ITTO20100212A1

ITTO20100212A1 - "PROCEDURE FOR THE GENERATION AND ANALYSIS OF SIGNALS OF ELECTROCHEMILUMINESCENCE AND ITS SYSTEM"

Info

Publication number: ITTO20100212A1
Application number: IT000212A
Authority: IT
Inventors: Roberto Canova; Pierluigi Civera; Ciana Leopoldo Della; Danilo Demarchi; Alessandro Sanginario; Marco Turturici
Original assignee: Cyanagen S R L; Torino Politecnico
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2011-09-20

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: DESCRIPTION of the industrial invention entitled:

“Procedimento per la generazione e l’analisi di segnali di elettrochemiluminescenza e relativo sistema” "Procedure for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals and related system"

TESTO DELLA DESCRIZIONE TEXT OF THE DESCRIPTION

La presente invenzione si riferisce a un procedimento per la generazione e l’analisi di segnali di elettrochemiluminescenza, che comprende le operazioni di generare uno stimolo in una cella elettrochimica comprendente un elettrodo di lavoro comprendente nanotubi di carbonio in contatto con una soluzione da misurare, cui è applicato detto stimolo, e rilevare e analizzare un segnale di elettrochemiluminescenza rappresentativo di radiazione di elettrochemiluminescenza emessa da detta soluzione in risposta a detto stimolo. The present invention relates to a process for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals, which comprises the operations of generating a stimulus in an electrochemical cell comprising a working electrode comprising carbon nanotubes in contact with a solution to be measured, which said stimulus is applied, and detecting and analyzing an electrochemiluminescence signal representative of electrochemiluminescence radiation emitted by said solution in response to said stimulus.

L’elettrochemiluminescenza (ECL) è definita come la generazione di luce per trasferimento elettronico fra specie generate elettrochimicamente. Tramite applicazioni dell’elettrochemiluminescenza si è riusciti a realizzare l’analisi ultrasensibile di biomolecole in soluzione e la conseguente produzione e commercializzazione di analizzatori ECL, rivolti alla diagnosi precoce di malattie in applicazioni cliniche, patologie, analisi chimiche in generale, test immunologici. Electrochemiluminescence (ECL) is defined as the generation of light by electron transfer between electrochemically generated species. Through applications of electrochemiluminescence it has been possible to carry out the ultrasensitive analysis of biomolecules in solution and the consequent production and marketing of ECL analyzers, aimed at the early diagnosis of diseases in clinical applications, pathologies, chemical analyzes in general, immunological tests.

Gli studi sulla ECL si sono dapprima orientati sullo studio del Ru(bpy) in soluzione di MeCN. Il meccanismo relativo è comunemente chiamato annichilazione diretta catione-anione. Quindi la scoperta di ECL per il Ru(bpy) solubile in acqua ha suggerito la possibilità di ottenere la ECL acquosa, in particolare dopo aver accertato che anche il Ru(bpy) era ragionevolmente stabile in soluzione acquosa. L’inconveniente è tuttavia che la finestra di potenziale applicato alla quale si ha l'idrolisi dell'acqua è ridotta se paragonata a solventi aprotici come il MeCN. Si evidenzia quindi la necessità di specie idrosolubili che possano generare il riducente per la reazione con il Ru(bpy) per ossidazione piuttosto che per riduzione. Tali specie sono note come coreagenti. Si è trovato che l’anione ossalato si comporta come coreagente, ciò permettendo di generare ECL tramite semplice ossidazione di Ru(bpy) e ossalato in miscela. Un coreagente più efficace per il Ru(bpy) è la tri-n-propilammina (TPrA), a pH vicini a 7. L’utilizzo di ECL acquosa e di coreagenti ha reso l’ECL adatta all’impiego in applicazioni bioanalitiche. I correnti metodi analitici basati sull’ECL permettono di rilevare biomolecole in un ampio campo di pesi molecolari. L’ECL permette, ad esempio, di monitorare con precisione la concentrazione o presenza di specifiche proteine, loro sequenze e sequenze di DNA. La generazione elettrochimica dello stato eccitato permette vantaggiosamente di ottenere assenza di scattering della sorgente di eccitazione, un’emissione di fondo molto bassa e la possibilità di controllare la generazione di luce sia spazialmente che temporalmente. Infine, l’ECL richiede una strumentazione dal costo relativamente contenuto rispetto ad altre tecniche con prestazioni simili. L’ECL, per la sua sensibilità, elevata specificità e semplicità di misura è impiegata perciò in campi come la diagnosi clinica, analisi di alimenti e ricerca di nuovi materiali. The ECL studies were first oriented on the study of Ru (bpy) in MeCN solution. The relative mechanism is commonly called direct cation-anion annihilation. Thus the discovery of ECL for water-soluble Ru (bpy) suggested the possibility of obtaining aqueous ECL, in particular after ascertaining that Ru (bpy) was also reasonably stable in aqueous solution. The drawback, however, is that the window of potential applied at which water hydrolysis occurs is reduced when compared to aprotic solvents such as MeCN. There is therefore a need for water-soluble species that can generate the reducing agent for the reaction with Ru (bpy) by oxidation rather than by reduction. Such species are known as co-reactants. It has been found that the oxalate anion behaves as a coreagent, thus allowing to generate ECL by simple oxidation of Ru (bpy) and oxalate in a mixture. A more effective coreagent for Ru (bpy) is tri-n-propylamine (TPrA), at pH close to 7. The use of aqueous ECL and co-reagents has made the ECL suitable for use in bioanalytical applications. Current analytical methods based on ECL allow to detect biomolecules in a wide range of molecular weights. The ECL allows, for example, to accurately monitor the concentration or presence of specific proteins, their sequences and DNA sequences. The electrochemical generation of the excited state advantageously allows to obtain the absence of scattering of the excitation source, a very low background emission and the possibility of controlling the generation of light both spatially and temporally. Finally, ECL requires relatively low cost instrumentation compared to other techniques with similar performance. Due to its sensitivity, high specificity and simplicity of measurement, the ECL is therefore used in fields such as clinical diagnosis, food analysis and research of new materials.

Le tecniche ECL richiedono in generale l’uso di elettrodi per applicare l’eccitazione, ad esempio usando tecniche di voltammetria, una tecnica già impiegata per la misura della risposta elettrica fornita dal campione (in soluzione) quando questo venga inserito in un sistema elettrochimico, ovvero un insieme opportunamente strutturato di conduttori. Gli elettrodi ECL per eseguire saggi biologici e test medici sono tipicamente fatti di materiali quali argento, platino, oro e altri metalli nobili. Le prestazioni di tali sistemi sono tuttavia influenzate da molti fattori, fra i quali principalmente il rumore di fondo, ed eventuali effetti di polarizzazione degli elettrodi, le basse correnti e quindi una conseguente bassa intensità di segnale e efficienza d’elettrodo. Un basso rapporto segnale rumore (SNR) riduce la sensibilità di una cella ECL, riducendo così la possibilità di rilevazione a bassi volumi del target, o campione. Le fotocorrenti che passano tipicamente nei fotorivelatori hanno valori da fA a pochi μA, determinati dall’emissione di pochi fotoni. ECL techniques generally require the use of electrodes to apply excitation, for example using voltammetry techniques, a technique already used for measuring the electrical response provided by the sample (in solution) when it is inserted into an electrochemical system, or a suitably structured set of conductors. ECL electrodes for performing biological assays and medical tests are typically made of materials such as silver, platinum, gold and other noble metals. The performance of these systems is however influenced by many factors, including mainly the background noise, and any polarization effects of the electrodes, the low currents and therefore a consequent low signal intensity and electrode efficiency. A low signal-to-noise ratio (SNR) reduces the sensitivity of an ECL cell, thereby reducing the possibility of low-volume detection of the target, or sample. The photocurrents that typically pass through the photodetectors have values from fA to a few μA, determined by the emission of a few photons.

La presente invenzione si prefigge lo scopo di realizzare un procedimento per la generazione e l’analisi di segnali di elettrochemiluminescenza che risolva gli inconvenienti dell’arte nota, permettendo in particolare di ottenere un elevato rapporto segnale/rumore. The present invention aims to achieve a process for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals that solves the drawbacks of the prior art, allowing in particular to obtain a high signal / noise ratio.

