositivi disponibili in commercio. Ad esempio, per facilitare la produzione e la caratterizzazione delle librerie dei geni candidati, i dispositivi robotizzati per la preparazione di acidi nucleici da colonie batteriche comprendono, per esempio, un selezionatore automatizzato di colonia (per esempio il Q-bot, Genetix, UK) capace di identificare, campionare e inoculare fino a 10.000 cloni diversi in micropiastre da 96 pozzetti in 4 ore. In alternativa, o in aggiunta, i sistemi robotizzati per la manipolazione di liquidi sono disponibili presso vari fornitori, ad esempio, stazioni di lavoro automatizzato come l'apparato di sintesi automatizzato sviluppato da Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Giappone) e molti sistemi robotizzati che utilizzano bracci robotici (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, nel Massachusetts, Orca, Beckman Coulter, Ine. (Fullerton, California)) che imitano le operazioni manuali eseguite da uno scienziato. Inoltre, per implementare i sistemi robotizzati durante una fase del processamento, possono essere necessari incubatori, frigoriferi, congelatori, copripiastre, dispensatori di reagenti e lettori di codici a barre. Uno qualsiasi dei dispositivi di cui sopra è adatto per gli scopi della presente invenzione, per esempio per l'analisi ad alto rendimento dei componenti della libreria o di campioni. La natura e 1'implementazione di modifiche apportate a questi dispositivi (se esistono), tali da poter operare come descritto nel presente documento, saranno evidenti a persone esperte della materia in questione.

Una varietà di dispositivi secondari presenti in commercio tra cui, per esempio, citometri a flusso e relativi rivelatori ottici e fluorescenti e simili, e software sono disponibili per digitalizzare, memorizzare ed analizzare un segnale video digitale o un segnale ottico digitale o altri risultati di un saggio usando un computer. I fornitori commerciali della strumentazione di citometria a flusso includono Beckman Coulter, Ine. (Fullerton, Calif.), e Becton Dickinson (San Jose, Calif.), tra gli altri. Per ulteriori esempi di sistemi di citometria ad alto rendimento, si veda US 12/606,869.

Analisi

I progressi in citometria a flusso hanno permesso di quantificare, a livello di singola cellula, fino a tredici parametri simultaneamente (De Rosa et al., 2001) e stanno andando verso lo studio di sottoinsiemi di dati proteomici e genomici (Krutzik and Nolan, 2003; Perez and Nolan, 2002). Inoltre, progressi in altre tecniche (per esempio microarray) tengono conto dell'identificazione di molteplici elementi attivabili. Poiché è aumentato il numero di parametri, epitopi e campioni, sono aumentate anche la complessità degli esperimenti e le sfide nell'analizzare i dati. Un ulteriore livello di complessità dei dati si è aggiunto con lo sviluppo di pannelli di stimolazione che consentono lo studio di elementi attivabili sotto una serie crescente di condizioni sperimentali. Metodi per l'analisi di parametri multipli sono ben noti nell'arte.

In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, differenti strategie di selezione elettronica possono essere utilizzate allo scopo di analizzare una o più specifiche popolazioni cellulari in un campione di popolazioni miste dopo trattamento con il modulatore. Queste strategie di selezione elettronica possono basarsi sulla presenza di uno o più specifici marcatori di superficie espressi da ciascun tipo cellulare. In alcune forme di realizzazione, la prima selezione elettronica elimina i doppietti cellulari in modo che l'operatore possa analizzare singole cellule. La seguente selezione elettronica consente di discriminare le cellule morte dalle cellule vive e la successiva selezione elettronica classifica le cellule, per esempio, in blasti mieloidi, monociti e linfociti. Si può eseguire un confronto per studiare l'effetto di potenziali modulatori su elementi attivabili in: campioni non selezionati, blasti mieloidi, monociti, granulociti, linfociti, cellule B e/o altri tipi cellulari usando rappresentazioni a due dimensioni dei gruppi di cellule per contorni, per punti, e/o istogrammi. Per esempio, si può eseguire un confronto per studiare l'effetto di un modulatore della via di segnalamento del recettore delle cellule B (BCR) in differenti popolazioni cellulari all'interno di un campione di un paziente mediante l'utilizzo di rappresentazioni bidimensionali per contorni della fosforilazione di Syk ed NF-κΒ (risultati intracellulari a valle dell'attivazione del BCR) (assi X ed Y). Possono così essere messi a confronto il livello di fosforilazione basale e la variazione della fosforilazione di Syk ed NF-κΒ in risposta ad un modulatore. Il vantaggio della selezione elettronica è quello di ottenere un quadro più chiaro e dei risultati più precisi sull'effetto di diversi elementi attivabili in una o più specifiche sottopopolazioni cellulari all'interno di un campione complesso di origine umana.

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione fornisce i metodi per la classificazione, diagnosi, prognosi, e/o predizione di un esito relativo ad una condizione neoplastica e/o ematopoietica in un individuo attraverso la caratterizzazione di una o più vie e/o la determinazione della presenza o assenza di un aumento dell'attivazione di uno o più elementi attivabili in una cellula. La caratterizzazione di una o più vie può essere realizzata esponendo una cellula e/o la popolazione cellulare ad uno o più modulatori e determinando il livello di attivazione di un elemento attivabile della cellula e/o di almeno una cellula in una popolazione cellulare. I dati possono essere analizzati usando varie metriche. Esempi di metriche includono: 1) misura della differenza logaritmica tra il valore di mediana di fluorescenza di un campione non stimolato marcato con un anticorpo legato ad un fluorocromo ed un campione che non è stato trattato con lo stimolante o che non è stato marcato (log (MFI Non Stimolato Marcato) -log (MFI Selezionato Elettronicamente Non Marcato)); 2) misura della differenza logaritmica tra il valore di mediana di fluorescenza di un campione stimolato e marcato con un anticorpo legato ad un fluorocromo ed un campione che non è stato stimolato o marcato (log (MFI Stimolato Marcato) - log (MFI Selezionato Elettronicamente Non Marcato)); 3) misura della variazione logaritmica tra un campione stimolato marcato con un anticorpo coniugato con un fluorocromo ed un campione non stimolato marcato con un anticorpo coniugato con un fluorocromo log (MFI Stimolato Marcato) - log (MFI Non Stimolato Marcato), anche detta "fold change dell'intensità mediana di fluorescenza"; 4) misura della percentuale di cellule all'interno di un quadrante della selezione elettronica (Quadrant Gate) in una rappresentazione per contorni che misura popolazioni multiple in una o più dimensioni; 5) misura della MFI di popolazioni fosfo-positive al fine di ottenere la percentuale di positività sul fondo; e 6) uso di multimodalità e metriche diffuse per una popolazione campionaria ampia e per l'analisi di sottopopolazioni. Altre possibili metriche comprendono l'analisi a tre colori (3D plots); la percentuale positiva e l'espressione relativa di vari marcatori; l'analisi clinica sulla base di diversi parametri del singolo paziente, inclusi ma non limitati a, età, razza, citogenetica, stato mutazionale, percentuale di blasti, percentuale di CD5+, tempo di ricaduta, sopravvivenza, ecc. In forme di realizzazione alternative, vi sono altri modi per l'analisi dei dati, come l'analisi a tre colori (3D plots), che può essere simile alla Cytobank 2D, con l'aggiunta della terza D nel colore. In altre forme di realizzazione, un operatore può analizzare il segnalamento in sottopopolazioni cellulari selezionando le cellule sulla base dell'espressione di marcatori di superficie. Per esempio, l'operatore può guardare ad una selezione elettronica di cellule di LLC sulla base della co-espressione di CD5 con CD19, CD23 con CD20, CD5 con CD20, CD23 con una debole espressione di immunoglobuline di superficie, CD5 con CD19 e CD23, oppure CD5 con CD20 e CD23 e una debole espressione di immunoglobuline di superficie. In un'altra forma alternativa di realizzazione, un operatore può analizzare i dati sulla base dell'espressione di marcatori intracellulari, come fattori di trascrizione o altre proteine intracellulari, sulla base di un saggio funzionale o sulla base di altri marcatori fluorescenti.

In alcune forme di realizzazione che utilizzano la citometria a flusso, gli esperimenti di citometria a flusso vengono ordinati in una stringa ed i risultati sono approssimati come fold change utilizzando una visualizzazione con pseudocolori per facilitane la valutazione. In generale, gli esperimenti di citometria a flusso così ordinati semplificano i dati citofluorimetrici multidimensionali basati su un disegno sperimentale e sulle differenze osservate tra i campioni di citometria a flusso. Un modo usato di frequente per confrontare variazioni in una serie di campioni di citometria a flusso è quello di sovrapporre gli istogrammi di un parametro sullo stesso grafico. Gli esperimenti di citometria a flusso allineati in una stringa contengono idealmente un campione di riferimento contro il quale vengono confrontati i campioni sperimentali. Questo campione di riferimento viene collocato nella prima posizione della stringa, ed i successivi campioni sperimentali seguono il controllo nella sequenza. I campioni di riferimento possono comprendere cellule normali e/o associate ad una condizione (per esempio cellule tumorali).

In alcune forme di realizzazione, dove è utilizzata la citometria a flusso, prima dell'analisi dei dati vengono definite le popolazioni di interesse ed il metodo per caratterizzare queste popolazioni. Per esempio, ci sono almeno due modi con cui comunemente vengono identificate le popolazioni per l'analisi dei dati: (i) confronto "esternointerno" delle serie di parametri per i campioni singoli o per sottogruppi di campioni (per esempio i pazienti in un trial). In questa situazione più comune, le popolazioni cellulari sono omogenee o selezionate sulla base della linea differenziativa in modo tale da creare degli insiemi distinti che si possono considerare omogenei per gli scopi di interesse. Un esempio di comparazione a livello di campione sarebbe l'identificazione dei profili di segnalamento nelle cellule tumorali di un paziente e la correlazione di questi profili con una distribuzione non casuale di risposte cliniche. Questo è considerato un approccio esterno-interno poiché la popolazione di interesse viene predefinita precedentemente alla mappatura ed al confronto tra il suo profilo e quello delle altre popolazioni, (ii) Confronto "interno-esterno" dei parametri a livello di sinqole cellule in una popolazione eteroqenea. Un esempio di questo sarebbe la mappatura dello stato di trasduzione del seqnale di cellule eteroqenee ematopoietiche sotto certe condizioni ed il successivo confronto dei qruppi cellulari identificati computazionalmente con i marcatori specifici della linea differenziativa . Questo può essere considerato un approccio interno-esterno per studi su sinqola cellula dal momento che non presuppone l'esistenza di specifiche popolazioni prima della classificazione. Un inconveniente rilevante di questo approccio è che questo delinea popolazioni che, almeno inizialmente, necessitano di multipli marcatori transitori per essere identificate e che possono non risultare mai accessibili con un sinqolo epitopo di superficie cellulare. Di consequenza, il siqnificato bioloqico di tali popolazioni può essere difficile da determinare. Il principale vantaqqio di questo approccio non convenzionale consiste nella localizzazione obiettiva di popolazioni cellulari senza trarre distinzioni potenzialmente arbitrarie tra i le linee differenziative o i tipi cellulari.

