ITTO20080870A1 - Biomarcatori per la diagnosi e per rilevare la progressione di malattie neurodegenerative, in particolare della sclerosi laterale amiotrofica - Google Patents

Description

“BIOMARCATORI PER LA DIAGNOSI E PER RILEVARE LA PROGRESSIONE DI MALATTIE NEURODEGENERATIVE, IN PARTICOLARE DELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICAâ€

La presente invenzione à ̈ relativa a biomarcatori per la diagnosi e per rilevare la progressione di malattie neurodegenerative, in particolare della Sclerosi Laterale Amiotrofica.

Stato dell’Arte

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), conosciuta anche come malattia di Lou Gehrig, rappresenta la forma più grave di malattia del motoneurone: si tratta di una patologia devastante del sistema nervoso centrale (SNC) ad eziopatogenesi multifattoriale e decorso fatale. La SLA colpisce 5 individui su 100.000 ogni anno [Julien, 2001], ed à ̈ pertanto la terza causa di morte in età adulta per malattie neurodegenerative, dopo la malattia di Alzheimer (MA) e la malattia di Parkinson [fonte: Motor Neuron Disease Association].

Esistono forme di SLA sia familiari sia sporadiche. Le prime costituiscono solo il 5-10% di tutti i casi e sono state correlate con la presenza di diverse mutazioni genetiche: circa nel 20% dei casi familiari si sono osservate mutazioni del gene della superossidodismutasi 1 (SOD1), una proteina antiossidante ad espressione ubiquitaria. La forma sporadica e la forma familiare della malattia sono clinicamente indistinguibili, il che suggerisce una patogenesi simile innescata da eventi molecolari eterogenei [Bruijn et al., 2004].

Dal punto di vista anatomopatologico la SLA à ̈ caratterizzata dalla perdita rapida e selettiva dei motoneuroni cerebrali, troncoencefalici e/o midollari, con ripercussioni negative sulla forza, sul trofismo e sul tono muscolare. La malattia al suo esordio si presenta con una sintomatologia alquanto eterogenea che può includere debolezza degli arti e del tronco, spasticità, difficoltà ventilatorie, di parola e di masticazione e deglutizione. A questi sintomi seguono una progressiva atrofia e la paralisi più o meno completa dei muscoli scheletrici, che portano alla morte per insufficienza respiratoria generalmente tra i 3 ed i 5 anni dalla manifestazione dei primi sintomi [Belsh, 1996; Rowland, 1998].

Attualmente non sono disponibili terapie efficaci per la SLA. L’unico farmaco approvato, il riluzolo (un composto ad attività anti-glutammatergica), prolunga solo di poco l’aspettativa di vita ed allevia parzialmente alcuni sintomi, ma non à ̈ efficace nell’arrestare la progressione della neurodegenerazione, né nell’indurre la regressione dei sintomi ed il recupero parziale delle funzioni motorie [Lacomblez et al., 1996; Miller et al., 2002].

La ricerca biomedica sulla SLA ha tra le proprie priorità la scoperta di biomarcatori della malattia, in quanto attualmente mancano nella pratica clinica gli strumenti per una diagnosi molecolare di SLA. Infatti, nonostante il numero di studi, pubblicazioni e domande di brevetto sull’argomento, al momento non sono disponibili biomarcatori specifici di SLA utilizzabili clinicamente [Shaw e Williams, 2000; Bowser et al., 2006]. In particolare, nessun biomarcatore si à ̈ rivelato capace di distinguere tra pazienti di SLA e soggetti con processi infiammatori non neurologici, né sono disponibili marcatori di progressione della malattia. In mancanza di parametri biochimici che consentano di diagnosticare precocemente la SLA, la diagnostica si basa unicamente sull’osservazione clinica di sintomi (spesso già gravi ed invalidanti), che si manifestano presumibilmente molto dopo gli eventi molecolari patogenetici. Questa può essere una delle ragioni per cui i trattamenti disponibili mostrano una limitata efficacia. Va anche notato che, in mancanza di terapie efficaci, una diagnosi tempestiva permetterebbe di iniziare i trattamenti in anticipo e quindi di prolungare l’aspettativa di vita del malato [Lacomblez et al., 1996; Miller et al., 2002].

La mancanza di biomarcatori inoltre non permette un’efficiente classificazione su base molecolare dei diversi fenotipi di SLA, una malattia multifattoriale complessa che probabilmente include diversi sottotipi all’interno della sua definizione clinica [Shaw e Williams, 2000; Bowser et al., 2006].

La mancanza di biomarcatori specifici d’altro canto riflette la scarsa conoscenza dei meccanismi molecolari coinvolti nell’insorgenza e nello sviluppo della SLA, con la conseguenza che, nel testare nuovi composti per l’attività terapeutica, non à ̈ possibile ricavare un’indicazione quantitativa della loro efficacia. La scoperta di nuovi biomarcatori può in questo senso contribuire alla comprensione dei meccanismi della malattia, e quindi all’emergere di possibili nuovi bersagli terapeutici.

Alla luce di quanto appena evidenziato, risulterà chiara la necessità impellente di trovare biomarcatori specifici per la SLA. Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di fornire polipeptidi utilizzabili come biomarcatori, in particolare per la diagnosi e il rilevamento della progressione della SLA.

Secondo la presente invenzione tale scopo viene raggiunto mediante polipeptidi secondo le rivendicazioni 1 e 2. La presente invenzione difatti include l’uso dei polipeptidi delle rivendicazioni 1 e 2 per la diagnosi di patologie neurodegenerative, in particolare per la diagnosi della SLA.

Secondo la presente invenzione viene inoltre fornito l’uso dei polipeptidi delle rivendicazioni 1 e 2 per il rilevamento della progressione della SLA.

Definizioni

A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato qui sotto indicato.

Nel presente testo per “percentuale di identità†e “% di identità†tra due sequenze di amminoacidi (peptidi) o di acidi nucleici (nucleotidi) si intende la percentuale di residui amminoacidici o nucleotidici identici in posizioni corrispondenti nelle due sequenze allineate in modo ottimale.

Per determinare la “percentuale di identità†delle due sequenze di amminoacidi o di acidi nucleici, le sequenze vengono tra loro allineate; per raggiungere un confronto ottimale, nelle sequenze possono venire introdotte interruzioni (vale a dire cancellazioni o inserimenti – i quali possono eventualmente essere anche disposti all’estremità delle sequenze) (gap). I residui amminoacidici e nucleotidici in posizioni corrispondenti vengono quindi confrontati. Quando una posizione nella prima sequenza à ̈ occupata dal medesimo residuo amminoacidico o nucleotide che occupa la corrispondente posizione nella seconda sequenza, le molecole sono identiche in quella posizione. La percentuale di identità tra due sequenze à ̈ funzione del numero di posizioni identiche condivise dalle sequenze [vale a dire % di identità = (numero delle posizioni identiche / numero totale delle posizioni) X 100].

Secondo una vantaggiosa forma di attuazione, le sequenze hanno la stessa lunghezza.

Vantaggiosamente, le sequenze confrontate non presentano interruzioni (o inserimenti).

La percentuale di identità può venire ottenuta utilizzando algoritmi matematici. Un esempio non limitativo di un algoritmo matematico utilizzato per il confronto di due sequenze à ̈ l’algoritmo di Karlin ed Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2264-2268] modificato da Karli ed Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5873-5877]. Tale algoritmo à ̈ incorporato nei programmi BLASTn e BLASTp di Altschul [Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410].

Allo scopo di ottenere allineamenti anche in presenza di una o più interruzioni (o inserimenti) à ̈ possibile utilizzare metodi che assegnano una penalità relativamente elevata a ciascuna interruzione (o inserimento) ed una penalità inferiore per ciascun residuo amminoacidico o nucleotidico aggiuntivo nell’interruzione (tale residuo amminoacidico o nucleotide aggiuntivo viene definito come estensione dell’interruzione). Alte penalità determineranno, ovviamente, allineamenti ottimizzati con un minore numero di interruzioni.

