ITTO20090797A1 - METHOD AND SOLUTION FOR THE CRIOCONSERVATION OF HUMAN EMBRYOS - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DESCRIPTION
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: of the patent for industrial invention entitled:
“METODO E SOLUZIONE PER LA CRIOCONSERVAZIONE DI EMBRIONI UMANI” "METHOD AND SOLUTION FOR THE CRYO PRESERVATION OF HUMAN EMBRYOS"
La presente invenzione è relativa a un metodo e a una soluzione per la crioconservazione di embrioni umani. The present invention relates to a method and a solution for the cryopreservation of human embryos.
Stato dell’Arte State of the art
La fertilizzazione in vitro e il trasferimento di embrioni richiedono l’utilizzo di stimolazioni ormonali e di interventi chirurgici che possono modificare la recettività dell’utero della paziente. La crioconservazione degli embrioni consente di posticipare a un momento più ottimale il trasferimento degli stessi nell’utero, ad esempio a un ciclo successivo non stimolato. In vitro fertilization and embryo transfer require the use of hormonal stimulation and surgical interventions that can change the receptivity of the patient's uterus. Cryopreservation of embryos makes it possible to postpone their transfer to the uterus to a more optimal time, for example to a subsequent non-stimulated cycle.
Le procedure di stimolazione in alcuni casi non permettono di controllare la crescita follicolare e possono avere come risultato una produzione eccessiva di oociti e conseguentemente di embrioni. The stimulation procedures in some cases do not allow to control the follicular growth and can result in an excessive production of oocytes and consequently of embryos.
Per questi motivi la crioconservazione degli embrioni rappresenta un’alternativa importante per il successo delle tecniche di FIVER (fecondazione in vitro ed embrioriposizione). For these reasons, the cryopreservation of embryos represents an important alternative for the success of IVF techniques (in vitro fertilization and embrioriposition).
Le tecniche di crioconservazione degli embrioni sono state sviluppate a partire dagli anni ‘80 nel tentativo di limitare i danni cellulari causati dal raffreddamento e dalla conservazione a temperature molto basse. In particolare, la tecnica detta “vitrificazione”, permette di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio nei blastomeri (le cellule che compongono gli embrioni) preservandoli così da un danno cellulare e consentendone la conservazione per lunghi periodi. La vitrificazione è resa possibile dall’utilizzo di una soluzione concentrata di agenti crioprotettivi che solidifica durante il raffreddamento rapido in modo da formare “vetro” solidificato mantenendo le normali distribuzioni molecolari e ioniche dello stato liquido in una forma estremamente viscosa e super-raffreddata. La sopravvivenza degli embrioni in uno stato vitrificato è stata ormai dimostrata sia in vitro che in vivo, anche se la percentuale di sopravvivenza degli embrioni è ancora tutt’altro che ottimale. Embryo cryopreservation techniques have been developed since the 1980s in an attempt to limit cell damage caused by cooling and storage at very low temperatures. In particular, the so-called “vitrification” technique avoids the formation of ice crystals in the blastomeres (the cells that make up embryos) thus preserving them from cell damage and allowing them to be stored for long periods. Vitrification is made possible by the use of a concentrated solution of cryoprotective agents that solidifies during rapid cooling to form solidified "glass" while maintaining the normal molecular and ionic distributions of the liquid state in an extremely viscous and super-cooled form. The survival of embryos in a vitrified state has now been demonstrated both in vitro and in vivo, even if the survival rate of embryos is still far from optimal.
Gli embrioni possono essere crioconservati secondo questa tecnica a qualsiasi stadio di crescita a condizione che siano di buona qualità. Gli embrioni sono conservati in gruppi di uno o più a seconda del numero di embrioni che si prevede di trasferire in utero. Embryos can be cryopreserved according to this technique at any stage of growth provided they are of good quality. Embryos are stored in groups of one or more depending on the number of embryos that are expected to be transferred to the uterus.