Ognuna di queste tecniche sfrutta la capacità della citometria a flusso di fornire una quantità molto vasta di dati multiparametrici a livello di singola cellula. Per cellule associate ad una condizione (per esempio una condizione neoplastica o ematopoietica), esiste un terzo "metalivello" di dati poiché cellule associate ad una condizione (per esempio cellule tumorali) sono generalmente trattate come un'entità singola e classificate secondo tecniche storiche. Queste tecniche hanno incluso l'organo o il tessuto di origine, il grado di differenziazione, l'indice di proliferazione, la diffusione metastatica ed i dati genetici e metabolici relativi al paziente.

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione utilizza tecniche di mappatura della varianza per mappare la dispersione del segnalamento in una condizione. Questi metodi rappresentano un avanzamento significativo nello studio della biologia di una condizione perché questo consente di confrontare delle condizioni indipendentemente da un presunto controllo normale. I metodi tradizionali di analisi della differenza tra stati (per esempio DNA microarrays, Northern blotting sottrattivo) in genere si affidano al confronto di cellule associate ad una condizione provenienti dai campioni di pazienti con un controllo normale, in genere un tessuto adiacente ed in teoria non trasformato. In alternativa, i metodi tradizionali si basano su raggruppamenti multipli e raggruppamenti ripetuti di una classe e di seguito stratificano ulteriormente i campioni dei pazienti secondo il fenotipo. Diversamente, la mappatura della varianza degli stati di una condizione confronta i campioni relativi ad una condizione prima con se stessi e poi con la popolazione della condizione parentale. Come risultato, gli stati di attivazione con più vasta variabilità tra le condizioni forniscono i parametri centrali nell'analisi della differenza tra stati. Dato un insieme di condizioni diverse, questa tecnica consente ad un ricercatore di identificare gli eventi molecolari che sono alla base delle differenze delle condizioni in uno stato patologico (per esempio le risposte del cancro alla chemioterapia), piuttosto che le differenze tra le condizioni ed un dato controllo normale.

In alcune forme di realizzazione, quando si usa la mappatura della varianza per tracciare il profilo della dispersione di segnalamento tra i campioni di pazienti, le condizioni in cui la risposta di segnalamento ai modulatori è simile vengono raggruppate insieme, indipendentemente dal tessuto o dal tipo cellulare di origine. In modo simile, due condizioni (per esempio due tumori), che si pensa siano relativamente simili sulla base di marcatori della linea differenziativa o del tessuto di origine, possono avere capacità notevolmente differenti di interpretare gli stimoli ambientali e sarebbero raggruppate in due classi differenti.

Una volta identificati gruppi di profili di segnalamento, spesso è utile determinare se altri fattori, come ad esempio risposte cliniche, presenza di mutazioni geniche e livelli di espressione proteica, sono distribuiti in maniera non casuale all'interno dei gruppi. Se gli esperimenti o la letteratura suggeriscono una tale ipotesi, in un esperimento di citofluorimetria ordinato in una stringa, questa ipotesi può essere verificata mediante semplici test statistici, come ad esempio il test t di Student ed il test X2. Allo stesso modo, se si pensa che due fattori variabili in un esperimento siano associati, per rappresentare il grado di questa relazione si utilizza il coefficiente di correlazione r2 ottenuto da una regressione lineare.

Esempi di analisi per elementi attivabili sono descritti in: domanda di brevetto US Numero 20060073474 dal titolo "Methods and compositions for detecting thè activation state of multiple proteins in single cells" e la pubblicazione US numero 20050112700 dal titolo "Methods and compositions for risk stratification".

In alcune forme di realizzazione la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili è correlata con un esito clinico. In altre forme di realizzazione, la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione è determinata per ognuno della pluralità di elementi attivabili. In alcune forme di realizzazione, la presenza o assenza di un incremento del livello di attivazione per ognuno di due o più di questi elementi attivabili in combinazione tra loro è correlata con un esito clinico. In alcune forme di realizzazione, la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di ognuno o più elementi attivabili, da soli o in combinazione, e combinati con una o più covariate cliniche, è correlata con un'altra covariata clinica e/o con un esito clinico. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è una covariata clinica, che include, ma non è limitata a, lo stato mutazionale dei geni IgVH, l'espressione di CD38, l'espressione della tirosin chinasi ZAP-70 (ZAP-70) e la stadiazione secondo i criteri di Binet. In alcune forme di realizzazione, l'esito clinico è il tempo di progressione (TTP) o la sopravvivenza complessiva (OS). Le correlazioni possono essere positive o negative. In alcune forme di realizzazione, il valore assoluto della correlazione tra la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di uno o più elementi attivabili da soli o in combinazione ed un esito clinico è di almeno circa il 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, o più. In alcune forme di realizzazione, la correlazione è espressa come la capacità della presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di ognuno o più elementi attivabili, da soli o in combinazione, di stratificare i soggetti con una particolare covariata clinica da quelli che non hanno una particolare covariata, in una pluralità di soggetti. In alcune forme di realizzazione, le differenze tra i gruppi di soggetti stratificati sono statisticamente significative, avendo valori di p inferiori a circa 0,2, 0,15, 0,1, 0, 05, 0,04, 0,03, 0, 02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0001, o più bassi.

In alcune forme di realizzazione, la presenza o assenza di un incremento del livello di attivazione per ciascuno di uno o più elementi attivabili, da soli o in combinazione, è correlata con un TTP di almeno circa 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, o più mesi. In alcune forme di realizzazione, la presenza o assenza di un incremento del livello di attivazione per ciascuno di uno o più elementi attivabili, da soli o in combinazione, è correlata con un TTP massimo di circa 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, o più mesi. In alcune forme di realizzazione, la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione per ciascuno di uno o più elementi attivabili, da soli o in combinazione, è correlata con una OS di almeno circa 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, o più mesi. In alcune forme di realizzazione, la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione per ciascuno di uno o più elementi attivabili, da soli o in combinazione, è correlata con una OS massima di circa 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, o più mesi.

In alcune forme di realizzazione, viene utilizzato un modello di rischio proporzionale, come il modello di regressione Cox, per predire un esito clinico. I modelli di rischio proporzionale possono includere la presenza o assenza di un aumento del livello di attivazione di un elemento attivabile in risposta ad un modulatore, il livello relativo o assoluto di attivazione di un elemento attivabile, la presenza o assenza di una covariata clinica o una combinazione di questi. I modelli possono essere valutati sulla base dell'indice C di Harrell (Harrell FE Jr., et al. Stat Med. 1996;15:361-87) . In generale, l'indice C può essere definito come una misura della frazione di tutte le possibili coppie in una data serie per la quale una predizione del tempo di progressione (come diagnosi, grado o stadio di una condizione neoplastica e/o ematopoietica) specifica correttamente quale membro della coppia progredisce per primo. In alcune forme di realizzazione, l'indice C è circa uguale o maggiore di 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99, 0,995, o più.

Kit

In alcune forme di realizzazione l'invenzione fornisce kit. I kit forniti dall'invenzione possono contenere uno o più degli elementi di legame specifici per stato descritti nella presente documentazione, per esempio anticorpi fosfospecifici. I kit forniti dall'invenzione possono contenere uno o più dei modulatori descritti nel presente documento. L'elemento di legame stato-specifico dell'invenzione può essere coniugato ad un supporto solido ed a gruppi rivelabili direttamente o indirettamente. I reagenti possono contenere anche agenti ausiliari come agenti tamponanti e stabilizzanti, per esempio polisaccaridi e simili. Il kit può contenere inoltre, dove necessario, altri componenti del sistema di produzione del segnale del cui sistema fa parte il gruppo rivelabile (per esempio substrati enzimatici), agenti per la riduzione dell'interferenza dovuta al rumore in un test, reagenti di controllo, apparato per la conduzione del test, e simili. Il kit può essere confezionato in una qualsiasi maniera idonea, tipicamente con tutti gli elementi in un unico contenitore insieme ad un foglietto stampato di istruzioni per l'esecuzione del test.

Tali kit consentono la rivelazione di elementi attivabili mediante metodi sensibili di saggio cellulare, come l'IHC e la citometria a flusso, che sono adatte per la rivelazione clinica, la prognosi e lo screening di cellule e tessuti da pazienti, per esempio pazienti leucemici, che affetti da una malattia che implica un'alterazione di vie di segnalamento cellulare.

Tali kit possono contenere inoltre uno o più agenti terapeutici. Il kit può inoltre contenere un pacchetto software per l'analisi dei dati dello stato fisiologico, che può includere profili di riferimento per il confronto con il profilo del test.

Tali kit possono inoltre includere informazioni, come referenze di letteratura scientifica, materiali supplementari confezionati, risultati di trial clinici e/o loro riassunti e simili, che indicano o stabiliscono le attività e/o i vantaggi della composizione, e/o che descrivono il dosaggio, la somministrazione, gli effetti collaterali, le interazioni farmacologiche, o altre informazioni utili a chi fornisce l'assistenza sanitaria. Tali informazioni possono basarsi sui risultati di diversi studi, per esempio, studi che utilizzano animali da esperimento che coinvolgono modelli in vivo e studi basati su trial clinici nell'uomo. I kit descritti nella presente possono essere forniti, commercializzati e/o pubblicizzati al personale sanitario, tra cui medici, infermieri, farmacisti, medici di base, ecc. Inoltre, i kit, in alcune forme di realizzazione, possono essere commercializzati direttamente al consumatore. Ulteriori esempi di kit utili nelle forme di realizzazione della presente invenzione sono descritti in US 12/730,170.

Gli esempi seguenti hanno lo scopo di descrivere più ampiamente il modo per utilizzare l'invenzione sopradescritta, così come di esporre i migliori modi contemplati per eseguire i diversi aspetti dell'invenzione. E' chiaro che questi esempi in nessun modo vogliono limitare lo scopo reale di questa invenzione, ma piuttosto vengono presentati a scopo illustrativo.

ESEMPI

Esempio 1

Profili di reti di Fosfo-Proteine del recettore delle cellule B analizzati in singola cellula associati a prognosi e progressione nella Leucemia Linfatica Cronica Dichiarazione di rilevanza traslazionale.