Secondo la presente invenzione, tale scopo viene raggiunto grazie ad un procedimento per la generazione e l’analisi di segnali di elettrochemiluminescenza avente le caratteristiche richiamate in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono. L’invenzione riguarda anche un corrispondente sistema di generazione e analisi di segnali di elettrochemiluminescenza. According to the present invention, this purpose is achieved thanks to a process for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals having the characteristics referred to specifically in the following claims. The invention also relates to a corresponding system for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals.

Il procedimento per la generazione e l’analisi di segnali di elettrochemiluminescenza secondo l’invenzione permette di ottenere un segnale periodico basato sullo specifico comportamento di nano strutture di carbonio, in particolare di nanotubi in carbonio, che viene sfruttato per prelevare l’informazione contenuta nel segnale concentrata in un preciso istante. Si ottiene così una diminuzione del contributo di rumore, il quale è distribuito in modo casuale sull’intero periodo del segnale. Tramite il procedimento e sistema secondo l’invenzione, il miglioramento del rapporto segnale/rumore permette di operare con soluzioni aventi più bassa concentrazione di molecole e dualmente di ottenere maggior precisione e sensibilità (detection limit). The process for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals according to the invention allows to obtain a periodic signal based on the specific behavior of carbon nanostructures, in particular carbon nanotubes, which is exploited to collect the information contained in the signal concentrated in a precise instant. This results in a decrease in the noise contribution, which is randomly distributed over the entire signal period. Through the method and system according to the invention, the improvement of the signal / noise ratio allows to operate with solutions having a lower concentration of molecules and at the same time to obtain greater precision and sensitivity (detection limit).

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione risulteranno dalla descrizione che segue con riferimento ai disegni annessi, forniti a puro titolo di esempio non limitativo, in cui: Further features and advantages of the invention will emerge from the following description with reference to the attached drawings, provided purely by way of non-limiting example, in which:

- la figura 1 rappresenta una vista schematica di un sistema implementante il procedimento secondo l’invenzione; - Figure 1 represents a schematic view of a system implementing the process according to the invention;

- la figura 2 rappresenta un dettaglio del sistema di figura 1; figure 2 represents a detail of the system of figure 1;

- la figura 3 mostra un diagramma rappresentante un segnale di stimolo impiegato dal procedimento secondo l’invenzione; - Figure 3 shows a diagram representing a stimulus signal used by the process according to the invention;

- le figure 4a e 4b mostrano diagrammi di segnali di elettrochemiluminescenza in funzione del tempo e della tensione per differenti concentrazioni generati da un sistema secondo l’arte nota; - Figures 4a and 4b show diagrams of electrochemiluminescence signals as a function of time and voltage for different concentrations generated by a system according to the prior art;

- la figura 5 mostra uno schema a blocchi rappresentativo di passi del procedimento secondo l’invenzione; - Figure 5 shows a block diagram representing the steps of the process according to the invention;

- le figure 6a e 6b mostrano diagrammi rappresentativi dei segnali delle figure 4a e 4b dopo un passo di filtraggio; Figures 6a and 6b show diagrams representing the signals of Figures 4a and 4b after a filtering step;

- le figure 7a e 7b mostrano diagrammi rappresentativi di segnali di elettrochemiluminescenza in funzione del tempo generati da un sistema secondo l’arte nota e da un sistema secondo l’invenzione; - Figures 7a and 7b show representative diagrams of electrochemiluminescence signals as a function of time generated by a system according to the prior art and by a system according to the invention;

- le figure 8a e 8b mostrano diagrammi di segnali di elettrochemiluminescenza in funzione del tempo a una prima concentrazione cui è applicato il procedimento secondo l’invenzione; - Figures 8a and 8b show diagrams of electrochemiluminescence signals as a function of time at a first concentration to which the process according to the invention is applied;

- le figure 9a e 9b mostrano diagrammi di segnali di elettrochemiluminescenza in funzione del tempo a una prima concentrazione cui è applicato il procedimento secondo l’invenzione; - Figures 9a and 9b show diagrams of electrochemiluminescence signals as a function of time at a first concentration to which the process according to the invention is applied;

- la figura 10 mostra uno schema a blocchi rappresentativo di una seconda forma realizzativa del procedimento e sistema secondo l’invenzione; - Figure 10 shows a block diagram representative of a second embodiment of the process and system according to the invention;

- la figura 11 e la figura 12 mostrano un diagramma e un relativo diagramma d’ingrandimento rappresentativi di un segnale generato da detta seconda forma realizzativa del procedimento e sistema secondo l’invenzione: - Figure 11 and Figure 12 show a diagram and a relative enlargement diagram representative of a signal generated by said second embodiment of the method and system according to the invention:

- la figura 13 e la figura 14 mostrano diagrammi illustrativi di una modalità di analisi del segnale nel procedimento e sistema secondo l’invenzione: - Figure 13 and Figure 14 show illustrative diagrams of a signal analysis mode in the method and system according to the invention:

In breve, il sistema secondo l’invenzione comprende una cella elettrochimica basata su un elettrodo preferibilmente in nanotubi di carbonio, una procedura di generazione di uno stimolo e una procedura di analisi della risposta. In short, the system according to the invention comprises an electrochemical cell based on an electrode preferably made of carbon nanotubes, a stimulus generation procedure and a response analysis procedure.

In figura 1 è mostrato un sistema che implementa il procedimento secondo l’invenzione e comprende un elaboratore 11 che pilota un potenziostato 12 per applicare una forma d’onda di stimolo U desiderata, ad esempio una tensione di stimolo, a una cella elettrochimica 13 immersa in una soluzione di misura 14. Con L è indicata una radiazione luminosa emessa per elettrochemiluminescenza dalla soluzione di misura 14 e raccolta da un fotomoltiplicatore 15 che trasduce quindi un corrispondente segnale di elettrochemiluminescenza E, ossia un segnale trasdotto rappresentativo della radiazione di elettrochemiluminescenza emessa dalla soluzione, ad esempio un segnale di tensione proporzionale all’intensità di elettrochemiluminescenza, all’elaboratore 11 per l’analisi. Figure 1 shows a system which implements the method according to the invention and comprises a processor 11 which drives a potentiostat 12 to apply a desired stimulus waveform U, for example a stimulus voltage, to an immersed electrochemical cell 13 in a measurement solution 14. L indicates a light radiation emitted by electrochemiluminescence from the measurement solution 14 and collected by a photomultiplier 15 which then transduces a corresponding electrochemiluminescence signal E, i.e. a transduced signal representative of the electrochemiluminescence radiation emitted by the solution , for example a voltage signal proportional to the electrochemiluminescence intensity, to the processor 11 for analysis.

In figura 2 è mostrato il dettaglio della cella elettrochimica 13 che comprende un elettrodo di lavoro 131 in nanotubi di carbonio, o CNT (Carbon Nano Tubes), così come comprende un elettrodo di riferimento 132, ad esempio in argento e un controelettrodo 133, ad esempio in oro. Come si può osservare da figura 2, l’elettrodo di lavoro 131 è ottenuto tramite un filo 134 conduttore che è posto a contatto con una fascio di CNT 136, che è stato cresciuto ad esempio tramite un processo di Thermal Chemical Vapour Deposition su un substrato, tale substrato nella realizzazione d’esempio essendo di silicio cristallino. Il fascio di CNT 136 prende la forma di una piastrina cilindrica o rettangolare con un lato superiore e un lato di fondo. Il fascio di CNT 136 poggia con il lato di fondo sul substrato di silicio cristallino, mentre la parte rimanente del fascio di CNT 136 è posta all’interno di un involucro di supporto 135, realizzato nell’esempio descritto in PDMS (polidimetilsilossano), che opera da supporto isolante. Gli altri elettrodi 132 e 133 sono realizzati in maniera analoga contattando tramite rispettivi fili 134 rispettive piastrine di argento 137 e oro 138. La soluzione di misura 14 emette la radiazione luminosa L rilevata dal fotomoltiplicatore 15, ad esempio un fotomoltiplicatore HAMAMATSU H9306-03, posizionato al di sotto degli elettrodi 131, 132, 133. Figure 2 shows the detail of the electrochemical cell 13 which comprises a working electrode 131 in carbon nanotubes, or CNT (Carbon Nano Tubes), as well as including a reference electrode 132, for example in silver and a counter electrode 133, for example example in gold. As can be seen from Figure 2, the working electrode 131 is obtained by means of a conducting wire 134 which is placed in contact with a bundle of CNT 136, which has been grown for example by means of a Thermal Chemical Vapor Deposition process on a substrate , said substrate in the exemplary embodiment being of crystalline silicon. The bundle of CNT 136 takes the form of a cylindrical or rectangular plate with an upper side and a bottom side. The CNT 136 beam rests with the bottom side on the crystalline silicon substrate, while the remaining part of the CNT 136 beam is placed inside a support casing 135, made in the example described in PDMS (polydimethylsiloxane), which acts as an insulating support. The other electrodes 132 and 133 are made in a similar way by contacting through respective wires 134 respective plates of silver 137 and gold 138. The measurement solution 14 emits the light radiation L detected by the photomultiplier 15, for example a HAMAMATSU H9306-03 photomultiplier, positioned below the electrodes 131, 132, 133.