Un esempio di un programma atto a realizzare questo tipo di allineamento à ̈ il programma BLAST come descritto in Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. A questo scopo i programmi BLASTn e BLASTp possono essere utilizzati con i parametri di default. Utilizzando i programmi BLAST viene tipicamente impiegata la matrice BLOSUM62.

Un esempio vantaggioso e non limitativo di un programma per realizzare un allineamento ottimale à ̈ GCG Winsconsin Bestfit package (Università del Winsconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Anche in questo caso vengono utilizzati i parametri di default che per una sequenza di amminoacidi prevedono una penalità di -12 per una interruzione ed una penalità di -4 per ciascuna estensione.

Nel presente testo per “percentuale di omologia†e “% di omologia†tra due sequenze di amminoacidi o di acidi nucleici si intende la percentuale di residui amminoacidici o nucleotidi omologhi in posizioni corrispondenti nelle due sequenze allineate in modo ottimale.

La percentuale di omologia fra due sequenze viene determinata in modo sostanzialmente identico a quanto sopra descritto per la determinazione della percentuale di identità eccetto per il fatto che nel calcolo vengono considerate anche le posizioni omologhe e non solo le posizioni identiche.

Per quanto riguarda una sequenza di nucleotidi, due posizioni omologhe presentano due nucleotidi differenti ma che all’interno del proprio codone portano alla codificazione del medesimo amminoacido.

Per quanto riguarda una sequenza di amminoacidi, due posizioni omologhe presentano due amminoacidi omologhi, vale a dire amminoacidi dotati di proprietà chimicofisiche simili, per esempio, amminoacidi appartenenti a medesimi gruppi come: aromatici (Phe, Trp, Tyr), acidi (Glu, Asp), polari (Gln, Asn), basici (Lys, Arg, His), alifatici (Ala, Leu, Ile, Val), con un gruppo idrossi (Ser, Thr), con catena laterale corta (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). Ci si aspetta che sostituzioni tra tali amminoacidi omologhi non cambino il fenotipo delle proteine (sostituzioni conservative di amminoacidi). Specifici esempi di sostituzioni conservative sono note in questo campo tecnico e sono descritte in varia letteratura (ad es., Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990)).

Ulteriori esempi di programmi e/o articoli relativi alla determinazione di allineamenti e delle percentuali di omologia e/o identità sono indicati in, ad esempio, US2008003202, US2007093443, WO06048777.

Nel presente testo per “posizione corrispondente†si intende una posizione in una sequenza di un polipeptide o di acidi nucleici che corrisponde (si affaccia), a seguito di un allineamento, ad una determinata posizione di una sequenza di riferimento.

Breve descrizione delle figure

Per una migliore comprensione della presente invenzione, essa viene ora descritta anche con riferimento alle figure allegate, che illustrano quanto segue:

- la Figura 1A Ã ̈ una tabella in cui sono indicati gli spot corrispondenti ai biomarcatori per la diagnosi della SLA identificati mediante elettroforesi bidimensionale (2DE), e i rispettivi identificativo di sequenza (SEQ ID NO), Accession number, numero (N.) di peptidi della identificazione Mascot, Sequenza di copertura, punto isoelettrico (pI) apparente, peso molecolare (PM) apparente, punteggio Mowse della identificazione Mascot (punteggio MS);

- la Figura 1B à ̈ una tabella in cui à ̈ indicato lo spot corrispondente al biomarcatore per il rilevamento della progressione della SLA identificato mediante 2DE, e i rispettivi SEQ ID NO, Accession number, N. di peptidi, sequenza di copertura, pI apparente, PM apparente, punteggio MS;

- la Figura 2 rappresenta un gel bidimensionale in cui sono evidenziati gli spot elencati nella tabella della Figura 1A;

- la Figura 3 à ̈ una tabella in cui sono indicati, per ciascuno degli spot identificati per 2DE, i valori medi dei volumi percentuali (Vol%) di ciascun gruppo di campioni di plasma individuali analizzati (ovvero: gruppo dei pazienti SLA, gruppo dei soggetti infartuati (INF) e gruppo dei controlli sani (CTR)), ottenuti come di seguito descritto, le deviazioni standard relative ai Vol% medi all’interno del gruppo, ed i valori di p statistico esprimente la significatività di ciascuno spot nel discriminare, sulla base dei Vol%, il gruppo SLA rispetto a ciascuno dei due gruppi di confronto ;

- la Figura 4 Ã ̈ una rappresentazione grafica della magnificazione tridimensionale dello spot 8 rilevato con colorazione di tipo Coomassie, come di seguito descritto;

- la Figura 5 Ã ̈ un grafico che riporta i livelli del biomarcatore corrispondente allo spot 8 negli individui analizzati in forma di Vol%;

- la Figura 6 Ã ̈ un istogramma dei valori della funzione diagnostica DF, calcolata come di seguito descritto, per ognuno dei soggetti inclusi nello studio;

- la Figura 7 à ̈ un grafico che mostra l’andamento decrescente del Vol% dello spot 101 in funzione del tempo trascorso dall’esordio clinico (qui indicato come “onset†) in diversi pazienti di SLA;

- la Figura 8 mostra le sequenze amminoacidiche minime dei frammenti proteici di albumina corrispondenti agli spot 65 (SEQ ID NO: 3), 110 (SEQ ID NO: 2), 8 (SEQ ID NO: 1), 66 (SEQ ID NO: 1), 34 (SEQ ID NO: 4), allineate rispetto alla sequenza amminoacidica dell’albumina intera (Accession number: 28592); e

- la Figura 9 contiene l’immagine di un gel bidimensionale in cui à ̈ evidenziato lo spot 101 elencato nella tabella della Figura 1B.

Descrizione dettagliata dell’invenzione L’identificazione di nuovi biomarcatori à ̈ avvenuta prendendo in esame le proteine del plasma. Il passaggio di molecole dal SNC al plasma permette l’individuazione direttamente nel plasma di biomarcatori provenienti dai siti affetti, che si aggiungono all’eventuale alterazione di marcatori specifici del plasma. Inoltre il campionamento di fluidi periferici consente la collezione di un maggior numero di campioni durante la fase di scoperta dei biomarcatori, permettendo di raggiungere una maggiore robustezza statistica dei risultati ottenuti.

È stato effettuato uno studio mediante 2DE del proteoma plasmatico di pazienti affetti da SLA, confrontandoli con individui sani e con pazienti non neurologici che hanno avuto un recente infarto miocardico o coronarico (d’ora in avanti semplicemente indicati come infartuati).

L’ipotesi di lavoro della ricerca proteomica applicata à ̈ che la maggioranza delle malattie ingeneri modifiche della quantità di proteine e peptidi nei fluidi corporei e nei tessuti. Strategie di tipo proteomico possono rivelare per molte proteine sbilanciamenti tra le diverse isoforme o modifiche quali quelle derivanti da stress ossidativo, legate direttamente od indirettamente al meccanismo eziologico [Perluigi et al., 2005]: per questo motivo tanta parte dell’odierna ricerca biochimica applicata si indirizza allo studio del proteoma di fluidi biologici allo scopo di individuare biomarcatori di diverse condizioni patologiche. Per quel che riguarda miscele biologiche complesse come il sangue, analisi proteomiche diverse hanno già identificato proteine specificamente associate a malattie non genetiche e non correlate a patologie tumorali [Aivado et al., 2007; Kim et al., 2007; Li et al., 2007; Avasarala et al., 2005].