È emerso di recente che diversi parametri molecolari e citogenetici sono potenziali indicatori prognostici della leucemia linfatica cronica B (LLC-B). Tuttavia, questi parametri misurano le caratteristiche biologiche statiche della cellula leucemica e non danno informazioni sulle risposte delle cellule leucemiche ai segnali esterni, come quelle provocate dalla stimolazione antigenica della via di segnalamento del recettore delle cellule B (BCR).

Il saggio di determinazione dei profili di reti di segnalamento in singola cellula (SCNP) è un metodo multiparametrico basato sulla citometria a flusso che consente la misurazione simultanea di molteplici fosfoproteine a livello di singola cellula, fornendo quindi un'analisi dinamica e "a livello di rete" di vie di segnalamento rilevanti da un punto di vista biologico.

In questo studio, l'analisi SCNP dimostra che i profili di segnalamento di risposta del BCR sono associati alla progressione della LLC-B e migliorano il valore prognostico dei biomarcatori utilizzati attualmente; di conseguenza, possono essere considerati come marcatori di significato prognostico nella LLC-B. Inoltre, questo studio porta a nuove conoscenze nella patogenesi della LLC-B che possono essere rilevanti per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.

Sommario

SCOPO: I pazienti con leucemia linfatica cronica B (LLC-B) presentano un decorso clinico variabile. L'attività delle vie di segnalamento del recettore delle cellule B (BCR) è stata associata a differenti sottogruppi biologici di LLC-B, sebbene la rilevanza clinica di questa considerazione sia ancora da definire chiaramente. Lo scopo di questo studio è valutare la possibile associazione tra le reti di seqnalamento di fosfoproteine del BCR dopo modulazione e l'esito clinico dei pazienti con LLC-B.

DISEGNO SPERIMENTALE: In 27 pazienti con LLC e 19 donatori sani, sono state misurate le proteine di seqnalamento a valle dell'attivazione del BCR (p-Syk, p-Erkl/2, p-NF-κΒ, p-p38 e p-JNK), dopo trattamento con modulatori anti-IqM o H2O2, utilizzando il saqqio di determinazione dei profili delle reti di seqnalamento in sinqola cellula (SCNP) basato sulla citometria a flusso.

RISULTATI: l'analisi dei raqqruppamenti senza predeterminazione ha individuato dei profili della rete di seqnalamento di fosfoproteine del BCR che stratificano in modo siqnificativo i pazienti in due qruppi con differente tempo di proqressione (TTP) (P=0,0091, test loq-rank). Inoltre, questi profili di rete sono stati associati anche ai biomarcatori proqnostici utilizzati attualmente nella LLC-B (quali stato mutazionale dei qeni IGHV, espressione di CD38, e positività per ZAP-70). L'analisi del TTP nel sottoqruppo di pazienti a stadiazione A di Binet, mediante applicazione di modelli proporzionali di rischio di Cox comprendenti covariate cliniche e/o dati del saqqio SCNP, ha dimostrato che la rete di seqnalamento del BCR dopo modulazione ha un maggiore valore prognostico rispetto alla valutazione dell'espressione di CD38 e migliora la previsione prognostica quando utilizzata in combinazione con lo stato mutazionale dei geni IGHV.

CONCLUSIONI: Questo studio dimostra che i profili della rete di fosfoproteine del BCR analizzati a livello di singola cellula sono associati alla progressione della malattia nella LLC-B. Sebbene sia stata osservata l'associazione anche con i parametri biologici classici, i dati relativi al saggio SCNP forniscono informazioni indipendenti da questi, come dimostrato dal miglioramento del valore prognostico di marcatori biologici quando usati in combinazione.

Introduzione

La leucemia linfatica cronica B (LLC-B) è caratterizzata dall'accumulo di cellule B monoclonali mature nel sangue, nel midollo osseo e nei tessuti linfoidi. E' la forma di leucemia dell'adulto più comune nei paesi occidentali e, benché trattabile, la malattia è considerata incurabile. I pazienti con LLC-B manifestano un decorso clinico variabile, con alcuni pazienti che hanno un decorso della malattia indolente ed altri che vanno incontro a una rapida progressione, resistenza al trattamento e morte (1, 2). Benché la patogenesi della LLC-B ed il motivo di questa disparità nell'esito clinico non siano state ancora completamente chiarite, nuove evidenze suggeriscono che la stimolazione antigenica mediata dal recettore delle cellule B (BCR) rappresenti un evento trainante nell'insorgenza e nella progressione della LLC-B (3). Gli effetti di questa stimolazione possono differire nei diversi pazienti di LLC-B e dunque contribuire alla disparità osservata tra i decorsi clinici.

È stato dimostrato che diversi parametri biologici sono associati all'esito clinico nella LLC-B. Tra questi, uno dei marcatori più affidabili è la presenza o assenza di un livello significativo di mutazioni somatiche all'interno dei geni che codificano per la regione variabile della catena pesante delle immunoglobuline (IGHV). I pazienti di LLC-B con i geni IGHV non mutati di solito presentano una malattia con sintomatologia avanzata, che richiede trattamento, ed hanno una sopravvivenza globale più breve rispetto ai pazienti di LLC-B con i geni IGHV mutati (4, 5). Altri parametri biologici utilizzati nella stratificazione del rischio dei pazienti di LLC-B alla diagnosi includono la presenza di certe anomalie cromosomiche (6) e la presenza di cellule B leucemiche che esprimono la tirosin-chinasi ZAP-70 nel citosol (7, 8) e/o l'antigene di superficie CD38 (4). E' stato dimostrato che entrambe le proteine CD38 e ZAP-70 permettono un segnalamento più efficace nelle cellule B di LLC (9, 10).

Questa associazione riportata tra i parametri di esito clinico infausto ed il segnalamento del BCR nella LLC-B rafforza l'ipotesi secondo cui i segnali del BCR possono avere un ruolo nella patogenesi e progressione clinica della LLC-B. Confermare e comprendere le basi di questa associazione è di interesse pratico poiché questo può tradursi nell'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.

Nelle cellule B normali, la stimolazione del BCR da parte di un antigene induce la fosforilazione dei motivi di attivazione dell'immunorecettore basati sulla tirosina (ITAM) da parte di tirosin chinasi della famiglia Src. Gli ITAM fosforilati reclutano Syk a livello del recettore, che si attiva a sua volta mediante la fosforilazione in tirosina del suo dominio chinasico e propaga il segnale di attivazione a proteine di segnalamento a valle (11). In particolare, le principali vie attivate dal BCR comprendono la fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI-3K), la fosfolipasi Cy2 (PLCY2), e le vie di Ras. L'attivazione dell'enzima PLCy2 porta all'attivazione di fattori di trascrizione, tra cui il fattore nucleare KB (NF-KB) ed il fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT). L'attivazione della via di Ras porta all'attivazione della chinasi regolata da segnali extracellulari (ERK) 1/2. Inoltre, la stimolazione del BCR induce l'attivazione delle protein chinasi attivate dai mitogeni (MAPK) p38 e la chinasi c-JUN NH2-terminale (11-13, si veda il sito web Science STKE per una rappresentazione schematica, 14). L'equilibrio tra questi eventi di segnalamento regola diverse decisioni del destino delle cellule B, tra cui proliferazione, sopravvivenza, differenziazione e morte cellulare.

Diversi studi hanno indagato la rete di segnalamento del BCR ed il suo ruolo nella progressione della LLC-B (15-19). Nel loro insieme, questi lavori hanno evidenziato risposte funzionali eterogenee tra i pazienti di LLC-B dopo stimolo del BCR. Tuttavia, questi studi sono stati finora eseguiti su elementi discreti della via di segnalamento del BCR mediante approcci biochimici classici ed il profilo preciso delle reti di segnalamento del BCR a livello di singola cellula e la loro relazione con i decorsi clinici nella LLC-B restano ancora da definire. Lo scopo del nostro studio è di valutare il segnalamento del BCR a livello di singola cellula ed "a livello di rete" mediante l'analisi simultanea di molteplici vie di segnalamento in citometria a flusso e di valutare la loro associazione con gli esiti clinici nei pazienti con LLC-B.

Analisi multivariata del profilo di rete cellulare in singola cellula (SNCP) e covariate cliniche

Materiali e Metodi

Pazienti e cellule

In questo studio sono state utilizzate cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs) crioconservate provenienti da 27 pazienti di LLC-B e da 19 donatori sani. I campioni di LLC-B sono stati raccolti presso l'Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di Verona (Italia) tra il 27 agosto 2003 e 1'1 dicembre 2008. I criteri di inclusione dei campioni per questo studio erano rappresentati dall'assenza di trattamento del paziente per almeno 6 mesi precedenti al momento della raccolta del campione e dalla disponibilità di dati completi clinici e di laboratorio (inclusi lo stato mutazionale dei geni IGHV; l'espressione di ZAP-70 e CD38; l'analisi FISH dei cromosomi llq23, 17pl3, 13ql4 e del centromero del cromosoma 12). La determinazione dello stato mutazionale dei geni IGHV e dell'espressione di ZAP-70 e di CD38 è stata eseguita come descritto in precedenza (20).

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Locale ed i campioni sono stati raccolti dopo ottenimento del consenso informato scritto. La diagnosi di LLC-B si è basata sulle linee guida del Gruppo di Lavoro per la leucemia linfatica cronica (21). Le caratteristiche cliniche e biologiche di base sono riassunte nella Tabella 1.

Tabella 1. Caratterisitche cliniche e biologiche dei pazienti di LLC-B

Totale, n (%) Stadio A di Binet, n (%) n 27 21

Età

Media 55 54

Intervallo 36-73 36-73

Sesso

F 12 (44%) 11 (52%)

M 15 (56%) 10 (48%)

Stadio di Binet

A 21 (78%) 21 (100%)

B 3 (11%) n/a

C 3 (11%) n/a

Tempo di progressione

Intervallo 1-421 6-421

Media 44 62

IGHV

Mutato 13 (48%) 12 (57%)

Non Mutato 14 (52%) 9 (43%)

ZAP-70*

Negativo 14 (52%) 13 (62%)

Positivo 13 (48%) 8 (38%)

CD38*

Negativo 19 (70%) 17 (81%)

161 Francesco FIUSSELLO (Iscrizione Albo nr. 1099/B) Positivo 8 (30%) 4 (19%)

Citogenetica

12;dell3q 1 (4%) 1 (5%)

12 2 (7%) 2 (10%)

delllq 3 (11%) 3 (14%)

delllq;dell7 1 (4%) 0 (0%)

dell3q 5 (19%) 3 (14%)

dell3q; 1 (4%) 1 (5%)

diploidia 14 (52%) 11 (52%)

*La percentuale di cellule positive per ZAP-70 e CD38 è stata determinata stabilendo rispettivamente una soglia al 20% e 30%.

