ITRM20130635A1 - PLA-NANOCAPSULE PEGILATE WITH AQUEOUS CORE AS AN EFFECTIVE HALF OF GENE VEHICLE - Google Patents
PLA-NANOCAPSULE PEGILATE WITH AQUEOUS CORE AS AN EFFECTIVE HALF OF GENE VEHICLEInfo
- Publication number
- ITRM20130635A1 ITRM20130635A1 IT000635A ITRM20130635A ITRM20130635A1 IT RM20130635 A1 ITRM20130635 A1 IT RM20130635A1 IT 000635 A IT000635 A IT 000635A IT RM20130635 A ITRM20130635 A IT RM20130635A IT RM20130635 A1 ITRM20130635 A1 IT RM20130635A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- peg
- nanocapsule
- acpla
- nanocapsules
- genetic material
- Prior art date
Links
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 title claims description 106
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 55
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 title description 3
- 108091029119 miR-34a stem-loop Proteins 0.000 claims description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 claims description 22
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 15
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 14
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 9
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 9
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 19
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 4
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] 2-(2-methoxyethoxycarbonylamino)ethyl phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCCNC(=O)OCCOC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000023940 X-Linked Combined Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000020595 eating behavior Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UXDBPOWEWOXJCE-DIPNUNPCSA-N 1,2-dihexadecyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OCCCCCCCCCCCCCCCC UXDBPOWEWOXJCE-DIPNUNPCSA-N 0.000 description 1
- HEPCJCVNHBXRBO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxohexanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CCC(=O)C(O)=O HEPCJCVNHBXRBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 201000011452 Adrenoleukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009030 Member 1 Subfamily D ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 1
- 108010049137 Member 1 Subfamily D ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100027330 Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000012827 T-B+ severe combined immunodeficiency due to gamma chain deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- FLKYBGKDCCEQQM-WYUVZMMLSA-M cefazolin sodium Chemical compound [Na+].S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 FLKYBGKDCCEQQM-WYUVZMMLSA-M 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 108010035774 phosphoribosylaminoimidazole carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
- A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Description
Descrizione Description
PLA-nanocapsule PEGilate con nucleo acquoso come mezzo efficace di veicolazione genica CAMPO DELL’INVENZIONE PLA-PEGylated nanocapsules with aqueous core as an effective means of gene delivery FIELD OF THE INVENTION
La presente invenzione si riferisce al campo farmaceutico, in particolare al campo della terapia genica. Più in particolare, si riferisce ad un sistema di veicolazione genica basato su nanoparticelle polimeriche a nucleo acquoso. The present invention relates to the pharmaceutical field, in particular to the field of gene therapy. More particularly, it refers to a gene delivery system based on polymeric nanoparticles with aqueous core.
SFONDO DELL’INVENZIONE BACKGROUND OF THE INVENTION
Negli ultimi anni, la terapia genica è diventata una strategia promettente per il trattamento di molte malattie ereditarie o acquisite. In particolare, la scoperta dell’RNA interference (RNAi) e del suo mediatore farmacologico, il piccolo RNA interference (small interfering RNA o siRNA), ha rappresentato un approccio stimolante a causa del suo vasto range di applicazioni legate alla sua capacità di silenziamento (Reischl e Zimmer.2009). In recent years, gene therapy has become a promising strategy for the treatment of many inherited or acquired diseases. In particular, the discovery of RNA interference (RNAi) and its pharmacological mediator, small RNA interference (small interfering RNA or siRNA), represented a stimulating approach due to its wide range of applications linked to its silencing capacity ( Reischl and Zimmer. 2009).
E’ anche stato dimostrato che alcuni miRNA sono degli efficaci agenti antitumorali, quando vengono veicolati selettivamente ed efficientemente a cellule ed a tessuti bersaglio. It has also been shown that some miRNAs are effective anticancer agents, when they are selectively and efficiently delivered to target cells and tissues.
Purtroppo, la somministrazione dei siRNA e di altri piccoli acidi nucleici richiede la loro incapsulazione/complessazione in sistemi di veicolazione a causa del loro sfavorevole profilo farmacocinetico e della loro difficoltà di penetrare nelle cellule; infatti, le RNasi li degradano rapidamente, favorendo la loro clearance renale mentre la carica negativa dei gruppi fosfato evita una buona interazione con la membrana cellulare (a causa delle teste fosfolipidiche anioniche) (Scholz and Wagner.2012). Unfortunately, the administration of siRNAs and other small nucleic acids requires their encapsulation / complexation in delivery systems due to their unfavorable pharmacokinetic profile and their difficulty in penetrating cells; in fact, the RNases degrade them rapidly, favoring their renal clearance while the negative charge of the phosphate groups avoids a good interaction with the cell membrane (due to the anionic phospholipid heads) (Scholz and Wagner. 2012).
Per queste ragioni sono stati studiati molti approcci al fine di ottenere un’efficace veicolazione genica. For these reasons, many approaches have been studied in order to obtain effective gene delivery.
Strategie fisiche, come l'elettroporazione, hanno consentito di ottenere risultati incoraggianti in saggi in vitro ma sono difficili da eseguire in modelli in vivo (Suzuki et al., 1998). Physical strategies, such as electroporation, have yielded encouraging results in in vitro assays but are difficult to perform in in vivo models (Suzuki et al., 1998).
L'utilizzo di sistemi di veicolazione virali e non virali hanno favorito il miglioramento delle proprietà biofarmaceutiche del materiale genico, rappresentando così dei dispositivi promettenti per un’applicazione clinica. Purtroppo, i vettori virali hanno mostrato molti svantaggi, vale a dire la comparsa di tossicità, un grado di transfezione irregolare, immunogenicità e infiammazioni (David et al., 2010). The use of viral and non-viral delivery systems have favored the improvement of the biopharmaceutical properties of the gene material, thus representing promising devices for clinical application. Unfortunately, viral vectors have shown many disadvantages, namely the appearance of toxicity, an irregular degree of transfection, immunogenicity and inflammation (David et al., 2010).
Per queste ragioni, i nanodispositivi non virali hanno acquisito grande importanza come mezzi (carrier) plausibili per la veicolazione genica (Aliabadi et al., 2012). I liposomi cationici e i lipoplessi hanno rappresentato i primi sistemi vescicolari utilizzati al fine di veicolare in modo efficiente i materiali genetici. Tuttavia, è stato dimostrato che sono caratterizzati da una bassa efficienza di incapsulazione, una scarsa stabilità di conservazione e una rapida clearance ematica (Lv et al., 2006; Karmali and Chaudhuri. 2007). Inoltre, i polimeri cationici hanno evidenziato diverse caratteristiche sfavorevoli, ossia un ampio range dimensionale e una conformazione variabile (Köping-Hoggard et al., 2004). Inoltre, i polimeri cationici sono stati utilizzati per ottenere nanoparticelle cationiche, ma la carica di superficie positiva compromette le loro proprietà biofarmaceutiche (Nimesh, 2012). For these reasons, non-viral nanodevices have acquired great importance as plausible carriers for gene delivery (Aliabadi et al., 2012). Cationic liposomes and lipoplexes were the first vesicular systems used in order to efficiently convey genetic materials. However, they have been shown to be characterized by low encapsulation efficiency, poor storage stability and rapid blood clearance (Lv et al., 2006; Karmali and Chaudhuri. 2007). Furthermore, cationic polymers showed several unfavorable characteristics, namely a wide dimensional range and a variable conformation (Köping-Hoggard et al., 2004). Furthermore, cationic polymers have been used to obtain cationic nanoparticles, but the positive surface charge compromises their biopharmaceutical properties (Nimesh, 2012).
