ITRM20130719A1 - NEW LIGANDS OF ESTROGENIC RECEPTORS COUPLED WITH PROTEIN G - Google Patents

NEW LIGANDS OF ESTROGENIC RECEPTORS COUPLED WITH PROTEIN G

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ITRM20130719A1
ITRM20130719A1 IT000719A ITRM20130719A ITRM20130719A1 IT RM20130719 A1 ITRM20130719 A1 IT RM20130719A1 IT 000719 A IT000719 A IT 000719A IT RM20130719 A ITRM20130719 A IT RM20130719A IT RM20130719 A1 ITRM20130719 A1 IT RM20130719A1
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IT
Italy
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nicotinic acid
nicotinamide
gpr30
receptor
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IT000719A
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Marcello Maggiolini
Maria Francesca Santolla
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Univ Calabria
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Description

“NUOVI LIGANDI DI RECETTORI ESTROGENICI ACCOPPIATI A PROTEINA G” "NEW LIGANDS OF ESTROGENIC RECEPTORS COUPLED TO PROTEIN G"

DESCRIZIONE DESCRIPTION

La presente invenzione è diretta all’uso di acido nicotinico o nicotinammide e a composizioni che li comprendono per uso in un trattamento di condizioni patologiche che possano beneficiare dell’attività biologica indotta dall’attivazione del recettore GPR30. L’invenzione si riferisce inoltre ad un metodo per la valutazione/selezione di ligandi ad attività agonista o antagonista del recettore GPR30. The present invention is directed to the use of nicotinic acid or nicotinamide and to compositions that include them for use in the treatment of pathological conditions that can benefit from the biological activity induced by the activation of the GPR30 receptor. The invention also refers to a method for the evaluation / selection of ligands with agonist or antagonist activity of the GPR30 receptor.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE STATE OF THE PRIOR ART

Il recettore GPR30, noto anche come GPER (G protein estrogen receptor), è un recettore orfano di circa 38kDa caratterizzato dalla presenza di 7 eliche transmembrana tipiche dei recettori accoppiati a proteine G (GPCRs) (Lappano, R. and Maggiolini M. Nat. Rev. Drug Discov.2011, 10: 47-60). GPER, la cui struttura non è dunque correlata ai classici recettori estrogenici (ERα e ERβ), in seguito all’interazione con una serie di ligandi (estrogeni e altre tipologie di composti) attiva varie vie (pathways) trasduzionali (es. EGFR/ERK1-2, PI3K/AKT, ecc.) coinvolti in importanti risposte biologiche dipendenti dal contesto cellulare interessato (Maggiolini, M. and Picard, D. 2010, 204: 105-14; Prossnitz, E. R. and Maggiolini, M. Mol. Cell Endocrinol.2009, 308: 32–38). The GPR30 receptor, also known as GPER (G protein estrogen receptor), is an orphan receptor of about 38kDa characterized by the presence of 7 transmembrane helices typical of G protein-coupled receptors (GPCRs) (Lappano, R. and Maggiolini M. Nat. Rev. Drug Discov. 2011, 10: 47-60). GPER, whose structure is therefore not related to the classic estrogen receptors (ERα and ERβ), following the interaction with a series of ligands (estrogens and other types of compounds) activates various transductional pathways (eg EGFR / ERK1) -2, PI3K / AKT, etc.) involved in important biological responses depending on the cellular context concerned (Maggiolini, M. and Picard, D. 2010, 204: 105-14; Prossnitz, E. R. and Maggiolini, M. Mol. Cell Endocrinol . 2009, 308: 32–38).

Il recettore GPER è ampiamente distribuito in diversi tessuti, tra cui cuore e vasi, ovaie, placenta, prostata, fegato, pancreas, rene, surrene, tessuto epiteliale e osseo, sistema nervoso e linfatico. In particolare, studi funzionali hanno dimostrato che G-1, agonista selettivo di GPER, promuove sopravvivenza neuronale, come gli estrogeni, in seguito ad ischemia cerebrale (Brailoiu E, et al. Journal of Endocrinology 2007, 193: 311–321). Nel sistema cardiovascolare G-1 esercita un’azione protettiva poiché riduce i danni da riperfusione e la necrosi cellulare dopo infarto miocardico, limitando inoltre la produzione di citochine proinfiammatorie (Weil BR, et al. Surgery. 2010; 148: 436– 43.). In corso di nefropatie l’attivazione di GPER induce una riduzione della proteinuria e un miglioramento della clearence della creatinina (Gilliam-Davis S, et al. Hypertension.2010; 56: 50-166). E’ stato anche osservato che gli estrogeni attraverso GPER ed i classici recettori estrogenici (ERα e ERβ) sono in grado di indurre atrofia timica con una diminuzione della porzione corticale rispetto alla midollare e conseguente riduzione dei timociti (Wang C, et al. Mol Endocrinol.2008; 22: 636–48). Nelle isole pancreatiche umane e murine è stato inoltre dimostrato che la downregolazione di GPER determina una riduzione della secrezione di insulina (Sharma G, et al. Endocrinology. 2011; 152:3030-9). L’espressione di GPER è stata anche evidenziata in vari tipi di tumore, particolarmente in quelli estrogeno-responsivi ed è stata associata direttamente alle dimensioni tumorali, alla presenza di metastasi e all’overespressione di HER-2/neu (Maggiolini M, et al, 2004 J BiolChem 279: 27008-27016). A tal riguardo, è stato riportato che il cross-talk funzionale tra diversi GPCRs e vari recettori dei fattori di crescita è coinvolto nell’attivazione di segnali molecolari che attraverso la modulazione dell'espressione di numerosi geni contribuiscono allo sviluppo dei tumori, alla formazione di metastasi e alla neo-angiogenesi. Per quanto concerne la regolazione di GPER, sono stati coinvolti nella sua espressione non solo importanti fattori di crescita come l’EGF e l’ IGF-1, ma anche l’ipossia che attivando il fattore trascrizionale noto come “hypoxia inducible factor-1α” (HIF-1α) induce la cascata del segnale mediata da GPER sia in cellule tumorali che in cardiomiociti (De Marco P, et al. 2013 Oncogene 7, 32: 678-88). Tali evidenze sperimentali sono di particolare interesse poiché indicano che GPER può esercitare in differenti contesti cellulari un ruolo fondamentale associato sia alla sua attività recettoriale che da mediatore dell’ipossia. The GPER receptor is widely distributed in different tissues, including heart and vessels, ovaries, placenta, prostate, liver, pancreas, kidney, adrenal, epithelial and bone tissue, nervous and lymphatic systems. In particular, functional studies have shown that G-1, a selective agonist of GPER, promotes neuronal survival, like estrogen, following cerebral ischemia (Brailoiu E, et al. Journal of Endocrinology 2007, 193: 311–321). In the cardiovascular system G-1 exerts a protective action as it reduces reperfusion damage and cell necrosis after myocardial infarction, also limiting the production of proinflammatory cytokines (Weil BR, et al. Surgery. 2010; 148: 436–43.) . In the course of nephropathies, the activation of GPER induces a reduction in proteinuria and an improvement in creatinine clearance (Gilliam-Davis S, et al. Hypertension. 2010; 56: 50-166). It has also been observed that estrogens through GPER and the classic estrogen receptors (ERα and ERβ) are able to induce thymic atrophy with a decrease in the cortical portion compared to the medulla and consequent reduction of thymocytes (Wang C, et al. Mol Endocrinol . 2008; 22: 636–48). In human and murine pancreatic islets it has also been shown that downregulation of GPER leads to a reduction in insulin secretion (Sharma G, et al. Endocrinology. 2011; 152: 3030-9). GPER expression has also been highlighted in various tumor types, particularly in estrogen-responsive ones, and has been directly associated with tumor size, the presence of metastases and the overexpression of HER-2 / neu (Maggiolini M, et al. , 2004 J BiolChem 279: 27008-27016). In this regard, it has been reported that the functional cross-talk between different GPCRs and various growth factor receptors is involved in the activation of molecular signals which, through the modulation of the expression of numerous genes, contribute to the development of tumors, to the formation of metastasis and neo-angiogenesis. Regarding the regulation of GPER, not only important growth factors such as EGF and IGF-1 have been involved in its expression, but also hypoxia which activating the transcription factor known as "hypoxia inducible factor-1α" (HIF-1α) induces the GPER-mediated signal cascade in both tumor cells and cardiomyocytes (De Marco P, et al. 2013 Oncogene 7, 32: 678-88). These experimental evidences are of particular interest as they indicate that GPER can exercise a fundamental role in different cellular contexts associated with both its receptor activity and as a mediator of hypoxia.