Le PBMC sono state isolate mediante centrifugazione ficoll-hypaque (Lymphoprep, Nicomed, Oslo, Norway) e risospese in un mezzo di congelamento per la conservazione in azoto liquido. Dopo scongelamento, la vitalità delle cellule superava il 90% in ogni campione, come valutato con il saggio di esclusione del colorante propidio-ioduro (PI).

Stimolazione delle cellule

Le PBMC criopreservate ottenute da pazienti di LLC-B e donatori sani sono state scongelate e risospese alla concentrazione di 4x106 cellule/ml nel mezzo RPMI (GIBCO, Grand Island, NY), 10% FBS. La sospensione cellulare è stata trasferita in tubi da citofluorimetria e le cellule sono state mantenute nel mezzo di coltura a 37°C, per 1 ora prima della stimolazione. La stimolazione del BCR è stata eseguita incubando le cellule con 20 pg/ml di anticorpo di capra F(ab')2 anti-IgM umana (SouthernBiotech, Birmingham, AL) o perossido di idrogeno 3,3 mM (H2O2) per 15 minuti. Dopo la stimolazione, le cellule sono state fissate aggiungendo 500 μΐ di Fix Buffer I pre-riscaldato (Becton Dickinson, San Jose, CA) direttamente al mezzo di coltura e mantenute a 37°C per 10 minuti. Le cellule fissate sono state quindi lavate e permeabilizzate con 50% metanolo ghiacciato per 30 minuti.

Citometria a flusso fosfo-specifica intracellulare Le cellule fissate e permeabilizzate sono state lavate due volte e risospese in PBS, 2% FBS. Per la procedura di colorazione, le cellule sono state aliquotate in nuovi tubi da citofluorimetria (3x105 cellule/tubo) ed incubate con differenti combinazioni di anticorpi monoclonali specifici anti-fosfo (Figura 1). Anticorpi monoclonali isotipici corrispondenti non rilevanti sono stati utilizzati come controlli. Le cellule di LLC-B e le cellule B normali sono state identificate sulla base dell'espressione di CD5+/CD19+ e CD5-/CD19+, rispettivamente. Tutti gli anticorpi sono stati acquistati da Becton Dickinson. Per ciascun campione sono stati acquisiti approssimativamente 10000 eventi selezionati elettronicamente utilizzando un citometro a flusso FACScalibur dotato di due laser (Becton Dickinson).

Analisi dei dati

I dati di citometria a flusso sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). I segnali di fluorescenza sono stati normalizzati rispetto ai controlli calcolando il rapporto tra l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) di ciascuna fosfoproteina ed il rispettivo controllo isotipico, un anticorpo monoclonale non rilevante. Laddove indicato, la fosforilazione proteica è stata espressa come log2 della MFI normalizzata e le variazioni nella fosforilazione delle fosfoproteine sono state espresse calcolando il log2 del rapporto tra MFI delle cellule stimolate e quella relativa alle cellule non stimolate (cioè fold change). È stato possibile definire due gruppi di pazienti di LLC-B sulla base della risposta della rete del BCR all'anticorpo anti-IgM, come misurato dal log2 del fold change della MFI, utilizzando un metodo di raggruppamento medoide-k secondo l'algoritmo di partizione tramite il metodo dei medoidi (22) implementato nella funzione del pacchetto R (23).

Per il confronto statistico della fosforilazione di proteine del segnalamento del BCR nei gruppi di pazienti e di donatori sani è stato utilizzato il test della somma dei ranghi di Wilcoxon a due campioni. Le differenze tra i risultati sono state considerate statisticamente significative per valori di p < 0,05.

Per valutare la concordanza tra i gruppi di pazienti definiti in base al segnalamento e i gruppi basati sui fattori prognostici attualmente in uso (come lo stato mutazionale di IGHV e la percentuale di cellule B leucemiche esprimenti ZAP-70) è stato utilizzato il test esatto di Fisher. Il tempo di progressione (TTP) è stato calcolato a partire dalla data della diagnosi fino alla data di progressione o dell'ultimo controllo. I casi sono stati esclusi quando non è stata osservata progressione di malattia al momento dell'ultimo controllo. Le curve di TTP sono state valutate secondo il metodo Kaplan-Meier. Le differenze tra la sopravvivenza e le curve di TTP per i pazienti classificati secondo i fattori prognostici attualmente in uso e il segnalamento cellulare sono state valutate utilizzando il test log-rank.

I 27 campioni di pazienti con LLC e i 19 campioni di donatori sani (ossia per i quali non è nota o sospetta la condizione di avere la LLC) sono stati caratterizzati utilizzando il saggio di determinazione dei profili delle reti di segnalamento. È stata misurata la fosforilazione indotta nelle cinque fosfoproteine: p-Syk, p-NF-KB, p-Erk, p-p38 e p-JNK, in risposta a due modulatori, IgM (nel presente documento riferito come BCR) e H2O2. I dati di SCNP sono stati rappresentati come fold change dell'intensità media di fluorescenza (MFI) e trasformati in log2 prima della costruzione del modello. La fosforilazione di una fosfoproteina indotta da una modulazione specifica è nella presente rappresentata utilizzando la notazione A->B, dove A rappresenta il modulatore e B rappresenta la fosfoproteina. Per esempio, H202->p-Syk rappresenta la fosforilazione indotta di Syk in risposta al trattamento con H2O2. Tale coppia modulatore/fosfoproteina è riferita nella presente come un "nodo". I dati SCNP sono riassunti nella Figura 2.

Oltre ai dati di SCNP, nei campioni sono state determinate le metriche cliniche standard come lo stato mutazionale IgVH, lo stato di espressione di ZAP70 e lo stato di espressione di CD38. I campioni sono stati inoltre associati con le informazioni cliniche includendo il tempo di progressione (TTP), la sopravvivenza complessiva (OS), il tempo di sopravvivenza, lo stadio di Binet, il sesso e l'età. Ai dati relativi al TTP sono stati associati codici aggiuntivi per indicare se il paziente aveva ricevuto un trattamento e ai dati relativi alla OS sono stati associati codici aggiuntivi per indicare se il paziente era deceduto. Le variabili cliniche utilizzate in questa analisi sono riassunte nella Tabella 1 dove la colonna sinistra elenca il numero (e/o la percentuale) di campioni associati con ciascuna variabile e la colonna destra elenca il numero (e/o la percentuale) di pazienti con stadio di Binet A associati con ciascuna variabile. I mesi del tempo di progressione nei differenti sottogruppi clinici di pazienti sono riassunti nella Figura 3.

Diverse di queste variabili sperimentali sono state trasformate per generare variabili continue e discrete per la modellazione e l'analisi. Lo stato di espressione di ZAP70 è stato determinato applicando una soglia del 20%. Lo stato di espressione di CD38 è stato ricavato applicando una soglia del 30%.

Analisi immunofenotipica: Le cellule di sangue intero sono state marcate per 15 minuti a temperatura ambiente con anticorpi monoclonali (MoAbs) anti-CD19 e anti-CD5 coniugati rispettivamente con PE-Cy7 e APC, (BD Biosciences, San Jose, CA). Per la marcatura di CD38, le cellule sono state incubate con MoAb anti-CD38 coniugati con ficoeritrina (PE) (BD Biosciences). La percentuale di cellule B CD38 positive è stata determinata fissando la soglia al 30%. Per la determinazione di ZAP-70, le cellule sono state fissate e permeabilizzate con Fix & Perm (Caltag Laboratories, Burlingame, CA), secondo le raccomandazioni della casa produttrice, e incubate per 20 minuti a temperatura ambiente con MoAb anti-ZAP-70 (clone 1 E7.2, Caltag) coniugato con Alexa Fluor 488. La percentuale di cellule LLC positive per ZAP-70 è stata misurata usando cellule T come controllo positivo interno e anticorpi dello stesso isotipo degli anticorpi usati per il test come controllo negativo. I linfociti T e le cellule di LLC sono stati identificati, rispettivamente, tramite l'espressione di CD5+/CD19- e CD5+/CD1 9+. La percentuale di cellule B positive per ZAP-70 è stata determinata fissando la soglia al 20%. In tutti i casi sono stati acquisiti al citometro a flusso FACScanto (BD Biosciences) almeno 10000 eventi selezionati elettronicamente e analizzati con il software FlowJo (TreeStar, Ashland, USA).

I dati del saggio SCNP sono stati analizzati per identificare le correlazioni tra i dati di segnalamento. E' stato notato che tutti i nodi che sono indotti dal BCR correlavano fortemente l'uno con l'altro e debolmente o negativamente con i nodi indotti da H2O2. Al contrario, i nodi indotti da H202 correlavano fortemente l'uno con l'altro e debolmente o negativamente con i nodi indotti dal BCR. In questa analisi è stato osservato un campione fuori scala (CLL-4); questo campione aveva valori di fold change dei nodi indotti da H202 maggiori di 15, mentre il fold change massimo degli altri campioni era 8.3. L'eliminazione di questo campione dall'analisi ha migliorato complessivamente i livelli di significatività.

Analisi e Modellamento dei Dati

Il tempo di progressione (TTP) è stato modellato statisticamente come una variabile di esito clinico usando come covariate sia dati del saggio SCNP sia i dati clinici. In altre parole, sono stati analizzati differenti combinazioni di dati SCNP con dati clinici per identificare dati che potessero predire il tempo alla progressione. Per modellare i dati è stata usato il modello di regressione dei rischi proporzionali di Cox; il modello di regressione dei rischi proporzionali di Cox è il metodo più usato per modellare il rapporto tra dati covariati e sopravvivenza o un altro esito censorizzato. I dati censorizzati sono dati in cui il valore di una osservazione è solo parzialmente noto. Si è considerato il TTP come censorizzato (cioè si è supposto che la progressione non si sia verificata entro il TTP documentato) se il TTP era uguale alla sopravvivenza complessiva (OS) del paziente ed il paziente era vivo. Mentre il modellamento proporzionale di Cox fornisce dettagli utili nel modellamento degli esiti censorizzati come il TTP, altri tipi di modelli statistici multivariati possono essere applicati anche al SCNP e ai dati clinici per identificare combinazioni di dati con buoni valori prognostici .

In breve, il modello dei rischi proporzionali di Cox esprime il rischio (cioè la percentuale con cui si verifica un evento come la progressione o la morte) come una funzione di una o più covariate. La formula della funzione del rischio , λ, è:

dove À0(t) è il rischio di base o sottostante che è la probabilità che accada l'evento previsto senza conoscere nessuna covariata, z è un vettore di una o più covariate, possibilmente dipendenti dal tempo, e β è un vettore di coefficienti. Coefficienti positivi contribuiscono a valori più ampi della funzione di rischio o ad un più alto rischio; quindi, coefficienti positivi indicano covariate che contribuiscono a tempi di progressione più brevi. Al contrario, coefficienti negativi implicano covariate associate a rischio decrescente e a tempi di progressione più lunghi. Generalmente i coefficienti non sono direttamente comparabili perché la loro grandezza dipende dall'intervallo di valori per le covariate.