Pertanto, vi è ancora la necessità di un sistema per la veicolazione di materiale genetico alle cellule, in particolare di piccoli acidi nucleici, in un modo non tossico per le cellule ma che allo stesso tempo permetta al suddetto materiale genetico di esercitare efficacemente la sua attività terapeutica. Therefore, there is still a need for a system for the delivery of genetic material to cells, in particular of small nucleic acids, in a non-toxic way for the cells but which at the same time allows the aforementioned genetic material to effectively exercise its activity. therapeutic.
Recentemente, sono state realizzate delle nanocapsule polimeriche costituite da acido poli-L-lattico (PLA), un polimero approvato per le applicazioni farmaceutiche dalla FDA, caratterizzate da un nucleo acquoso circondato da un rivestimento (shell) di PLA che hanno consentito di intrappolare efficacemente molecole solubili in acqua (Paolino et al, 2013; Sculptra<®>, Sanofi Aventis www.sculptra.com). Recently, polymeric nanocapsules have been created consisting of poly-L-lactic acid (PLA), a polymer approved for pharmaceutical applications by the FDA, characterized by an aqueous core surrounded by a PLA shell that allowed to effectively trap water-soluble molecules (Paolino et al, 2013; Sculptra <®>, Sanofi Aventis www.sculptra.com).
In Paolino et al.2013, nanocapsule a base di PLA e rivestite da polietilenglicole (PEG) sono state utilizzate per incapsulare la gemcitabina, farmaco antineoplastico, dimostrando una maggiore efficacia antitumorale rispetto al farmaco libero sia in modelli in vitro che in vivo. In Paolino et al. 2013, PLA-based and polyethylene glycol (PEG) coated nanocapsules were used to encapsulate the antineoplastic drug gemcitabine, demonstrating greater antitumor efficacy than the free drug in both in vitro and in vivo models.
È stato ora trovato che le suddette nanocapsule di PLA rivestite da PEG possono essere efficacemente utilizzate anche per intrappolare materiale genetico e veicolarlo efficientemente all'interno delle cellule. Grazie alle suddette nanocapsule il materiale genetico intrappolato è protetto dalla degradazione, in particolare dalla degradazione da parte di RNasi, e la sua attività farmacologica viene preservata. It has now been found that the aforementioned PEG-coated PLA nanocapsules can also be effectively used to trap genetic material and efficiently deliver it within cells. Thanks to the aforementioned nanocapsules, the trapped genetic material is protected from degradation, in particular from degradation by RNase, and its pharmacological activity is preserved.
Come accennato in precedenza, le nanocapsule cationiche sono state utilizzate per la veicolazione genica, ma le cariche positive sulla superficie compromettono le loro proprietà biofarmaceutiche e possono anche essere tossiche per le cellule bersaglio. As previously mentioned, cationic nanocapsules have been used for gene delivery, but the positive charges on the surface compromise their biopharmaceutical properties and can also be toxic to target cells.
È stato ora trovato dagli inventori della presente invenzione che le nanocapsule di PEG-AcPLA, evitando la presenza di cariche positive sulla superficie delle nanocapsule, forniscono un sistema per la veicolazione di materiale genetico alle cellule che non è tossico per le cellule e, al tempo stesso, è in grado di preservare l'integrità e l'attività farmacologica del materiale intrappolato, detto sistema di veicolazione essendo quindi particolarmente vantaggioso. It has now been found by the inventors of the present invention that the PEG-AcPLA nanocapsules, avoiding the presence of positive charges on the surface of the nanocapsules, provide a system for the delivery of genetic material to the cells which is not toxic to the cells and, at the same time itself, is capable of preserving the integrity and pharmacological activity of the trapped material, said delivery system therefore being particularly advantageous.
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
E’ stato ora trovato un nuovo sistema di veicolazione genica basato su nanocapsule di PEG-AcPLA in grado di intrappolare efficacemente il materiale genetico, interagire con le cellule e promuovere la trasfezione cellulare permettendo così al(ai) composto(i) incapsulato(i) di esercitare efficacemente la sua(loro) attività farmacologica. In particolare, la mancanza di una carica positiva sulla superficie delle nanocapsule a base di PEG-AcPLA ne consente un utilizzo efficiente nella veicolazione genica, rappresentando quindi una nuova nanomedicina particolarmente adatta per l'applicazione clinica. A new gene delivery system based on PEG-AcPLA nanocapsules has now been found capable of effectively trapping genetic material, interacting with cells and promoting cell transfection thus allowing the encapsulated compound (s) to effectively exercise its (their) pharmacological activity. In particular, the lack of a positive charge on the surface of PEG-AcPLA-based nanocapsules allows them to be used efficiently in gene delivery, thus representing a new nanomedicine particularly suitable for clinical application.
È pertanto un oggetto della presente invenzione, l'uso di una nanocapsula di polietilenglicole-acido poli-L-lattico con un nucleo acquoso (di seguito denominata anche nanocapsula PEG-AcPLA) per veicolare materiale genetico. The use of a polyethylene glycol-poly-L-lactic acid nanocapsule with an aqueous core (hereinafter also referred to as PEG-AcPLA nanocapsule) to carry genetic material is therefore an object of the present invention.
In particolare, detto materiale genetico è uno o più di un acido nucleico intrappolato all'interno della nanocapsula. In particular, said genetic material is one or more of a nucleic acid trapped inside the nanocapsule.
Detta nanocapsula di polietilenglicole-acido poli-L-lattico con nucleo acquoso che comprende materiale genetico intrappolato all'interno della nanocapsula è anche un oggetto della presente invenzione. Said polyethylene glycol-poly-L-lactic acid nanocapsule with aqueous core comprising genetic material trapped inside the nanocapsule is also an object of the present invention.
Detto materiale genetico può essere una molecola di DNA o di RNA o una loro miscela, preferibilmente è un siRNA o un miRNA, e può essere in forma lineare o circolare; per esempio può essere un plasmide. Said genetic material can be a DNA or RNA molecule or a mixture thereof, preferably it is a siRNA or a miRNA, and can be in linear or circular form; for example it can be a plasmid.
In una realizzazione preferita, detta nanocapsula è utilizzata per la veicolazione di un miRNA. In a preferred embodiment, said nanocapsule is used for the delivery of a miRNA.
In una realizzazione più preferita, detto miRNA è il miR-34a. In a more preferred embodiment, said miRNA is miR-34a.
La veicolazione genica è particolarmente utile per il trattamento di molte malattie. Gene delivery is particularly useful for the treatment of many diseases.
Perciò, in un ulteriore oggetto della presente invenzione, la nanocapsula di PEG-AcPLA è per uso per la veicolazione di materiale genetico nel trattamento di una malattia che può essere trattata attraverso la somministrazione di detto materiale genetico. Detta malattia è preferibilmente il cancro, più preferibilmente è il mieloma multiplo. Therefore, in a further object of the present invention, the PEG-AcPLA nanocapsule is for use for the delivery of genetic material in the treatment of a disease which can be treated through the administration of said genetic material. Said disease is preferably cancer, more preferably it is multiple myeloma.
La veicolazione genica è anche particolarmente utile nella terapia genica. Gene delivery is also particularly useful in gene therapy.