Alla luce di quanto detto, appare evidente l’importanza d'identificare ligandi selettivi di GPER ad azione agonista o antagonista. La scoperta di nuovi composti sia di origine endogena che sintetica in grado di legare ed attivare il pathway trasduzionale mediato da GPER è inoltre di estrema importanza per la messa a punto di strumenti diagnostici, prognostici e terapeutici innovativi in una vasta gamma di condizioni fisiopatologiche (ad esempio tumori, malattie cardiovascolari, neurodegenerative, metaboliche, ecc) nelle quali GPER può esercitare un ruolo biologico fondamentale. In light of the foregoing, the importance of identifying selective GPER ligands with agonist or antagonist action appears evident. The discovery of new compounds of both endogenous and synthetic origin capable of binding and activating the transduction pathway mediated by GPER is also of extreme importance for the development of innovative diagnostic, prognostic and therapeutic tools in a wide range of pathophysiological conditions (for for example tumors, cardiovascular, neurodegenerative, metabolic diseases, etc.) in which GPER can play a fundamental biological role.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION

La presente invenzione si basa sulla scoperta di due nuovi ligandi del recettore GPR30 che attivano in modo selettivo la via trasduzionale mediata da tale recettore. I due nuovi ligandi sono l’acido nicotinico noto come vitamina B3 ed il derivato ammidico dell’acido nicotinico noto come nicotinammide. The present invention is based on the discovery of two new ligands of the GPR30 receptor which selectively activate the transduction pathway mediated by this receptor. The two new ligands are nicotinic acid known as vitamin B3 and the amide derivative of nicotinic acid known as nicotinamide.

Un primo oggetto della presente invenzione è un metodo di screening di regolatori del recettore GPR30 comprendente i seguenti passaggi: A first object of the present invention is a GPR30 receptor regulator screening method comprising the following steps:

i)mettere a contatto con il recettore GPR30 un composto da testare e acido nicotinico e/o nicotinammide; i) contacting the GPR30 receptor with a compound to be tested and nicotinic acid and / or nicotinamide;

ii)determinare l’attività di detto recettore GPR30. ii) determine the activity of said GPR30 receptor.

Un secondo oggetto della presente invenzione è l’acido nicotinico e/o nicotinammide per l’uso nel trattamento di una condizione patologica migliorata dall’attivazione del recettore GPR30. A second object of the present invention is nicotinic acid and / or nicotinamide for use in the treatment of a pathological condition improved by the activation of the GPR30 receptor.

Un terzo oggetto della presente invenzione è una composizione per l’uso nel trattamento di una condizione patologica migliorata dall’attivazione del recettore GPR30 comprendente acido nicotinico e/o nicotinammide e uno o più veicolanti e/o eccipienti e/o diluenti. A third object of the present invention is a composition for use in the treatment of a pathological condition improved by the activation of the GPR30 receptor comprising nicotinic acid and / or nicotinamide and one or more carriers and / or excipients and / or diluents.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE DESCRIPTION OF THE FIGURES

FIGURA 1. Utilizzando 40nM di [5,6-3H] acido nicotinico nelle cellule di tumore mammario SkBr3 (numero ATCC HTB 30) che esprimono GPER ma non esprimono i classici recettori estrogenici (ERα e ERβ) e le due isoforme del recettore dell’acido nicotinico (GPR109A e GPR109B), abbiamo dimostrato la capacità dell’acido nicotinico (NA) e della nicotinammide (NM) di legare GPER (figura 1). Infatti, l’ acido nicotinico, la nicotinammide ed il ligando selettivo di GPER, denominato G-1, sono stati in grado di competere con l’acido nicotinico marcato in maniera dose-dipendente (figura 1A). Silenziando l’espressione di GPER nelle cellule SkBr3 attraverso la trasfezione di uno specifico short hairpin (shGPER), l’acido nicotinico, la nicotinammide e G-1 non sono stati in grado di competere con l’acido nicotinico marcato (figura 1B-C) indicando che GPER è necessario affinché avvenga la competizione recettoriale. Tale esperimento dimostra chiaramente che l’acido nicotinico e la nicotinammide sono ligandi di GPER. FIGURA 2. Al fine di valutare se il legame dell’ acido nicotinico (NA) e della nicotinammide (NM) a GPER induce l’espressione di alcuni importanti geni target di tale recettore, come c-fos e CTGF, sono stati realizzati saggi di immunoblotting nelle cellule SkBr3 trasfettate per 24h con un vettore di controllo (shRNA) o con uno short hairpin di GPER (shGPER) e successivamente trattate con 10µM di acido nicotinico e 10µM di nicotinammide per 4h. La figura 2 mostra come entrambi i composti inducono significativamente l’espressione proteica di c-fos e CTGF nelle cellule SkBr3 trasfettate con shRNA (●, p<0,05), viceversa nelle cellule SkBr3 trasfettate con shGPER l’induzione di c-fos e CTGF è abrogata come evidenziato nel pannello che riporta la valutazione densitometrica di tre esperimenti indipendenti (figura 2A-B). FIGURE 1. Using 40nM of [5.6-3H] nicotinic acid in SkBr3 breast cancer cells (ATCC number HTB 30) expressing GPER but not expressing the classical estrogen receptors (ERα and ERβ) and the two isoforms of the nicotinic acid (GPR109A and GPR109B), we demonstrated the ability of nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NM) to bind GPER (figure 1). In fact, nicotinic acid, nicotinamide and the selective ligand of GPER, called G-1, were able to compete with the labeled nicotinic acid in a dose-dependent manner (Figure 1A). By silencing GPER expression in SkBr3 cells through transfection of a specific short hairpin (shGPER), nicotinic acid, nicotinamide and G-1 were unable to compete with labeled nicotinic acid (Figure 1B-C ) indicating that GPER is necessary for receptor competition to take place. This experiment clearly demonstrates that nicotinic acid and nicotinamide are ligands of GPER. FIGURE 2. In order to evaluate whether the binding of nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NM) to GPER induces the expression of some important target genes of this receptor, such as c-fos and CTGF, tests of immunoblotting in SkBr3 cells transfected for 24h with a control vector (shRNA) or with a GPER short hairpin (shGPER) and subsequently treated with 10µM of nicotinic acid and 10µM of nicotinamide for 4h. Figure 2 shows how both compounds significantly induce protein expression of c-fos and CTGF in shRNA-transfected SkBr3 cells (●, p <0.05), vice versa in shG-transfected SkBr3 cells, for the induction of c-fos and CTGF is abrogated as highlighted in the panel reporting the densitometric evaluation of three independent experiments (Figure 2A-B).

FIGURA 3. In cellule endoteliali ombelicali venose umane (HUVECs) l’acido nicotinico (NA) è in grado di inibire l’espressione di “intercellular adhesion molecule-1” (ICAM-1) indotta da TNF-α. ICAM-1 è una proteina che mediando l’adesione dei leucociti all’endotelio vasale e il loro accumulo nella tunica intima dell’endotelio vasale, contribuisce a determinare l’iniziale processo di formazione della placca aterosclerotica. Le cellule endoteliali sottoposte all’azione di citochine proinfiammatorie come IL-1, IFN-γ e TNF-α sono caratterizzate da alti livelli di ICAM-1. Sulla base di tali osservazioni abbiamo valutato se GPER è coinvolto nell’azione inibitoria esercitata dall’ acido nicotinico sull’espressione di ICAM-1 indotta da TNF-α. A tale scopo, le HUVECs sono state trasfettate per 24h con un vettore di controllo (shRNA) o con uno short hairpin di GPER (shGPER) e successivamente trattate con 1mM di acido nicotinico per 30h e contemporaneamente con 50ng/ml di TNF-α nelle ultime 6h. Come mostrato in figura 3, l’effetto inibitorio esercitato dall’acido nicotinico sull’espressione di ICAM-1 indotta da TNF-α non è osservabile silenziando GPER (Figura 3A-B; ●, p<0,05), indicando che GPER media l’azione modulatrice dell’acido nicotinico sull’espressione di ICAM-1. La valutazione densitometrica mostra il risultato ottenuto in tre esperimenti indipendenti. FIGURE 3. In human venous umbilical endothelial cells (HUVECs), nicotinic acid (NA) is able to inhibit the expression of "intercellular adhesion molecule-1" (ICAM-1) induced by TNF-α. ICAM-1 is a protein which, by mediating the adhesion of leukocytes to the vascular endothelium and their accumulation in the intimate tunica of the vascular endothelium, helps to determine the initial formation process of atherosclerotic plaque. Endothelial cells subjected to the action of pro-inflammatory cytokines such as IL-1, IFN-γ and TNF-α are characterized by high levels of ICAM-1. Based on these observations, we assessed whether GPER is involved in the inhibitory action exerted by nicotinic acid on the expression of ICAM-1 induced by TNF-α. For this purpose, the HUVECs were transfected for 24h with a control vector (shRNA) or with a short hairpin of GPER (shGPER) and subsequently treated with 1mM of nicotinic acid for 30h and simultaneously with 50ng / ml of TNF-α in the last 6h. As shown in Figure 3, the inhibitory effect exerted by nicotinic acid on the expression of ICAM-1 induced by TNF-α is not observable by silencing GPER (Figure 3A-B; ●, p <0.05), indicating that GPER mediates the modulating action of nicotinic acid on the expression of ICAM-1. The densitometric evaluation shows the result obtained in three independent experiments.