Vale la pena di sottolineare come non sempre i biomarcatori identificati consistano in proteine rare o loro frammenti, o in proteine o parti di proteine la cui espressione à ̈ peculiare e rara. Molte pubblicazioni riportano, al contrario, biomarcatori di malattia che consistono in forme modificate di proteine comuni ed ubiquitarie come l’albumina e le proteine correlate con l’albumina [Yagame et al., 1995; Kaiser et al., 2004; Funding et al., 2005; German et al., 2007]. Un vantaggio importante della proteomica basata su 2DE consiste infatti nella possibilità di identificare alterazioni nelle quantità di frammenti e forme modificate di proteine per le quali il livello della molecola intatta non cambia significativamente [Finehout et al., 2007]. Frammenti proteici peculiari, tipici della SLA e di altre malattie con forte componente apoptotica, possono derivare dall’attivazione selettiva di proteasi e vie degradative specifiche, solitamente attive a livelli bassi [Ilzecka et al., 2001]. In particolare, per quanto riguarda le malattie neurodegenerative, à ̈ stato dimostrato che frammenti C-terminali di albumina presenti nel fluido cerebrospinale (FCS) di pazienti con MA sono biomarcatori specifici di malattia, probabilmente perché la malattia comporta alterazioni nel processo di degradazione dell’albumina [Finehout et al., 2007]. E’ stato inoltre dimostrato che frammenti di albumina hanno attività tossica su colture organotipiche di neuroni colinergici e su colture primarie di astrociti [Moser e Humpel, 2007]. Pertanto, peptidi derivati dalla degradazione dell’albumina o di altre abbondanti proteine seriche potrebbero rappresentare non soltanto un epifenomeno della malattia in esame, ma anche degli attori primari della patogenesi.

Per lo studio proteomico che ha portato all’identificazione dei biomarcatori, si à ̈ considerato il proteoma plasmatico di tre gruppi di individui:

- Soggetti sani (controlli, n = 14)

- Pazienti infartuati, entro 6 ore dall’infarto miocardico o coronarico (n = 8)

- Pazienti affetti da SLA (n = 27)

Per 5 pazienti con SLA, sono stati considerati due prelievi ematici a tempi diversi. I pazienti infartuati sono stati inclusi nello studio come “filtro†per eliminare quei biomarcatori che discriminano pazienti con SLA da controlli solo a causa del processo infiammatorio in atto nei pazienti. Previo consenso informato da parte di tutti gli individui considerati, si à ̈ proceduto al prelievo di sangue venoso da cui à ̈ stato ricavato a fresco il plasma mediante metodo standard.

I campioni di plasma sono poi stati centrifugati a 400 g per 10’ a 4°C. L’albumina non à ̈ stata rimossa dai campioni, non solo perché l’albumina à ̈ una proteina di trasporto che può legare marcatori di interesse, ma anche perché (come discusso precedentemente) forme modificate di albumina differenzialmente presenti nella malattia di interesse possono avere un ruolo ai fini diagnostici. La rimozione dell’albumina può portare pertanto alla perdita di utili biomarcatori [Kawakami et al., 2005; German et al., 2007].

Una volta preparati i campioni, per ognuno di essi à ̈ stato effettuato un esperimento di 2DE ed almeno un replicato tecnico, secondo la procedura di Jacobs et al.

[2001] con alcune modifiche. In breve, per ciascun campione un’aliquota di 6 µl (circa 400 µg di proteina totale) à ̈ stata riscaldata per 5’ a 95°C in presenza di 10 µl di dodecilsolfato di sodio (SDS) al 5% (p/v) e ditiotreitolo (DTT) al 2,5% (p/v), e quindi diluita a 330 µl con un tampone contenente urea (7 M), tiourea (2 M), acido 3[(3-Colamidopropil)dimetilammonio]-propansulfonico (CHAPS) al 4% (p/v), tampone IPG 3-10NL al 0,5% (v/v)(GE Healthcare, Uppsala, Sweden), e tracce di blu di bromofenolo [Hughes et al., 1992]. Il campione à ̈ stato quindi caricato su strisce per isoelettrofocalizzazione (IEF) da 18 cm IPG 3-10 non lineari (GE Healthcare) con reidratazione in gel (2 h a 0 V e 12 h a 30 V). E’ stata quindi effettuata una IEF a 20°C con apparato IPGphor (GE Healthcare), secondo il seguente protocollo: 500 V a 500 V/h, 1.000 V a 1.000 V/h con gradiente lineare; 8.000 V a 13.500 V/h con gradiente lineare; 8.000 V a 72.000 V/h. Prima dell’ elettroforesi denaturante in gel di poliacrilammide-SDS (SDS-PAGE), le strisce IPG sono state equilibrate due volte per 15’ in tampone Tris-HCl (50 mM) a pH 8,8, urea (6 M), glicerolo al 30% (v/v), SDS al 2% (p/v) e tracce di blu di bromofenolo, contenenti DTT al 1% (p/v) per il primo passaggio e iodoacetammide al 2,5% (p/v) per il secondo passaggio. E’ seguita quindi SDS-PAGE in un gel al 12,5% (1,5 mm di spessore), secondo il protocollo di Laemmli [1970], ma senza stacking gel, utilizzando un apparato Hoefer SE600 (GE Healthcare). La seconda dimensione à ̈ stata corsa a 60 mA/gel a 16°C, ed à ̈ stata interrotta quando il fronte del blu di bromofenolo ha raggiunto l’estremità inferiore del gel. Per la calibrazione dei pesi molecolari (PM) e dei punti isolelettrici (pI) sono state usate come standard proteine dal PM compreso tra i 15 ed i 100 kDa e dal pI compreso tra 4,5 e 8,5. I gel sono stati colorati con Coomassie brilliant blue R350 (Sigma, San Diego, US). Dopo la colorazione sono state acquisite immagini digitali dei gel utilizzando uno scanner ImageMaster Labscan V3.0 (GE Healthcare) e le immagini sono state analizzate con il software ImageMaster 2-DE Platinum (GE Healthcare). Per tutti i campioni di ciascun gruppo di individui à ̈ stato scelto un gel di riferimento, cioà ̈ un gel contenente il più alto numero di spot correttamente focalizzati per quel gruppo. Ciascun gel à ̈ stato poi sovrapposto virtualmente (“matching†) al rispettivo gel di riferimento. Gli spot presenti in più del 70% dei gel in un dato gruppo sono stati usati per creare un gel virtuale (“gel media†) che rappresenta il proteoma medio di ogni gruppo. I tre gel media sono stati successivamente sottoposti a matching reciproco per individuare gli spot condivisi fra le tre popolazioni di individui esaminate; la successiva analisi quantitativa à ̈ consistita nel paragonare i corrispettivi volumi percentuali (Vol%) di ciascuno di questi spot nelle tre popolazioni. Per ogni spot, il Vol% à ̈ stato calcolato come integrale del volume di ciascuno spot colorato con Coomassie (area dello spot moltiplicata per la sua intensità) normalizzato sulla somma dei volumi di tutti gli spot presenti nel gel media di riferimento. Per individuare gli spot che variano consistentemente e significativamente fra le tre popolazioni, à ̈ stata condotta un’analisi ANOVA non parametrica (test di Kruskal-Wallis), seguita da un post-test di comparazione (test di Dunn), con una soglia di p ≤ 0,05. Gli spot così evidenziati sono elencati in Figura 1A e mostrati in Figura 2 (spot 65, 66, 110, 125, 182, 183, 87, 34, ovvero SEQ ID NO: 1-8, escluso lo spot 8). I valori medi di Vol% e le deviazioni standard per ciascuno degli spot sono riassunti in Figura 3, evidenziando le differenze fra i soggetti malati di SLA ed il resto dei soggetti considerati. La variabilità sperimentale tra replicati tecnici dello stesso campione à ̈ stata determinata paragonando i diversi Vol% ottenuti, e non à ̈ risultata essere in nessun caso superiore a 0,8 volte (variabilità media: 0,45 volte; variabilità minima: 0,2 volte).