Pertanto un altro oggetto della presente invenzione, è la nanocapsula di PEG-AcPLA per uso per la veicolazione di materiale genetico nella terapia genica. Therefore another object of the present invention is the PEG-AcPLA nanocapsule for use for the delivery of genetic material in gene therapy.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE DESCRIPTION OF THE INVENTION
Definizioni Definitions
Nell’ambito della presente invenzione, una nanocapsula è una particella con un diametro inferiore ai 500 nm, preferibilmente inferiore ai 200 nm. Nell’ambito della presente invenzione "Nanoparticella" è usato anche come sinonimo di nanocapsula. In the context of the present invention, a nanocapsule is a particle with a diameter of less than 500 nm, preferably less than 200 nm. In the context of the present invention, "Nanoparticle" is also used as a synonym for nanocapsule.
Nell’ambito della presente invenzione, il "materiale genetico" è uno o più acidi nucleici di qualsiasi lunghezza, preferibilmente di lunghezza compresa tra 20 e 30 nucleotidi. Per esempio, detto acido nucleico può essere un gene, una parte di un gene, un gruppo di geni, una molecola di DNA o RNA, un frammento di DNA o RNA, un gruppo di molecole di DNA/RNA, o l'intero genoma di un organismo. Può essere a singolo filamento o doppio filamento e può essere di forma lineare o circolare. Preferibilmente, è un breve acido nucleico come, per esempio, un miRNA (denominato anche microRNA) o un siRNA. Nella presente invenzione, il materiale genetico non include un singolo nucleoside o nucleotide, naturale o modificato. In the context of the present invention, the "genetic material" is one or more nucleic acids of any length, preferably with a length of between 20 and 30 nucleotides. For example, said nucleic acid may be a gene, part of a gene, a group of genes, a DNA or RNA molecule, a DNA or RNA fragment, a group of DNA / RNA molecules, or the entire genome. of an organism. It can be single-stranded or double-stranded and can be linear or circular in shape. Preferably, it is a short nucleic acid such as, for example, a miRNA (also referred to as a microRNA) or a siRNA. In the present invention, the genetic material does not include a single nucleoside or nucleotide, whether natural or modified.
Nell’ambito della presente invenzione, un siRNA è uno small interfering RNA (denominato anche short interfering RNA o silencing RNA), solitamente con lunghezza di 20-25 paia di basi, che svolge diversi ruoli nel pathway dell’RNA interference. In the context of the present invention, a siRNA is a small interfering RNA (also called short interfering RNA or silencing RNA), usually with a length of 20-25 base pairs, which plays different roles in the RNA interference pathway.
Figure Figures
Figura 1. A: Micrografia con microscopia elettronica a scansione di una nanocapsula (Bar=100 nm). B: Dimensioni medie dei nanosistemi contenenti miR34a mediante analisi di dispersione dinamica della luce (dynamic light scattering). C: Efficienza d’incapsulazione (%) del miR34a nelle nanocapsule di PEG-AcPLA in funzione della quantità del composto aggiunto inizialmente. Figure 1. A: Scanning electron microscopy micrograph of a nanocapsule (Bar = 100 nm). B: Average size of nanosystems containing miR34a by dynamic light scattering analysis. C: Encapsulation efficiency (%) of miR34a in the PEG-AcPLA nanocapsules as a function of the amount of the compound initially added.
Figura 2. Saggio d’interazione del miR34a con le nanocapsule di PEG-AcPLA mediante gel di agarosio (pannello a sinistra) e saggio di protezione eseguito dopo 1 ora d’incubazione con l’RNasi del miR34a in forma libera e in nanoparticelle (pannello di destra). Pannello di sinistra: A = miR34a, B = miR34a incapsulato nelle nanocapsule di PEG-AcPLA, C = pellet delle nanocapsule di PEG-AcPLA contenenti il miR34a, D = surnatante delle nanocapsule di PEG-AcPLA contenenti il miR34a. Pannello di destra: A = dsRNA ladder, B = miR34a non trattato, C = miR34a incubato con la Ribonucleasi A, D = miR34a incapsulato nelle nanocapsule di PEG-AcPLA incubato con la Ribonucleasi A. Figure 2. Interaction assay of miR34a with PEG-AcPLA nanocapsules using agarose gel (left panel) and protection assay performed after 1 hour of incubation with miR34a RNase in free form and in nanoparticles (panel right). Left panel: A = miR34a, B = miR34a encapsulated in PEG-AcPLA nanocapsules, C = pellet of PEG-AcPLA nanocapsules containing miR34a, D = supernatant of PEG-AcPLA nanocapsules containing miR34a. Right panel: A = dsRNA ladder, B = untreated miR34a, C = miR34a incubated with Ribonuclease A, D = miR34a encapsulated in PEG-AcPLA nanocapsules incubated with Ribonuclease A.
Figura 3. Analisi citofluorimetriche (FACS) di diverse linee cellulari trattate per 6 ore con un<miRNA-FAMTM>incapsulato nelle nanocapsule di PEG-AcPLA-pGFP dopo incubazione per 24 ore (colonna a sinistra) e 48 ore (colonna a destra). A) cellule A549, B) cellule HeLa, C) cellule SKMM1. FL1-H sull’asse delle x è il canale della fluorescenza usato. Sull’asse delle y sono riportate le conte cellulari. Figure 3. Flow cytometric analysis (FACS) of different cell lines treated for 6 hours with a <miRNA-FAMTM> encapsulated in PEG-AcPLA-pGFP nanocapsules after incubation for 24 hours (left column) and 48 hours (right column) . A) A549 cells, B) HeLa cells, C) SKMM1 cells. FL1-H on the x axis is the fluorescence channel used. The cell counts are shown on the y-axis.
Figura 4. Micrografie al microscopio confocale (CLSM) di cellule A549 incubate per 6 ore con nanocapsule di PEG-AcPLA marcate con rodamina. 2D (A, B, C), Z-stack con un angolo di rotazione di 180° (A’, B’, C’). Pannelli A, A’: filtro TRITC; pannelli B, B’: filtro Hoechst; pannelli C, C’: sovrapposizione. Non è stato osservato nessun fenomeno di autofluorescenza. Figure 4. Confocal microscopic micrographs (CLSM) of A549 cells incubated for 6 hours with rhodamine-labeled PEG-AcPLA nanocapsules. 2D (A, B, C), Z-stack with a rotation angle of 180 ° (A ', B', C '). Panels A, A ': TRITC filter; panels B, B ': Hoechst filter; panels C, C ': overlap. No autofluorescence phenomena were observed.
Figura 5. Citotossicità in vitro delle nanocapsule di PEG-AcPLA su diverse linee cellulari di mieloma in funzione della concentrazione di PLA e del tempo di esposizione (pannelli di sinistra). Citotossicità del miR34a incapsulato nei nanosistemi su linee cellulari di mieloma multiplo in funzione della concentrazione del farmaco e del tempo di esposizione (pannelli di destra). I dati sono espressi come percentuale della vitalità cellulare valutata mediante MTT test. I risultati sono la media di 4 diversi esperimenti ± la deviazione standard. Le barre di errore, se non indicate, sono all'interno dei simboli. Figure 5. In vitro cytotoxicity of PEG-AcPLA nanocapsules on different myeloma cell lines as a function of PLA concentration and exposure time (left panels). Cytotoxicity of miR34a encapsulated in nanosystems on multiple myeloma cell lines as a function of drug concentration and exposure time (right panels). The data are expressed as a percentage of cell viability as assessed by the MTT test. The results are the mean of 4 different experiments ± the standard deviation. The error bars, if not indicated, are inside the symbols.