FIGURA 4. E’ stato inoltre valutato, attraverso saggi di angiogenesi in vitro su Matrigel il ruolo di GPER negli effetti angiogenetici indotti dall’ acido nicotinico (NA). A tale scopo le HUVECs sono state trasfettate per 24h con un vettore di controllo (shRNA) o con uno short hairpin di GPER (shGPER) e successivamente trattate con acido nicotinico per 12h. La figura 4 mostra come la formazione di tubuli indotta dall’acido nicotinico è abrogata silenziando l’espressione di GPER, indicando che GPER media gli effetti angiogenetici indotti dall’acido nicotinico in tale modello sperimentale. (Per i dettagli inerenti la metodologia del saggio di “angiogenesi in vitro su Matrigel” vedi Viñals et al., 2001). FIGURE 4. The role of GPER in the angiogenetic effects induced by nicotinic acid (NA) was also evaluated through in vitro angiogenesis assays on Matrigel. For this purpose, the HUVECs were transfected for 24h with a control vector (shRNA) or with a GPER short hairpin (shGPER) and subsequently treated with nicotinic acid for 12h. Figure 4 shows how the formation of tubules induced by nicotinic acid is abrogated by silencing the expression of GPER, indicating that GPER mediates the angiogenic effects induced by nicotinic acid in this experimental model. (For details concerning the methodology of the “in vitro angiogenesis on Matrigel” assay see Viñals et al., 2001).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

E’ oggetto della presente invenzione un metodo di screening di regolatori del recettore GPR30 comprendente i seguenti passaggi: The subject of the present invention is a screening method for regulators of the GPR30 receptor comprising the following steps:

i) mettere a contatto con il recettore GPR30 un composto da testare e acido nicotinico e/o nicotinammide; i) contacting the GPR30 receptor with a compound to be tested and nicotinic acid and / or nicotinamide;

ii) determinare l’attività di detto recettore GPR30. ii) determine the activity of said GPR30 receptor.

Con il termine “regolatori” come qui utilizzato, si fa riferimento a composti che influenzano l'attività del recettore GPR30 in vitro e/o in vivo. I regolatori possono essere ad esempio agonisti e antagonisti del recettore GPR30 e possono essere ad esempio composti che esercitano il loro effetto sull'attività di GPR30 mediante l'espressione, o attraverso modificazioni post-trasduzionali o con altri mezzi. Agonisti di GPR30 sono molecole che, quando legate a GPR30, aumentano o prolungano l'attività di GPR30. Agonisti di GPR30 includono ad esempio proteine, acidi nucleici, carboidrati, piccole molecole, o qualsiasi altra molecola che attivi GPR30. Antagonisti di GPR30 sono molecole che, quando legate a GPR30, diminuiscono la quantità o la durata dell'attività di GPR30. By the term "regulators" as used herein, we refer to compounds that affect GPR30 receptor activity in vitro and / or in vivo. The regulators can be, for example, agonists and antagonists of the GPR30 receptor and can be, for example, compounds which exert their effect on the activity of GPR30 by expression, or by post-transductional modifications or by other means. GPR30 agonists are molecules which, when bound to GPR30, increase or prolong the activity of GPR30. GPR30 agonists include for example proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, or any other molecule that activates GPR30. GPR30 antagonists are molecules which, when bound to GPR30, decrease the amount or duration of GPR30 activity.

Con il termine “metodo di screening” come qui utilizzato s’intende un metodo per l’identificazione o selezione di un composto. The term "screening method" as used herein means a method for the identification or selection of a compound.

Il composto da testare sarà ad esempio un peptide, molecole organiche, molecole organiche di sintesi o di origine naturale, loro miscele o altre molecole. Composti da testare idonei per l'uso nei metodi di screening dell'invenzione possono essere ottenuti da qualsiasi sorgente adatta, per esempio, da librerie di composti noti. The compound to be tested will be, for example, a peptide, organic molecules, synthetic or natural organic molecules, their mixtures or other molecules. Test compounds suitable for use in the screening methods of the invention can be obtained from any suitable source, for example, from libraries of known compounds.

Nel metodo di screening secondo la presente invenzione il composto da testare è messo in contatto con il recettore GPR30 in presenza di acido nicotinico e/o nicotinammide. In the screening method according to the present invention, the compound to be tested is brought into contact with the GPR30 receptor in the presence of nicotinic acid and / or nicotinamide.

Con il termine “mettere in contatto” come qui utilizzato si deve intendere anche qualsiasi saggio di competizione recettoriale idoneo ad essere usato con il recettore GPR30. The term "contacting" as used here must also mean any receptor competition assay suitable for use with the GPR30 receptor.

Il recettore GPR30 usato nel metodo della presente invenzione potrà essere il polipeptide completo di GPR30 o isoforme o forme troncate di GPR30 che hanno la stessa funzione cellulare e legano selettivamente acido nicotinico e/o nicotinammide, ad esempio potranno essere usati varianti di GPR30 come frammenti biologicamente attivi o una proteina di fusione che comprende la sequenza polipeptidica di GPR30. Secondo una forma di realizzazione potrà essere usata la sequenza polipeptidica SEQ ID NO:1 o la sequenza polipeptidica accessibile nelle banche dati genbank con il codice AF015257.1 o la sequenza polipeptidica accessibile nella banca dati con il codice Uniprot Q99527 (ultima modifica alla sequenza riportata 5/1/1997). Inoltre GPR30 può essere derivata da qualsiasi specie di mammifero idonea preferibilmente sarà usato GPR30 umano, di ratto o di topo. The GPR30 receptor used in the method of the present invention may be the complete polypeptide of GPR30 or isoforms or truncated forms of GPR30 which have the same cellular function and selectively bind nicotinic acid and / or nicotinamide, for example variants of GPR30 may be used as biologically fragments. active or a fusion protein comprising the polypeptide sequence of GPR30. According to one embodiment, the polypeptide sequence SEQ ID NO: 1 or the polypeptide sequence accessible in the genbank databases with the code AF015257.1 or the polypeptide sequence accessible in the database with the Uniprot code Q99527 (last modification to the reported sequence 5/1/1997). Furthermore GPR30 can be derived from any suitable mammalian species, preferably human, rat or mouse GPR30 will be used.

Composti da testare che si legano a GPR30 con un effetto stimolatorio o inibitorio sull'attività di GPR30 sono identificati sia in metodi che impiegano cellule che esprimono GPR30 sulla superficie cellulare (saggi cellulari) o in saggi con GPR30 isolato (saggi acellulari). Nei saggi cellulari potranno essere usate tutte le linee cellulari che esprimono GPR30, ad esempio linee cellulari ingegnerizzate che esprimono questo recettore. Compounds to be tested that bind to GPR30 with a stimulatory or inhibitory effect on GPR30 activity are identified either in methods employing cells expressing GPR30 on the cell surface (cellular assays) or in assays with isolated GPR30 (acellular assays). All cell lines expressing GPR30 can be used in cell assays, for example engineered cell lines expressing this receptor.

Il metodo può essere ad esempio un saggio di legame che comprende la misura diretta o indiretta del legame di un composto da testare come ligando di GPR30 in presenza di acido nicotinico e/o nicotinammide e in assenza di acido nicotinico e/o nicotinammide o un saggio di attività che comprende la misura diretta o indiretta dell'attività di GPR30. The method can be for example a binding assay that includes the direct or indirect measurement of the binding of a compound to be tested as a ligand of GPR30 in the presence of nicotinic acid and / or nicotinamide and in the absence of nicotinic acid and / or nicotinamide or an assay of activity which includes the direct or indirect measurement of GPR30 activity.

Il metodo potrà prevedere vari saggi di screening in vitro combinati con un test in vivo comprendente un passaggio di misurare l'effetto del composto da testare sui sintomi di malattie cardiovascolari, infezioni, malattie dermatologiche, malattie endocrine, malattie metaboliche, cancro, malattie gastrointestinali, infiammazione, malattie ematologiche, malattie respiratorie, malattie muscolo scheletriche, malattie neurologiche e malattie urologiche. The method may include various in vitro screening assays combined with an in vivo test comprising a step to measure the effect of the compound to be tested on the symptoms of cardiovascular diseases, infections, dermatological diseases, endocrine diseases, metabolic diseases, cancer, gastrointestinal diseases, inflammation, haematological diseases, respiratory diseases, musculoskeletal diseases, neurological diseases and urological diseases.

La determinazione della capacità del composto di prova di legarsi a GPR30 può essere realizzata, ad esempio, accoppiando il composto da testare con un marcatore rilevabile come ad esempio un radioisotopo o un enzima, alternativamente potrà essere accoppiato, direttamente o indirettamente, con un marcatore rilevabile anche l’acido nicotinico e/o la nicotinammide. Ad esempio, potranno essere usati come marcatori rilevabili isotopi radioattivi quali I<125>, S<35>, C<14>, H<3>. In alternativa, potranno essere usate marcature enzimatiche come perossidasi di rafano, fosfatasi alcalina, o luciferasi. The determination of the ability of the test compound to bind to GPR30 can be carried out, for example, by coupling the compound to be tested with a detectable marker such as a radioisotope or an enzyme, alternatively it can be coupled, directly or indirectly, with a detectable marker. also nicotinic acid and / or nicotinamide. For example, radioactive isotopes such as I <125>, S <35>, C <14>, H <3> can be used as detectable markers. Alternatively, enzymatic labels such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, or luciferase may be used.

Secondo una forma di realizzazione del metodo il composto da testare e l’acido nicotinico e/o nicotinammide sono utilizzati contemporaneamente nel passaggio i), ad esempio a diverse concentrazioni del composto da testare o dell’acido nicotinico e/o nicotinammide, ad esempio secondo un qualsiasi saggio di competizione recettoriale noto idoneo ad essere usato con il recettore GPR30. According to an embodiment of the method the compound to be tested and the nicotinic acid and / or nicotinamide are used simultaneously in step i), for example at different concentrations of the compound to be tested or of the nicotinic acid and / or nicotinamide, for example according to any known receptor competition assay suitable for use with the GPR30 receptor.