La soluzione di misura 14 d’esempio è basata su un composto di rutenio, Ru(bpy) (rutenio-tris-bipiridile). La concentrazione della soluzione madre, o soluzione stock, è di 10<-4>M, con una soluzione fosfata (PBS) 10<-1>M come soluzione tampone. In altre parole, si ha una concentrazione di circa 80 ng/μl di rutenio, nella quale viene successivamente dissolta tripropilammina fino al limite di solubilità. Nel seguito sono mostrate misure su differenti diluzioni in PBS di tale soluzione madre per paragonare la sensibilità del sistema e procedimento secondo l’invenzione. The sample measurement solution 14 is based on a ruthenium compound, Ru (bpy) (ruthenium-tris-bipyridyl). The concentration of the stock solution is 10 <-4> M, with a 10 <-1> M phosphate solution (PBS) as a buffer solution. In other words, there is a concentration of about 80 ng / μl of ruthenium, in which tripropylamine is subsequently dissolved up to the solubility limit. Below are shown measurements on different dilutions in PBS of this stock solution to compare the sensitivity of the system and procedure according to the invention.

In una possibile configurazione di misura, non mostrata in figura 1 e 2, la soluzione di misura 14, ad esempio un quantitativo di 100 μl, viene disposta su un vetrino da microscopio appoggiato su un substrato di plexiglass, in corrispondenza di un foro al di sotto del quale si trova il fotomoltiplicatore 15, per evitare effetti di diffrazione. Un posizionatore controlla il posizionamento relativo di cella 13 e soluzione 14 lungo gli assi orizzontale e verticale. In a possible measurement configuration, not shown in figures 1 and 2, the measurement solution 14, for example a quantity of 100 μl, is placed on a microscope slide resting on a plexiglass substrate, in correspondence with a hole beyond under which the photomultiplier 15 is located, to avoid diffraction effects. A positioner controls the relative positioning of cell 13 and solution 14 along the horizontal and vertical axes.

La fabbricazione dell’elettrodo di lavoro 131 in nanotubi di carbonio, o CNT, comprende i seguenti passi: The manufacture of the working electrode 131 in carbon nanotubes, or CNT, includes the following steps:

- creare un contatto elettrico con un fascio di CNT 136 depositati su substrato rappresentato da un wafer di silicio cristallino; - creating an electrical contact with a beam of CNT 136 deposited on a substrate represented by a crystalline silicon wafer;

- isolare l’elettrodo di lavoro 131 tramite l’involucro di supporto 135 in PDMS; - isolate the working electrode 131 through the support casing 135 in PDMS;

- distaccare il fascio di CNT 136 dal substrato di silicio; - detaching the CNT 136 bundle from the silicon substrate;

- operare un test di conduzione. - perform a conduction test.

Il fascio di CNT 136, come accennato in precedenza, è inizialmente attaccato al substrato di silicio, che a titolo di esempio non limitativo, ha forma di piastrina quadrata o cilindrica. A tale fascio di CNT 136 viene applicato quindi un contatto elettrico quando ancora i nanotubi sono attaccati alla superficie di silicio, impiegando un filo 134 di rame con differenti diametri a seconda della dimensione dei nanotubi di carbonio del fascio 136. Il fascio 136 ha un diametro di 2mm, anche se in varie forme realizzative sono impiegabili fasci da 1 mm a 4 mm, ed è possibile adattare anche diametri oltre questo intervallo. Un capo del filo di rame 134 è immerso in una goccia di pasta d’argento depositata precedentemente sopra il fascio di CNT 136. L’evaporazione successiva del solvente della pasta d’argento lascia in pochi minuti uno strato adesivo conduttivo fra il filo di rame e il fascio di CNT 136. The bundle of CNT 136, as previously mentioned, is initially attached to the silicon substrate, which, by way of non-limiting example, has the shape of a square or cylindrical plate. An electrical contact is then applied to this CNT beam 136 when the nanotubes are still attached to the silicon surface, using a copper wire 134 with different diameters depending on the size of the carbon nanotubes of the beam 136. The beam 136 has a diameter of 2mm, although in various embodiments beams from 1 mm to 4 mm can be used, and it is also possible to adapt diameters beyond this range. One end of the copper wire 134 is immersed in a drop of silver paste previously deposited over the CNT 136 bundle. The subsequent evaporation of the silver paste solvent leaves a conductive adhesive layer between the copper wire in a few minutes. and the CNT 136 bundle.

Dopo tale passo, si ottiene una fascio di CNT 136 connesso al filo di rame, che deve essere isolato al fine di lasciare solo un suo lato di fondo senza isolamento. Dal momento che tale lato di fondo è vincolato al substrato di silicio è possibile in primo luogo circondare il fascio di CNT 136 con una maschera in PMMA (PoliMetilMetAcrilato) per contenere il materiale PDMS (PoliDiMetilSilossano) per la costruzione dell’involucro 135. Il PDMS è un polimero caratterizzato da alta resistenza alla temperatura, buon isolamento elettrico, biocompatibile e otticamente trasparente. Inoltre il PDMS forma vantaggiosamente vincoli reversibili con altri materiali. Pertanto, il PDMS viene versato in fase liquida nel foro della maschera in PMMA nella quale è inserito il fascio di CNT 136 e lasciato polimerizzare. Il processo di polimerizzazione può essere accelerato tramite riscaldamento a 65° C. After this step, a bundle of CNT 136 is obtained connected to the copper wire, which must be insulated in order to leave only one of its bottom side without insulation. Since this bottom side is bonded to the silicon substrate it is possible first of all to surround the CNT 136 beam with a PMMA (PolyMethylMetAcrylate) mask to contain the PDMS (PolyDiMethylSiloxane) material for the construction of the envelope 135. The PDMS it is a polymer characterized by high temperature resistance, good electrical insulation, biocompatible and optically transparent. Furthermore, the PDMS advantageously forms reversible bonds with other materials. Therefore, the PDMS is poured in liquid phase into the hole of the PMMA mask in which the CNT 136 bundle is inserted and left to polymerize. The curing process can be accelerated by heating to 65 ° C.

Quando la polimerizzazione è completa, il fascio di CNT 136 può essere staccato dal substrato di silicio, applicando una forza meccanica o immergendolo in acqua calda. Il fascio di CNT 136 rimane naturalmente vincolato sul suo lato superiore nell’involucro 135 al filo 134. When the polymerization is complete, the CNT 136 beam can be detached from the silicon substrate, by applying a mechanical force or by immersing it in hot water. The bundle of CNT 136 naturally remains bound on its upper side in the casing 135 to the wire 134.

L’elaboratore 14 adopera ad esempio routine software ottenute tramite il linguaggio LabView per controllare la forma d’onda dello stimolo U generato dal potenziostato 12. L’elaboratore 15 riceve altresì il segnale di elettrochemiluminescenza E dal fotomoltiplicatore 15, elaborandone i dati e applicando le operazioni di analisi e le procedure che vengono descritte nel seguito. The processor 14 uses, for example, software routines obtained through the LabView language to control the waveform of the stimulus U generated by the potentiostat 12. The processor 15 also receives the electrochemiluminescence signal E from the photomultiplier 15, processing the data and applying the analysis operations and the procedures described below.