Figura 6. Effetti delle nanocapsule di PEG-AcPLA con miR-34a (Nano miR-34a) in xenotrapianti (xenograft) di SKMM1 attraverso iniezioni peritumorali. Gli xenotrapianti tumorali sottocutanei palpabili sono stati trattati ripetutamente ogni tre giorni, come indicato dalle frecce, con 20 µg di Nano miR-34a o Nano-NC (NC). Come controllo 2 gruppi separati di animali con il tumore sono stati trattati con il solo veicolo (la nanocapsule di PEG-AcPLA, Nano) o con tampone fosfato salino (PBS). I tumori sono stati misurati con un calibro (caliper) elettronico ogni 3 giorni, sono mostrati la media del volume del tumore di ciascun gruppo e la deviazione standard. I valori di P sono stati calcolati per Nano-miR34a contro Nano-NC (test t di Student, a due code). (*) Indica i valori di P significativi (P <0,01). ;;Descrizione dettagliata dell'invenzione ;;La nanocapsula di PEG-AcPLA usata nella presente invenzione è caratterizzata da un nucleo acquoso (Ac), un guscio (shell) di acido poli-L-lattico (PLA) e un rivestimento di PEG. ;;Una rappresentazione schematica della struttura di una nanocapsula PEG-AcPLA viene riportata di seguito: ;;Guscio di ;poli-L-lattide ;;Schema 1 ;;Il PEG della suddetta nanocapsula di PEG-AcPLA è preferibilmente un derivato lipidico o fosfolipidico del PEG. ;;Esempi non limitanti di derivati idonei del PEG sono i seguenti: 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-[metossi (polietilene glicole)] (DSPE-mPEG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metossi (polietilene glicole)] (DMPE-mPEG), preferibilmente nella forma di un sale di ammonio, un ceramide-PEG, un colesterolo-PEG (Chol-PEG). Tutti i suddetti PEG-lipidi possono anche essere funzionalizzati, per esempio con l’acido succinil carbossilico, maleimide, (piridilditio) propionato (PDP), ammina, biotina, cianuro, acido folico. In ogni caso, il PEG ha un peso molecolare compreso tra 350 e 5000. Preferibilmente ha un peso molecolare di 350, 550, 750, 1000, 2000, 3000 o 5000. ;;In una realizzazione preferita, il PEG della nanocapsula è l’N-(carbonil-metossipolietilene glicol-2000)-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE-mPEG2000). ;;Un metodo esemplificativo di preparazione della suddetta nanocapsule è il seguente. Riferimento può anche essere fatto a Paolino et al.2013. ;Le nanocapsule di PLA con nucleo acquoso (AcPLA) rivestite di PEG possono essere ottenute aggiungendo una soluzione acquosa (soluzione acquosa primaria) ad una miscela di acido polilattico (PLA), esteri del sorbitano (Span), cloroformio, diclorometano e un PEG. La miscela viene poi sonicata. La sospensione ottenuta viene aggiunta ad una soluzione acquosa che contiene sodio desossicolato idrato (SD) e glicerolo e omogeneizzata (soluzione acquosa secondaria). La formulazione è mescolata fino all’evaporazione dei solventi e alla formazione delle nanocapsule PEG-AcPLA, che vengono successivamente lavate con acqua distillata mediante, ad esempio, ultracentrifugazione. ;;Le nanocapsule di PEG-AcPLA che contengono materiale genetico vengono preparate aggiungendo il suddetto materiale genetico alla fase acquosa primaria. ;;La nanocapsula di polietilen glicole-acido polilattico con nucleo acquoso che comprende materiale genetico intrappolato all’interno della nanocapsula è un oggetto della presente invenzione. ;;Detto materiale genetico è uno o più acidi nucleici. Detto acido nucleico può essere una molecola di DNA o di RNA, o una loro miscela, preferibilmente è un miRNA. ;;L'acido nucleico può essere di forma lineare o circolare. Ad esempio, può essere un plasmide. ;Inoltre, detto acido nucleico può essere a singolo filamento o a doppio filamento. ;;In una realizzazione preferita, detto acido nucleico intrappolato all'interno della nanocapsula di PEG-AcPLA è un miRNA. In una realizzazione più preferita, è il miR-34a. ;;Il miR-34a è un miRNA noto. ;;La nanocapsula di PEG-AcPLA usata nella presente invenzione può anche comprendere ulteriori molecole attaccate sulla sua superficie esterna. Dette molecole possono essere, per esempio, anticorpi o altre molecole che riconoscono specificatamente una cellula bersaglio. Detta molecola può essere coniugata alla superficie esterna della nanocapsula utilizzando metodi noti nel settore. In particolare, dette molecole possono essere coniugate al PEG della nanocapsula. ;;Le nanocapsule di PEG-AcPLA dell'invenzione forniscono il vantaggio di un'assenza di cariche positive sulla superficie della nanocapsula, che consente il mantenimento delle proprietà biofarmaceutiche, un buon grado di transfezione cellulare e nessuna tossicità per le cellule target. ;Allo stesso tempo le nanocapsule proteggono il materiale genetico intrappolato al loro interno dall'attività delle DNA/RNasi, che degraderebbero il materiale genetico libero. ;;In particolare, i vantaggi dell'utilizzo delle nanocapsule di PEG-AcPLA come sistemi di veicolazione genica sono stati dimostrati dall’incapsulazione del miR-34a, un miRNA oncosoppressore sottoregolato (downregulated) in molti tipi di tumori. Il miR-34a è stato usato come composto modello a causa della sua attività antitumorale recentemente dimostrata nei confronti del mieloma multiplo (Di Martino et al., 2012). ;L'uso della nanocapsula di PEG-AcPLA per veicolare materiale genetico assicura anche un buon grado di trasfezione cellulare, permettendo così l'assorbimento (uptake)/internalizzazione cellulare del composto(i) intrappolato(i). ;;La trasfezione cellulare con le nanocapsule dell'invenzione può essere ottenuta mediante metodi noti nel settore. Tutti i tipi di cellule possono essere trasfettati con le nanocapsule dell'invenzione. ;Preferibilmente, la cellula trasfettata è una cellula di mieloma. ;;Le nanocapsule di PEG-AcPLA sono quindi uno strumento utile ed efficace per la veicolazione genica. ;;Le nanocapsule della presente invenzione possono anche essere convenientemente utilizzate per trasfettare cellule con materiale genetico nel lavoro di laboratorio, come ad esempio nella trasfezione in vitro. ;;È pertanto un oggetto della presente invenzione l'uso delle nanocapsule di PEG-AcPLA per la veicolazione in vitro di materiale genetico. ;;Detto materiale genetico può essere DNA o RNA. Preferibilmente, è un miRNA. Esso può essere un singolo miRNA o una miscela di miRNA. In una realizzazione più preferita è il miR-34a. ;;La veicolazione genica è particolarmente utile per la terapia genica, dove un acido nucleico è utilizzato come agente farmaceutico per trattare una malattia. ;;Pertanto, è anche un oggetto dell'invenzione l'uso della nanocapsula di PEG-AcPLA nella terapia genica, in particolare per la veicolazione in vivo di materiale genetico nella terapia genica. ;;Nella terapia genica, un acido nucleico può essere utilizzato per integrare o modificare i geni all'interno delle cellule dell'individuo come terapia per il trattamento di una malattia. La forma più comune di terapia genica prevede l'uso di DNA che codifica per un gene terapeutico funzionale per sostituire un gene mutato. Altre forme prevedono la correzione diretta di una mutazione o l’uso di DNA che codifica per una proteina terapeutica farmaco (al posto di un gene naturale umano) per fornire un trattamento. Ad esempio, nella terapia genica un acido nucleico codificante per una proteina terapeutica può essere incapsulato in un "vettore", che viene utilizzato per