Secondo un’altra forma di realizzazione il composto da testare o l’acido nicotinico e/o nicotinammide saranno messi a contatto con il recettore separatamente o insieme. Nel passaggio successivo ii) l’attività del recettore GPR30 potrà essere determinata con qualsiasi metodo adatto per misurare l'attività di GPR30 noto nello stato della tecnica. According to another embodiment, the compound to be tested or the nicotinic acid and / or nicotinamide will be put into contact with the receptor separately or together. In the next step ii) the activity of the GPR30 receptor can be determined with any suitable method for measuring the activity of GPR30 known in the state of the art.

Il metodo secondo la presente invenzione potrà comprendere anche saggi acellulari, ad esempio saggi in cui GPR30 è in una forma legata alla membrana o è fatta adsorbire come frammento solubile su un supporto solido come ad esempio una micropiastra. The method according to the present invention may also comprise acellular assays, for example assays in which GPR30 is in a form bonded to the membrane or is adsorbed as a soluble fragment on a solid support such as a microplate.

Secondo una forma di realizzazione preferita il metodo potrà essere eseguito secondo la procedura descritta per il saggio di legame riportato nella sezione sperimentale come esempio 1.2. According to a preferred embodiment, the method can be carried out according to the procedure described for the binding assay reported in the experimental section as example 1.2.

E’ oggetto della presente invenzione anche l’acido nicotinico e/o nicotinammide per l’uso nel trattamento di una condizione patologica migliorata dall’attivazione del recettore GPR30. The subject of this invention is also nicotinic acid and / or nicotinamide for use in the treatment of a pathological condition improved by the activation of the GPR30 receptor.

Come qui usato, il termine "trattamento" è utilizzato per indicare sia la prevenzione della malattia, che il trattamento di condizioni pre-esistenti. La prevenzione della malattia è ottenuta con la somministrazione di acido nicotinico e/o nicotinammide prima dello sviluppo della malattia conclamata. Il trattamento della malattia in corso, è ad esempio al fine di stabilizzare o migliorare i sintomi clinici del paziente. Tale trattamento potrà essere preferibilmente eseguito prima della completa perdita di funzione nei tessuti interessati. As used herein, the term "treatment" is used to mean both the prevention of disease and the treatment of pre-existing conditions. Disease prevention is achieved by administering nicotinic acid and / or nicotinamide prior to the development of the overt disease. Treatment of the current disease is for example in order to stabilize or improve the patient's clinical symptoms. This treatment can preferably be performed before the complete loss of function in the affected tissues.

Condizioni patologiche migliorate dall’attivazione del recettore GPR30 sono ad esempio i disturbi neurologici. Nello stato della tecnica è noto infatti l’effetto di neuroprotezione acuto mediato da GPR30 e l’effetto di neuroprotezione mediato da attivatori di GPR30. E’ quindi oggetto della presente invenzione l’acido nicotinico e/o nicotinammide per l’uso nel trattamento di disturbi neurologici come ad esempio morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, corea di Huntington, neuropatia periferica diabetica, sclerosi multipla, amiotrofica sclerosi laterale e malattie neurodegenerative acute come ad esempio ictus, trauma cranico, danni ai nervi periferici, ipoglicemia, lesioni del midollo spinale, epilessia, anossia e ipossia. Pathological conditions improved by the activation of the GPR30 receptor are for example neurological disorders. In fact, the state of the art is known for the acute neuroprotection effect mediated by GPR30 and the neuroprotection effect mediated by activators of GPR30. The object of the present invention is therefore nicotinic acid and / or nicotinamide for use in the treatment of neurological disorders such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, diabetic peripheral neuropathy, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and acute neurodegenerative diseases such as stroke, head trauma, peripheral nerve damage, hypoglycemia, spinal cord injury, epilepsy, anoxia and hypoxia.

Oltre all’attività ipolipidemizzante, l’acido nicotinico diminuisce il rischio di eventi aterotrombotici riducendo i livelli di fattori protrombotici come fibrinogeno e l’espressione di molecole di adesione cellulare (CAM) che mediano l'adesione, il reclutamento e la migrazione di monociti e leucociti attraverso le superfici vascolari, processi essenziali per la formazione della placca aterosclerotica (Tavintharan S et al. Basic Clin Pharmacol Toxicol.2009; 104:206-10). In particolare, l’espressione proteica di ICAM-1 (fattore altamente predittivo di eventi coronarici anche infausti) viene indotta dalla citochina pro-infiammatoria TNF-α, ma tale incremento può essere prevenuto dal trattamento con acido nicotinico attraverso GPR30, come dimostrato nei saggi sperimentali condotti in cellule endoteliali ombelicali venose umane (HUVECs) nelle quali è stata silenziata l’espressione di GPR30 (Figura 3). L’acido nicotinico, dunque, per le positive azioni biologiche indotte attraverso GPR30 può essere nel trattamento di diverse malattie a carattere flogistico-degenerativo a carico del sistema cardiovascolare oltre che in varie malattie a carico del sistema osseo, nervoso, immunitario, endocrino, che possono beneficiare dell’attivazione di GPR30 da parte degli estrogeni ma che gli effetti collaterali di tali ormoni ne limitano fortemente l’utilizzo. Di particolare interesse risulta quindi una terapia basata su acido nicotinico o nicotinammide come sostituto di estrogeni, in quanto attivatori selettivi di GPR30 che non attivano altri recettori degli estrogeni, e quindi non hanno gli effetti estrogenici negativi classici. In addition to lipid-lowering activity, nicotinic acid decreases the risk of atherothrombotic events by reducing the levels of prothrombotic factors such as fibrinogen and the expression of cell adhesion molecules (CAM) that mediate the adhesion, recruitment and migration of monocytes and leukocytes through the vascular surfaces, processes essential for the formation of atherosclerotic plaque (Tavintharan S et al. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009; 104: 206-10). In particular, the protein expression of ICAM-1 (a highly predictor of coronary events, including fatal ones) is induced by the pro-inflammatory cytokine TNF-α, but this increase can be prevented by treatment with nicotinic acid through GPR30, as demonstrated in the assays. experiments conducted in human venous umbilical endothelial cells (HUVECs) in which the expression of GPR30 was silenced (Figure 3). Nicotinic acid, therefore, for the positive biological actions induced through GPR30 can be in the treatment of various inflammatory-degenerative diseases affecting the cardiovascular system as well as in various diseases affecting the bone, nervous, immune, endocrine system, which can benefit from the activation of GPR30 by estrogen but that the side effects of these hormones severely limit its use. Of particular interest is therefore a therapy based on nicotinic acid or nicotinamide as an estrogen substitute, as they are selective activators of GPR30 which do not activate other estrogen receptors, and therefore do not have the classic negative estrogenic effects.

Quando l’acido nicotinico o nicotinammide è usato secondo la presente invenzione nel trattamento delle patologie sopra descritte, la dose potrà essere ad esempio in un intervallo da 1 mg a 1 g, preferibilmente da 10 a 1000 mg. Nel metodo di trattamento il dosaggio esatto e la frequenza di somministrazione delle composizioni dipenderà dalla particolare severità della condizione da trattare, dall’età, dal peso e dalle condizioni fisiche generali del particolare paziente come è ben noto agli esperti del settore. Tipici regimi di dosaggio da usare nel metodo di trattamento potranno essere da 1 a 3 unità di dosaggio al giorno ad esempio dopo i pasti nelle quantità sopra definite, ad esempio somministrando 1 unità di dosaggio ogni 8 ore. When nicotinic acid or nicotinamide is used according to the present invention in the treatment of the diseases described above, the dose may be for example in a range from 1 mg to 1 g, preferably from 10 to 1000 mg. In the method of treatment, the exact dosage and frequency of administration of the compositions will depend on the particular severity of the condition to be treated, on the age, weight and general physical condition of the particular patient as is well known to those skilled in the art. Typical dosage regimens to be used in the treatment method may be from 1 to 3 dosage units per day, for example after meals in the amounts defined above, for example by administering 1 dosage unit every 8 hours.

Sono oggetto della presente invenzione anche composizioni comprendenti acido nicotinico e/o nicotinammide per l’uso nel trattamento di tutte le condizioni patologiche sopra descritte. The present invention also includes compositions comprising nicotinic acid and / or nicotinamide for use in the treatment of all the pathological conditions described above.

Composizioni secondo la presente invenzione possono essere preparate mediante la selezione di un’idonea forma di preparazione a seconda della via di somministrazione. Esempi di forme di preparazione delle composizioni per l’uso secondo la presente invenzione, possono essere ad esempio compresse, polveri, granuli, capsule, soluzioni, sciroppi, elisir, olio o sospensioni acquose o simili preparazioni per uso orale. Nel caso di somministrazioni per via iniettabile può essere preferibilmente aggiunto nella preparazione uno stabilizzante, un conservante e un solubilizzante. Come esempio di forme di preparazione per applicazioni esterne, possono essere menzionate soluzioni, sospensioni, emulsioni, unguenti, gel, creme, lozioni, spray, o simili. Compositions according to the present invention can be prepared by selecting a suitable form of preparation depending on the route of administration. Examples of forms of preparation of the compositions for use according to the present invention, can be for example tablets, powders, granules, capsules, solutions, syrups, elixirs, oil or aqueous suspensions or similar preparations for oral use. In the case of injectable administration, a stabilizer, a preservative and a solubilizer can preferably be added to the preparation. As an example of preparation forms for external applications, solutions, suspensions, emulsions, ointments, gels, creams, lotions, sprays, or the like may be mentioned.