La forma d’onda della tensione di stimolo U è, ad esempio, come mostrato in figura 3, che illustra la voltammetria ciclica applicata, un’onda triangolare che varia fra 2V e -2V di tensione, con scan rate di 500mV/s. La tensione di stimolo U è applicata per un numero di cicli variabile fra 3 e 300 a seconda delle condizioni di misura. I potenziali di ossidazione e riduzione sono principalmente legati alla dichiarazione in etichetta della ECL, in particolare dunque dalla composizione della soluzione, e ai materiali di elettrodo. Nel caso d’esempio, la reazione di ossidoriduzione si instaura in un intervallo di tensioni di circa 1 V e -1 V. Con uno scan rate di 500 mV/s l’emissione di luce si osserva per due volte nel primo ciclo di stimolo dopo 6 secondi e dopo 10 secondi nel ciclo periodico di durata T di 16 secondi. Con E1 e E2 in figura 3 sono indicati tali punti di emissione. Come detto, a seconda delle caratteristiche dell’elettrodo di CNT usato la tensione a cui avviene l’emissione può variare, usualmente si situa nell’intorno di -1 V. Nel caso illustrato più avanti con riferimento alle figure 6a-6b, l’emissione ha inizio a -1.3V circa e il picco di emissione si ha a circa -1.7V, che, riportato sull’andamento di figura 3, localizza l’emissione a una coordinata temporale di circa 11 s. The waveform of the stimulus voltage U is, for example, as shown in Figure 3, which illustrates the applied cyclic voltammetry, a triangular wave that varies between 2V and -2V voltage, with a scan rate of 500mV / s. The stimulus voltage U is applied for a number of cycles varying between 3 and 300 depending on the measurement conditions. The oxidation and reduction potentials are mainly related to the ECL label declaration, in particular therefore from the composition of the solution, and to the electrode materials. In the case of the example, the redox reaction occurs in a voltage range of about 1 V and -1 V. With a scan rate of 500 mV / s, the emission of light is observed twice in the first stimulus cycle. after 6 seconds and after 10 seconds in the periodic cycle of duration T of 16 seconds. With E1 and E2 in figure 3 these emission points are indicated. As said, depending on the characteristics of the CNT electrode used, the voltage at which the emission occurs can vary, usually it is around -1 V. In the case illustrated below with reference to figures 6a-6b, the emission starts at approximately -1.3V and the emission peak occurs at approximately -1.7V, which, reported on the trend in Figure 3, locates the emission at a time coordinate of approximately 11 s.

Il fotomoltiplicatore 15 restituisce un segnale di elettrochemiluminescenza E, che, come detto, è in generale una tensione proporzionale all’intensità della radiazione luminosa L raccolta a sua volta proporzionale alla reazione di ECL. In figura 4a è rappresentato un diagramma che mostra la tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E in funzione del tempo a diverse diluizioni, rispettivamente per una concentrazione di rutenio di 1600 pg/μl (traccia più chiara indicata con il riferimento Eh) e 800 pg/μl (traccia più scura indicata con il riferimento El). In figura 4b è rappresentato un diagramma che mostra la tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E in funzione della voltammetria applicata, ossia della tensione di stimolo U applicata. Come si può osservare la traccia Eh ad alta concentrazione mostra picchi ben visibili, mentre la traccia El a più bassa concentrazione è nascosta dal rumore. The photomultiplier 15 returns an electrochemiluminescence signal E, which, as mentioned, is in general a voltage proportional to the intensity of the light radiation L collected in turn proportional to the ECL reaction. Figure 4a shows a diagram showing the voltage representing the electrochemiluminescence signal E as a function of time at different dilutions, respectively for a ruthenium concentration of 1600 pg / μl (lighter trace indicated with the reference Eh) and 800 pg / μl (darker trace indicated with the reference El). Figure 4b shows a diagram showing the voltage representing the electrochemiluminescence signal E as a function of the applied voltammetry, that is, of the stimulus voltage U applied. As you can see, the high concentration Eh trace shows clearly visible peaks, while the lower concentration El trace is hidden by the noise.

In figura 5 è mostrato uno schema a blocchi rappresentativo delle operazioni di analisi sul segnale di elettrochemiluminescenza E, ossia la tensione proporzionale all’intensità di elettrochemiluminescenza, eseguite all’elaboratore 11. Poiché un’analisi spettrale del segnale di elettrochemiluminescenza E indica che l’intero spettro utile di tale segnale è localizzato prima della frequenza di 1 Hz, con il riferimento 110 è indicata un’operazione di applicazione al segnale di elettrochemiluminescenza E proveniente dal fotomoltiplicatore 15 di un filtro, un passa basso ellittico del terzo ordine con frequenza di taglio di circa 1 Hz, nel presente caso d’esempio, per ridurre il rumore e produrre un segnale filtrato Ef. Figure 5 shows a block diagram representative of the analysis operations on the electrochemiluminescence signal E, that is the voltage proportional to the intensity of electrochemiluminescence, performed at the processor 11. Since a spectral analysis of the electrochemiluminescence signal E indicates that the the entire useful spectrum of this signal is located before the frequency of 1 Hz, the reference 110 indicates an application operation to the electrochemiluminescence signal E coming from the photomultiplier 15 of a filter, an elliptical low pass of the third order with a cut-off frequency of about 1 Hz, in the present example case, to reduce the noise and produce a filtered signal Ef.

Le figure 6a e 6b mostrano tale segnale filtrato Ef(rispettivamente per una concentrazione di rutenio di 1600 pg/μl, traccia Efh, e 800 pg/μl, traccia Efl), in funzione del tempo e della tensione di stimolo U applicata. I picchi risultano visibili anche nel caso di bassa concentrazione, sicché il passo 110 di filtraggio è di per sé utile a migliorare il segnale. Figures 6a and 6b show this filtered signal Ef (respectively for a ruthenium concentration of 1600 pg / μl, trace Efh, and 800 pg / μl, trace Efl), as a function of time and of the applied stimulus voltage U. The peaks are visible even in the case of low concentration, so that the filtering step 110 is in itself useful for improving the signal.

Secondo un aspetto importante dell’invenzione, tuttavia, è prevista, in aggiunta o in alternativa all’operazione di filtraggio 110, un’operazione 120 di estrazione del segnale dal rumore, ossia di depurazione del segnale dal rumore e aumento del rapporto segnale/rumore, che è basata sulle proprietà dell’elettrodo di lavoro 131 in CNT. According to an important aspect of the invention, however, an operation 120 for extracting the signal from the noise, i.e. purifying the signal from the noise and increasing the signal / noise ratio, is provided, in addition to or as an alternative to the filtering operation 110. , which is based on the properties of the working electrode 131 in CNT.

Nelle figure 7a e 7b è a questo proposito rappresentata tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E in funzione del tempo, rispettivamente per un elettrodo di lavoro in oro (figura 7a) e un elettrodo di lavoro in CNT (figura 7b), come l’elettrodo 131. La diluizione è di 1:10. I picchi dell’elettrodo di lavoro in oro sono indicati con Gie quelli dell’elettrodo in CNT con Ci. Da tali figure si osserva che i valori per l’elettrodo in oro decrescono entro i primi cicli, in particolare entro tre cicli dal primo picco il segnale risulta sostanzialmente non rilevabile, mentre per l’elettrodo in CNT, per il quale sono mostrati dieci cicli, i valori decrescono molto lentamente e anche l’ultimo picco presenta un valore tale da essere facilmente rilevabile e utilizzabile. Dunque, per l’elettrodo in CNT vi è una pluralità di cicli C1…C10del segnale di elettrochemiluminescenza E in cui tale segnale di elettrochemiluminescenza (E) presenta picchi di ampiezza sostanzialmente costante ad ogni ciclo. Figures 7a and 7b show voltage representing the electrochemiluminescence signal E as a function of time, respectively for a gold working electrode (figure 7a) and a CNT working electrode (figure 7b), respectively, as the electrode 131. The dilution is 1:10. The peaks of the working gold electrode are indicated with G and those of the CNT electrode with Ci. From these figures it is observed that the values for the gold electrode decrease within the first cycles, in particular within three cycles from the first peak the signal is substantially undetectable, while for the CNT electrode, for which ten cycles are shown , the values decrease very slowly and even the last peak has a value that is easily detectable and usable. Therefore, for the CNT electrode there is a plurality of cycles C1 ... C10 of the electrochemiluminescence signal E in which this electrochemiluminescence signal (E) has peaks of substantially constant amplitude at each cycle.