Gli embrioni sono solitamente trasferiti in soluzioni contenenti concentrazioni crescenti di agenti crioprotettivi per preservarli dal danno causato dalle variazioni osmotiche e di volume. Gli embrioni immersi nella soluzione di crioconservazione appropriata sono poi aspirati in una paillette di plastica e conservati in appositi contenitori contenenti azoto liquido, utilizzando solitamente una macchina automatizzata per il raffreddamento progressivo. Lo scongelamento avviene estraendo la paillette contenente gli embrioni dall’azoto liquido e portando gli stessi a temperatura ambiente, trasferendoli in soluzioni con concentrazioni decrescenti di agenti crioprotettivi e infine in terreno di coltura. Gli embrioni sono successivamente posizionati in un incubatore in attesa del trasferimento. Embryos are usually transferred to solutions containing increasing concentrations of cryoprotective agents to protect them from damage caused by osmotic and volume changes. The embryos immersed in the appropriate cryopreservation solution are then aspirated into a plastic straw and stored in special containers containing liquid nitrogen, usually using an automated machine for progressive cooling. Thawing takes place by extracting the straw containing the embryos from liquid nitrogen and bringing them to room temperature, transferring them into solutions with decreasing concentrations of cryoprotective agents and finally into culture medium. The embryos are then placed in an incubator awaiting transfer.
Le procedure di crioconservazione prevedono generalmente periodi di stabilizzazione dell’embrione nelle diverse soluzioni a concentrazioni variabili di agenti crioprotettivi. Cryopreservation procedures generally provide for periods of stabilization of the embryo in the various solutions at varying concentrations of cryoprotective agents.
Esistono diversi kit commerciali e protocolli per la crioconservazione degli embrioni ottenuti mediante fertilizzazione in vitro, ad esempio quelli distribuiti dalle ditte Cook IVF®, Medicult e Vitrolife. There are several commercial kits and protocols for cryopreservation of embryos obtained by in vitro fertilization, for example those distributed by the companies Cook IVF®, Medicult and Vitrolife.
Questi kit consistono in un sistema di congelamento mediante il trasferimento degli embrioni in 3 soluzioni successive che contengono concentrazioni crescenti di agenti crioprotettivi e in un sistema di scongelamento mediante il trasferimento degli embrioni in 4 soluzioni successive che contengono concentrazioni decrescenti di agenti crioprotettivi. Per ciascun trasferimento occorre attendere un periodo di stabilizzazione in cui gli embrioni si adattano alla nuova concentrazione della soluzione in cui sono immersi. These kits consist of a freezing system by transferring embryos in 3 successive solutions containing increasing concentrations of cryoprotective agents and a thawing system by transferring embryos in 4 successive solutions containing decreasing concentrations of cryoprotective agents. For each transfer it is necessary to wait for a stabilization period in which the embryos adapt to the new concentration of the solution in which they are immersed.
Gli embrioni sono comunque soggetti a un certo danno cellulare durante il processo di crioconservazione e le procedure utilizzate dai suddetti kit implicano in ogni caso un notevole stress per gli embrioni, sia a causa del continuo cambiamento dell’ambiente esterno in cui si trovano, sia a causa delle inevitabili manovre per trasferirli da una soluzione all’altra. Il catalogo della Cook® (A complete guide to Cook IVF® Media, June 2001) infatti riporta percentuali di sopravvivenza degli embrioni soltanto pari all’80% e percentuali di gravidanza per trasferimento di due embrioni soltanto pari al 40%. The embryos are however subject to a certain cell damage during the cryopreservation process and the procedures used by the aforementioned kits involve in any case a considerable stress for the embryos, both due to the continuous change of the external environment in which they are found, and to because of the inevitable maneuvers to transfer them from one solution to another. The Cook® catalog (A complete guide to Cook IVF® Media, June 2001) in fact reports embryo survival rates of only 80% and pregnancy rates for the transfer of two embryos only equal to 40%.
Questi kit a 3 fasi per il congelamento e 4 fasi per lo scongelamento implicano inoltre una procedura piuttosto lunga e complicata per l’operatore e un probabile rischio di errore a causa dell’elevato numero di passaggi. These 3-phase freezing and 4-phase defrosting kits also involve a rather long and complicated procedure for the operator and a probable risk of error due to the high number of steps.