Una preparazione solida potrà contenere oltre ad acido nicotinico e nicotinammide altri veicolanti farmaceuticamente accettabili. Per esempio, riempitivi, diluenti, leganti, disintegranti, solubilizzatori, umidificanti, ecc possono essere opportunamente selezionati e miscelati, dando una preparazione. In addition to nicotinic acid and nicotinamide, a solid preparation may contain other pharmaceutically acceptable carriers. For example, fillers, diluents, binders, disintegrants, solubilizers, humectants, etc. can be suitably selected and mixed, giving a preparation.

Come esempio composizioni liquide, possono essere menzionate soluzioni, sospensioni, emulsioni e simili. Questi possono contenere un agente di sospensione, emulsionante e/o simili. As an example liquid compositions, solutions, suspensions, emulsions and the like can be mentioned. These may contain a suspending agent, emulsifier and / or the like.

Per la preparazione delle composizioni farmaceutiche la miscela dei composti sarà formulata in idonee unità di dosaggio con uno o più eccipienti e veicolanti farmaceuticamente accettabili. Composizioni farmaceutiche in forma di compresse e capsule per somministrazione orale possono essere in forma a dosaggio unitario, e possono contenere eccipienti convenzionali inclusi, per esempio, agenti leganti, per esempio, gomma arabica, gelatina, sorbitolo, gomma adragante, o polivinilpirrolidone; riempitivi, per esempio lattosio, zucchero, amido di mais, fosfato di calcio, sorbitolo o glicina; lubrificanti di pastigliatura, per esempio stearato di magnesio, talco, polietilenglicole o silice; disintegranti, per esempio amido di patata; e agenti bagnanti accettabili farmaceuticamente, per esempio sodio laurilsolfato. Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti nella normale pratica farmaceutica. For the preparation of the pharmaceutical compositions the mixture of the compounds will be formulated in suitable dosage units with one or more pharmaceutically acceptable excipients and carriers. Pharmaceutical compositions in tablet and capsule form for oral administration may be in unit dosage form, and may contain conventional excipients including, for example, binding agents, for example, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, or polyvinylpyrrolidone; fillers, for example lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine; tableting lubricants, for example magnesium stearate, talc, polyethylene glycol or silica; disintegrants, for example potato starch; and pharmaceutically acceptable wetting agents, for example sodium lauryl sulfate. The tablets can be coated according to methods well known in normal pharmaceutical practice.

Composizioni adatte per l'iniezione parenterale possono comprendere soluzioni fisiologiche acquose o non acquose sterili, dispersioni, sospensioni o emulsioni, o possono comprendere polveri sterili per la ricostituzione in soluzioni o dispersioni iniettabili sterili. Esempi di veicolanti idonei comprendono acqua, etanolo, polioli (glicole propilenico , glicole polietilenico , glicerolo , e simili ). La fluidità ottimale potrà essere mantenuta, per esempio, mediante l'uso di un rivestimento come lecitina. Compositions suitable for parenteral injection may comprise sterile aqueous or non-aqueous physiological solutions, dispersions, suspensions or emulsions, or may comprise sterile powders for reconstitution into sterile injectable solutions or dispersions. Examples of suitable carriers include water, ethanol, polyols (propylene glycol, polyethylene glycol, glycerol, and the like). Optimal fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin.

Queste composizioni possono anche contenere adiuvanti per la conservazione o prevenzione della contaminazione da microrganismi delle composizioni ad esempio parabeni, clorobutanolo, fenolo, acido sorbico e simili. These compositions can also contain adjuvants for the preservation or prevention of contamination by microorganisms of the compositions for example parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid and the like.

La presente invenzione è stata fin qui descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione. È da intendersi che possono esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, tutte rientranti nell’ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate. The present invention has been described up to now with reference to some of its embodiments. It is to be understood that there may be other embodiments that refer to the same inventive core, all falling within the scope of the claims set out below.

ESEMPI EXAMPLES

1. Materiali e metodi usati nella sperimentazione 1. Materials and methods used in the experiment

1.1 Colture Cellulari 1.1 Cell cultures

Le cellule di tumore mammario (SkBr3) sono state mantenute, in piastre Petri per colture cellulari, aventi diametro di 10 cm, contenenti mezzi di coltura specifici, alla temperatura di 37°C, al 5% di anidride carbonica (C O2) e in ambiente umidificato. Le cellule SkBr3 sono state mantenute in mezzo RPMI senza rosso fenolo addizionato con FBS al 10% e Penicillina-Streptomicina all’1%. Le cellule endoteliali ombelicali venose umane (HUVECs) sono state mantenute in mezzo EGM (Endothelial Growth Medium) addizionato con FBS al 5 % e Penicillina-Streptomicina all’1%. Breast cancer cells (SkBr3) were maintained, in cell culture petri dishes, having a diameter of 10 cm, containing specific culture media, at a temperature of 37 ° C, 5% carbon dioxide (C O2) and in humidified environment. SkBr3 cells were maintained in RPMI medium without phenol red added with 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin. Human venous umbilical endothelial cells (HUVECs) were maintained in EGM (Endothelial Growth Medium) supplemented with 5% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin.

Tutte le operazioni di manipolazione delle colture cellulari sono state eseguite sotto cappa a flusso laminare per garantire adeguate condizioni di sterilità. Il mezzo di coltura è stato sostituito ogni 48 ore, previo lavaggio con i corrispettivi mezzi, per eliminare i cataboliti accumulati in tale periodo ed impedire che essi e le variazioni di pH del mezzo, andassero ad influenzare la crescita cellulare. All cell culture manipulation operations were performed under a laminar flow hood to ensure adequate sterility conditions. The culture medium was replaced every 48 hours, after washing with the corresponding means, to eliminate the catabolites accumulated in this period and to prevent them and the pH variations of the medium from affecting cell growth.

1.2 Ligand binding assays (Saggi di legame dei ligandi) 1.2 Ligand binding assays

Il ligand binding assay è un saggio che fa parte delle tecniche di radioanalisi e sfrutta il principio del legame proteico competitivo. Per determinare se un composto funge da agonista di un recettore, si può valutare la capacità del composto in esame di spiazzare il ligando naturale da quella determinata proteina recettoriale. Il saggio di binding per GPER, è stato eseguito utilizzando cellule di tumore mammario SkBr3, mantenute in coltura in piastre Petri (10 cm di diametro). Le cellule sono state lavate due volte e trattate con 40nM di [5,6-3H] acido nicotinico (50-60 Ci/mmol), in presenza e assenza di acido nicotinico, nicotinammide e del ligando selettivo di GPER, denominato G-1 non marcati. The ligand binding assay is an assay that is part of radioanalysis techniques and exploits the principle of competitive protein binding. To determine whether a compound acts as a receptor agonist, the ability of the test compound to displace the natural ligand from that particular receptor protein can be assessed. The binding assay for GPER was performed using SkBr3 breast tumor cells, cultured in Petri dishes (10 cm in diameter). The cells were washed twice and treated with 40nM of [5,6-3H] nicotinic acid (50-60 Ci / mmol), in the presence and absence of nicotinic acid, nicotinamide and the selective ligand of GPER, called G-1 not marked.

Nella fase successiva, le cellule sono state incubate, per due ore, a 37°C. Dopo tre lavaggi con PBS fredda, le cellule sono state lisate utilizzando etanolo al 100% e successivamente è stata misurata la radioattività del lisato usando un contatore a scintillatore liquida. Ciascun campione è stato miscelato con 4ml di liquido di scintillazione. La presenza di competizione per il legame a GPER viene valutata grazie alla capacità del contatore di convertire le emissioni radioattive invisibile dei campioni in fotoni di luce visibile, facilmente rilevabili da un fotomoltiplicatore. Una riduzione della radioattività emessa dal campione in esame rispetto al campione contenente il solo l’ acido nicotinico marcato, e quindi una riduzione della luce emessa, indica che la molecola competitrice ha proprietà di spiazzamento. In the next step, the cells were incubated for two hours at 37 ° C. After three washes with cold PBS, the cells were lysed using 100% ethanol and subsequently the radioactivity of the lysate was measured using a liquid scintillator counter. Each sample was mixed with 4ml of scintillation liquid. The presence of competition for binding to GPER is evaluated thanks to the ability of the counter to convert the invisible radioactive emissions of the samples into visible light photons, easily detectable by a photomultiplier. A reduction in the radioactivity emitted by the sample in question compared to the sample containing only the marked nicotinic acid, and therefore a reduction in the light emitted, indicates that the competing molecule has displacement properties.