veicolare l' acido nucleico all'interno delle cellule. Una volta all'interno, l'acido nucleico viene espresso dal metabolismo cellulare, con conseguente produzione di una proteina terapeutica, che a sua volta tratta la malattia del paziente. ;;Nella presente invenzione, una nanocapsula di PEG-AcPLA è fornita come un vettore per la veicolazione all'interno delle cellule dell’acido nucleico necessario. ;;La nanocapsula di PEG-AcPLA contenente il materiale genetico può essere somministrata ad un soggetto che soffre di una malattia trattabile con la terapia genica con metodi convenzionali. ;Esempi di malattie curabili mediante terapia genica sono l’immunodeficienza combinata grave legata al cromosoma X (X-linked SCID), il deficit dell’enzima adenosina–deaminasi (ADA-SCID), l’adrenoleucodistrofia, la leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia linfocitica acuta (ALL), il mieloma multiplo e il morbo di Parkinson. ;;La nanocapsula di PEG-AcPLA può essere utilizzata anche per il trattamento di una qualsiasi malattia che può essere trattata con la somministrazione di materiale genetico. ;;In particolare, l'uso della nanocapsula di PEG-AcPLA per la veicolazione di materiale genetico per il trattamento del cancro è un oggetto preferito della presente invenzione. ;;Preferibilmente, detto cancro è il mieloma multiplo. ;;Più preferibilmente, detta nanocapsula di PEG-AcPLA viene utilizzata per la veicolazione del miR-34a per il trattamento del mieloma multiplo. ;;Convenientemente, le nanocapsule sono sotto forma di un preparato per la somministrazione parenterale, preferibilmente per la somministrazione endovenosa. La persona esperta nella tecnica deciderà il tempo effettivo di somministrazione, a seconda del tipo di malattia, le condizioni del paziente, il grado di gravità della malattia, la risposta del paziente e qualsiasi altro parametro clinico entro la conoscenza generale di questa materia. ;;L’iniezione è una via di somministrazione preferita. ;;Una composizione farmaceutica che comprende la nanocapsula di PEG-AcPLA che contiene il materiale genetico è anche un oggetto della presente invenzione. Preferibilmente, detta composizione è per l'utilizzo nella terapia genica o per trattare malattie che possono essere trattate da detto materiale genetico. ;;La composizione può contenere, insieme alla nanocapsula di PEG-AcPLA, almeno un eccipiente e/o veicolo accettabile farmaceuticamente. Questi possono essere particolarmente utili coadiuvanti di formulazione come, ad esempio agenti solubilizzanti, agenti disperdenti, agenti di sospensione, ed emulsionanti. ;;I seguenti esempi illustreranno ulteriormente l'invenzione senza limitarla. ;;ESEMPI ;;Materiali e Metodi ;;L’acido polilattico (PLA, P.M. 85.000-160.000), il sodio desossicolato idrato (SD), le tavolette di tampone fosfato, i sali di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-3,5-difeniltetrazolio bromuro (usati per l’MTT-test), la soluzione di amfotericina B (250 ug/ml) e il dimetil sulfossido sono stati acquistati dalla Sigma Aldrich (Milano, Italia). L’N-(carbonil-metossipolietilenglicole-2000)-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE-mPEG2000) è stato acquistato dalla Genzyme (Suffolk, UK). ;La Lissamine rodamina B 1,2-diesadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina sale trietilammonio (rodamina DHPE) è stata fornita dalla Invitrogen (Eugene, Oregon,USA). ;;L’estere del sorbitano (Span) è stato ottenuto da ACEF Spa (Piacenza, Italia). pCMV-GFP (3487 ;bp) è stato acquistato dalla Plasmid Factory GmbH & Co. KG (Bielefeld, Germania). ;;Le linee cellulari di mieloma multiplo umano (MM) sono state fornite dalla rete di ricerca AIRC 5X 1000, mentre le linee cellulari A549 e HeLa sono state acquistate presso l’Istituto Zooprofilattico di Modena e Reggio Emilia. ;;Il pre-miR34a e il FAM-pre-miR scrambled control, l’RNAse, il terreno di coltura RPMI-1640, il terreno essenziale modificato di Dulbecco (D-MEM) con glutammina, il siero fetale bovino (FBS), la soluzione di tripsina-EDTA (1×) e la soluzione di penicillina-streptomicina (100 UI/mL) sono stati acquistati dalla Life Technologies, Italia. ;;Tutti gli altri materiali e i solventi utilizzati in questo lavoro erano di grado analitico (Carlo Erba, Milano, Italia). ;;Preparazione delle nanocapsule a nucleo acquoso ;;Le nanocapsule di PLA a nucleo acquoso (AcPLA) sono state realizzate mediante tecnica dell'emulsione con alcune modifiche. In breve, 1 ml di una soluzione acquosa è stato aggiunto ad una miscela di PLA (6 mg), Span (1 % p/v), cloroformio e diclorometano (2 ml, 3:1 v/v) e sonicate per 2 minuti utilizzando un Sonopuls GM70 (Bandelin) con lo strumento al 30 % della sua massima potenza in ghiaccio. La sospensione ottenuta è stata aggiunta ad una soluzione acquosa contenente SD (1% p/v) e glicerolo (1 g) e omogeneizzata a 24000 rpm per 1 min (Ultraturrax T25,<IKA®>Werke). La formulazione è stata posta sotto agitazione per 3 ore a temperatura ambiente fino all’evaporazione dei solventi e alla formazione delle nanocapsule di AcPLA, le quali sono state successivamente lavate per tre volte con acqua distillata mediante ultracentrifugazione (Optima TL Ultracentrifuga, Beckman). ;;Per preparare le nanocapsule di PLA rivestite con il PEG (PEG-AcPLA), la DSPE-mPEG2000 (0,05 p/v) è stata dispersa nella soluzione organica polimerica, permettendo così l'inserimento di questa sostanza nella superficie dei colloidi grazie alla sua frazione fosfolipidica. ;;Le nanocapsule di PEG-AcPLA contenenti il materiale genetico sono state preparate aggiungendo quest’ultimo nella fase acquosa primaria. ;;Le nanoparticelle marcate con sonda fluorescente sono state preparate co-dissolvendo la rodamina-DHPE (0,1% molare) con il polimero nella fase organica durante la procedura di preparazione (Paolino et al., 2013). ;;Caratterizzazione chimico-fisica delle nanocapsule di AcPLA ;Le dimensioni medie, la distribuzione dimensionale e la carica di superficie delle diverse formulazioni sono state analizzate mediante spettroscopia di fotocorrelazione (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Spring Lane South, Worchester Shine, England) come riportato precedentemente (Paolino et al., 2013). ;;Interazione del miR34a con le nanocapsule e saggio di protezione ;;Il legame del miR34a con le nanocapsule di PEG-AcPLA è stato determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio. Brevemente, i nanosistemi sono stati centrifugati ed il pellet è stato distrutto con una soluzione acquosa di SDS (0,4 % p/v) per investigare la presenza del miRNA.10 µl di ogni campione sono stati miscelati con 2 µl di colorante di caricamento (loading dye) 6× ottenendo un volume finale di 12 microlitri. I complessi sono stati caricati su un gel di agarosio all’1 e con il Tris-acetato-EDTA (TAE) come tampone di corsa, contenente 0,5 µg/µl di etidio bromuro, a 100 V per 30 minuti. Le bande del miR34a sono state visualizzate per irraggiamento con luce UV con un transilluminatore UV-20 (Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San Francisco, CA, USA). Il miR34a nudo e le nanoparticelle vuote (blank) sono stati utilizzati come controlli. ;;La quantità esatta del miR34a contenuto nelle nanocapsule di PEG-AcPLA è stata misurata a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop<®>ND1000.;;Al fine di investigare la capacità della