Una parte chiave della metodologia Cox è la probabilità parziale, che è il prodotto dei rischi per ogni paziente in ogni momento in cui il paziente è a rischio (se il paziente ha già sperimentato l'evento o è stato censorizzato, non fa più parte del gruppo di rischio). La probabilità parziale, dato un set di coefficienti, β, è espressa come:

Dove ri(3,t)=e<zfJ>è il valore del rischio per il paziente i, Y±(t) una funzione che indica se il paziente i è a rischio dell'evento al tempo t, e Ni(t) è il numero di eventi osservati per il paziente i tra il tempo 0 e un tempo dato, che per i modelli di progressione o sopravvivenza può essere solo zero o uno. Per ricavare un modello di rischio da un gruppo di dati, i coefficienti, β, vengono calcolati tramite metodi di probabilità massima. Le procedure per rendere idonei i modelli dei rischi proporzionali di Cox sono ben determinate e implementate nella maggior parte dei pacchetti di algoritmi statistici ivi compresi R (funzioni coxph e cph), SAS (funzione freg) and STATA (funzione stcox).

La regressione dei rischi proporzionali di Cox è stata eseguita usando la funzione coxph R (version 2.9.2) per i seguenti gruppi di covariate, usando tutte le possibili combinazioni delle covariate: un parametro singolo SCNP (cioè un nodo), una singola covariata clinica, un singolo parametro SCNP e una singola covariata clinica, due parametri SCNP, due covariate cliniche, due parametri SCNP e una singola covariata clinica, e due covariate cliniche e un singolo parametro SCNP. I modelli sono stati valutati usando i seguenti criteri: valori p per tutti i coefficienti nel modello e il test del rapporto di verosimiglianza (LRT) deve essere <0,10; I modelli vengono messi in ordine di priorità in base ai valori più alti di LRT. Il LRT consiste nel confrontare il log della verosimiglianza parziale calcolata impostando tutti i coefficienti a zero (soprattutto il rischio prioritario) con il log della verosimiglianza parziale calcolata dati i coefficienti del modello. Maggiore è la differenza nel log delle verosimiglianze parziali, migliore è la previsione del tempo dell'evento da parte del modello.

In totale, sono stati costruiti 678 modelli di regressione Cox e di questi 41 hanno superato i criteri di importanza descritti precedentemente; i risultati sono riassunti nella Figura 4 e Figura 5, con i nodi rappresentati come "modulatore->elemento attivabile" . Per valutare il livello di false scoperte in questi gruppi di dati sono stati effettuate 500 prove di costruzione di tutti i modelli con i dati di ogni colonna spostati. In tutte le 500 prove è stata fatta una media di 5,3 modelli significativi per prova a partire dai dati mescolati. La deviazione standard nel numero di modelli significativi costruiti per prova con dati mescolati è stata 5,1; poiché 41 modelli sono superiori di due deviazioni standard al numero di modelli significativi scoperti in modo casuale, si può concludere che l'associazione tra TTP e i dati clinici combinati con i dati SCNP non è casuale. L'esame dei modelli costruiti a partire da tutti i campioni ha rivelato che le covariate cliniche dello stadio Binet, dello stato IgVH, dello stato di ZAP-70, e dello stato di CD38 erano predittori del TTP. L'analisi della sopravvivenza (senza lo stadio Binet come covariata del modello) è stata eseguita come descritto precedentemente solo per i pazienti dello stadio A di Binet, con i risultati riassunti nella Figura 6 e Figura7 con i nodi rappresentati come "modulatore->elemento attivabile." Per I sottogruppi dello stadio A di Binet, sono stati costruiti 556 modelli di regressione Cox dei quali 16 erano significativi. Il livello di false scoperte nel gruppo di dati dello stadio A di Binet è stato determinato come descritto precedentemente, il numero medio di modelli significativi per prova di dati casuali è stato 6,3 e la deviazione standard nel numero di modelli significativi per prova è stato 5.2 Per alcuni modelli è anche calcolato l'indice C di Harrell, i cui risultati sono illustrati nella Figura 8.

I modelli univariati e multivariati per TTP sono stati generati usando la regressione dei rischi proporzionali di Cox (24) implementata nel pacchetto Design (25) per R. I dati usati per i modellamenti sono stati: la variazione di fosforilazione per ogni proteina della rete del BCR in risposta al legame del BCR (espresso come log2 fold change dalla MFI rispetto alla fosforilazione basale), i marcatori standard di prognosi usati nella pratica e le covariate cliniche. L'analisi multivariata ha incluso tutte le possibili coppie di dati usati per i modelli univariati. I modelli di sopravvivenza sono stati valutati usando sia il test del rapporto di verosimiglianza sia l'indice di concordanza di Harrell (C), che valuta quanto bene un modello ordina i pazienti in termini di TTP (26). I modelli sono stati considerati solo se il valore p per ogni coefficiente era <= 0,10 (questo limite è stato scelto sulla base della piccola dimensione del campione e data la natura ipotetica dello studio). Il modellamento del TTP è stato limitato ai pazienti che mostravano il primo stadio della malattia, il gruppo che clinicamente si presenta con un più alto indice di variabilità di questo esito. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite usando la versione R 2.10-1 (27).

Sono state fatte delle analisi per valutare il livello di false scoperte in questi dati. SCNP e dati clinici sono stati mescolati tra le colonne dei dati per randomizzare i dati. Sui dati randomizzati sono state eseguite 500 prove per costruire tutte le possibili combinazioni dei modelli. In media , sono stati costruiti 5,3 modelli significativi in ogni prova, con un valore di deviazione standard di 5,1. Al contrario, sono stati costruiti 41 modelli significativi usando dati non randomizzati, un numero che è più grande di due deviazioni standard rispetto a 5,3. Quindi, c'è un'associazione non casuale tra TTP e dati clinici combinati con dati SCNP.

Le stesse analisi sono state eseguite usando solo i dati dei pazienti con stadio A di Binet. Sono stati costruiti 556 modelli di regressione Cox, dei quali 16 erano significativi. Questi risultati sono presentati in tabella nelle Figure 6, 7, e 9. Il livello di false scoperte è stata calcolata come descritta precedentemente e il numero medio di modelli significativi costruiti è stato 6,3 con una deviazione standard di 5,2.

Risultati

I livelli basali di fosforilazione delle proteine del segnalamento del BCR differenziano la rete del segnalamento delle cellule B leucemiche da quelle normali.

Per prima cosa, i profili di segnalamento del BCR sono stati caratterizzati in cellule primarie isolate da 27 pazienti di LLC, analizzando i livelli basali di fosforilazione di 5 fosfoproteine sul percorso del segnale del BCR. Le fosfoproteine comprendevano p-Syk, p-Erkl/2, p-NF-κΒ, p-p38 e p-JNK. Come controllo sono state usate PBMC da 19 donatori sani per valutare la fosforilazione basale di queste fosfoproteine in campioni di cellule B non maligne. La Figura 10A mostra i risultati della comparazione delle proteine del segnalamento del BCR nel loro stato non modulato (cioè basale) nei donatori sani e nei pazienti di LLC-B (suddivisi per stato IGHV).

Sono stati osservati livelli basali di fosforilazione significativamente più alti in cellule LLC-B rispetto a cellule B normali per le fosfoproteine p-Syk, p-Erkl/2 e p-NF-κΒ , come calcolato dal test della somma dei ranghi di Wilcoxon (Figura 12; vedi Figure 13 per un riassunto descrittivo dei dati basali delle proteine del segnalamento del BCR nelle cellule di LLC-B e nelle cellule B normali).

Tra i pazienti di LLC-B, non si sono riscontrate correlazioni statisticamente significative tra livelli basali di fosfoproteine del BCR e parametri biologici e clinici delle LLC-B, incluso lo stato mutazionale del gene IGHV , l'espressione di CD38 e ZAP-70 e lo stadio della malattia alla diagnosi secondo i criteri Binet (Figura 12 e dati non illustrati).

I profili del segnalamento dopo modulazione del BCR sono associati a parametri biologici di prognosi e al tempo di progressione

Per valutare se le caratteristiche biologiche e cliniche dei pazienti di LLC-B potessero essere distinte in base alla risposta delle cellule al legame del BCR, le variazioni dei livelli di fosforilazione di p-Syk, p-Erkl/2, p-NF-κΒ, p-p38 e p-JNK in risposta alla stimolazione del BCR sono state misurate nelle cellule di LLC-B e di cellule B normali dopo legame con anticorpi anti-IgM. In esperimenti preliminari svolti su 3 campioni di LLC-B per i quali erano disponibili diverse fiale, sono stati misurati livelli di fosforilazione di ogni proteina del segnalamento sia nelle cellule non stimolate sia in quelle stimolate a differenti tempi (15, 30, 60 minuti, dati non mostrati). Variazioni robuste (sebbene non necessariamente massime per ogni fosfoproteina) tra i livelli di fosforilazione basale e modulata sono state osservate 15 minuti dopo la stimolazione(dati non mostrati), quindi tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a questo tempo.

Per ogni fosfoproteina del BCR misurata, le risposte delle cellule di LLC-B e delle cellule B normali allo stimolo con anti-IgM sono state confrontate con lo stato basale ed espresse come log2 fold change. La Figura 10B illustra i risultati mettendo a confronto la fosforilazione delle proteine del segnalamento del BCR modulata dall'anti-IgM nei donatori sani e nei pazienti di LLC-B (suddivisi per stato IGHV). I dati delle proteine del segnalamento del BCR modulati dall'anti-IgM nelle cellule di LLC-B e nelle cellule B normali sono riassunti nella Figura 11. Le differenze nei cambiamenti dei livelli di fluorescenza indotti dall'anti-IgM tra cellule di LLC-B e cellule B normali non sono risultate significative per nessuna proteina del segnalamento del BCR (Figura 12). Tra i campioni di LLC-B, tuttavia, il legame del BCR ha indotto una fosforilazione significativamente più alta di p-Syk, p-Erkl/2 e p-NF-κΒ nel gruppo di pazienti "non mutati" rispetto a quello dei "mutati" (Figura 12).

I pazienti di LLC-B sono stati successivamente raggruppati sulla base della responsività del BCR usando il raggruppamento dei medoidi k. Come illustrato nella Figura 17, l'analisi non supervisionata del raggruppamento ha distinto due principali gruppi di pazienti di LLC-B: il primo (gruppo 1) comprendeva pazienti con una risposta nel complesso positiva al legame col BCR mentre il secondo (gruppo 2) era composto da casi con una risposta in generale nulla o negativa (vedi anche la Figura 11).