1.3 Western blotting 1.3 Western blotting

Le cellule SkBr3 e HUVECs sono state coltivate nel regolare mezzo di crescita in piastre Petri da 10 cm fino ad una confluenza di circa 70-80%. A questo punto le cellule sono lavate due volte con PBS fredda e successivamente poste per 24h in mezzo di coltura senza siero. Dopo 24h di deprivazione, le cellule sono state sottoposte agli opportuni trattamenti e successivamente lisate mediante l’aggiunta di 500µl di buffer di lisi costituito da Hepes 50mM, a pH 7.5, glicerolo 1% (che impedisce la dissociazione delle proteine durante la diluizione), triton-X-100 all’ 1% (che evita l’adsorbimento delle proteine sulla superficie del contenitore), una miscela di inibitori delle proteasi Aprotinina1 0.6%, PMSF 1mM e Na-orto-vanadato2 0.2mM3; che consentono un recupero massimale del contenuto proteico poiché inibiscono l’attività delle proteasi endogene. Il buffer di lisi viene lasciato agire per 7minuti circa, per consentire la completa rottura delle membrane cellulari, al termine dei quali viene raccolto l’intero contenuto proteico delle cellule all’interno di eppendorf sterili. Il lisato raccolto è stato sottoposto poi a bollitura per 10 min al fine di recuperare dal surnatante la frazione proteica, separandola dalle membrane cellulari che rimangono sottoforma di pellet sul fondo dell’eppendorf. La concentrazione delle proteine totali è stata determinata mediante valutazione colorimetrica con il metodo Bradford, utilizzando come standard una curva ottenuta dall’assorbanza dell’albumina di siero bovino (BSA) a diverse concentrazioni a partire da una soluzione 1mg/ml. A 50µl di lisato proteico, diluito 1:10, è stato aggiunto 1ml di reattivo Bradford e la soluzione cosi ottenuta è stata letta allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 595nm. La quantità di colorante legato dipende dal contenuto di amminoacidi basici nelle proteine in soluzione. Aliquote di lisato cellulare aventi la stessa quantità di proteine totali sono state sottoposte a separazione elettroforetica mediante tecnica riducente SDS PAGE su gel di poliacrilammide al 10%. Le proteine addizionate ad una soluzione riducente contenente buffer di Laemmli2, sono state bollite per 5 minuti e successivamente caricate sul gel immerso in un buffer di corsa 10X opportunamente diluita contenente TRIS 25mm, Glicina 192mM ph 8.3 e SDS 0.1%. Sul gel è stato caricato anche un marker costituito da una miscela di proteine a peso molecolare noto, che ha consentito l’identificazione della proteina in esame. La corsa elettroforetica è stata condotta applicando una differenza di potenziale tra 80 e 100V per circa 2h a temperatura ambiente. Dopo la corsa elettroforetica, le proteine sono state trasferite dal gel su una membrana di nitrocellulosa mediante elettrotrasferimento con camera transblot in buffer di trasferimento a basso contenuto salino (TRIS 25mM, Glicina 192 mM pH 8.3, SDS 0.1%, Metanolo 20%). Il gel e la membrana di nitrocellulosa, lasciata per 10 minuti in acqua distillata e poi in buffer di trasferimento, sono stati disposti in maniera tale che, da questo sistema, la membrana di nitrocellulosa si verrà a trovare tra l’anodo e il gel. Il trasferimento delle proteine è stato favorito dall’applicazione di una differenza di potenziale di circa 65V per 1 ora e mezza a 4°C. L’effettivo trasferimento delle proteine dal gel sulla membrana è stato verificato immergendo la membrana in una soluzione di Red Poinceau per circa 2-3 minuti. Successivamente la membrana è stata posta in una soluzione di milk no-fat al 5% in TBST 1X (Tris HCL 100mM pH 7.5, NaCl 1M, Tween 20 all’1%) per 1h a temperatura ambiente in modo da bloccare tutti i siti non specifici di interazione idrofobica. Dopo un breve lavaggio con buffer TBST 1X la membrana di nitro cellulosa è stata incubata over-night con l’anticorpo primario specifico per la proteina in esame, opportunamente diluito. Al termine del periodo d’incubazione la soluzione contenente l’anticorpo primario è stata rimossa e la membrana sottoposta, a tre lavaggi di 10 minuti ciascuno con buffer TBST 1X. Successivamente la membrana è stata incubata per 1h a temperatura ambiente con l’anticorpo secondario in TBST 1X e milk al 5%. L’anticorpo secondario è in grado di riconoscere la porzione costante della IgG utilizzata come anticorpo primario ed inoltre si coniuga con l’enzima perossidasi di rafano. In seguito la membrana di nitrocellulosa è stata nuovamente lavata con la soluzione buffer e sottoposta a tecnica di immunorivelazione mediante l’utilizzo del Kit ECL System in chemiluminescenza. L’enzima perossidasi, coniugato all’anticorpo secondario, è in grado di catalizzare in condizioni basiche l’ossidazione di un substrato chemiluminescente, il luminolo (5 amino, 2-3 diidroftalazina, 1-4 dione). Questo emette una certa quantità di luce che può essere visualizzata esponendo la membrana trattata ad una lastra fotografica (Hyperfilm ECL). SkBr3 and HUVECs cells were cultured in regular growth medium in 10 cm Petri dishes up to approximately 70-80% confluence. At this point the cells are washed twice with cold PBS and then placed for 24h in serum-free culture medium. After 24h of deprivation, the cells were subjected to the appropriate treatments and subsequently lysed by adding 500µl of lysis buffer consisting of Hepes 50mM, at pH 7.5, 1% glycerol (which prevents the dissociation of proteins during dilution), 1% triton-X-100 (which avoids the adsorption of proteins on the surface of the container), a mixture of protease inhibitors Aprotinin1 0.6%, PMSF 1mM and Na-ortho-vanadate2 0.2mM3; which allow maximum recovery of the protein content as they inhibit the activity of endogenous proteases. The lysis buffer is left to act for about 7 minutes, to allow the complete rupture of the cell membranes, at the end of which the entire protein content of the cells is collected inside sterile eppendorf. The collected lysate was then subjected to boiling for 10 min in order to recover the protein fraction from the supernatant, separating it from the cell membranes which remain in the form of pellets on the bottom of the eppendorf. The total protein concentration was determined by colorimetric evaluation with the Bradford method, using as a standard a curve obtained from the absorbance of bovine serum albumin (BSA) at different concentrations starting from a 1mg / ml solution. To 50µl of protein lysate, diluted 1:10, 1ml of Bradford reagent was added and the solution thus obtained was read on the spectrophotometer at a wavelength of 595nm. The amount of bound dye depends on the basic amino acid content in the proteins in solution. Aliquots of cell lysate having the same amount of total proteins were subjected to electrophoretic separation by SDS PAGE reducing technique on 10% polyacrylamide gel. The proteins added to a reducing solution containing Laemmli2 buffer were boiled for 5 minutes and then loaded onto the gel immersed in a suitably diluted 10X run buffer containing 25mm TRIS, 192mM ph 8.3 glycine and 0.1% SDS. A marker consisting of a mixture of proteins with a known molecular weight was also loaded onto the gel, which allowed the identification of the protein in question. The electrophoretic run was conducted by applying a potential difference between 80 and 100V for about 2h at room temperature. After the electrophoretic run, the proteins were transferred from the gel onto a nitrocellulose membrane by electrotransfer with a transblot chamber in a low saline transfer buffer (TRIS 25mM, Glycine 192 mM pH 8.3, SDS 0.1%, Methanol 20%). The gel and the nitrocellulose membrane, left for 10 minutes in distilled water and then in the transfer buffer, were arranged in such a way that, from this system, the nitrocellulose membrane will be found between the anode and the gel. The transfer of proteins was favored by the application of a potential difference of about 65V for 1 hour and a half at 4 ° C. The actual transfer of proteins from the gel to the membrane was verified by immersing the membrane in a Red Poinceau solution for about 2-3 minutes. Subsequently the membrane was placed in a 5% milk no-fat solution in TBST 1X (Tris HCL 100mM pH 7.5, NaCl 1M, Tween 20 at 1%) for 1h at room temperature in order to block all the non specifics of hydrophobic interaction. After a brief wash with 1X TBST buffer, the nitro cellulose membrane was incubated over-night with the primary antibody specific for the protein in question, suitably diluted. At the end of the incubation period, the solution containing the primary antibody was removed and the membrane subjected to three washes of 10 minutes each with 1X TBST buffer. Subsequently, the membrane was incubated for 1h at room temperature with the secondary antibody in 1X TBST and 5% milk. The secondary antibody is able to recognize the constant portion of the IgG used as primary antibody and also conjugates with the horseradish peroxidase enzyme. Subsequently, the nitrocellulose membrane was washed again with the buffer solution and subjected to an immunodetection technique using the ECL System Kit in chemiluminescence. The peroxidase enzyme, conjugated to the secondary antibody, is able to catalyze the oxidation of a chemiluminescent substrate, luminol (5 amino, 2-3 dihydrophthalazine, 1-4 dione) under basic conditions. This emits a certain amount of light which can be visualized by exposing the treated membrane to a photographic plate (Hyperfilm ECL).

1.4 Esperimenti di silenziamento genico 1.4 Gene silencing experiments

Le cellule sono state seminate in piastre Petri da 10 cm, mantenute in terreno privo di siero per 24 ore e poi trasfettate per 24 ore o 48 ore, prima dei trattamenti, con X-treameGENE9 (Roche Molecular Biochemicals, Milano, Italia), 0.5µl/piastra di un vettore di controllo quale lo shRNA vector, (Short Hairpin di controllo) e con lo shGPER (Short Hairpin per il silenziamento di GPER). Le cellule sono state successivamente lisate e i lisati analizzati tramite Western Blotting. Uno short hairpin RNA comunemente abbreviato come shRNA, è una sequenza di RNA che, curvandosi, forma una struttura che ricorda una forcina. In questo modo l’RNA che si trova a valle di questa struttura a forcina non può essere tradotto poiché tutto il complesso traduzionale non riesce a leggere le sequenze presenti e le proteine corrispondenti non si formano. Cells were seeded in 10 cm Petri dishes, kept in serum-free medium for 24 hours and then transfected for 24 hours or 48 hours, before treatments, with X-treameGENE9 (Roche Molecular Biochemicals, Milan, Italy), 0.5 µl / plate of a control vector such as shRNA vector, (Control Short Hairpin) and with shGPER (Short Hairpin for GPER silencing). The cells were subsequently lysed and the lysates analyzed by Western Blotting. A short hairpin RNA, commonly abbreviated as shRNA, is a sequence of RNA that, when curving, forms a structure that resembles a hairpin. In this way, the RNA found downstream of this hairpin structure cannot be translated because the whole translational complex cannot read the sequences present and the corresponding proteins are not formed.