formulazione polimerica di proteggere il miR34a, sono stati condotti gli stessi esperimenti dopo incubazione dei campioni con una RNasi A per 1 ora. ;;Colture Cellulari ;;Le cellule RPMI8226 e SKMM1 sono state mantenute in sospensione in beute trattate per colture tissutali (75 cm<2>) in terreno RPMI 1640, mentre le cellule A549 e le cellule HeLa sono state poste in coltura in piastre di plastica (100 mm x 20 mm). Tutti i terreni sono stati integrati con il 10% di FBS (v/v), 100 µg/mL di streptomicina, 100 IU/ml di penicillina, 250 µg/ml di amfotericina B e incubate a 37 °C in ambiente umidificato al 5% di CO2(Forma<®>Series II Water-Jacketed CO2Incubator, Thermo Scientific, Germania). Il terreno fresco è stato sostituito ogni 48 ore. ;;Trasfezione in vitro e analisi dell’interazione cellulare mediante Microscopia Confocale a scansione laser (CLSM) ;;Le cellule sono state poste in coltura in piastre da 6 pozzetti (4×10<5>cellule/pozzetto per le cellule SKMM1 e 5×10<4>cellule/pozzetto per le cellule A549 e HeLa) per 24 h prima degli esperimenti, in modo da raggiungere il 75% della confluenza. In seguito, il mezzo è stato sostituito per 6 ore con un mezzo senza antibiotico contenente le diverse formulazioni, cioè le nanocapsule di PEG-AcPLA contenenti un premiR-FAM™ marcato (1,5 µg di composto, progettato per mimare i miRNA endogeni maturi), le nanocapsule di PEGAcPLA vuote (usando la stessa quantità utilizzata nel caso del nanosistema contenente la suddetta sonda), un controllo positivo costituito da calcio fosfato complessato con il premiR marcato con FAM™ (1,5 µg di composto). Come controllo sono state utilizzate delle cellule non trattate. Dopo 6 h d’incubazione, le cellule sono state lavate ed incubate per 24 e 48 h con terreno completo fresco. ;;Successivamente, il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato risospeso con PBS preraffreddato. Le cellule sono state trasferite in una provetta di polistirene da 5 ml a fondo rotondo per l’analisi citometrica di flusso. ;;Una simile procedura sperimentale è stata adottata utilizzando un plasmide codificante per la GFP (8 µg di plasmide/pozzetto). ;;L’intensità di fluorescenza delle cellule A549, HeLa e SKMM1 è stata registrata nel canale FL1 utilizzando un citofluorimetro FACSCanto II (Becton Dickinson, USA). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. ;;L’interazione delle nanocapsule di PEG-AcPLA marcate con la rodamina-DHPE è stata indagata anche sulle cellule A549 mediante studi di CLSM come descritto in precedenza (Paolino et al., 2012). ;;Attività citotossica in vitro ;;Il test del colorante bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difeniltetrazolio (MTT-test) è stato eseguito sulle suddette linee cellulari per valutare la citotossicità delle formulazioni colloidali in funzione sia della concentrazione di PLA o di mir-34a che del tempo di incubazione, come descritto precedentemente (Cosco et al., 2009). ;;Attività antitumorale in vivo del miR34a incapsulato nelle nanocapsule di PEG-AcPLA ;;Topi immunodeficienti NOD-SCID (Harlan Italia srl, San Pietro al Natisone, Udine, Italia, di 4-6 settimane) sono stati inoculati per via sottocutanea con le cellule SKMM1 (1×10<6>) sospese intampone fosfato salino come descritto precedentemente (Di Martino et al. Clin Cancer Res 2012). Quando il volume del tumore ha raggiunto circa 10 mm<3>, come misurato da un calibro (caliper), gli animali sono stati separati in quattro gruppi in modo casuale (n = 5 animali per gruppo) e trattati per via peritumorale con 150 µl delle diverse formulazioni (nanocapsule di PEG-AcPLA caricate con miR-34a, o Nano-miR34a, e nanocapsule di PEG-AcPLA caricate con controllo negativo, o Nano-NC). Il gruppo di topi controllo (n = 5) è stato trattato con 150 µl di soluzione salina, mentre i topi “vuoti” (blank) (n = 5) sono stati trattati con le nanocapsule di PEG-AcPLA vuote (Nano). Come indicatori dello stato di salute generale dei topi sono stati valutati il peso corporeo, il comportamento alimentare e l'attività motoria. La formula: V = 0,5 × ab<2>(a e b sono i diametri lunghi e corti del tumore, rispettivamente) è stata utilizzata per calcolare i volumi tumorali. Come indicatori dello stato di salute generale dei topi sono stati valutati il peso corporeo, il comportamento alimentare e l'attività motoria. ;;Analisi statistica ;Per l'analisi statistica dei vari esperimenti è stato utilizzato One-way ANOVA. Il t-test a posteriori di Bonferroni è stato effettuato per verificare il test ANOVA. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I valori sono riportati come media ± deviazione standard. ;;Esempio 1 ;;Incapsulazione del miR34a nelle nanocapsule di PEG-AcPLA ;;Le nanocapsule di PEG-AcPLA hanno mostrato dimensioni medie di circa 200 nm e un indice di polidispersione (PI) di ~0,1 mentre la carica di superficie è stata di circa -30 mV; l'incapsulazione del materiale genico, per esempio il miR34a, non ha modificato il diametro medio e l’indice di polidispersione dei nanosistemi preservando la forma sferica della struttura, ma ha portato ad una riduzione della carica superficiale fino a circa -50 mV, probabilmente come conseguenza dell'interazione del miR34a con le frazioni di PEG (Figura 1). ;;L'efficienza d’incapsulazione del miR34a è stata investigata mediante saggio su gel di agarosio. In particolare, la rottura delle nanocapsule di PEG-AcPLA ha evidenziato un’elevata concentrazione del composto mentre la quantità contenuta nel surnatante dopo centrifugazione era inosservabile (Figura 2). Più in dettaglio, l'analisi spettrofotometrica ha evidenziato un’elevata efficienza d’incapsulazione del miR34a quando la quantità di farmaco inizialmente aggiunto era di 300 µg (Figura 1C). Inoltre, un prerequisito di un sistema innovativo per la veicolazione genica dovrebbe essere la sua capacità di protezione contro la DNA/RNAsi, per questo motivo il miR-34a incapsulato all’interno delle nanocapsule di PEG-AcPLA è stato incubato con una ribonucleasi A per indagare l’attitudine dei nanosistemi di preservare il materiale genico rispetto alla sua forma libera. Dopo 1 h di incubazione, il miR-34a libero è stato totalmente degradato dall'enzima mentre esso è stato efficientemente protetto dalle capsule polimeriche, assicurando così una nondestabilizzazione della sua struttura (Figura 2) . ;;Esempio 2 ;;Trasfezione cellulare con le nanocapsule di PEG-AcPLA in diverse linee cellulari ;;D'altro lato un sistema di veicolazione genica dovrebbe assicurare un buon grado di trasfezione cellulare, permettendo così l’assorbimento (uptake)/internalizzazione cellulare del composto(i) intrappolato(i). Quindi, sono stati effettuati degli esperimenti di trasfezione su diverse linee cellulari utilizzando un miRNA-FAM™ come composto modello fluorescente, utile per mimare la struttura chimica del miR-34a; le cellule SKMM1 sono state scelte come modello di cellule di mieloma e rappresentano le cellule utilizzate negli esperimenti di citotossicità riguardanti l'azione antitumorale del miR-34a, mentre le cellule A549 e le cellule HeLa sono state utilizzate come modelli di linee cellulari in adesione frequentemente utilizzate negli esperimenti di trasfezione. ;;Come si può osservare nella Figura 3, dove lo spostamento (shift) della fluorescenza fornisce un'indicazione della presenza di un composto fluorescente (cioè il miRNA), le