Si avverte quindi la necessità di sviluppare dei metodi e delle composizioni che migliorando la procedura di crioconservazione di embrioni risolvano i problemi sopra descritti. There is therefore a need to develop methods and compositions which, by improving the embryo cryopreservation procedure, solve the problems described above.
Un primo scopo della presente invenzione è pertanto quello di limitare il danno cellulare procurato agli embrioni dalla complessità dei procedimenti noti. A first object of the present invention is therefore to limit the cellular damage caused to the embryos by the complexity of the known procedures.
Un secondo scopo della presente invenzione è quello di minimizzare la manipolazione da parte dell’operatore. A second purpose of the present invention is to minimize manipulation by the operator.
Un terzo scopo della presente invenzione è quello di aumentare la percentuale di sopravvivenza degli embrioni. A third object of the present invention is to increase the survival rate of the embryos.
Un quarto scopo della presente invenzione è quello di ottenere una procedura più veloce e semplice. A fourth object of the present invention is to obtain a faster and simpler procedure.
Secondo la presente invenzione tali scopi vengono raggiunti mediante il metodo secondo la rivendicazione 1. According to the present invention, these objects are achieved by the method according to claim 1.
Secondo la presente invenzione viene inoltre fornita una soluzione secondo la rivendicazione 23. According to the present invention, a solution according to claim 23 is also provided.
Tale metodo consente di crioconservare embrioni umani mediante una procedura rapida, semplice ed efficace e di recuperarli con una percentuale di sopravvivenza molto elevata. This method allows to cryopreserve human embryos by means of a quick, simple and effective procedure and to recover them with a very high survival rate.
Definizioni Definitions
A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato qui sotto indicato. Unless otherwise explicitly specified, the following terms have the meanings given below.
Per “raffreddare gradualmente” si intende raffreddare la soluzione di crioconservazione per fasi successive fino a raggiungere la temperatura dell’azoto liquido. Preferibilmente, il protocollo di raffreddamento seguito comprende una prima fase di raffreddamento a una prima velocità di raffreddamento da temperatura ambiente ad una temperatura compresa tra -2°C e -20°C, seguita da una prima fase di standby; successivamente la soluzione viene sottoposta a una fase di cristallizzazione seguita da almeno una seconda fase di raffreddamento, preferibilmente a una seconda velocità di raffreddamento inferiore alla prima velocità di raffreddamento, dalla temperatura raggiunta nella fase precedente alla temperatura di crioconservazione. By "gradually cooling" we mean cooling the cryopreservation solution in successive stages until it reaches the temperature of liquid nitrogen. Preferably, the cooling protocol followed comprises a first cooling phase at a first cooling rate from room temperature to a temperature ranging from -2 ° C to -20 ° C, followed by a first standby phase; subsequently the solution is subjected to a crystallization step followed by at least a second cooling step, preferably at a second cooling rate lower than the first cooling rate, from the temperature reached in the previous step to the cryopreservation temperature.
Breve descrizione delle figure Brief description of the figures
Per una migliore comprensione della presente invenzione, viene nel seguito descritta una forma di realizzazione preferita anche con riferimento alla figura allegata che è una rappresentazione schematica di una paillette contenente gli embrioni, pronta al congelamento. For a better understanding of the present invention, a preferred embodiment is described hereinafter also with reference to the attached figure which is a schematic representation of a sequin containing the embryos, ready for freezing.
Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention
Il metodo per crioconservare embrioni umani secondo la presente invenzione comprende una prima fase di stabilizzazione degli embrioni in una soluzione di crioconservazione. The method for cryopreserving human embryos according to the present invention comprises a first step of stabilizing the embryos in a cryopreservation solution.
Quindi gli embrioni vengono caricati mediante aspirazione di un’aliquota di soluzione di crioconservazione in una paillette. Then the embryos are loaded by aspirating an aliquot of cryopreservation solution in a straw.
Successivamente gli embrioni vengono raffreddati in una prima fase di raffreddamento ad una prima velocità di raffreddamento da temperatura ambiente ad una temperatura a) compresa tra -2°C e -20°C. Preferibilmente la temperatura a) è compresa tra -4°C e -8°C, ancor più preferibilmente è pari a -6°C. Subsequently the embryos are cooled in a first cooling phase at a first cooling rate from room temperature to a temperature a) between -2 ° C and -20 ° C. Preferably the temperature a) is comprised between -4 ° C and -8 ° C, even more preferably it is equal to -6 ° C.