Conclusa l’analisi quantitativa nel modo descritto, sono stati cercati quegli spot assenti nei gel dei soggetti con SLA e presenti negli altri, o viceversa (analisi qualitativa). Questo tipo di analisi ha messo in evidenza lo spot 8 (SEQ ID NO: 1), che rappresenta il miglior singolo marcatore di SLA identificato (Figura 1A, Figura 2; la magnificazione tridimensionale dello spot 8 colorato con Coomassie appare in Figura 4; i livelli del marcatore in oggetto negli individui analizzati sono mostrati in Figura 5).

Considerando tutti i 9 spot evidenziati, à ̈ stata condotta un’analisi discriminante post-test, per saggiare la loro capacità di classificare ogni individuo nella popolazione appropriata, sulla base dei Vol% misurati (software utilizzato: StatistiXL). La capacità di corretta predizione complessiva arriva all’89,8%, con l’assegnazione corretta di tutti i soggetti non affetti da SLA e del 81,5% dei pazienti con SLA. La stessa analisi ha portato alla formulazione della seguente funzione lineare (Diagnostic Function, DF):

DF = - 3.349 Vol%(182) 8.688 Vol%(183) - 1.146 Vol%(65) 5.536 Vol%(110) 1.652 Vol%(87) 2.630 Vol%(125) 3.026 Vol%(34) - 2.426 Vol%(66) 30.098 Vol%(8) - 2.38

in cui Vol%(n) indica il Vol% dello spot n, secondo la numerazione indicata sulla mappa 2DE in Figura 2. La corrispondenza tra la numerazione degli spot considerati per il calcolo della DF così come evidenziati in Figura 2 ed i loro rispettivi identificativi di sequenza (SEQ ID NO), utilizzati altrove nel presente brevetto, à ̈ mostrata nella Figura 1A. Il valore della DF per ognuno dei soggetti inclusi nello studio à ̈ riportato in Figura 6. Un valore positivo di questa funzione à ̈ chiaramente un parametro diagnostico di SLA, mentre un valore negativo tende ad essere associato a soggetti non affetti da SLA.

I valori medi della DF, le corrispondenti deviazioni standard e le dimensioni dei gruppi considerati sono stati presi come valori di input per la successiva Power Analysis, comprendente il calcolo del parametro Cohen’s D, che rende conto dell’effetto delle dimensioni del campione nella determinazione dell’effetto grandezza normalizzato, come descritto da Cohen [1992] e da Hedges e Olkin [1985]. La Power Analysis effettuata pertanto fornisce una misura della confidenza con cui lo stesso effetto grandezza può essere osservato sull’intera popolazione.

Per quel che riguarda i biomarcatori di progressione della malattia, à ̈ stato utilizzato un approccio diverso. Si à ̈ partiti dalla considerazione che un candidato marcatore di progressione deve avere un Vol% molto variabile tra i pazienti considerati, poiché i prelievi sono stati effettuati a distanza temporale diversa dall’esordio clinico. Quindi tutti gli spot identificati nei pazienti con SLA sono stati preliminarmente ordinati per coefficiente di variazione dei loro Vol%, cioà ̈ per la loro deviazione standard normalizzata come frazione del valore medio. Solo quegli spot che presentavano un coefficiente di variazione uguale o maggiore del 100% sono stati esaminati ulteriormente. Nessuno degli spot evidenziati mediante ANOVA come biomarcatori di malattia ha passato questo filtro, come peraltro ci si aspettava (un biomarcatore di malattia tende ad essere costante fra i malati). Tuttavia, il Vol% dello spot 101 à ̈ risultato essere negativamente correlato con il tempo dall’esordio sintomatico, o “onset†(espresso in mesi) in ognuno di quei 5 pazienti per cui erano disponibili due prelievi a tempi diversi (uno del 2004 ed uno del 2006/2007), come illustrato in Figura 7: lo spot 101 à ̈ pertanto considerato un potenziale biomarcatore di progressione della SLA.

Una volta individuati i biomarcatori nella maniera descritta, si à ̈ proceduto a stabilirne l’identità con tecniche di spettrometria di massa. In particolare, gli spot individuati sono stati tagliati manualmente dai gel corrispondenti e decolorati per una notte con una soluzione contenente etanolo al 40% in bicarbonato di ammonio (25 mM); sono quindi stati lavati due volte con bicarbonato di ammonio (25 mM), tre volte con acetonitrile, e quindi essiccati. Ogni frammento di gel à ̈ stato reidratato in bicarbonato di ammonio (25 mM) contenente 0,6 µg di tripsina porcina modificata, ed à ̈ stata condotta una digestione proteasica per una notte a 37°C. I peptidi risultanti sono stati estratti per sonicazione in bicarbonato di ammonio (25 mM), caricati su colonna ZORBAX 300 SB C18 RP (75 µm x 150 mm, particelle da 3,5 µm, Agilent, Milano, Italia) ed eluiti con un gradiente di acetonitrile dal 5% all’80% (contenente acido formico al 0,1%) ad un flusso di 0,3 ml/min, utilizzando un sistema HP 1100 nanoLC accoppiato a spettrometro di massa a trappola ionica XCT-Plus nanospray-ion trap (Agilent)(altrove abbreviato in LC-ESI MS/MS). I parametri utilizzati per lo spettrometro di massa erano i seguenti: ampiezza di scansione = 100-2.200 m/z; velocità di scansione = 8.100 m/z per s; flusso del gas secco = 5 l/min; temperatura secca = 300°C; capillare = 1,8 kV; skimmer = 40 V; target di controllo di carica ionica (ion charge control, ICC) = 125.000; tempo massimo di accumulo = 300 ms. I peptidi carichi positivamente sono stati automaticamente isolati e frammentati, e gli spettri sono stati deconvoluti utilizzando il software DataAnalysis (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). I dati di massa ottenuti con LC-ESI MS/MS sono stati utilizzati per una ricerca sul database di sequenze proteiche NCBI non-redundant tramite l’algoritmo di ricerca Mascot (http://www.matrixscience.com - tolleranza di massa di picco monisotopico: 1,8 Da per lo ione parentale o 0,8 Da per i frammenti; massimo numero di siti non tagliati per peptide pari a 3). Sono state considerate come modificazioni consentite la carbammidometilazione delle cisteine e l’ossidazione delle metionine. I risultati con un punteggio Mowse superiore a 47 sono stati considerati significativi (p < 0,05).

L’identità proteica dei biomarcatori così ottenuta à ̈ riportata in Figura 1 e indicata con i corrispondenti identificativi di sequenza (SEQ ID NO). Come risulta chiaramente, vi à ̈ una prevalenza di frammenti di albumina (SEQ ID NO: 1-4). La sequenza amminoacidica minima di questi frammenti à ̈ riportata in Figura 1A ed esemplificata graficamente in Figura 8 in confronto alla sequenza dell’albumina intera, identificata dall’Accession number 28592, che risulta essere la sequenza di riferimento per l’albumina serica umana, sequenza amminoacidica di cui il presente studio ha individuato frammenti quali biomarcatori in oggetto al presente brevetto.

Per sequenza minima dei frammenti si intende la sequenza ottenuta esaminando i peptidi derivanti dalla digestione triptica di un frammento, ordinando i peptidi sulla base della sequenza della proteina di origine, e ricavando la sequenza compresa tra l’amminoacido N-terminale del primo peptide e l’amminoacido C-terminale dell’ultimo. Questa sequenza à ̈ sicuramente compresa all’interno del frammento di interesse, ma non la esaurisce, potendosi avere ulteriori aminoacidi sia all’N-terminale sia al C terminale compresi tra i siti di taglio triptico riscontrati ed il sito triptico successivo (in direzione N- o C-terminale). Pertanto, benchà ̈ i frammenti corrispondenti allo spot 66 ed allo spot 8 in Figura 1A (evidenziati nella mappa bidimensionale in Figura 2) possiedano la stessa sequenza minima (SEQ ID NO: 1), essi sono distinti probabilmente al C-terminale (dato che entrambe le sequenze minime iniziano all’estremità N-terminale dell’albumina matura). In particolare, poiché immediatamente a valle della sequenza minima identificata sono presenti molti residui acidi, à ̈ probabile che il frammento corrispondente allo spot 66 abbia qualche residuo C-terminale acido in più rispetto al frammento corrispondente allo spot 8, in accordo con il suo punto isoelettrico più acido (Figura 2, Figura 8).