I due gruppi di LLC-B definiti dalla risposta del segnalamento del BCR sono stati considerati in relazione ai principali parametri biologici noti, al fine di ottenere una suddivisione prognostica dei pazienti di LLC-B. Per valutare la significatività delle associazioni tra parametri biologici e fosfoproteine modulate dall'anti-IgM è stato usato il test esatto di Fisher. Generalmente, i pazienti di LLC-B con una risposta complessivamente più alta alla stimolazione con anti-IgM (gruppo 1) avevano uno stato non mutato del gene IGHV, l'espressione in superficie di CD38 e la presenza della proteina ZAP-70 (P=0,0018, P=0,007 and P=0,013, rispettivamente). Tra i pazienti allo stadio A di Binet, il test di Fisher ha dimostrato una concordanza significativa tra la classificazione basata sul segnalamento e gli stati di IGHV, ZAP-70 e CD38 (P=0,0092, P=0,032, P=0,021, rispettivamente).

Le relazioni tra i profili di responsività del BCR e TTP sono stati esaminati per tutti i 27 pazienti di LLC-B. La mediana del TTP era di 27 mesi per i pazienti del gruppo 1 e di 76 mesi per i pazienti del gruppo 2 (test log-rank P=0,0091). La mediana del TTP e i test log-rank per i gruppi di pazienti basati sui marcatori biologici e i gruppi definiti in base al segnalamento del BCR in risposta all'anti-IgM sono riassunti nella Tabella 2.

Tabella 2. Mediana del TTP per i sottogruppi di pazienti definiti da parametri biologici e dal segnalamento Intero gruppo dei campioni dei pazienti

Gruppo con Gruppo con

prognosi prognosi Valore p del infausta positiva test log-rank (mesi) (mesi)

IGHV 27 111 0, 00012 ZAP-70 27 111 0, 000079 CD38 24 60 0, 0072 Segnalamento 27 76 0, 0091

del BCR

all'anti-IgM

Pazienti allo stadio Binet A

Gruppo con Gruppo con

prognosi prognosi Valore p del infausta positiva test log-rank (mesi) (mesi)

IGHV 42 111 0,00019 ZAP-70 42 111 0,00021 CD38 44 76 0,123 Segnalamento

del BCR 44 111 0,0089 all'anti-IgM

Sia che si sia esaminato l'intero gruppo dei campioni o solo i pazienti allo stadio A di Binet, non si è osservata una significativa differenza nelle curve di Kaplan-Meier per i pazienti a cui è stata predetta una prognosi positiva dal segnalamento del BCR rispetto allo stato mutazionale IGHV (test log-rank, P=0.58 per tutti i pazienti, P=0.74 per i pazienti allo stadio Binet A). Le curve per i pazienti allo stadio A di Binet sono illustrate nella Figura 14.

Modelli per l'intero gruppo di campioni: Per i modelli che comprendono una singola covariata clinica, lo stadio Binet, lo stato IgVH, lo stato di ZAP-70 e lo stato di CD38 sono tutti predittori significativi di TTP. Il segno dei coefficienti concorda con le associazioni prognostiche note per queste covariate. Cioè, coefficienti positivi per stadio Binet avanzato , IgVH non mutato, stato positivo di ZAP-70, e stato positivo di CD38 indicano che questi fattori sono associati ad un aumentato rischio di progressione e perciò a tempi di progressione generalmente più brevi. Lo stadio C di Binet ha un coefficiente positivo più alto dello stadio B di Binet, indicando che una malattia più avanzata alla diagnosi è associata a tempi di progressione più brevi. I modelli che comprendono un singolo parametro SCNP, tre nodi H2O2 e due nodi BCR forniscono modelli significativi. Questi nodi, presentati come (modulatore, elemento attivabile) includono: (H2O2, NF-KB) , (H202, p-p38), (H202, p-Erk), (BCR, p-Erk), e (BCR, p-Syk) . I coefficienti per i nodi H2O2 sono tutti negativi suggerendo che una risposta a H2O2 può indicare una prognosi migliore; mentre una risposta al BCR può implicare una prognosi più infausta. I migliori modelli basati sul parametro singolo SCNP superano il valore del LRT per CD38.

I modelli generati da un parametro SCNP e una covariata clinica si comportano abbastanza bene secondo il test del rapporto delle verosimiglianze; per esempio l'aggiunta di un parametro SCNP (H2O2/p-Erk) aumenta il valore di LRT per lo stadio Binet da 14,75 a 23,97 e (H2O2, p-NF-KB) aumenta il valore di LRT per lo stato IgVH da 14,75 a 17,86. Altre combinazioni di covariate cliniche con nodi SCNP includono: stadio Binet con (H2O2, p-p38), (H2O2, p-NF-KB) , (H202, p-Syk), (H202, p-JNK), e (BCR, p-Syk); IgVH con (BCR, p-p38); e stato di CD38 con (H2O2, p-p38).

Modelli per campioni allo stadio A di Binet (malattia precoce) : I modelli a singolo parametro SCNP riflettono quelli trovati per l'intero gruppo di dati, dove rimangono significativi gli stessi parametri SCNP e i segni dei coefficienti del modello di rischio rimangono gli stessi. Ci sono quattro modelli significativi costruiti da due parametri SCNP, con coppie di nodi illustrate nella Figura 6B . I segni dei parametri SCNP del BCR corrispondono ai segni dei parametri del BCR per l'intero gruppo di dati; anche i segni per i parametri H2O2 corrispondono ai segni per l'intero gruppo di dati. Per i rimanenti modelli dei pazienti allo stadio A di Binet, la combinazione di SCNP con le covariate cliniche, (BCR, p-Erk) è compresa coerentemente .

L'analisi univariata della sopravvivenza ha identificato segnalamenti maggiori per p-Erk (P=0,047) e p-Syk (P=0,057) in risposta al legame del BCR, stato IGHV non mutato (P=0,0055), e positività di ZAP-70 (P=0,0026) come predittori significativi e indipendenti di TTP più breve. CD38 non era un predittore significativo (P=0,14).

Nell'analisi multivariata sono stati trovati modelli significativi combinando il segnalamento di p-Erk in risposta al legame del BCR con la positività di ZAP-70 e lo stato IGHV non mutato, individualmente. I coefficienti, i valori p, i test del rapporto delle verosimiglianze e i coefficienti C di Harrell per ogni modello sono riassunti nella tabella 3.

Tabella 3. Riassunto dei modelli univariati e multivariati per TTP

La risposta al trattamento con H202 discrimina differenti reti di segnalamento del BCR tra cellule B leucemiche e normali e tra sottogruppi di LLC-B.

La rete di segnalamento del BCR è stata perturbata mediante trattamento delle cellule con H202, che inibisce l'attività delle proteine tirosin fosfatasi (PTP), spostando pertanto l'equilibrio in favore dell'attivazione delle chinasi (28). Sono state poi misurate le variazioni nei livelli di fosforilazione in p-Syk, p-Erkl/2, p-NF-κΒ, p-p38 e p-JNK nelle LLC-B e nelle cellule B in seguito al trattamento con H202. In modo simile alla stimolazione con anti-IgM, esperimenti preliminari eseguiti su campioni di LLC-B hanno dimostrato che variazioni robuste tra livello basale e fosforilazione modulata, sebbene non necessariamente massime per tutte le fosfoproteine, sono state osservate 15 minuti dopo la stimolazione, quindi tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a questo tempo. Per ogni fosfoproteina misurata, i livelli di fosforilazione in presenza di H2O2 sono stati comparati con quelli basali ed espressi in log2 fold change . La Figura 10C mostra i risultati ottenuti comparando la fosforilazione delle proteine del segnalamento del BCR modulata da H2O2 in donatori sani e in pazienti con LLC-B (suddivisi per stato IGHV).

Il trattamento con H2O2 induceva un aumento variabile nei livelli di fosforilazione di tutte le proteine del segnalamento del BCR nei campioni di pazienti con LLC-B. Al contrario, nelle cellule B normali non sono stati osservate variazioni a seguito della stimolazione con H202 in nessuna fosfoproteina (Figura 10C e Figura 15). Il test della somma dei ranghi di Wilcoxon ha dimostrato che differenze nei livelli di fosforilazione dopo modulazione con H2O2 tra LLC-B e cellule B normali erano significive per p-Erkl/2, p-NF-κΒ, p-p38 e p-JNK (Figura 12).

La comparazione delle variazioni di MFI indotti da H2O2 nelle proteine del segnalamento del BCR tra gruppi di LLC-B ulla base dello stato IGHV ha rivelato una risposta generale più alta al trattamento con H2O2 nel gruppo di pazienti "mutati" rispetto ai "non mutati" (Figura 10C). In particolare, sono stati osservati livelli di fosforilazione più elevati di p-Erk, p-NF-κΒ e p-p38 nel gruppo dei pazienti LLC-B "mutati", anche se le differenze sono state statisticamente significative solo per p-p38 (Figura 12). Inoltre, è stata osservata un'aumentata fosforilazione di p-Erkl/2 dopo la modulazione con H2O2 nel 36% dei pazienti CLL "non mutati" e nell'85% dei "mutati" (Figura 15). Quando i pazienti di LLC-B sono stati suddivisi sulla base della responsività del legame del BCR, le cellule di LLC-B nel gruppo 2 ha mostrato un più alto aumento dello stato di fosforilazione in risposta alla H2O2 rispetto ai pazienti del gruppo 1 (dati non mostrati).

Non è stata trovata un'associazione significativa tra livelli di fosforilazione delle proteine analizzate dopo modulazione con H2O2 e altri parametri prognostici come lo stadio Binet e la percentuale di cellule che esprimono CD38 o ZAP-70 (dati non mostrati).

Discussione

In questo studio, usando campioni di pazienti con LLC-B non trattati, abbiamo definito, dopo modulazione del BCR, profili di segnalamento che sono concordanti con altri parametri prognostici della LLC-B, come lo stato mutazionale di IGHV, la presenza di ZAP-70, e l'espressione di CD38. Inoltre, abbiamo dimostrato che i profili modulati dal BCR sono associati in modo significativo al TTP e, cosa più importante, implementano il modello TTP per lo stato mutazionale IGHV e la positività di ZAP-70, suggerendo di conseguenza che essi possono fornire informazioni prognostiche addizionali e indipendenti rispetto ai classici fattori prognostici.