Segue una prima fase di standby e successivamente una fase di cristallizzazione, che preferibilmente viene indotta toccando la parete della paillette con una pinza di metallo previo raffreddamento della stessa in azoto liquido. A first standby phase follows and subsequently a crystallization phase, which is preferably induced by touching the sequin wall with a metal clamp after cooling it in liquid nitrogen.
Quindi la soluzione viene ulteriormente raffreddata in una seconda fase di raffreddamento ad una seconda velocità di raffreddamento inferiore alla prima velocità di raffreddamento dalla temperatura a) alla temperatura di b). La temperatura b) è preferibilmente compresa tra -40°C e -50°C, ancor più preferibilmente è pari a -45°C. Then the solution is further cooled in a second cooling step at a second cooling rate lower than the first cooling rate from the temperature a) to the temperature of b). The temperature b) is preferably between -40 ° C and -50 ° C, even more preferably it is equal to -45 ° C.
Successivamente la soluzione viene nuovamente raffreddata in una terza fase di raffreddamento ad una terza velocità di raffreddamento maggiore della seconda velocità di raffreddamento dalla temperatura b) alla temperatura c). La temperatura c) è preferibilmente compresa tra -140°C e la temperatura dell’azoto liquido, più preferibilmente è compresa tra -140°C e -160°C, ancor più preferibilmente è pari a -150°C. Subsequently the solution is cooled again in a third cooling phase at a third cooling rate greater than the second cooling rate from temperature b) to temperature c). The temperature c) is preferably between -140 ° C and the liquid nitrogen temperature, more preferably it is between -140 ° C and -160 ° C, even more preferably it is equal to -150 ° C.
Opzionalmente il metodo comprende una quarta fase di raffreddamento successivamente alla terza fase di raffreddamento per portare la soluzione alla temperatura dell’azoto liquido, temperatura alla quale possono essere conservati per anni. Optionally, the method includes a fourth cooling phase following the third cooling phase to bring the solution to the temperature of liquid nitrogen, a temperature at which it can be stored for years.
La prima e la seconda velocità di raffreddamento sono preferibilmente comprese rispettivamente tra -1°C/min e -3°C/min e tra -0,25°C/min e –0,50°C/min. Preferibilmente la terza velocità di raffreddamento è compresa tra -5°C/min e -15°C/min. The first and second cooling rates are preferably between -1 ° C / min and -3 ° C / min and between -0.25 ° C / min and -0.50 ° C / min respectively. Preferably the third cooling rate is comprised between -5 ° C / min and -15 ° C / min.
Quando si desidera scongelare gli embrioni si può procedere ad una fase di stabilizzazione a una temperatura d). When it is desired to thaw the embryos, a stabilization phase can be carried out at a temperature d).
Alternativamente si può procedere ad una prima fase di stabilizzazione a una temperatura d) seguita da una seconda fase di stabilizzazione a una temperatura e). Alternatively, a first stabilization phase can be carried out at a temperature d) followed by a second stabilization phase at a temperature e).
La temperatura d) è preferibilmente compresa nell’intervallo tra 0 e 6 °C e la temperatura e) tra 35°C e 39°C. The temperature d) is preferably in the range between 0 and 6 ° C and the temperature e) between 35 ° C and 39 ° C.
Il metodo può inoltre comprendere una fase di stabilizzare gli embrioni in terreno di coltura successiva alla fase di scongelamento. The method may further comprise a step of stabilizing the embryos in culture medium following the thawing step.
L’embrione da crioconservare si trova preferibilmente a uno stadio di 4-8 cellule. The embryo to be cryopreserved is preferably at a stage of 4-8 cells.
L’aliquota di soluzione di crioconservazione utilizzata per crioconservare gli embrioni è preferibilmente da 100 μl a 500 μl. The aliquot of cryopreservation solution used to cryopreserve embryos is preferably from 100 μl to 500 μl.