La frammentazione dell’albumina in vivo à ̈ alterata in molte condizioni, tra cui postumi del trapianto di cellule staminali ematopoietiche [Kaiser et al., 2004], tossicità pancreatica esocrina [Walgren et al., 2007], rigetto corneale acuto [Funding et al., 2005], sepsi da meningococco [Holland et al., 2001], nefropatie diabetiche [Yagame et al., 1995], ischemia cardiaca, infiammazione acuta, endotossicosi ed invecchiamento [Bito et al., 2005]. Per quel che riguarda il SNC e le malattie neurodegenerative, determinati frammenti di albumina sono già stati riportati come biomarcatori: per es., alcuni frammenti C-terminali di albumina presenti nel FCS costituiscono dei biomarcatori specifici di MA [Finehout et al., 2007]. Inoltre, in un modello murino di distrofia muscolare uno specifico frammento serico di albumina à ̈ stato trovato aumentato di 2,8 volte [Doran et al., 2006]. Poiché la SLA à ̈ caratterizzata da un’estesa attivazione delle proteasi seriche [Ilzecka et al., 2001; Demestre et al., 2006] e da un forte stress ossidativo [Barber et al., 2006], à ̈ del tutto ragionevole che alcuni meccanismi degradativi specifici della malattia producano specifici frammenti di albumina, come quelli inclusi nel set di biomarcatori descritto in Figura 1A e rappresentati in Figura 8 contro la sequenza dell’albumina intera.

Un altro biomarcatore identificato, corrispondente allo spot 182 (Figura 1A e Figura 2; SEQ ID NO: 6), à ̈ una glicoforma di transferrina. Va ricordato che nei pazienti con SLA la transferrina si accumula nei corpi di Bunina [Mizuno et al., 2006], che la proteina SOD1 modula l’espressione del recettore della transferrina [Danzeisen et al., 2006], ed infine che difetti nell’espressione di alsina causano l’accumulo intracellulare di transferrina in colture di motoneuroni [Jacquier et al., 2006]. Se considerata singolarmente, e non in combinazione con gli altri biomarcatori descritti nella presente invenzione, la transferrina avrebbe limitato valore come biomarcatore di SLA, in quanto glicoforme di transferrina sono coinvolte in modo aspecifico in diverse malattie neurodegenerative e non [Zeman et al., 2000; Brettschneider et al., 2008]. Tuttavia abbiamo verificato che l’inclusione di questi due spot nel set di biomarcatori identificato aumenta il potere diagnostico globale del set, probabilmente poiché esistono - come già ricordato - alcuni meccanismi che portano all’alterazione della transferrina nei pazienti con SLA.

Un altro biomarcatore identificato, corrispondente allo spot 183 (SEQ ID NO: 7), à ̈ la catena costante delle IgM. Il coinvolgimento delle IgM nella SLA à ̈ ben documentato e basato principalmente su evidenze serologiche da pazienti. Titoli elevati di IgM anti-ganglioside GM1 si trovano comunemente in pazienti con neuropatie periferiche e sindromi neuromotorie [Pestronk, 1991]. Più recentemente sono stati dosati elevati titoli di IgM anche contro i gangliosidi GM2 e GD2 [Mizutani et al., 2003]. La risposta immune che talora si riscontra a livello serico contro le proteine dei neurofilamenti à ̈ di tipo IgM [Couratier et al., 1998]. In generale, quindi, il frammento di IgM identificato come marcatore nella SLA potrebbe derivare dalla risposta immune IgM-correlata, riportata in più di uno studio su pazienti di SLA.

Un altro biomarcatore identificato con il metodo descritto à ̈ risultato essere la catena A del fibrinogeno gamma (spot 125, SEQ ID NO: 5). Sebbene il fibrinogeno non sia sintetizzato nel SNC, in quest’ultimo, specialmente in condizioni infiammatorie, si producono molecole correlate col fibrinogeno, come ad es. proteine della coagulazione e della cascata fibrinolitica, così come recettori per la fibrina e messaggeri intracellulari attivati dalla fibrina [discussi in Akassoglou e Strickland, 2002]. Studi recenti hanno dimostrato che i macrofagi nel SNC e le cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico sono i due citotipi più spesso coinvolti nei fenomeni correlati con la fuoriuscita extravasale del fibrinogeno e dei suoi prodotti di degradazione. Nella sclerosi multipla la perdita di regolazione della cascata fibrinolitica à ̈ connessa strettamente alla patogenesi attraverso molti processi biochimici diversi [Adams et al., 2004]. Inoltre, nel FCS di pazienti con MA un aumento della catena A del fibrinogeno gamma riveste un ruolo di biomarcatore di malattia, sebbene questo aumento possa essere dovuto semplicemente al danneggiamento della barriera ematoencefalica [Lee et al., 2007].

L’ultimo biomarcatore di SLA identificato (spot 87; SEQ ID NO: 8) à ̈ risultato essere una forma di clusterina (Apo J). In aree di attiva neurodegenerazione del midollo spinale à ̈ stato dimostrato attraverso ibridazione in situ un aumento del messaggero per la clusterina [Grewal et al., 1999]. La clusterina può avere un ruolo complesso nei processi neurodegenerativi: oltre alla sua attività di inibitore del complesso di ancoraggio alla membrana cellulare, questa glicoproteina multifunzionale può promuovere l’aggregazione cellulare e funzionare da chaperon molecolare, prevenendo l’aggregazione di proteine denaturate. L’innalzamento del livello di RNA messaggero della clusterina e della proteina stessa sono riscontrabili nel danno ischemico cerebrale ed in molte malattie neurologiche, fra cui MA, sclerosi multipla ed epilessia. In alcune cellule l’induzione dell’espressione della clusterina à ̈ associata con l’apoptosi; cellule non neurali ingegnerizzate in modo da produrre ridotte quantità di clusterina sono maggiormente sensibili allo stress ossidativo [Grewal et al., 1999].

Per quanto riguarda il biomarcatore di progressione della SLA, l’analisi mediante spettrometria di massa LC-ESI MS/MS lo ha identificato come il componente 3 del Complemento, in particolare un frammento della porzione c (catena a’ di C3c; SEQ ID NO: 9). Frammenti di C3c sono stati già identificati tramite 2DE come marcatori periferici di SLA [Goldknopf et al., 2006]: tuttavia i frammenti riportati da Goldknopf et al. non coincidono con lo specifico frammento descritto nella presente invenzione, come risulta evidente dal pI completamente differente (e quindi dalla diversa posizione nelle mappe 2DE ottenute da siero o da plasma, di cui un esempio à ̈ riportato in Figura 9). Inoltre C3c non à ̈ mai stato implicato nella progressione della malattia, e quindi il frammento di C3c corrispondente allo spot 101 costituisce un biomarcatore realmente nuovo di progressione della SLA.