1.5 Tube formation assay 1.5 Tube formation assay

Le HUVECs sono state transfettate con un vettore di controllo quale lo shRNA vector e con lo shGPER nel regolare mezzo di crescita e dopo 8h le cellule sono state deprivate e trattate con acido nicotinico 1mM per 18 h a 37 °C. Il giorno dopo il Matrigel® privo di fattori di crescita, precedentemente scongelato è stato piastrato sul fondo di piastre da 96 pozzetti, e lasciato agire a 37 °C per 1h per la gelificazione. Le HUVECs, deprivate e trattate, sono state raccolte mediante distacco enzimatico, contate e risospese in EBM. In seguito10,000 cellule per ciascun pozzetto sono state seminate sul Matrigel e incubate a 37 °C. La forma zione dei tubi è stata osservata a partire da 2h dalla semina. The HUVECs were transfected with a control vector such as shRNA vector and with shGPER in the regular growth medium and after 8h the cells were deprived and treated with 1mM nicotinic acid for 18h at 37 ° C. The next day, the previously thawed growth factor-free Matrigel® was plated on the bottom of 96-well plates, and left to act at 37 ° C for 1h for gelation. Deprived and treated HUVECs were harvested by enzymatic detachment, counted and resuspended in EBM. Then 10,000 cells per well were seeded on the Matrigel and incubated at 37 ° C. The formation of the tubes was observed starting from 2h after sowing.

1.6 Analisi Statistica 1.6 Statistical Analysis

L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA seguita dal test di Newman-Keuls’ per determinare le differenze delle medie. Valori di p<0.05 sono stati considerati statisticamente significativi. Statistical analysis was performed using ANOVA followed by the Newman-Keuls' test to determine the differences in the means. Values of p <0.05 were considered statistically significant.

2. Risultati 2. Results

Utilizzando 40nM di [5,6-3H] acido nicotinico nelle cellule di tumore mammario SkBr3 (numero ATCC HTB 30), che esprimono GPER, ma non esprimono i classici recettori estrogenici (ERα e ERβ) e le due isoforme del recettore dell’acido nicotinico (GPR109A e GPR109B), abbiamo dimostrato la capacità dell’ acido nicotinico (NA) e della nicotinammide (NM) di legare GPER (figura 1). Infatti, l’ acido nicotinico, la nicotinammide ed il ligando selettivo di GPER, denominato G-1, sono stati in grado di competere con l’acido nicotinico marcato in maniera dose-dipendente (figura 1A). Silenziando l’espressione di GPER nelle cellule SkBr3 attraverso la trasfezione di uno specifico short hairpin (shGPER), l’acido nicotinico, la nicotinammide e G-1 non sono stati in grado di competere con l’acido nicotinico marcato (figura 1B-C) indicando che GPER è necessario affinché avvenga la competizione recettoriale. Tale esperimento dimostra chiaramente che l’ acido nicotinico e la nicotinammide sono ligandi di GPER. (Per i dettagli inerenti la metodologia del saggio di competizione vedi Lappano et al., 2012). Al fine di valutare se il legame dell’acido nicotinico (NA) e della nicotinammide (NM) a GPER induce l’espressione di alcuni importanti geni target di tale recettore, come c-fos e CTGF, sono stati realizzati saggi di immunoblotting nelle cellule SkBr3 trasfettate per 24h con un vettore di controllo (shRNA) o con uno short hairpin di GPER (shGPER) e successivamente trattate con 10 µM di acido nicotinico e 10 µM di nicotinammide per 4h. La figura 2 mostra come entrambi i composti inducono significativamente l’espressione proteica di c-fos e CTGF nelle cellule SkBr3 trasfettate con shRNA (●, p<0,05), viceversa nelle cellule SkBr3 trasfettate con shGPER l’induzione di c-fos e CTGF è abrogata come evidenziato nel pannello che riporta la valutazione densitometrica di tre esperimenti indipendenti (figura 2A-B). Using 40nM of [5.6-3H] nicotinic acid in SkBr3 breast cancer cells (ATCC HTB number 30), which express GPER, but do not express the classic estrogen receptors (ERα and ERβ) and the two acid receptor isoforms nicotinic acid (GPR109A and GPR109B), we demonstrated the ability of nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NM) to bind GPER (figure 1). In fact, nicotinic acid, nicotinamide and the selective ligand of GPER, called G-1, were able to compete with the labeled nicotinic acid in a dose-dependent manner (Figure 1A). By silencing GPER expression in SkBr3 cells through transfection of a specific short hairpin (shGPER), nicotinic acid, nicotinamide and G-1 were unable to compete with labeled nicotinic acid (Figure 1B-C ) indicating that GPER is necessary for receptor competition to take place. This experiment clearly demonstrates that nicotinic acid and nicotinamide are ligands of GPER. (For details regarding the competition assay methodology see Lappano et al., 2012). In order to evaluate whether the binding of nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NM) to GPER induces the expression of some important target genes of this receptor, such as c-fos and CTGF, immunoblotting assays were performed in the cells SkBr3 transfected for 24h with a control vector (shRNA) or with a GPER short hairpin (shGPER) and subsequently treated with 10 µM of nicotinic acid and 10 µM of nicotinamide for 4h. Figure 2 shows how both compounds significantly induce protein expression of c-fos and CTGF in shRNA-transfected SkBr3 cells (●, p <0.05), vice versa in shG-transfected SkBr3 cells, for the induction of c-fos and CTGF is abrogated as highlighted in the panel reporting the densitometric evaluation of three independent experiments (Figure 2A-B).

In cellule endoteliali ombelicali venose umane (HUVECs) l’acido nicotinico (NA) è in grado di inibire l’espressione di “intercellular adhesion molecule-1” (ICAM-1) indotta da TNF-α. ICAM-1 è una proteina che mediando l’adesione dei leucociti all’endotelio vasale e il loro accumulo nella tunica intima dell’ endotelio vasale, contribuisce a determinare l’iniziale processo di formazione della placca aterosclerotica. Le cellule endoteliali sottoposte all’azione di citochine pro-infiammatorie come IL-1, IFN-γ e TNF-α sono caratterizzate da alti livelli di ICAM-1. Sulla base di tali osservazioni abbiamo valutato se GPER è coinvolto nell’azione inibitoria esercitata dall’acido nicotinico sull’espressione di ICAM-1 indotta da TNF-α. A tale scopo, le HUVECs sono state trasfettate per 24h con un vettore di controllo (shRNA) o con uno short hairpin di GPER (shGPER) e successivamente trattate con 1mM di acido nicotinico per 30h e contemporaneamente con 50 ng/ml di TNF-α nelle ultime 6 h. Come mostrato in figura 3, l’effetto inibitorio esercitato dall’acido nicotinico sull’espressione di ICAM-1 indotta da TNF-α non è osservabile silenziando GPER (Figura 3A-B; ●, p<0,05), indicando che GPER media l’azione modulatrice dell’acido nicotinico sull’espressione di ICAM-1. La valutazione densitometrica mostra il risultato ottenuto in tre esperimenti indipendenti. Abbiamo inoltre valutato, attraverso saggi di angiogenesi in vitro su Matrigel il ruolo di GPER negli effetti angiogenetici indotti dall’ acido nicotinico (NA). A tale scopo le HUVECs sono state trasfettate per 24h con un vettore di controllo (shRNA) o con uno short hairpin di GPER (shGPER) e successivamente trattate con acido nicotinico per 12h. La figura 4 mostra come la formazione di tubuli indotta dall’ acido nicotinico è abrogata silenziando l’espressione di GPER, indicando che GPER media gli effetti angiogenetici indotti dall’acido nicotinico in tale modello sperimentale. In human venous umbilical endothelial cells (HUVECs), nicotinic acid (NA) is able to inhibit the expression of "intercellular adhesion molecule-1" (ICAM-1) induced by TNF-α. ICAM-1 is a protein that, by mediating the adhesion of leukocytes to the vascular endothelium and their accumulation in the intimate tunica of the vascular endothelium, helps to determine the initial formation process of the atherosclerotic plaque. Endothelial cells subjected to the action of pro-inflammatory cytokines such as IL-1, IFN-γ and TNF-α are characterized by high levels of ICAM-1. Based on these observations, we assessed whether GPER is involved in the inhibitory action exerted by nicotinic acid on the expression of ICAM-1 induced by TNF-α. For this purpose, the HUVECs were transfected for 24h with a control vector (shRNA) or with a short hairpin of GPER (shGPER) and subsequently treated with 1mM of nicotinic acid for 30h and simultaneously with 50 ng / ml of TNF-α. in the last 6 h. As shown in Figure 3, the inhibitory effect exerted by nicotinic acid on the expression of ICAM-1 induced by TNF-α is not observable by silencing GPER (Figure 3A-B; ●, p <0.05), indicating that GPER mediates the modulating action of nicotinic acid on the expression of ICAM-1. The densitometric evaluation shows the result obtained in three independent experiments. We also evaluated, through in vitro angiogenesis assays on Matrigel, the role of GPER in the angiogenic effects induced by nicotinic acid (NA). For this purpose, the HUVECs were transfected for 24h with a control vector (shRNA) or with a GPER short hairpin (shGPER) and subsequently treated with nicotinic acid for 12h. Figure 4 shows how the formation of tubules induced by nicotinic acid is abrogated by silencing the expression of GPER, indicating that GPER mediates the angiogenic effects induced by nicotinic acid in this experimental model.