nanocapsule di PEG-AcPLA hanno consentito un buon grado di trasfezione in tutte le linee cellulari utilizzate; più dettagliatamente, è possibile osservare un significativo spostamento dell'intensità del picco dopo 24 ore che diventa più rilevante dopo 48 ore. Probabilmente ciò è legato alla massiva internalizzazione dei sistemi colloidali che hanno rilasciato il composto fluorescente, inducendo così un aumento della fluorescenza. Esperimenti simili sono stati eseguiti utilizzando un plasmide codificante per la GFP ottenendo un elevato grado di trasfezione come conseguenza dell’elevata espressione della proteina. ;;Inoltre, l'interazione cellulare delle nanocapsule di PEG-AcPLA è stata dimostrata marcando il guscio polimerico dei sistemi con una sonda idonea (rodamina-DHPE); infatti dopo 6 ore di incubazione, i nanodispositivi colloidali sono stati efficacemente internalizzati dalle cellule A549, conferendo così la caratteristica colorazione rossa della sonda alle cellule (Figura 4, le cellule marcate sono in grigio chiaro). Inoltre, l’assorbimento (uptake) delle particelle è stato rivelato dall'analisi Z-stack che ha mostrato la presenza dei colloidi in tutto il compartimento citosolico cellulare (Figura 4, A', B', C'). Questo andamento ed i precedenti risultati del FACS dimostrano chiaramente che il miR-34a incapsulato nei colloidi polimerici, dopo intrappolamento fisico, viene rapidamente internalizzato all'interno delle cellule e rilasciato, esercitando così efficacemente la sua azione farmacologica. ;;Esempio 3 ;;Attività antitumorale in vitro e in vivo delle nanocapsule di PEG AcPLA caricate con miR-34a ;;L'attività antitumorale delle nanocapsule di PEG-AcPLA caricate con miR34a è stata studiata sulle due linee cellulari di mieloma (RPMI8226 e SKMM1). Prima, è stata investigata la concentrazione massima tollerata dei nanosistemi in funzione sia della concentrazione di polimero che del tempo di incubazione. Com’è possibile osservare nella Figura 5, solo ad una concentrazione di PLA superiore a 30 µg/ml si è evidenziata una significativa tossicità delle cellule, ma considerando che questa concentrazione non è stata mai raggiunta durante i seguenti esperimenti, la concentrazione di capsule polimeriche usate è stata considerata sicura. ;;L'effetto antitumorale del miR-34a incapsulato è stato appena percettibile su entrambe le linee cellulari dopo 24 ore di incubazione ad una concentrazione di miRNA ≥50 nM. Dopo 48 e 72 ore di incubazione, questa tendenza è stata confermata, anche se a concentrazioni più basse del composto è stata visibile una riduzione della vitalità cellulare. In particolare, ad una concentrazione di miR-34a di 20 nM, è stato possibile apprezzare una riduzione della vitalità cellulare di ~ il 20% dopo 72 ore di incubazione, mentre la concentrazione più alta di farmaco ha indotto una sopravvivenza cellulare solo di ~ il 55 e ~ il 40 % rispettivamente nelle cellule SKMM1 e RPMI-8226. ;L’attività antitumorale delle nanocapsule di PEG-AcPLA è stata investigata su topi SCID con xenograft di MM. Le cellule SKMM1 sono state iniettate nei topi per via sottocutanea (sc); quando i tumori sono diventati palpabili (circa 30 mm<3>), i topi sono stati randomizzati e trattati per via intratumorale con 20 µg di nanocapsule PEG-AcPLA caricate con miR-34a (Nano miR-34a) o con il controllo/i (Nano-NC, Nano vuote, o tampone fosfato salino, PBS). Gli xenotrapianti (xenograft) di tumori sottocutanei palpabili sono stati ripetutamente trattati ogni tre giorni. I tumori sono stati misurati con un calibro (caliper) elettronico ogni 3 giorni. I valori di P sono stati calcolati per le Nano-miR-34a contro le Nano-NC (test t di Student, a due code). (*) indica i valori significativi di P (P <0,01). Dopo 4 iniezioni (a 3 giorni di distanza) del miR-34a formulato nelle nanocapsule PEG-AcPLA, è stata rilevata una inibizione altamente significativa (P <0,01) della crescita del tumore nei topi trattati con il miR-34a (Figura 6). Quindi concludiamo che le nanocapsule di miR-34a-PEG-AcPLA somministrate per via intratumorale sono altamente efficaci contro xenotrapianti (xenograft) di MM. Figure 6. Effects of PEG-AcPLA nanocapsules with miR-34a (Nano miR-34a) in xenografts (xenograft) of SKMM1 through peritumor injections. Palpable subcutaneous tumor xenografts were treated repeatedly every three days, as indicated by the arrows, with 20 µg of Nano miR-34a or Nano-NC (NC). As controls, 2 separate groups of animals with the tumor were treated with the vehicle alone (the PEG-AcPLA nanocapsule, Nano) or with phosphate buffered saline (PBS). Tumors were measured with an electronic caliper every 3 days, the mean tumor volume of each group and standard deviation are shown. P-values were calculated for Nano-miR34a versus Nano-NC (Student's, two-tailed t-test). (*) Indicates the significant P values (P <0.01). ;; Detailed description of the invention ;; The PEG-AcPLA nanocapsule used in the present invention is characterized by an aqueous core (Ac), a poly-L-lactic acid (PLA) shell and a PEG coating. ;; A schematic representation of the structure of a PEG-AcPLA nanocapsule is shown below: ;; Shell of; poly-L-lactide ;; Scheme 1 ;; The PEG of the aforementioned PEG-AcPLA nanocapsule is preferably a lipid or phospholipid derivative of the PEG. Non-limiting examples of suitable PEG derivatives are as follows: 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine- [methoxy (polyethylene glycol)] (DSPE-mPEG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycer -3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol)] (DMPE-mPEG), preferably in the form of an ammonium salt, a ceramide-PEG, a cholesterol-PEG (Chol-PEG). All of the aforementioned PEG-lipids can also be functionalized, for example with succinyl carboxylic acid, maleimide, (pyridildithium) propionate (PDP), amine, biotin, cyanide, folic acid. In any case, the PEG has a molecular weight between 350 and 5000. Preferably it has a molecular weight of 350, 550, 750, 1000, 2000, 3000 or 5000. ;; In a preferred embodiment, the PEG of the nanocapsule is the N- (carbonyl-methoxy polyethylene glycol-2000) -1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DSPE-mPEG2000). An exemplary method of preparation of the aforesaid nanocapsule is the following. Reference can also be made to Paolino et al. 2013. ; PEG-coated aqueous core PLA (AcPLA) nanocapsules can be obtained by adding an aqueous solution (primary aqueous solution) to a mixture of polylactic acid (PLA), sorbitan esters (Span), chloroform, dichloromethane and a PEG. The mixture is then sonicated. The suspension obtained is added to an aqueous solution containing sodium deoxycholate hydrate (SD) and glycerol and homogenized (secondary aqueous solution). The formulation is mixed until the solvents evaporate and the formation of PEG-AcPLA nanocapsules, which are subsequently washed with distilled water by, for example, ultracentrifugation. ;; PEG-AcPLA nanocapsules containing genetic material are prepared by adding the aforementioned genetic material to the primary aqueous phase. ;; The polyethylene glycol-polylactic acid nanocapsule with aqueous core that includes genetic material trapped inside the nanocapsule is an object of the present invention. ;; Said genetic material is one or more nucleic acids. Said nucleic acid can be a DNA or RNA molecule, or