A questo punto, dovrebbe essere evidente agli esperti del campo che ogni combinazione dei biomarcatori descritti, con differente potere statistico, può essere usata per la diagnosi differenziale della SLA rispetto ad altre malattie neurodegenerative, così come per una valutazione della sua progressione. Inoltre, ogni combinazione di tali biomarcatori può essere usata congiuntamente ad altri biomarcatori, per ottenere un potere predittivo ed una potenza statistica migliori. Ad esempio, à ̈ possibile utilizzare i biomarcatori descritti, ed in particolare i loro Vol% valutati mediante 2DE, in combinazione con i marcatori serici di SLA scoperti da Goldknopf et al. [2006], sia per la diagnosi sia per la valutazione dello stato di avanzamento della malattia. E’ evidente che tali combinazioni rientrano nello scopo e nell’ambito del presente brevetto, così come ogni altra combinazione con altri tipi di biomarcatori e/o marcatori fisiologici e/o diagnostici.

Descrizione di una o più forme di attuazione

La procedura diagnostica oggetto della presente invenzione può esplicarsi attraverso diverse forme di attuazione.

A mero titolo di esempio, nel paragrafo successivo si illustra una forma di attuazione basata sul prelievo di campioni ematici dai soggetti da testare, sulla quantificazione mediante 2DE dei biomarcatori identificati, sul calcolo di una funzione diagnostica per individuare la presenza della SLA e sulla valutazione dello stato di avanzamento della malattia mediante confronto della quantità di C3c alla 2DE tra prelievi diacronici.

Come descritto nel paragrafo dedicato alle varianti del metodo proposto, resta inteso che la procedura dettagliatamente descritta qui di seguito à ̈ una fra le molte possibili procedure che sfruttano lo stesso set di biomarcatori, le quali procedure devono considerarsi nel loro complesso rientranti nello spirito e nell’ambito del presente brevetto.

In particolare, la presente invenzione si basa sulla scoperta di un set di biomarcatori per la SLA, il cui ammontare à ̈ correlato con la presenza della malattia (tutti i biomarcatori indicati in Figura 1A, eccetto quindi il marcatore C3c) o alla sua progressione (solo C3c, Figura 1B). La quantità di questi biomarcatori può essere valutata mediante 2DE, come descritto precedentemente, ma à ̈ evidente agli esperti del settore che un qualunque altro metodo di valutazione del livello di uno o più dei biomarcatori riportati in Figura 1 rientra pienamente nello scopo e nello spirito della presente domanda di brevetto. A puro titolo di esempio, i biomarcatori possono essere quantificati attraverso una o più delle seguenti tecniche alternative:

1. Western Blotting

2. Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay (ELISA) 3. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) 4. Spettrometria di massa

Inoltre, una variante pienamente nello scopo della presente domanda di brevetto consiste nel far uso di qualunque combinazione numerica dell’ammontare di alcuni o di tutti i biomarcatori descritti, al fine di calcolare una differente funzione diagnostica (lineare o non lineare) oppure di derivare un qualunque parametro statistico in modo da ottenere un punteggio utile per la diagnosi di SLA o per la valutazione della sua progressione.

E’ inteso inoltre che qualunque combinazione dei presenti biomarcatori con altri metodi diagnostici di SLA o di altre malattie neurologiche à ̈ da ritenersi parte integrante della presente domanda di brevetto.

Infine va osservato come, sebbene l’utilizzo di campioni di sangue umano sia preferibile all’utilizzo di altro materiale biologico, la ricerca e l’utilizzo di una qualunque combinazione dei biomarcatori indicati in Figura 1 in campioni biologici diversi dal sangue umano à ̈ da ritenersi parte integrante della presente domanda di brevetto.

Funzionamento della procedura diagnostica

Allo scopo di diagnosticare la SLA in un dato individuo, o di valutare lo stato di avanzamento della malattia, nei seguenti paragrafi sarà descritto:

(1) un metodo di quantificazione dei biomarcatori oggetto del presente brevetto;

(2) un metodo di diagnosi di SLA basato sulla quantificazione di cui al punto precedente;

(3) un metodo di valutazione dello stato di avanzamento di SLA basato sulla quantificazione del biomarcatore C3c ottenuta con la procedura di cui al punto (1).

(1). QUANTIFICAZIONE DEI BIOMARCATORI

Il plasma degli individui di interesse à ̈ ottenuto mediante metodi standard. Una volta preparati i campioni di plasma (per centrifugazione a 4°C per 10’ a 400 g), per ognuno di essi va effettuato un esperimento di 2DE ed il relativo replicato tecnico, secondo la procedura di Jacobs et al. [2001] con alcune modifiche. In breve, un’aliquota di 6 µl (circa 400 µg di proteina totale) per ciascun campione à ̈ riscaldata per 5’ a 95°C in presenza di 10 µl di SDS al 5% (p/v) e DTT al 2,5% (p/v), e quindi diluita a 330 µl con un tampone contenente urea (7 M), tiourea (2 M), CHAPS al 4% (p/v), tampone IPG 3-10 NL al 0,5% (v/v), e tracce di blu di bromofenolo [Hughes et al., 1992]. Il campione à ̈ quindi caricato su strisce da 18 cm IPG 3-10 non lineari con reidratazione in gel (2 h a 0 V e 12 h a 30 V). Va quindi effettuata la IEF a 20°C con apparato IPGphor (GE Healthcare) o equivalente, secondo il seguente protocollo: 500 V a 500 V/h, 1.000 V a 1.000 V/h con gradiente lineare, 8.000 V a 13.500 V/h con gradiente lineare, 8.000 V a 72.000 V/h. Prima della SDS-PAGE le strisce IPG vengono equilibrate due volte per 15’ in Tris-HCl (50 mM) a pH 8,8, urea (6 M), glicerolo al 30% (v/v), SDS al 2% (p/v) e tracce di blu di bromofenolo, contenenti DTT al 1% (p/v) per il primo passaggio e iodoacetammide al 2,5% (p/v) per il secondo passaggio. Segue quindi SDS-PAGE con gel al 12,5% (1,5 mm di spessore), secondo il protocollo di Laemmli [1970], ma senza stacking gel, utilizzando un apparato Hoefer SE600 (GE Healthcare) o equivalente. La seconda dimensione viene corsa a 60 mA/gel a 16°C, e va interrotta quando il fronte del blu di bromofenolo ha raggiunto l’estremità inferiore del gel. Per la calibrazione dei PM e dei pI possono usarsi proteine come standard di PM (15-100 kDa) e di pI (pH 4,5-8,5). I gel vanno quindi colorati con Coomassie brilliant blue R350 (Sigma). Dopo la colorazione le immagini digitali dei gel vengono acquisite utilizzando uno scanner ImageMaster Labscan V3.0 (GE Healthcare) o equivalente, e le immagini vengono analizzate con il software ImageMaster 2-DE Platinum (GE Healthcare) o equivalente. Per identificare gli spot diagnostici sul gel in esame, l’immagine del gel viene sovrapposta con il gel di riferimento opportuno (Figura 2). Per ogni spot diagnostico si ricava il Vol% mediante analisi densitometrica, come rapporto percentuale della densità dello spot normalizzata sul totale della densità di tutti gli spot allineati tra il gel in esame ed il gel di riferimento.

(2) DIAGNOSI DI SLA

(2.1). Calcoli

A partire dai Vol% degli spot individuati in Figura 1 si calcola la seguente funzione diagnostica DF:

DF = - 3.349 Vol%(182) 8.688 Vol%(183) - 1.146 Vol%(65) 5.536 Vol%(110) 1.652 Vol%(87) 2.630 Vol%(125) 3.026 Vol%(34) - 2.426 Vol%(66) 30.098 Vol%(8) - 2.38

dove resta inteso che la numerazione di ciascuno spot mostrato a titolo esemplificativo evidenziato sulla mappa 2DE in Figura 1 corrisponde all’identificativo di sequenza mostrato in Figura 1A per ciascuno spot, ovvero: spot 8 e SPOT 66 = SEQ ID NO 1;

spot 110 = SEQ ID NO 2;

spot 65 = SEQ ID NO 3;

spot 34 = SEQ ID NO 4;

spot 125 = SEQ ID NO 5;

spot 182 = SEQ ID NO 6;

spot 183 = SEQ ID NO 7;

spot 87 = SEQ ID NO 8.