(Per i dettagli inerenti la metodologia del saggio di “angiogenesi in vitro su Matrigel” vedi Viñals et al., 2001). (For details concerning the methodology of the “in vitro angiogenesis on Matrigel” assay see Viñals et al., 2001).

Claims (25)

RIVENDICAZIONI 1. Metodo di screening di regolatori del recettore GPR30 comprendente i seguenti passaggi: i) mettere a contatto con il recettore GPR30 un composto da testare e acido nicotinico e/o nicotinammide; ii) determinare l’attività di detto recettore GPR30. CLAIMS 1. GPR30 receptor regulator screening method comprising the following steps: i) contacting the GPR30 receptor with a compound to be tested and nicotinic acid and / or nicotinamide; ii) determine the activity of said GPR30 receptor. 2. Metodo di screening secondo la rivendicazione 1 in cui detti regolatori sono antagonisti o agonisti del recettore GPR30. 2. Screening method according to claim 1 wherein said regulators are GPR30 receptor antagonists or agonists. 3. Metodo di screening secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detto passaggio i) è ripetuto a diverse concentrazioni di detto composto da testare. 3. Screening method according to claim 1 or 2 wherein said step i) is repeated at different concentrations of said compound to be tested. 4. Metodo di screening secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto passaggio i) è ripetuto a diverse concentrazioni di detto acido nicotinico e/o nicotinammide, in un saggio di competizione recettoriale. 4. Screening method according to any one of the preceding claims wherein said step i) is repeated at different concentrations of said nicotinic acid and / or nicotinamide, in a receptor competition assay. 5. Metodo di screening secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendenti i seguenti ulteriori passaggi: iii) mettere a contatto con il recettore GPR30 detto composto da testare in assenza di acido nicotinico e/o nicotinammide; iv) determinare l’attività di detto recettore GPR30. 5. Screening method according to any one of the preceding claims comprising the following further steps: iii) contacting said compound to be tested in the absence of nicotinic acid and / or nicotinamide with the GPR30 receptor; iv) determine the activity of said GPR30 receptor. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto composto da testare è accoppiato ad un marcatore rivelabile. Method according to any one of claims 1 to 5, wherein said compound to be tested is coupled to a detectable marker. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui l’acido nicotinico e/o la nicotinammide sono accoppiati ad un marcatore rivelabile. 7. Method according to any one of claims 1 to 6, wherein the nicotinic acid and / or nicotinamide are coupled to a detectable marker. 8. Metodo secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui detto marcatore rivelabile è un isotopo radioattivo, preferibilmente un isotopo dell’idrogeno. 8. Method according to claim 6 or 7, wherein said detectable marker is a radioactive isotope, preferably a hydrogen isotope. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detto passaggio di contatto i) è in o sulla superficie di una cellula. Method according to any one of claims 1 to 8, wherein said contact passage i) is in or on the surface of a cell. 10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detta cellula è in vitro o in vivo. Method according to claim 9, wherein said cell is in vitro or in vivo. 11. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detto passaggio di contatto è in un sistema acellulare. Method according to any one of claims 1 to 8, wherein said contact passage is in an acellular system. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto recettore GPR30 è su un supporto solido. Method according to claim 11, wherein said GPR30 receptor is on a solid support. 13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui detti regolatori sono agenti terapeutici utili nel trattamento di una malattia compresa in un gruppo di malattie costituite da malattie cardiovascolari, infezioni, malattie dermatologiche, malattie endocrine, malattie metaboliche, cancro, malattie gastrointestinali, infiammazione, malattie ematologiche, malattie respiratorie, malattie muscolo scheletriche, malattie neurologiche e urologiche. Method according to any one of claims 1 to 12, wherein said regulators are therapeutic agents useful in the treatment of a disease included in a group of diseases consisting of cardiovascular diseases, infections, dermatological diseases, endocrine diseases, metabolic diseases, cancer, gastrointestinal diseases, inflammation, haematological diseases, respiratory diseases, musculoskeletal diseases, neurological and urological diseases. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12 per valutare il ruolo di GPR30 in tessuti normali e tumorali. Method according to any one of claims 1 to 12 for evaluating the role of GPR30 in normal and tumor tissues. 15. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14 in cui il recettore GPR30 ha sequenza polipeptidica SEQ ID NO:1 o una sua isoforma o una sua variante biologicamente attiva. Method according to any one of claims 1 to 14 wherein the GPR30 receptor has SEQ ID NO: 1 polypeptide sequence or an isoform or a biologically active variant thereof. 16. Acido nicotinico e/o nicotinammide per l’uso nel trattamento di una condizione patologica migliorata dall’attivazione del recettore GPR30. 16. Nicotinic acid and / or nicotinamide for use in the treatment of a pathological condition improved by the activation of the GPR30 receptor. 17. Acido nicotinico e/o nicotinammide per l'uso secondo la rivendicazione 16 in cui detta patologia è un disturbo neurologico. 17. Nicotinic acid and / or nicotinamide for use according to claim 16 wherein said pathology is a neurological disorder. 18. Acido nicotinico e/o nicotinammide per l'uso secondo la rivendicazione 17 in cui detto disturbo neurologico è scelto tra morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, corea di Huntington, neuropatia periferica diabetica, sclerosi multipla, amiotrofica sclerosi laterale e malattie neurodegenerative acute. 18. Nicotinic acid and / or nicotinamide for the use according to claim 17 wherein said neurological disorder is selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, diabetic peripheral neuropathy, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and acute neurodegenerative diseases . 19. Acido nicotinico e/o nicotinammide per l'uso secondo la rivendicazione 18 in cui detta malattia neurodegenerativa acuta è scelta tra ictus, trauma cranico, danni ai nervi periferici, ipoglicemia, lesioni del midollo spinale, epilessia, anossia e ipossia. 19. Nicotinic acid and / or nicotinamide for use according to claim 18 wherein said acute neurodegenerative disease is selected from stroke, head trauma, peripheral nerve damage, hypoglycemia, spinal cord injury, epilepsy, anoxia and hypoxia. 20. Acido nicotinico e/o nicotinammide per l'uso come sostituto di una terapia a base di estrogeni in un trattamento di una condizione patologica scelta nel gruppo costituita da malattie cardiovascolari, infezioni, malattie dermatologiche, malattie endocrine, malattie metaboliche, cancro, malattie gastrointestinali, infiammazione, malattie ematologiche, malattie respiratorie, malattie muscolo scheletriche, malattie neurologiche e urologiche. 20. Nicotinic acid and / or nicotinamide for use as a substitute for estrogen therapy in the treatment of a pathological condition chosen from the group consisting of cardiovascular diseases, infections, dermatological diseases, endocrine diseases, metabolic diseases, cancer, diseases gastrointestinal, inflammation, haematological diseases, respiratory diseases, musculoskeletal diseases, neurological and urological diseases. 21. Composizione per l’uso nel trattamento di una condizione patologica migliorata dall’attivazione del recettore GPR30 comprendente acido nicotinico e/o nicotinammide e uno o più veicolanti e/o eccipienti e/o diluenti. 21. Composition for use in the treatment of a pathological condition improved by the activation of the GPR30 receptor including nicotinic acid and / or nicotinamide and one or more carriers and / or excipients and / or diluents. 22. Composizione per l'uso secondo la rivendicazione 21 in cui detta patologia è un disturbo neurologico. 22. A composition for use according to claim 21 wherein said pathology is a neurological disorder. 23. Composizione per l'uso secondo la rivendicazione 22 in cui detto disturbo neurologico è scelto tra morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, corea di Huntington, neuropatia periferica diabetica, sclerosi multipla, amiotrofica sclerosi laterale, invecchiamento e malattie neurodegenerative acute. 23. Composition for use according to claim 22 wherein said neurological disorder is selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, diabetic peripheral neuropathy, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, aging and acute neurodegenerative diseases. 24. Composizione per l'uso secondo la rivendicazione 23 in cui detta malattia neurodegenerativa acuta è scelta tra ictus, trauma cranico, danni ai nervi periferici, ipoglicemia, lesioni del midollo spinale, epilessia, anossia e ipossia. 24. Composition for use according to claim 23 wherein said acute neurodegenerative disease is selected from stroke, head trauma, peripheral nerve damage, hypoglycemia, spinal cord injury, epilepsy, anoxia and hypoxia. 25. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti in forma di compresse, polveri, granuli, capsule, soluzioni, sciroppi, elisir, olio o sospensioni acquose.25. Composition according to the preceding claims in the form of tablets, powders, granules, capsules, solutions, syrups, elixirs, oil or aqueous suspensions.
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