Si può osservare che il rutenio presente in soluzione non viene consumato dalla reazione. L'unico reagente che si consuma è la TPA (come risulta dalla reazione di ECL, che è ciclica per il rutenio, ma consuma TPA) ma, utilizzando l'elettrodo in CNT, non si ha un decadimento di segnale cosa che invece si ha per l'elettrodo in oro. Ciò indica che il mantenimento o decadimento del segnale sono strettamente legati al tipo di materiale con cui è fatto l'elettrodo. Senza volersi legare a una specifica teoria, si ritiene che ciò potrebbe essere ascritto a fattori quali che l'elettrodo in CNT presenta maggiore affinità con i reagenti (Ru (pby), TPA e analoghi) e minore affinità con specie chimiche interferenti/inibenti la reazione ECL quali H2O, O2e analoghi, presenta una superficie maggiore, ha caratteristiche idrofobiche, migliori condizioni di diffusività delle specie attive elettrochimiche generate. L’elettrodo in oro, nel caso d’esempio, ha migliori prestazioni per quanto riguarda l’ampiezza del segnale nel primo ciclo (G1), quindi l’ampiezza del relativo picco della tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E proporzionale all’intensità di radiazione luminosa L emessa dalla soluzione di misura 14, decresce esponenzialmente, diventando non rilevabile. L’elettrodo in CNT 131 determina un’ampiezza inferiore dell’emissione di radiazione luminosa L a alte concentrazioni di rutenio e nel primo ciclo o periodo dello stimolo U, ma l’emissione di radiazione luminosa L decresce in misura molto minore che nel caso dell’elettrodo in oro, diventando per un tratto, dal picco C7in poi, sostanzialmente costante. It can be observed that the ruthenium present in solution is not consumed by the reaction. The only reagent that is consumed is TPA (as results from the ECL reaction, which is cyclic for ruthenium, but consumes TPA) but, using the CNT electrode, there is no signal decay which instead occurs for the gold electrode. This indicates that the maintenance or decay of the signal is closely related to the type of material the electrode is made of. Without wishing to bind to a specific theory, it is believed that this could be ascribed to factors such as that the CNT electrode has greater affinity with the reagents (Ru (pby), TPA and analogues) and less affinity with interfering / inhibiting chemical species. ECL reaction such as H2O, O2 and analogues, has a larger surface, has hydrophobic characteristics, better conditions of diffusivity of the electrochemical active species generated. The gold electrode, in the case of the example, has better performances as regards the amplitude of the signal in the first cycle (G1), therefore the amplitude of the relative voltage peak representing the electrochemiluminescence signal E proportional to the intensity of light radiation L emitted by the measurement solution 14 decreases exponentially, becoming undetectable. The electrode in CNT 131 determines a lower amplitude of the emission of light radiation L at high concentrations of ruthenium and in the first cycle or period of the stimulus U, but the emission of light radiation L decreases to a much lesser extent than in the case of gold electrode, becoming for a while, from peak C7 onwards, substantially constant.

Il passo 120 di estrazione del segnale dal rumore sfrutta questo aspetto, ossia l’aspetto secondo il quale l’ampiezza dell’emissione periodica nell’elettrodo di lavoro 131 in CNT si mantiene all’incirca costante per una pluralità di cicli, in particolare ad esempio per più di 50 cicli, della tensione di stimolo U, mentre per gli elettrodi in metallo decresce rapidamente con l’aumentare dei cicli. Se le concentrazioni di rutenio sono molto basse, 160 pg/μl e 80 pg/μl ad esempio, il passo di filtraggio 110 può non essere sufficiente di per sé a permettere di discriminare il segnale dal rumore. Il passo 120 di estrazione del segnale dal rumore sfrutta invece tale costanza periodica dell’ampiezza dell’emissione sull’elettrodo di lavoro 131 in nanotubi di carbonio o CNT per una pluralità di cicli per aumentare il limite di rilevazione. The step 120 for extracting the signal from the noise exploits this aspect, that is the aspect according to which the amplitude of the periodic emission in the working electrode 131 in CNT remains approximately constant for a plurality of cycles, in particular for for example for more than 50 cycles, of the stimulus voltage U, while for metal electrodes it decreases rapidly with increasing cycles. If the ruthenium concentrations are very low, 160 pg / μl and 80 pg / μl for example, the filtering step 110 may not be sufficient in itself to allow discrimination of the signal from the noise. The 120 step for the extraction of the signal from the noise, on the other hand, exploits this periodic constancy of the amplitude of the emission on the working electrode 131 in carbon nanotubes or CNT for a plurality of cycles to increase the detection limit.

L’applicazione di un’onda periodica triangolare quale tensione di stimolo U fa sì che, come mostrato con riferimento a figura 3, siano noti con precisione l’istante del ciclo (6 e 14 secondi in un ciclo di 16 secondi in figura 3) e il valore di tensione di stimolo U (ad esempio 1V) per il quale avviene l’emissione di radiazione luminosa L. In particolare l’emissione di radiazione luminosa L, ossia il picco di emissione, si localizza sempre nello stesso punto, ad esempio E1 o E2, a un certo istante di tempo del ciclo dello stimolo U e quindi della corrispondente uscita periodica, la radiazione luminosa L e la corrispondente tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E, come mostrato anche in figura 4a e 4b. Il passo 120 di estrazione del segnale dal rumore prevede in una prima forma realizzativa di scomporre il segnale di elettrochemiluminescenza E secondo epoche scelte della durata T del ciclo dello stimolo U. Le epoche vengono scelte della durata del ciclo, in quanto il picco di emissione si ubica sempre nello stesso istante all’interno del ciclo. E’ previsto di scegliere una velocità di scansione per l’onda di figura 3, e di conseguenza il periodo e il numero di cicli che vengono eseguiti. Un'epoca corrisponde ad un periodo dell'onda triangolare di scansione e l'emissione avviene sempre in corrispondenza di un determinato valore di tensione U di ingresso, pertanto è posizionata sempre nella stessa posizione nel periodo di scansione. The application of a triangular periodic wave as stimulus voltage U ensures that, as shown with reference to Figure 3, the instant of the cycle is precisely known (6 and 14 seconds in a 16-second cycle in Figure 3) and the stimulus voltage value U (for example 1V) for which the emission of light radiation L occurs. In particular, the emission of light radiation L, i.e. the emission peak, is always localized in the same point, for example E1 or E2, at a certain instant of time of the stimulus cycle U and therefore of the corresponding periodic output, the light radiation L and the corresponding voltage representing the electrochemiluminescence signal E, as also shown in figures 4a and 4b. The step 120 for extracting the signal from the noise provides in a first embodiment to decompose the electrochemiluminescence signal E according to selected epochs of the duration T of the stimulus cycle U. The epochs are chosen for the duration of the cycle, since the emission peak is it is always located at the same instant within the cycle. It is expected to choose a scanning speed for the wave in figure 3, and consequently the period and number of cycles that are performed. An epoch corresponds to a period of the triangular scan wave and the emission always occurs at a certain input voltage value U, therefore it is always positioned in the same position in the scan period.

La scomposizione della tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E secondo epoche scelte della durata T del ciclo dello stimolo U è basata su una tecnica di averaging. The decomposition of the voltage representing the electrochemiluminescence signal E according to selected epochs of the duration T of the stimulus cycle U is based on an averaging technique.