Per analizzare i livelli di fosfoproteine sulla via di segnalamento del BCR abbiamo usato la citometria a flusso multiparametrica, che implica la misurazione simultanea e a livello di singola cellula, di fosfoproteine multiple all'interno di un circuito biochimico, fornendo perciò un'analisi a "livello di rete" del segnalamento del BCR (29). In base ai risultati descritti precedentemente, i profili modulati (ma non basali) del segnalamento del BCR possono essere considerati come marcatori con significato prognostico nelle LLC-B. Specificamente, l'aumentato segnalamento di p-Erk o p-Syk in risposta all' anti-IgM è stato associata a TTP più breve e pazienti con IGHV non mutato hanno evidenziato un più alto segnalamento in p-Erk and p-Syk in risposta alla stimolazione con anti-IgM. È notevole che l'associazione anti-IgM:p-Erk con TTP ha implementao anche il potere predittivo dei marcatori ZAP-70 e IGHV, fornendo perciò informazioni prognostiche indipendenti rispetto a quelle dei fattori prognostici classici nella LLC-B.

Oltre alla loro rilevanza prognostica, i profili di segnalamento del BCR possono fornire una più profonda comprensione del ruolo del segnalamento del BCR nella patogenesi della LLC-B, aprendo perciò la strada all'identificazione di nuovi possibili bersagli terapeutici .

Un'ampia frazione di campioni di LLC-B nel nostro studio mostra la fosforilazione costitutiva delle fosfoproteine Syk, Erk ed NF-κΒ. La fosforilazione costitutiva a livello del residuo attivatorio Y352 è compatibile con un report recente di Gobessi et al., che mostra come Syk sia costitutivamente fosforilata in Y352 nella maggior parte delle cellule B di LLC (30). La fosforilazione costitutiva di Syk è stata anche riscontrata in diversi linfomi a cellule B ed è stato evidenziato che questa regola la sopravvivenza e la crescita delle cellule leucemiche (30-32). Considerati nel loro insieme, questi dati suggeriscono che l'attivazione costitutiva di Syk può giocare un ruolo nella patogenesi di molte forme di cancro a cellule B. La maggior parte dei pazienti di LLC-B mostra inoltre un'alta fosforilazione costitutiva di NF-κΒ a livello della serina 529 della subunità p65, quando confrontata con le cellule B normali. La fosforilazione in S529 di p65 nel suo dominio di transattivazione è richiesta per una ottimale attivazione di NF-κΒ, dunque i nostri dati sono in accordo con un precedente report che ha descritto un'attivazione intrinseca di NF-κΒ nella LLC-B (33). La via di segnalamento di NF-κΒ gioca un ruolo cruciale nella tumorigenesi per la sua capacità di modulare la sopravvivenza cellulare (34); dunque la sua attivazione suggerisce un ruolo per NF-κΒ nella biologia delle cellule di LLC-B. La fosforilazione costitutiva di Erkl/2 è presente in circa la metà dei casi di LLC-B, in accordo con i dati descritti recentemente da Muzio et al (17). Nel loro insieme, questi dati rivelano che le cellule di LLC-B possiedono un livello più alto di segnalamento tonico del BCR rispetto alle cellule B normali. Il segnalamento tonico del BCR è necessario alle cellule B normali per svilupparsi, mantenersi e sopravvivere adeguatamente (34) ed è stato dimostrato recentemente che anche le cellule B maligne richiedono l'espressione di un BCR funzionale (30-32, 35) . I livelli basali più alti nei profili di segnalamento del BCR osservati per la LLC-B suggeriscono che un segnalamento tonico del BCR, indipendente dall'antigene può essere coinvolto in meccanismi oncogenici. Poiché noi non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli basali tra i due sottogruppi clinico-biologici di LLC-B, queste osservazioni suggeriscono che tali meccanismi possono forse essere caratteristici di una fase comune di trasformazione neoplastica .

Al contrario, i profili di segnalamento modulati dallo stimolo del BCR sono associati con la progressione clinica della malattia. Specificamente, l'analisi non supervisionata del raggruppamento distingue due gruppi di pazienti con differenti risposte di segnalamento allo stimolo del BCR. Nel loro insieme, i pazienti appartenenti al primo gruppo (gruppo 1) evidenziano risposte significativamente più alte in termini di incremento nei livelli di fosforilazione rispetto ai pazienti appartenenti al secondo gruppo (gruppo 2). Inoltre, il gruppo 1 comprende pazienti che hanno uno stato mutazionale dei geni IGHV non mutato, e positività nell'espressione di ZAP-70 e CD38 mentre i pazienti appartenenti al gruppo 2 mostrano geni IGHV mutati e sono negativi per l'espressione di ZAP-70 e CD38. Queste osservazioni sono in accordo con recenti studi che evidenziano come i casi di LLC-B con geni IGHV non mutati, positivi per l'espressione di ZAP-70 e CD38 abbiano un'aumentata capacità di rispondere al legame delle IgM di superficie, come misurato dalla fosforilazione di Syk e dalla mobilizzazione del Ca2+ intracellulare (15, 36, 37). In aggiunta, qui abbiamo mostrato come anche la fosforilazione di Erk e NF-κΒ sia significativamente e simultaneamente aumentata in risposta alla modulazione con IgM in questo sottogruppo di pazienti. Ancora più rilevante è che i pazienti del gruppo 1 mostrano un TTP significativamente più basso quando confrontati con i pazienti del gruppo 2. Nel loro insieme, queste osservazioni mettono in luce una capacità differenziale del BCR di rispondere in due categorie prognostiche di campioni di LLC-B e sostengono l'ipotesi secondo cui la stimolazione antigenica influenza il comportamento delle cellule leucemiche e rappresenta un evento cruciale nella storia naturale della LLC-B.

La ridotta capacità dei campioni di LLC-B del gruppo 2 di rispondere alla stimolazione del BCR ricorda la caratteristica molecolare di anergia B cellulare definita nei modelli transgenici di topo (38). Inoltre, le cellule B di LLC che non rispondono alla stimolazione del BCR presentano la fosforilazione di Erk 1/2 e p38 in presenza di inibizione delle fosfatasi. Questo dato indica che alcune proteine di segnalamento del BCR possono essere attivate da segnali che aggirano il BCR e anche questo è in accordo con un tratto anergico descritto nei modelli transgenici di topo (39). A conferma di questi dati, è stato recentemente descritto un tratto anergico in un sottogruppo di pazienti di LLC-B con un basso stadio di malattia (17).

Quindi, abbiamo usato ΙΉ2Ο2 (un noto inibitore delle fosfatasi) con lo scopo di rivelare differenze basali nella rete del BCR tra i pazienti di LLC-B. Infatti, H2O2 inibisce l'attività delle PTP associate al BCR ed è stata usata con successo per amplificare la grandezza e la durata del segnalamento del BCR (40, 41) nelle cellule B normali e neoplastiche. Collettivamente, il trattamento con H2O2 induce risposte più alte in termini di aumento degli stati di fosforilazione nei pazienti con geni IGHV mutati rispetto ai pazienti non mutati, dimostrando perciò un comportamento inversamente correlato rispetto alle risposte del BCR. Quando i pazienti di LLC-B vengono raggruppati in base alla responsività al legame del BCR, si può osservare un simile comportamento di relazione inversa tra le risposte al legame del BCR e il trattamento con H2O2. Perciò, nel gruppo 2 la capacità di rispondere alla modulazione dell'IgM aumentando gli stati di fosforilazione delle proteine del BCR (come osservato nel gruppo 1) sembra essere inibito da alti livelli di attività fosfatasica intracellulare. Considerate nel insieme, queste scoperte suggeriscono l'esistenza di una differente attività fosfatasica nelle categorie prognostiche di campioni di LLC-B.

Nei modelli che includono una singola covariata clinica (tabulati in Figura 16A) lo stadio di Binet, lo stato IgVH, lo stato di ZAP70 e lo stato di CD38 sono tutti predittori significativi di TTP. Il segno dei coefficienti concorda con le associazioni prognostiche note per queste covariate. Cioè coefficienti positivi per stadio di Binet avanzato, IgVH non mutato, stato positivo di ZAP70 e stato positivo di CD38 indicano che questi fattori sono associati con un rischio di progressione aumentato e quindi generalmente con un tempo di progressione più corto. Lo stadio C di Binet ha un coefficiente largamente più positivo rispetto allo stadio B di Binet, indicando che una malattia più avanzata alla diagnosi è associata a un tempo di progressione più corto.

Per i modelli che comprendono un parametro di SCNP (tabulati in Figura 4A), tre nodi H2O2 e due nodi BCR producono modelli significativi. I coefficienti per i nodi H2O2 sono tutti negativi, suggerendo che una risposta a H2O2 possa indicare una prognosi migliore; invece risposte al BCR possono implicare una prognosi peggiore. Il miglior modello basato su singolo parametro SCNP supera il valore di LRT per CD38, suggerendo che SCNP può fornire informazioni prognostiche migliori dello stato di CD38.

Per i modelli che includono due covariate cliniche tabulate in Figura 16B, sia lo stato IgVH sia lo stato di ZAP70 si associano con lo stadio di Binet per modelli significativi; anche lo stato IgVH e ZAP70 si associano per generare un modello significativo. Modelli che includono due parametri di SCNP si avvicinano ai risultati di LRT visti per singole covariate cliniche (tabulati in Figura 4B), suggerendo un valore prognostico comparabile. È interessante notare che i modelli più significativi con due parametri di SCNP includono sempre un nodo basato su BCR e un nodo basato su H2O2. Modelli generati da un parametro di SCNP (tabulati in Figura 6C) e una covariata clinica si comportano abbastanza bene secondo il test del rapporto delle verosimiglianze; per esempio aggiungendo un parametro di SCNP (H202→p-Erk) si incrementa il valore di LRT per lo stadio di Binet da 14,75 a 23,97 e H202→p-NF-KB incrementa il valore di LRT per lo stato IgVH da 14,75 a 17,86.

I modelli che comprendono due covariate cliniche e un singolo parametro di SCNP tabulato in Figura 7B dimostrano che i parametri di SCNP possono migliorare enormemente l'accuratezza della diagnostica clinica standard. Qui vediamo che una singola lettura di SCNP (generalmente basata su H2O2) può migliorare il risultato di LRT per combinazioni di stato di IgVH o ZAP70 con stadio avanzato di Binet.

Modelli con due parametri di SCNP e una singola covariate clinica non migliorano di molto rispetto ai modelli a singolo parametro SCNP e singolo parametro clinico (migliore LRT di 26,47 versus 23,97)

Data la distribuzione della popolazione osservata per i vari stadi Binet e considerate le esigenze prognostiche percepite, i modelli sono stati creati solo per i campioni allo stadio A di Binet (malattia precoce). Questi sono risultati in una dimensione del campione di 21 pazienti. Poiché questa popolazione ha generalmente un più lungo tempo di progressione e quindi un rischio basale minore, ci sono meno possibilità di miglioramento e quindi i valori LRT saranno generalmente più bassi che quelli per i modelli costruiti sull'intero gruppo di dati.