Resta inteso inoltre che ogni altra funzione (per es. una funzione lineare differente o una funzione non lineare) delle quantità dei biomarcatori indicate, determinate come descritto oppure per mezzo di Western Blotting, ELISA o altre metodiche, può essere usata al posto della funzione descritta, e rientra nello spirito del presente brevetto.

(2.2). Valutazione dei risultati

Come mostrato in Figura 6, il valore di DF tende ad essere positivo in presenza di SLA. Si assume quindi che, nel caso la quantificazione dei biomarcatori proposti porti ad un valore di DF > 0, il soggetto sotto esame sia affetto da SLA.

Gli esperti del campo non faranno fatica a riconoscere che, qualora si usi una funzione differente, bisognerà selezionare un diverso valore di soglia, ma l’informazione in ingresso, connessa in qualsiasi modo ad uno o più dei biomarcatori riportati, à ̈ la stessa ed à ̈ coperta dal presente brevetto.

(3) PROGRESSIONE DELLA MALATTIA

(3.1). Calcoli

Per identificare lo spot 101 sul gel in esame, lo stesso gel viene sovrapposto all’immagine di un gel di riferimento (Figura 9). Il Vol% dello spot 101 à ̈ quindi calcolato come descritto precedentemente.

(3.2). Valutazione

Man mano che aumenta il tempo trascorso dall’esordio clinico della malattia, il Vol% dello spot 101 à ̈ atteso diminuire nei pazienti di SLA (Figura 7). Quindi, un confronto del Vol% di questo spot con il corrispondente valore ottenuto in un momento antecedente à ̈ informativo sulla progressione della malattia. Come evidente agli esperti nel campo, la misura dell’ammontare di proteina corrispondente allo spot 101 (C3c) attraverso ogni altro mezzo può rimpiazzare la stima del Vol% dello spot 101, senza uscire dall’ambito del presente brevetto.

Vantaggi

Gli esperti nel campo e coloro che si occupano di SLA riconosceranno immediatamente i vantaggi di un test diagnostico quale quello descritto e dei corrispondenti biomarcatori, che possiedono le seguenti qualità:

1. maggiore obiettività rispetto a metodi clinici di diagnosi, essendo il test legato ad un aspetto molecolare della malattia ed alla misura di parametri quantitativi per la diagnosi;

2. maggiore accuratezza dei biomarcatori proposti rispetto ad altri, perché selezionati eliminando marcatori di infiammazione generica;

3. semplicità di prelievo dei campioni richiesti e della diagnosi, perché la misura si basa su biomarcatori ematici, piccoli volumi di sangue e sul calcolo di un unico valore per la diagnosi di SLA;

4. possibilità di sviluppo di metodologie semplificate di diagnosi, poiché i biomarcatori individuati possono essere rilevati con tecniche diverse dalla 2DE;

5. possibilità di follow-up a livello quantitativo della malattia e delle terapie, perché uno dei biomarcatori individuati cambia il proprio livello lungo il decorso della malattia.

Varianti

Ciò che à ̈ stato sin qui descritto à ̈ un esempio privilegiato dell’invenzione insieme con qualche possibile variazione. I termini, le descrizioni e le figure usate sono riportati a puro titolo illustrativo e non implicano limitazioni negli scopi e nell’oggetto del presente brevetto. Gli esperti della materia riconosceranno che molte varianti sono possibili nello spirito e nell’ambito di applicazione della presente invenzione, nella cui descrizione ogni termine à ̈ stato usato nel più ampio senso possibile, senza alcuna limitazione salvo quando esplicitamente indicato.

In particolare, la presente invenzione si basa sulla scoperta di un set di biomarcatori per la SLA, il cui ammontare à ̈ connesso alla presenza della patologia (tutti i biomarcatori indicati in Figura 1A, eccetto quindi il marcatore C3c) o alla sua progressione (solo C3c, Figura 1B). Questi biomarcatori possono essere quantificati mediante 2DE, come descritto precedentemente, ma à ̈ evidente agli esperti del settore che un qualunque altro metodo di valutazione dell’ammontare di uno o più dei biomarcatori riportati in Figura 1 rientra pienamente nello scopo e nello spirito della presente domanda di brevetto. A puro titolo di esempio, i biomarcatori possono essere quantificati attraverso una o più delle seguenti tecniche alternative:

1. Western Blotting

2. ELISA

3. HPLC

4. Spettrometria di massa.

Una variante pienamente nello scopo della presente domanda di brevetto consiste inoltre nel far uso di qualunque combinazione numerica dell’ammontare di alcuni o tutti i biomarcatori descritti, al fine di calcolare una differente funzione diagnostica (lineare o non lineare) oppure di ottenere un qualunque parametro statistico che fornisca un punteggio utile per la diagnosi di SLA o per la valutazione della sua progressione.

E’ inteso inoltre che qualunque combinazione dei presenti biomarcatori con altri metodi diagnostici di SLA o di altre malattie neurodegenerative à ̈ da ritenersi parte integrante della presente domanda di brevetto.

Infine, va osservato come, sebbene l’utilizzo di campioni di sangue umano sia preferibile all’utilizzo di altro materiale biologico, la ricerca e l’utilizzo di una qualunque combinazione dei biomarcatori indicati in Figura 1 in campioni biologici diversi dal sangue umano à ̈ da ritenersi parte integrante della presente domanda di brevetto.

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Walgren JL, Mitchell MD, Whiteley LO, Thompson DC. (2007). Evaluation of two novel peptide safety markers for exocrine pancreatic toxicity. Toxicol Sci, 96:184.

Yagame M, Suzuki D, Jinde K, Yano N, Naka R, Abe Y, Nomoto Y, Sakai H, Suzuki H, Ohashi Y. (1995). Urinary albumin fragments as a new clinical parameter for the early detection of diabetic nephropathy. Intern Med, 34:463.

Zeman D, Adam P, Kalistová H, Sobek O, Kelbich P, Andel J, Andel M. (2000). Transferrin in patients with multiple sclerosis: a comparison among various subgroups of multiple sclerosis patients. Acta Neurol Scand, 101:89.

LISTA DELLE SEQUENZE

<110> Bioindustry Park del Canavese SPA

<120> BIOMARCATORI PER LA DIAGNOSI E PER RILEVARE LA PROGRESSIONE DI MALATTIE NEURODEGENERATIVE, IN PARTICOLARE DELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA

<130> 713-08

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 262

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 8 e 66

<400> 1

Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala

1 5 10 15

Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn

20 25 30 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

35 40 45

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr

50 55 60

Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala

65 70 75 80

Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp

85 90 95

Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys

100 105 110

Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr

115 120 125

Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe

130 135 140

Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala

145 150 155 160

Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu

165 170 175

Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln

180 185 190

Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser

195 200 205

Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr

210 215 220

Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu

225 230 235 240

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln

245 250 255

Asp Ser Ile Ser Ser Lys

260

<210> 2

<211> 377

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 110

<400> 2

Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala

1 5 10 15

Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn

20 25 30 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

35 40 45

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr

50 55 60

Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala

65 70 75 80

Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp

85 90 95

Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys

100 105 110

Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr

115 120 125

Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe

130 135 140

Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala

145 150 155 160

Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu

165 170 175

Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln

180 185 190

Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser

195 200 205

Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr

210 215 220

Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu

225 230 235 240

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln

245 250 255

Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu

260 265 270

Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys

290 295 300

Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr

305 310 315 320

Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg

325 330 335

Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala

340 345 350

Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu

355 360 365

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys

370 375

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 65

<400> 3

Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala

1 5 10 15

Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn

20 25 30 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

35 40 45

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr

50 55 60

Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala

65 70 75 80

Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp

85 90 95

Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys

100 105 110

Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr

115 120 125

Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe

130 135 140

Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala

145 150 155 160

Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu

165 170 175

Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln

180 185 190

Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser

195 200 205

Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr

210 215 220

Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu

225 230 235 240

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln

245 250 255

Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu

260 265 270

Glu Lys

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 34

<400> 4

Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu

1 5 10 15

Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe

20 25 30 Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile

35 40 45

Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala

50 55 60

Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

65 70 75 80

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu

85 90 95

Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

100 105 110

<210> 5

<211> 194

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 125

<400> 5

Ala Ile Gln Leu Thr Tyr Asn Pro Asp Glu Ser Ser Lys Pro Asn Met

1 5 10 15

Ile Asp Ala Ala Thr Leu Lys Ser Arg Lys Met Leu Glu Glu Ile Met

20 25 30 Lys Tyr Glu Ala Ser Ile Leu Thr His Asp Ser Ser Ile Arg Tyr Leu

35 40 45

Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn Gln Lys Ile Val Asn Leu Lys Glu