Secondo la tecnica dell’averaging, per ogni epoca ‘i’ un segnale x(t), è esprimibile come: According to the averaging technique, for each epoch 'i' a signal x (t) can be expressed as:

(1) (1)

dove s(t) è il segnale, n(t) il rumore. where s (t) is the signal, n (t) the noise.

Il segnale x(t ) ottenuto mediando le epoche è: The signal x (t) obtained by averaging the epochs is:

(2) (2)

dove N indica il numero di epoche considerate. where N indicates the number of epochs considered.

σ<2>σ <2>

Quindi una corrispondente potenza di rumore N risulta N Hence a corresponding noise power N results in N

essere: to be:

(3) (3)

Quindi il rapporto segnale rumore SNR risulta: So the SNR signal to noise ratio is:

(4) (4)

Per ogni epoca, pari a un ciclo dello stimolo U, vengono dunque acquisiti ordinatamente valori di tensione E nel tempo, che corrispondono al segnale x(t). Da tale operazione di scomposizione della tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E risulta dunque un numero N di epoche. Ad esempio, se la tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E viene acquisita per 4000 s, con un ciclo dello stimolo U di 16 secondi si ottengono 250 epoche. Si provvede quindi a sommare i valori di tali N epoche. In tal modo, essendo il picco ubicato sempre allo stesso istante nel ciclo, ossia nell’epoca, i valori di picco si sommeranno fra loro. Il risultato finale della somma viene diviso per il numero di epoche, ottenendo un valore medio del segnale di elettrochemiluminescenza E nel periodo di tempo (in accordo con la precedente equazione (2)). Eseguendo tale operazione, il rumore si somma in potenza, ma il segnale viene sommato in ampiezza, sicché si determina un aumento considerevole del rapporto segnale/rumore (si veda la precedente equazione (4)). Il passo di estrazione del segnale dal rumore così concepito sfrutta la costanza dell’ampiezza del picco di emissione, in quanto richiede di acquisire più epoche su un lungo periodo di tempo, ad esempio, come accennato, 4000 secondi, e durante questo lungo periodo di tempo, l’ampiezza del picco di emissione non muta sostanzialmente, rendendo attendibile la misura finale ottenuta sommando le epoche e mediando sul numero N di epoche. Il passo 120 di estrazione del segnale dal rumore appena descritto è particolarmente efficace a basse concentrazioni di rutenio, dunque, permettendo di rilevare segnali sepolti nel rumore. Nelle figure 8a, 8b e 9a, 9b sono rappresentati diagrammi di tensioni rappresentanti il segnale di elettrochemiluminescenza E per due differenti soluzioni con bassa concentrazione di rutenio (160 pg/μl nelle figure 8a, 8b, 80 pg/μl nelle figure 9a, 9b). La diluizione è di 1:1000 in figura 8a e di 1:500 in figura 9b. Nei diagrammi di figura 8a e 9a il segnale è la tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E come fornita dal fotomoltiplicatore 15, cioè non è depurato tramite l’operazione 120, mentre nei diagrammi di figura 8b e 9b le curve rappresentano un segnale depurato Edtramite l’operazione 120. Tale segnale depurato Edappare chiaramente rilevabile, mostrando un picco relativo all’elettrochemiluminescenza significativo all’istante atteso. Quindi il passo di estrazione del segnale dal rumore 120 descritto permette di calcolare un’ampiezza di picco di elettrochemiluminescenza mediata su dette epoche. For each epoch, equal to one cycle of the stimulus U, voltage values E are therefore acquired in an orderly fashion over time, which correspond to the signal x (t). From this operation of decomposition of the voltage representing the electrochemiluminescence signal E therefore results a number N of epochs. For example, if the voltage representing the electrochemiluminescence signal E is acquired for 4000 s, 250 epochs are obtained with a stimulus cycle U of 16 seconds. The values of these N epochs are then added together. In this way, since the peak is always located at the same instant in the cycle, ie in the epoch, the peak values will be added together. The final result of the sum is divided by the number of epochs, obtaining an average value of the electrochemiluminescence signal E over the time period (in accordance with the previous equation (2)). By carrying out this operation, the noise is added in power, but the signal is added in amplitude, so that a considerable increase in the signal / noise ratio is determined (see the previous equation (4)). The step of extraction of the signal from the noise thus conceived exploits the constancy of the amplitude of the emission peak, as it requires to acquire more epochs over a long period of time, for example, as mentioned, 4000 seconds, and during this long period of time, the amplitude of the emission peak does not change substantially, making the final measurement reliable by adding the epochs and averaging over the number N of epochs. The step 120 for extracting the signal from the noise just described is particularly effective at low concentrations of ruthenium, therefore, allowing to detect signals buried in the noise. Figures 8a, 8b and 9a, 9b show voltage diagrams representing the electrochemiluminescence signal E for two different solutions with low concentration of ruthenium (160 pg / μl in figures 8a, 8b, 80 pg / μl in figures 9a, 9b) . The dilution is 1: 1000 in figure 8a and 1: 500 in figure 9b. In the diagrams of figures 8a and 9a the signal is the voltage representing the electrochemiluminescence signal E as supplied by the photomultiplier 15, that is, it is not purified by operation 120, while in the diagrams of figures 8b and 9b the curves represent a signal purified Ed by l operation 120. This purified signal E appears clearly detectable, showing a significant peak relative to the electrochemiluminescence at the expected instant. Therefore, the described noise signal extraction step 120 allows to calculate a peak amplitude of electrochemiluminescence averaged over said epochs.

Il passo 120 di estrazione del segnale dal rumore può essere, secondo una forma realizzativa alternativa, operato sfruttando la periodicità della tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E tramite una tecnica simile a quella del Lock-In. Come mostrato in figura 10, che schematizza tale forma realizzativa alternativa del passo 120 di estrazione del segnale dal rumore, è previsto di creare un segnale di riferimento OL, ad esempio sinusoidale, tramite un oscillatore locale 21, alla stessa frequenza, ossia con la stessa durata T del ciclo, della tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E. La frequenza del segnale di riferimento sinusoidale OL è calibrata su quella della tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E per ridurre il più possibile i contenuti di rumore. II segnale di tensione di elettrochemiluminescenza E, dopo essere stato amplificato in un amplificatore 22 e opzionalmente filtrato tramite un filtro passa banda 23, viene moltiplicato in un moltiplicatore/demodulatore 24 con il segnale di riferimento sinusoidale OL e la forma d’onda risultante viene filtrata tramite un filtro passa basso 25 di tipo FIR, ad esempio di ordine 4, al fine di evitare ogni distorsione di fase. Successivamente viene estratta una componente continua EDCdel segnale filtrato, tramite un’operazione di calcolo della media in un blocco 26: questa operazione è sostanzialmente equivalente a quella realizzata da un amplificatore in continua. Le operazioni vengono eseguite preferibilmente via software, ad esempio il moltiplicatore/demodulatore 24 viene attuato simulando il comportamento di un moltiplicatore reale. According to an alternative embodiment, the step 120 for extracting the signal from the noise can be operated by exploiting the periodicity of the voltage representing the electrochemiluminescence signal E by means of a technique similar to that of the Lock-In. As shown in Figure 10, which schematises this alternative embodiment of the step 120 for extracting the signal from the noise, it is provided to create a reference signal OL, for example sinusoidal, by means of a local oscillator 21, at the same frequency, i.e. with the same cycle duration T, of the voltage representing the electrochemiluminescence signal E. The frequency of the sinusoidal reference signal OL is calibrated on that of the voltage representing the electrochemiluminescence signal E to reduce the noise contents as much as possible. The electrochemiluminescence voltage signal E, after having been amplified in an amplifier 22 and optionally filtered by a band-pass filter 23, is multiplied in a multiplier / demodulator 24 with the sinusoidal reference signal OL and the resulting waveform is filtered through a low pass filter 25 of the FIR type, for example of order 4, in order to avoid any phase distortion. Subsequently, a continuous EDC component of the filtered signal is extracted, by means of an average calculation operation in a block 26: this operation is substantially equivalent to that carried out by a DC amplifier. The operations are preferably performed via software, for example the multiplier / demodulator 24 is implemented by simulating the behavior of a real multiplier.