All'interno del gruppo di pazienti con stadio A di Binet, lo stato IgVH e lo stato di ZAP70 producono individualmente modelli significativi. Al contrario del gruppo completo di dati, lo stato di CD38 non è un fattore significativo per il gruppo allo stadio A di Binet. I modelli a singolo parametro di SCNP per i pazienti allo stadio A di Binet (tabulati in Figura 6A) rispecchiano quelli trovati per l'insieme completo di dati, con gli stessi parametri SCNP che rimangono significativi e con i segni dei coefficienti del modello di rischio che restano gli stessi.

La combinazione dello stato IgVH con lo stato di ZAP70 (tabulato in Figura 9B) produce un modello significativo per i pazienti con stadio A di Binet. Ci sono quattro modelli significativi (tabulati in Figura 6B) costruiti da due parametri SCNP. Questi modelli seguono inoltre lo schema di un nodo BCR con un nodo H2O2 visto per tutto l'insieme di dati, sebbene gli specifici nodi sono in qualche modo differenti da quelli per i modelli costruiti per l'insieme completo di dati. Molti dei nodi sono correlati così che verosimilmente trasmettono informazioni simili, ma alcuni possono adattarsi meglio di altri al rispettivo gruppo di dati. I segni dei parametri SCNP del BCR concordano con i parametri del BCR per tutto l'insieme di dati; allo stesso modo concordano i segni per ΙΉ2Ο2· Per gli altri modelli dei pazienti a stadio Binet A (tabulati in Figura 6C, Figura7A, e Figura 7B), nel combinare SCNP con covariate cliniche, BCR → p-Erk è incluso in modo coerente. Inoltre questi modelli includono coerentemente IgVH e lo stato di ZAP70. Il modello con un parametro SCNP e due covariate cliniche aggiuntive (al di là della divisione secondo lo stadio Binet) sembra incerto rispetto al sesso come covariata significativa; il sesso non è stato selezionato come un predittore indipendente o in altri modelli.

Questi dati sono d'accordo con ciò che è noto dalla letteratura. Ad esempio, IgVH non mutata e gli stati ZAP70 positivi sono associati a prognosi peggiori. È interessante notare che sembra esserci evidenza che la reattività del BCR è associata a tempi più brevi di progressione e, per converso, la reattività all'H202 è legata a una migliore prognosi.

Vi sono evidenze che suggeriscono che SCNP offre l'opportunità di migliorare la valutazione prognostica per il classico gruppo di pazienti a basso rischio, con "vigile attesa". E' evidente dai dati demografici in questo insieme e dagli studi di letteratura che vi è una vasta gamma di tempi di progressione per questi pazienti suggerendo che questo è il gruppo che più richiede un miglioramento degli strumenti prognostici.

In conclusione il nostro studio mostra che i profili di segnalamento del BCR nelle LLC-B sono associati alla progressione della malattia, migliorano il valore prognostico dei biomarcatori correntemente in uso e forniscono informazioni funzionali e differenziali nella patogenesi di questa malattia eterogenea. Queste nuove conoscenze a loro volta possono essere rilevanti per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.

Anche se nella presente invenzione sono stati mostrati e descritti di preferenza alcune forme di realizzazione, è ovvio a coloro che sono esperti dell'arte che tali forme di realizzazione sono indicati solamente come esempi. Numerose varianti, modifiche e sostituzioni possono venire in mente agli esperti dell'arte, senza discostarsi dall'invenzione. Deve essere compreso che varie alternative alle forme di realizzazione dell'invenzione qui descritta possono essere applicate per l'esecuzione dell'invenzione. È inteso che le seguenti rivendicazioni definiscono lo scopo dell'invenzione e che i metodi e le strutture nel campo di applicazione di queste rivendicazioni e loro equivalenti siano in tal modo coperte.

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo in vitro di classificazione, diagnosi, prognosi e/o previsione dell'esito di una condizione neoplastica e/o ematopoietica in un individuo, detto metodo comprendendo : a) portare a contatto una cellula con almeno un modulatore selezionato dal gruppo che consiste di H202, uno o più reticolanti del recettore delle cellule B (BCR), PMA, BAFF, Aprii, SDFla, CD40L, IGF-1, Imiquimod, poliCpG, IL-7, IL-6, IL-10, IL-27, IL-4, IL-2, IL-3, tapsigargina, o una combinazione di essi; b) determinare la presenza o l'assenza di un aumento nel livello di attivazione di uno o più elementi attivabili in detta cellula, in cui detto uno o più elementi attivabili è/sono selezionato/i dal gruppo che consiste di JNK1, p38, Erkl, Syk, e NF-KB.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto reticolante del recettore delle cellule B (BCR) è selezionato dal gruppo che consiste di F(ab)2 IgM, F(ab)2 IgG, F(ab)2 IgD, anticorpi policlonali per il BCR, anticorpi monoclonali per il BCR, elementi di legame derivati dal recettore Fc, anticorpi policlonali IgM, anticorpi monoclonali IgM, F(ab)2 IgCM biotinilati, anticorpi policlonali IgM biotinilati, e anticorpi monoclonali IgM biotinilati.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta cellula è una cellula tumorale o una cellula di derivazione ematopoietica .
4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detta cellula di derivazione ematopoietica è selezionata dal gruppo che consiste di cellule ematopoietiche staminali pluripotenti , cellule progenitrici della linea B-linfocitica, cellule derivate dalla linea B-linfoci tica, cellule progenitrici della linea T-linf ocitica, cellule derivate dalla linea T-linf ocitica, cellule progenitrici della linea delle cellule NK, cellule derivate dalla linea delle cellule NK, cellule progenitrici della linea granulocitica, cellule derivate dalla linea granulocitica, cellule progenitrici della linea monocitica, cellule derivate dalla linea monocitica, cellule progenitrici della linea megacariocit ica, cellule derivate dalla linea megacariocitica, cellule progenitrici della linea eritroide, e cellule derivate dalla linea eritroide.
5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui detta cellula di derivazione ematopoietica è una cellula progenitrice della linea B linfocitica o una cellula derivata dalla linea B linfocitica.
6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detta cellula progenitrice della linea B linfocitica o cellula derivata dalla linea B linfocitica è selezionata dal gruppo che consiste di una cellula pro-B precoce, una cellula pro-B tardiva, una cellula pre-B grande, una cellula pre-B piccola, una cellula B immatura, una cellula B matura, una plasmacellula, una cellula B di memoria, una cellula B CD5+ o una cellula B che esprime ZAP-70.
7. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta condizione neoplastica e/o ematopoietica è un disturbo delle cellule B o di cellule derivate dalla linea B liniocitica .
8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui detto disturbo delle cellule B o di cellule derivate dalla linea B linfocitica è selezionato dal gruppo che consiste di leucemia linfatica cronica (LLC), leucemia della linea dei linfociti B, linfoma della linea dei linfociti B, mieloma multiplo, e un disturbo delle plasmacellule.
9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detto disturbo delle cellule B o di cellule derivate dalla linea B linfocitica è leucemia linfatica cronica (LLC).
10. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta cellula è portata a contatto con due o più modulatori.
11. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il livello di attivazione è selezionato dal gruppo che consiste di taglio mediante esposizione a proteasi extracellulari o intracellulari, formazione di nuovi eterooligomeri, livello di glicosilazione, livello di fosforilazione, livello di acetilazione, livello di metilazione, livello di biotinilazione, livello di glutamilazione, livello di glicilazione, livello di idrossilazione, livello di isomerizzazione, livello di prenilazione, livello di miristilazione, livello di lipoilazione, livello di fosfopanteteinilazione, livello di soli atazione, livello di ISGlazione, livello di nitrosilazione, livello di palmitoilazione, livello di SUMOlizzazione, livello di ubiquitinazione, livello di neddilazione, livello di citrullinazione, livello di deamilazione, livello di formazione del legame disulfidico, livello di taglio proteolitico, livello di traslocazione, variazioni nel riciclo delle proteine, livello del complesso multi-proteico, livello di ossidazione, complesso multi-lipide e cambi biochimici della membrana cellulare.
12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto livello di attivazione è un livello di fosforilazione.
13. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui nella fase b), un modello di rischio proporzionale comprendente detta presenza o assenza di un aumento nel livello di attivazione di detto uno o più elementi attivabili ha un valore di indice C di almeno 0,6.
14. Kit comprendente almeno un modulatore selezionato dal gruppo che consiste di F(ab)2 IgM, F(ab)2 IgG, F(ab)2 IgD, anticorpi policlonali per il BCR, anticorpi monoclonali per il BCR, elementi di legame derivati dal recettore Fc, anticorpi policlonali IgM, anticorpi monoclonali IgM, F(ab)2 IgCM biotinilati, anticorpi policlonali IgM biotinilati, e anticorpi monoclonali IgM biotinilati, H202, PMA, BAFF, Aprii, SDFla, CD40L, IGF-1, Imiquimod, poliCpG, IL-7, IL-6, IL-10, IL-27, IL-4, IL-2, IL-3, tapsigargina e/o una combinazione di essi, e un elemento legante specifico dello stato.
15. Kit secondo la rivendicazione 14, in cui l'elemento legante specifico dello stato è un anticorpo specifico dello stato di attivazione.
16. Kit secondo la rivendicazione 15, in cui 1'anticorpo specifico dello stato di attivazione è un anticorpo fosfospecifico.
17. Kit secondo la rivendicazione 16, in cui 1'anticorpo fosfospecifico è selezionato dal gruppo che consiste di anticorpo specifico per fosfo-JNKl, anticorpo specifico per fosfo-p38, anticorpo specifico per fosfo-Erkl, anticorpo specifico per fosfo-Syk, e anticorpo specifico per fosfo-NF-KB.
18. Modulatore selezionato dal gruppo che consiste di F(ab)2 IgM, F(ab)2 IgG, F(ab)2 IgD, anticorpi policlonali per il BCR, anticorpi monoclonali per il BCR, elementi di legame derivati dal recettore Fc, anticorpi policlonali IgM, anticorpi monoclonali IgM, F(ab)2 IgCM biotinilati, anticorpi policlonali IgM biotinilati, e anticorpi monoclonali IgM biotinilati, H202, PMA, BAFF, Aprii, SDFla, CD40L, IGF-1, Imiquimod, poliCpG, IL-7, IL-6, IL-10, IL-27, IL-4, IL-2, IL-3, tapsigargina e/o una combinazione di essi, per uso nella classificazione, diagnosi, prognosi e/o previsione dell'esito di una condizione neoplastica e/o ematopoietica in un individuo.