50 55 60

Lys Val Ala Gln Leu Glu Ala Gln Cys Gln Glu Pro Cys Lys Asp Thr

65 70 75 80

Val Gln Ile His Asp Ile Thr Gly Lys Asp Cys Gln Asp Ile Ala Asn

85 90 95

Lys Gly Ala Lys Gln Ser Gly Leu Tyr Phe Ile Lys Pro Leu Lys Ala

100 105 110

Asn Gln Gln Phe Leu Val Tyr Cys Glu Ile Asp Gly Ser Gly Asn Gly

115 120 125

Trp Thr Val Phe Gln Lys Arg Leu Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys

130 135 140

Asn Trp Ile Gln Tyr Lys Glu Gly Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly

145 150 155 160

Thr Thr Glu Phe Trp Leu Gly Asn Glu Lys Ile His Leu Ile Ser Thr

165 170 175

Gln Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Leu Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp Asn

180 185 190

Gly Arg

210> 6

<211> 650

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 182

<400> 6

Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg

1 5 10 15

Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys

20 25 30 Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn

35 40 45

Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr

50 55 60

Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys

85 90 95

Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His

100 105 110

Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu

115 120 125

Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala

130 135 140

Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe

145 150 155 160

Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn

165 170 175

Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala

180 185 190

Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala

195 200 205

Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr

210 215 220

Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro

225 230 235 240

Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile

245 250 255

Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser

260 265 270

Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe

275 280 285

Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala

290 295 300

Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg

305 310 315 320

Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys

325 330 335

Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser

340 345 350

Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu

355 360 365

Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu

370 375 380

Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val

385 390 395 400

Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu

405 410 415

Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu

420 425 430

Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly

435 440 445

Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile

450 455 460

Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly

465 470 475 480

Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu

485 490 495

Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly

500 505 510

Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His

515 520 525

Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala

530 535 540

Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr

545 550 555 560

Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro

565 570 575

Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys

580 585 590

Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys

595 600 605

Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe

610 615 620

Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr

625 630 635 640

Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys

<210> 7

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 183

<400> 7

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

1 5 10 15

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

20 25 30 Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

35 40 45

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

50 55 60

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

65 70 75 80

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

85 90 95

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

100 105 110

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln

115 120 125

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

130 135 140

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

145 150 155

160

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

165 170 175

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

180 185 190

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

195 200 205

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

210 215 220

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

225 230 235 240

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

245 250 255

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

260 265 270

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

275 280 285

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

290 295 300

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

305 310 315 320

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg

325

<210> 8

<211> 393

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 87

<400> 8

Glu Ile Gln Asn Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile

1 5 10 15

Glu Lys Thr Asn Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu

20 25 30 Ala Lys Lys Lys Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu

35 40 45

Thr Lys Leu Lys Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala

50 55 60

Leu Trp Glu Glu Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe

65 70 75 80

Tyr Ala Arg Val Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu

85 90 95

Glu Glu Phe Leu Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly

100 105 110

Asp Arg Ile Asp Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met

115 120 125

Leu Asp Val Met Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp

130 135 140

Glu Leu Phe Gln Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr

145 150 155 160

His Tyr Leu Pro Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe

165 170 175

Pro Lys Ser Arg Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu

180 185 190

Pro Leu Asn Phe His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His

195 200 205

Glu Ala Gln Gln Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln

210 215 220

His Pro Pro Thr Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val

225 230 235 240

Cys Arg Glu Ile Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp

245 250 255

Gln Cys Asp Lys Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn

260 265 270

Asn Pro Ser Gln Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln

275 280 285

Val Ala Glu Arg Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr

290 295 300

Gln Trp Lys Met Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu

305 310 315 320

Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp

325 330 335

Gln Tyr Tyr Leu Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser

340 345 350

Asp Val Pro Ser Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser

355 360 365

Asp Pro Ile Thr Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Asn Pro

370 375 380

Lys Phe Met Glu Thr Val Ala Glu Lys

385 390

<210> 9

<211> 319

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> polipeptide dello spot 101

<400> 9

Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly Gln Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ser Val Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu Thr

20 25 30 Cys Asn Lys Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu Thr

35 40 45

Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys

50 55 60

Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile

65 70 75 80

Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu

85 90 95

Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser His

115 120 125

Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys Val His Gln Tyr Phe Asn Val

130 135 140

Glu Leu Ile Gln Pro Gly Ala Val Lys Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu

145 150 155

160

Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu Lys Glu Asp Gly Lys

165 170 175

Leu Asn Lys Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu Asn

180 185 190

Cys Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu

195 200 205

Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg Leu

210 215 220

Val Lys Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile

225 230 235 240

Glu Gln Thr Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln

245 250 255

Arg Thr Phe Ile Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala Leu Lys Leu Glu

260 265 270

Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly

275 280 285

Glu Lys Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly Lys Asp Thr Trp Val Glu

290 295 300

His Trp Pro Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Glu Glu Asn Gln Lys

310 315

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Polipeptide avente sequenza con almeno il 90% di identità con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.
2. 2. Polipeptide avente SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.
3. 3. Uso di un polipeptide secondo la rivendicazione 1 o 2, come biomarcatore.
4. 4. Uso secondo la rivendicazione 3, per la diagnosi in vitro o per rilevare la progressione di una malattia neurodegenerativa in un individuo.
5. 5. Uso secondo la rivendicazione 3 o 4, in cui detta malattia neurodegenerativa à ̈ la sclerosi laterale amiotrofica.
6. 6. Uso di un polipeptide secondo la rivendicazione 3 o 5 avente sequenza: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 per la diagnosi in vitro di una malattia neurodegenerativa in un individuo.
7. 7. Uso di un polipeptide secondo la rivendicazione 4 o 5 avente sequenza SEQ ID NO: 9 per rilevare la progressione di una malattia neurodegenerativa in un individuo.
8. 8. Uso secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui detta malattia neurodegenerativa à ̈ la sclerosi laterale amiotrofica.
9. 9. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 8, in cui detto biomarcatore à ̈ utilizzato in combinazione con almeno un altro biomarcatore.
10. 10. Metodo per la diagnosi in vitro o per rilevare la progressione di una malattia neurodegenerativa in un individuo comprendente le fasi di: - isolamento di un campione biologico dall’individuo; - quantificazione del livello di uno o più polipeptidi secondo la rivendicazione 1 o 2 in detto campione biologico; - confronto di detto livello con un livello di riferimento.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detta malattia neurodegenerativa à ̈ la sclerosi laterale amiotrofica.
12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui detto campione organico à ̈ un fluido biologico.
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui detto fluido biologico à ̈ selezionato nel gruppo costituito da sangue, plasma, siero e liquido cerebrospinale.
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui la quantificazione di uno o più polipeptidi secondo le rivendicazioni 1 e 2 à ̈ effettuata mediante una tecnica selezionata nel gruppo costituito da elettroforesi bidimensionale, densitometria, Western Blotting, ELISA, HPLC, spettrometria di massa e protein chip.