In figura 11 è mostrato un diagramma riportante tale componente continua EDCdel segnale filtrato in funzione della diluizione della soluzione di misura 14, che ne mostra il decremento per elevati valori di diluizione. Tale diluizione è stata applicata di volta in volta, prima della misura, per variare la concentrazione di partenza ed è quindi differente dalla variazione di concentrazione derivante dalle reazioni di ossidoriduzione nella soluzione 14 durante la misura. Figure 11 shows a diagram showing this continuous component EDC of the filtered signal as a function of the dilution of the measurement solution 14, which shows its decrease for high dilution values. This dilution was applied from time to time, before the measurement, to vary the starting concentration and is therefore different from the concentration variation deriving from the redox reactions in the solution 14 during the measurement.

In figura 12 è mostrato un ingrandimento del diagramma di figura 11 nella regione che in tale figura 11 appariva a valori di componente continua EDCsostanzialmente costanti (diluizione maggiore di 1:50). Tale ingrandimento mostra come il valore di tale componente continua EDCsia in realtà anche in questa regione proporzionale alla concentrazione. I diagrammi delle figure 11 e 12, indicando che il valore della componente continua EDCè proporzionale alla concentrazione della soluzione di misura 14, supportano la possibilità di impiegare il valore della componente continua EDCmisurata attraverso il passo 120 di estrazione del segnale dal rumore con tecnica di Lock-in per la misura, anche se il picco di emissione non è rilevabile direttamente a causa del rumore. In altre parole, le figure 11 e 12 mostrano che il valore della componente continua EDCè rappresentativo, in particolare proporzionale, al valore del picco di emissione e quindi alla concentrazione. Figure 12 shows an enlargement of the diagram of Figure 11 in the region which in such Figure 11 appeared at substantially constant values of the continuous EDC component (dilution greater than 1:50). This magnification shows how the value of this continuous EDC component is actually also in this region proportional to the concentration. The diagrams of figures 11 and 12, indicating that the value of the continuous component EDC is proportional to the concentration of the measurement solution 14, support the possibility of using the value of the continuous component EDC measured through the step 120 of signal extraction from the noise with the Lock technique -in for the measurement, even if the emission peak is not detectable directly due to the noise. In other words, Figures 11 and 12 show that the value of the continuous component EDC is representative, in particular proportional, to the value of the emission peak and therefore to the concentration.

L’emissione di un elettrodo CNT tende a diminuire esponenzialmente e ad andare a zero. Il numero di cicli dopo il quale ciò avviene non è tuttavia fisso, dipende dalla tipologia di elettrodo in CNT, le misure sperimentali indicano correntemente una variazione fra 100 e 300 cicli. Nel caso d’esempio si ha che l’emissione di radiazione L va a zero dopo circa 4000 secondi (250 cicli per un ciclo di 16 secondi), in un ulteriore caso d’esempio si è riscontrato che l’emissione di radiazione L andava a zero dopo circa 1300 secondi, permettendo di mediare le epoche solo su 81 cicli. The emission of a CNT electrode tends to decrease exponentially and go to zero. However, the number of cycles after which this occurs is not fixed, it depends on the type of electrode in CNT, the experimental measurements currently indicate a variation between 100 and 300 cycles. In the case of the example we have that the emission of radiation L goes to zero after about 4000 seconds (250 cycles for a cycle of 16 seconds), in a further example case it was found that the emission of radiation L went to zero after about 1300 seconds, allowing the epochs to be averaged over only 81 cycles.

Il procedimento secondo l’invenzione prevede comunque di operare su una pluralità di cicli per i quali il picco di elettrochemiluminescenza rilevato nella tensione rappresentante il segnale di elettrochemiluminescenza E dovuto all’elettrodo di CNT 131 sia sostanzialmente costante. Nelle figure 13 e 14 è mostrato un esempio di impiego del procedimento utilizzando la tecnica di averaging. In figura 13 è mostrato un segnale di elettrochemiluminescenza con un numero N di cicli pari a 100. In figura 14 è mostrato il segnale depurato tramite averaging, operando sulle epoche dalla 30esima alla 70esima, calcolando il valor medio, picco massimo e picco minimo. Il picco massimo in figura 14 è 1,2303, il picco minimo 0,9514, il picco medio 1,0918, il che fornisce un’indicazione di un segnale, ad esempio, considerato costante entro una variazione percentuale del 15%. The process according to the invention however provides to operate on a plurality of cycles for which the electrochemiluminescence peak detected in the voltage representing the electrochemiluminescence signal E due to the CNT 131 electrode is substantially constant. Figures 13 and 14 show an example of use of the process using the averaging technique. Figure 13 shows an electrochemiluminescence signal with a number N of cycles equal to 100. Figure 14 shows the signal purified by averaging, operating on the epochs from the 30th to the 70th, calculating the average value, maximum peak and minimum peak. The maximum peak in figure 14 is 1.2303, the minimum peak 0.9514, the average peak 1.0918, which provides an indication of a signal, for example, considered constant within a percentage change of 15%.

Il numero N di tale pluralità di cicli può essere diverso, a seconda del tipo di elettrodo CNT, dell’ampiezza ottenibile e a seconda che si impieghi il passo di estrazione del segnale dal rumore basato sulla scomposizione in epoche o basata sull’ottenimento tramite tecnica Lock-in di un valore di componente continua. E’ chiaro che il numero minimo di cicli per l’impiego nel procedimento qui descritto è definito come il numero minimo di cicli ad ampiezza costante che permette di rilevare il picco del segnale di elettrochemiluminescenza. A titolo di esempio, una soglia di rilevabilità impiegabile dal procedimento descritto può valutare se il picco del segnale, dopo l’operazione di estrazione del segnale dal rumore, ad esempio filtraggio e averaging, è superiore al 5% del picco più alto dovuto al rumore. Tale numero N di cicli può essere dunque ad esempio maggiore di 10 cicli, oppure può essere maggiore di 20 cicli, oppure può essere maggiore di 50 cicli. The number N of this plurality of cycles can be different, depending on the type of CNT electrode, the amplitude obtainable and depending on whether the signal extraction step from the noise based on the decomposition into epochs or based on obtaining through the Lock technique is used -in of a continuous component value. It is clear that the minimum number of cycles for use in the procedure described here is defined as the minimum number of cycles with constant amplitude that allows to detect the peak of the electrochemiluminescence signal. By way of example, a detection threshold that can be used by the described procedure can evaluate whether the signal peak, after the operation of extracting the signal from the noise, for example filtering and averaging, is greater than 5% of the highest peak due to noise. . This number N of cycles can therefore be greater than 10 cycles, for example, or it can be greater than 20 cycles, or it can be greater than 50 cycles.

Dunque, il procedimento e sistema secondo l’invenzione permettono la rilevazione di segnali di elettrochemiluminescenza rumorosi sfruttando le proprietà di elettrodi, specificamente gli elettrodi di lavoro in CNT, dove in risposta a uno stimolo periodico si presentino relativamente a una pluralità di cicli del corrispondente segnale di elettrochemiluminescenza picchi di ampiezza sostanzialmente costante ad ogni ciclo. Therefore, the method and system according to the invention allow the detection of noisy electrochemiluminescence signals by exploiting the properties of electrodes, specifically the working electrodes in CNT, where in response to a periodic stimulus they occur relatively to a plurality of cycles of the corresponding signal of electrochemiluminescence peaks of substantially constant amplitude at each cycle.

Le operazioni di estrazione del segnale dal rumore qui descritte sono anche applicabili a una cella di flusso ECL. In una cella di flusso ECL l’elettrodo di lavoro è sempre bagnato da un nuovo volume di analita durante la misura, quindi il segnale ECL rimane costante e permette l’applicazione delle tecniche di depurazione del rumore sopra descritte nella zona di costanza dell’ampiezza. The noise signal extraction operations described here are also applicable to an ECL flow cell. In an ECL flow cell the working electrode is always wet by a new volume of analyte during the measurement, therefore the ECL signal remains constant and allows the application of the noise purification techniques described above in the amplitude constancy zone .