Le fasi di raffreddamento si svolgono preferibilmente in un dispositivo di raffreddamento automatizzato. The cooling steps preferably take place in an automated cooling device.
La soluzione di crioconservazione comprende preferibilmente saccarosio e/o PBS e/o albumina sierica umana e/o 1,2-propandiolo, ancor più preferibilmente comprende saccarosio 0.2 M, 1,2-propandiolo 1.5 M, albumina sierica umana al 20%, PBS. The cryopreservation solution preferably comprises sucrose and / or PBS and / or human serum albumin and / or 1,2-propanediol, even more preferably it comprises 0.2 M sucrose, 1.5 M 1,2-propandiol, 20% human serum albumin, PBS .
Secondo la presente invenzione viene inoltre fornita una soluzione di crioconservazione comprendente saccarosio, 1,2-propandiolo, albumina sierica umana, PBS. According to the present invention, a cryopreservation solution is also provided comprising sucrose, 1,2-propanediol, human serum albumin, PBS.
La presente invenzione sarà descritta nel seguito con riferimento a un esempio di realizzazione senza per questo uscire dall’ambito protettivo della presente invenzione. The present invention will be described below with reference to an example of embodiment without thereby departing from the protective scope of the present invention.
Esempio di realizzazione Example of realization
In due pozzetti di una piastra multi pozzetto Nunc da 4 pozzetti da 500 μl l’uno, si depositano 400 μL/pozzetto di soluzione di crioconservazione a temperatura ambiente. La soluzione di crioconservazione è composta da saccarosio 0,2 M, 1,2-propandiolo 1,5 M, albumina sierica umana (HSA) 20% in PBS. In two wells of a Nunc multi-well plate with 4 wells of 500 μl each, 400 μL / well of cryopreservation solution at room temperature are deposited. The cryopreservation solution consists of 0.2 M sucrose, 1.5 M propanediol 1,2, 20% human serum albumin (HSA) in PBS.
Si posiziona la piastra Nunc sotto il microscopio e si affianca a una piastra Petri contenente gli embrioni da congelare. Gli embrioni possono essere a uno stadio di circa 4-8 cellule. The Nunc plate is placed under the microscope and placed next to a Petri dish containing the embryos to be frozen. Embryos can be at a stage of about 4-8 cells.
Gli embrioni vengono prelevati con una pipetta munita di puntale sterile dal terreno di coltura della Petri e adagiati sul fondo del primo pozzetto della piastra Nunc contenente la soluzione di crioconservazione. The embryos are removed with a pipette fitted with a sterile tip from the culture medium of the Petri dish and placed on the bottom of the first well of the Nunc plate containing the cryopreservation solution.
Dopo cinque minuti di stabilizzazione gli embrioni vengono posizionati al centro di una paillette sterile, mediante aspirazione di una piccola aliquota (150 μl circa) di terreno prelevata dal secondo pozzetto della piastra Nunc. After five minutes of stabilization, the embryos are positioned in the center of a sterile straw, by aspirating a small aliquot (about 150 μl) of medium taken from the second well of the Nunc plate.
Nel frattempo si porta la macchina per congelare (Cryologic Freeze control system CL 5500) a temperatura ambiente e si satura con azoto liquido. In the meantime, the freezing machine (Cryologic Freeze control system CL 5500) is brought to room temperature and saturated with liquid nitrogen.
La paillette viene poi chiusa all’estremità opposta all’aspirazione con un tappo o jonc colorato etichettato con i dati della paziente. The straw is then closed at the opposite end to the suction with a colored cap or jonc labeled with the patient's data.
A questo punto la paillette può essere posizionata nella macchina per congelare e si può dare lo start per il congelamento lento o slow cooling. At this point the straw can be positioned in the freezing machine and the start can be given for slow freezing or slow cooling.
Il protocollo della macchina per lo slow cooling prevede una prima fase di discesa da RT a -6°C a -2°C/min; uno standby a -6°C della durata di circa 10 min, durante il quale si procede con il seeding, ovvero l’induzione della cristallizzazione della paillette (che avviene manualmente toccando la paillette con una pinza di metallo tenuta immersa in azoto liquido); quindi una discesa da -6°C a -45°C di 0.3°C/min; infine una discesa “free fall” (discesa della temperatura di -10°C/min) da -45°C a circa -150°C. The protocol of the slow cooling machine foresees a first phase of descent from RT to -6 ° C to -2 ° C / min; a standby at -6 ° C lasting about 10 minutes, during which we proceed with the seeding, that is the induction of the crystallization of the sequin (which is done manually by touching the sequin with a metal clamp immersed in liquid nitrogen); then a drop from -6 ° C to -45 ° C of 0.3 ° C / min; finally a “free fall” descent (temperature drop of -10 ° C / min) from -45 ° C to approximately -150 ° C.
Procedura di scongelamento Defrosting procedure
Si preleva la paillette dal contenitore di azoto liquido. Si stabilizza per due minuti nella parte bassa del frigorifero (4°C). Si stabilizza per un minuto a bagnomaria a 37°C. Si toglie il jonc e si connette la paillette alla pipetta aspirante. Si taglia con una forbice sterile l’estremità opposta. Si scarica il contenuto della paillette in una piastra Petri con terreno di coltura stabilizzato precedentemente in incubatore a 37°C e 5% di CO2. È stato utilizzato il terreno distribuito commercialmente da Cook® (Sidney IVF cleavage medium) ma può essere utilizzato qualsiasi terreno di coltura noto nella tecnica. Successivamente viene valutata la presenza degli embrioni. Si riposiziona la piastra Petri contenente gli embrioni nell’incubatore. Dopo 30 minuti si spostano gli embrioni in una seconda piastra Petri con terreno di coltura e si lasciano in incubatore fino al momento del trasferimento. The straw is removed from the liquid nitrogen container. It stabilizes for two minutes in the lower part of the refrigerator (4 ° C). It stabilizes for one minute in a water bath at 37 ° C. The jonc is removed and the sequin is connected to the suction pipette. The opposite end is cut with a sterile scissors. The content of the straw is discharged into a Petri dish with culture medium previously stabilized in an incubator at 37 ° C and 5% CO2. Cook® commercially distributed medium (Sidney IVF cleavage medium) was used but any culture medium known in the art can be used. Subsequently, the presence of the embryos is assessed. The Petri dish containing the embryos is repositioned in the incubator. After 30 minutes, the embryos are moved to a second Petri dish with culture medium and left in the incubator until the moment of transfer.
Risultati Results
Mediante questa procedura sono stati ottenuti i risultati schematizzati nella tabella 1 che segue: Using this procedure, the results outlined in table 1 below were obtained:
Anno N. di embrioni N. di embrioni Percentuale di scongelati scongelati sopravvivenza integri degli embrioni 1 27 23 85,18% Year No. of embryos No. of embryos Percentage of thawed thawed intact survival of embryos 1 27 23 85.18%
2 86 79 91,86% 2 86 79 91.86%
3 46 42 97.90% 3 46 42 97.90%
4 95 88 92.70% 4 95 88 92.70%
5 106 103 97.16% 5 106 103 97.16%
Come si può notare dalla tabella, il metodo secondo l'invenzione sorprendentemente permette di ottenere percentuali di sopravvivenza degli embrioni nettamente maggiori rispetto a quelle ottenibili con i metodi noti, ad esempio le percentuali di sopravvivenza riportate nel catalogo Cook raggiungono soltanto l'80%. È da notare che tali sorprendenti risultati vengono raggiunti con un metodo molto più veloce e semplice. As can be seen from the table, the method according to the invention surprisingly allows to obtain survival percentages of embryos that are much higher than those obtainable with known methods, for example the percentages of survival reported in the Cook catalog reach only 80%. It should be noted that these surprising results are achieved with a much faster and simpler method.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000797A ITTO20090797A1 (en) | 2009-10-21 | 2009-10-21 | METHOD AND SOLUTION FOR THE CRIOCONSERVATION OF HUMAN EMBRYOS |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITTO20090797A1 true ITTO20090797A1 (en) | 2011-04-22 |
Family
ID=42133505
Family Applications (1)
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| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITTO20090797A1 (en) |
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-
2009
- 2009-10-21 IT IT000797A patent/ITTO20090797A1/en unknown
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