Naturalmente, fermo restando il principio dell’invenzione, i particolari di costruzione e le forme di attuazione potranno ampiamente variare rispetto a quanto descritto ed illustrato a puro titolo di esempio, senza per questo uscire dall'ambito della presente invenzione. Naturally, without prejudice to the principle of the invention, the construction details and the embodiments may vary widely with respect to what is described and illustrated purely by way of example, without thereby departing from the scope of the present invention.

Possibili campi di applicazione del sistema proposto comprendono sensori per l’analisi elettrochimica e sistemi biomedici per molecole, proteine e rilevazione di DNA. Possible fields of application of the proposed system include sensors for electrochemical analysis and biomedical systems for molecules, proteins and DNA detection.

Dal momento che il PDMS tende a ricoprire completamente i nanotubi di CNT, isolandoli e determinando la riduzione dell’efficienza dell’elettrodo, in una possibile variante, il materiale PDMS può essere sostituito con un altro materiale che non riesca ad infiltrarsi in spazi di pochi nanometri, come, ad esempio, le resine epossidiche, materie plastiche termoplastiche o termoindurenti e/o loro copolimeri anche a blocchi, composti naturali quali amidi di cellulosa, chitosani, squaleni e simili, o qualunque altro materiale isolante con suddette caratteristiche, con molecole che si aggregano con catene lunghe e con diramazioni, determinando così valori di segnale di elettrochemiluminescenza E anche più elevati di quelli mostrati nei disegni annessi, in quanto tutti i nanotubi sono liberi di contribuire all'ossidoriduzione delle specie chimiche. Since the PDMS tends to completely cover the CNT nanotubes, isolating them and causing the reduction of the electrode efficiency, in a possible variant, the PDMS material can be replaced with another material that cannot infiltrate into spaces of a few nanometers, such as, for example, epoxy resins, thermoplastic or thermosetting plastics and / or their copolymers, including block copolymers, natural compounds such as cellulose starches, chitosans, squalens and the like, or any other insulating material with the aforementioned characteristics, with molecules that they aggregate with long chains and with branches, thus determining electrochemiluminescence E signal values even higher than those shown in the annexed drawings, since all the nanotubes are free to contribute to the oxidation-reduction of chemical species.

In varie forme di attuazione della soluzione, l’elettrodo in nanotubi di carbonio può essere staccato dal substrato e inglobato nel supporto isolante ad esempio in PDMS. Ad esempio, l’elettrodo in nanotubi di carbonio può essere cresciuto su una metallizzazione o pista metallica del chip, utilizzata per gestire il segnale elettrico, creando un contatto ohmico, o alternativamente tramite altre tecniche di contatto ohmico, ad esempio drogaggio del substrato. In various embodiments of the solution, the carbon nanotube electrode can be detached from the substrate and incorporated into the insulating support, for example in PDMS. For example, the carbon nanotube electrode can be grown on a metallization or metal track of the chip, used to manage the electrical signal, creating an ohmic contact, or alternatively through other ohmic contact techniques, such as doping of the substrate.

Secondo una variante alla soluzione, i nanotubi di carbonio dell’elettrodo di lavoro possono essere derivatizzati con radicali utili a favorire la selettività e/o sfavorire le specie chimiche interferenti. According to a variant of the solution, the carbon nanotubes of the working electrode can be derivatized with radicals useful for promoting selectivity and / or disadvantage the interfering chemical species.

E’ chiaro inoltre che la soluzione qui descritta con riferimento a elettrodi di lavoro comprendenti nanotubi di carbonio è estendibile a elettrodi comprendenti nanostrutture di carbonio con proprietà simili a quelle dei nanotubi di carbonio, che in risposta a uno stimolo periodico presentino relativamente a una pluralità di cicli del corrispondente segnale di elettrochemiluminescenza picchi di ampiezza sostanzialmente costante ad ogni ciclo. Tali nanostrutture di carbonio possono includere ad esempio fullereni. It is also clear that the solution described here with reference to working electrodes comprising carbon nanotubes can be extended to electrodes comprising carbon nanostructures with properties similar to those of carbon nanotubes, which in response to a periodic stimulus exhibit relatively a plurality of cycles of the corresponding electrochemiluminescence signal peaks of substantially constant amplitude at each cycle. Such carbon nanostructures can include, for example, fullerenes.

Claims

CLAIMS 1. Process for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals, which comprises the operations of generating a stimulus (U), in particular a stimulus voltage, in an electrochemical cell (13) comprising a working electrode (131) comprising carbon nanostructures, preferably carbon nanotubes, in contact with a solution to be measured (14), to which said stimulus (U) is applied, detect (15) and analyze (11) an electrochemiluminescence signal (E) representative of electrochemiluminescence radiation (L) emitted by said measurement solution (14) in response to said stimulus (U), characterized in that said operation of generating a stimulus (U) comprises generating a periodic stimulus signal with a determined duration (T) of the periodic cycle and said operation of analyzing (11) an electrochemiluminescence signal (E) comprises acquiring said electrochemiluminescence signal (E) in response to said periodic stimulus (U) at least in relation to a plurality (N) of cycles (C1 ... C10) of said electrochemiluminescence signal (E) in which said electrochemiluminescence signal (E) has peaks of substantially constant amplitude at each cycle and to apply a noise signal extraction operation (120) on said plurality (N) of cycles (C1… C10).

2. Process according to claim 1, characterized in that said operation of extracting the signal from the noise (120) comprises decomposing the electrochemiluminescence signal (E) into epochs equal to a duration (T) of the stimulus cycle (U) and applying an averaging operation over said epochs to calculate a peak amplitude of electrochemiluminescence averaged over said epochs.

3. Process according to claim 1, characterized in that said signal extraction from noise (120) comprises operating a Lock-in signal treatment by demodulating (25) said electrochemiluminescence signal (E) by means of a signal of reference (OL) with cycle duration corresponding to the cycle duration (T) of the periodic stimulus signal (U), in particular to generate a direct voltage signal (EDC) representative of the electrochemiluminescence peak amplitude.

4. Process according to claim 2 or 3, characterized in that it further comprises operating a low-pass filtering (110) on said electrochemiluminescence signal (E).

5. Process according to one or more of claims 1 to 4, characterized in that said plurality (N) of cycles (C1 ... C10) corresponds to a minimum number of cycles with constant amplitude suitable for allowing the detection of the peak of the signal electrochemiluminescence (E), in particular a number of cycles resulting in a signal peak greater than 5% of the highest peak due to noise.

6. Process according to one or more of claims 1 to 5, characterized in that said plurality (N) of cycles (C1 ... C10) of said electrochemiluminescence signal (E) comprises cycles in a number greater than 10.

7. Process according to one or more of the preceding claims, characterized in that said carbon nanotubes of the working electrode are derivatized with radicals useful to favor selectivity and / or disadvantage interfering chemical species.

8. Process according to one or more of the preceding claims, characterized in that said carbon nanostructures comprise fullerenes.

9. System for the generation and analysis of electrochemiluminescence signals, which comprises means (11, 12) for generating a stimulus (U), in particular a stimulus voltage, in an electrochemical cell (13) comprising a working electrode (131) comprising carbon nanostructures, preferably carbon nanotubes in contact with a solution to be measured (14), to which said stimulus (U) is applied, means for detecting (15) and means for analyzing (11) an electrochemiluminescence signal ( E) representative of electrochemiluminescence radiation (L) emitted by said measurement solution (14) in response to said stimulus (U), characterized in that said means (11, 12) for generating a stimulus (U) are configured for a periodic stimulus signal with a certain duration (T) of the periodic cycle and said means for analyzing (11) an electrochemiluminescence signal (E ) are configured to acquire said electrochemiluminescence signal (E) in response to said periodic stimulus (U) at least in relation to a plurality (N) of cycles (C1 ... C10) of said electrochemiluminescence signal (E) in which said electrochemiluminescence signal (E) has peaks of substantially constant amplitude at each cycle and to apply a noise signal extraction operation (120) on said plurality (N) of cycles (C1… C10).

System according to claim 9, characterized in that it is configured to implement operations of the method according to one or more of claims 2 to 8.

11. System according to claim 9 or 10, characterized in that said working electrode (131) comprises an insulation support in polydimethysiloxane or in epoxy resin. All substantially as described and illustrated and for the specified purposes.