a mixture thereof, preferably it is a miRNA. ;; Nucleic acid can be linear or circular in shape. For example, it can be a plasmid. Furthermore, said nucleic acid can be single-stranded or double-stranded. In a preferred embodiment, said nucleic acid trapped inside the PEG-AcPLA nanocapsule is a miRNA. In a more preferred embodiment, it is miR-34a. ;; miR-34a is a known miRNA. The PEG-AcPLA nanocapsule used in the present invention may also comprise further molecules attached to its outer surface. Said molecules can be, for example, antibodies or other molecules that specifically recognize a target cell. Said molecule can be conjugated to the external surface of the nanocapsule using methods known in the field. In particular, said molecules can be conjugated to the PEG of the nanocapsule. ;; The PEG-AcPLA nanocapsules of the invention provide the advantage of an absence of positive charges on the surface of the nanocapsule, which allows the maintenance of biopharmaceutical properties, a good degree of cell transfection and no toxicity for the target cells. At the same time the nanocapsules protect the genetic material trapped inside them from the activity of the DNA / RNases, which would degrade the free genetic material. ;; In particular, the advantages of using PEG-AcPLA nanocapsules as gene delivery systems have been demonstrated by the encapsulation of miR-34a, a downregulated tumor suppressor miRNA in many types of tumors. MiR-34a has been used as a model compound due to its recently demonstrated antitumor activity against multiple myeloma (Di Martino et al., 2012). ; The use of the PEG-AcPLA nanocapsule to convey genetic material also ensures a good degree of cell transfection, thus allowing cellular uptake / internalization of the trapped compound (s). Cell transfection with the nanocapsules of the invention can be obtained by methods known in the field. All cell types can be transfected with the nanocapsules of the invention. Preferably, the transfected cell is a myeloma cell. ;; PEG-AcPLA nanocapsules are therefore a useful and effective tool for gene delivery. The nanocapsules of the present invention can also be conveniently used to transfect cells with genetic material in laboratory work, such as in vitro transfection. The use of PEG-AcPLA nanocapsules for the in vitro delivery of genetic material is therefore an object of the present invention. ;; Said genetic material can be DNA or RNA. Preferably, it is a miRNA. It can be a single miRNA or a mixture of miRNAs. In a more preferred embodiment it is miR-34a. ;; Gene delivery is particularly useful for gene therapy, where a nucleic acid is used as a pharmaceutical agent to treat a disease. Therefore, the use of the PEG-AcPLA nanocapsule in gene therapy, in particular for the in vivo delivery of genetic material in gene therapy, is also an object of the invention. ;; In gene therapy, a nucleic acid can be used to supplement or modify genes within an individual's cells as a therapy for treating a disease. The most common form of gene therapy involves the use of DNA that codes for a functional therapeutic gene to replace a mutated gene. Other forms involve the direct correction of a mutation or the use of DNA that encodes a therapeutic drug protein (instead of a natural human gene) to provide treatment. For example, in gene therapy a nucleic acid encoding a therapeutic protein can be encapsulated in a "vector", which is used to deliver the nucleic acid into cells. Once inside, the nucleic acid is expressed by cellular metabolism, resulting in the production of a therapeutic protein, which in turn treats the patient's disease. ;; In the present invention, a PEG-AcPLA nanocapsule is provided as a vector for the delivery of the necessary nucleic acid inside the cells. ;; The PEG-AcPLA nanocapsule containing the genetic material can be administered to a subject suffering from a disease treatable with gene therapy using conventional methods. ; Examples of diseases treatable by gene therapy are X-linked severe combined immunodeficiency (X-linked SCID), adenosine-deaminase enzyme deficiency (ADA-SCID), adrenoleukodystrophy, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphocytic leukemia (ALL), multiple myeloma and Parkinson's disease. ;; The PEG-AcPLA nanocapsule can also be used for the treatment of any disease that can be treated by administering genetic material. In particular, the use of the PEG-AcPLA nanocapsule for the delivery of genetic material for the treatment of cancer is a preferred object of the present invention. Preferably, said cancer is multiple myeloma. More preferably, said PEG-AcPLA nanocapsule is used for the delivery of miR-34a for the treatment of multiple myeloma. Conveniently, the nanocapsules are in the form of a preparation for parenteral administration, preferably for intravenous administration. The person skilled in the art will decide the actual time of administration, depending on the type of disease, the patient's condition, the degree of disease severity, the patient's response and any other clinical parameters within the general knowledge of this matter. ;; Injection is a preferred route of administration. A pharmaceutical composition comprising the PEG-AcPLA nanocapsule containing the genetic material is also an object of the present invention. Preferably, said composition is for use in gene therapy or to treat diseases which can be treated by said genetic material. The composition may contain, together with the PEG-AcPLA nanocapsule, at least one pharmaceutically acceptable excipient and / or vehicle. These can be particularly useful formulation aids such as, for example, solubilizing agents, dispersing agents, suspending agents, and emulsifiers. The following examples will further illustrate the invention without limiting it. ;; EXAMPLES ;; Materials and Methods ;; Polylactic acid (PLA, M.V. 85,000-160,000), sodium deoxycholate hydrate (SD), phosphate buffer tablets, 3- [4,5-dimethylthiazol-2 salts -il] -3,5-diphenyltetrazolium bromide (used for the MTT-test), amphotericin B solution (250 ug / ml) and dimethyl sulfoxide were purchased from Sigma Aldrich (Milan, Italy). N- (carbonyl-methoxy polyethylene glycol-2000) -1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DSPE-mPEG2000) was purchased from Genzyme (Suffolk, UK). ; Lissamine rhodamine B 1,2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt (rhodamine DHPE) was supplied by Invitrogen (Eugene, Oregon, USA). ;; The sorbitan ester (Span) was obtained by ACEF Spa (Piacenza, Italy). pCMV-GFP (3487; bp) was acquired by Plasmid Factory GmbH & Co. KG (Bielefeld, Germany). ;; The human multiple myeloma (MM) cell lines were provided by the AIRC 5X 1000 research network, while the A549 and HeLa cell lines were purchased at the Zooprophylactic Institute of Modena and Reggio Emilia. ;; Pre-miR34a and FAM-pre-miR scrambled control, RNAse, RPMI-1640 culture medium, Dulbecco's modified essential medium (D-MEM) with glutamine, fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA solution (1 ×) and penicillin-streptomycin solution (100 IU / mL) were purchased from Life Technologies, Italy. ;; All other materials and solvents used in this work were analytical grade (Carlo Erba, Milan, Italy). ;; Preparation of the aqueous core nanocapsules ;; The aqueous core PLA nanocapsules (AcPLA) have been made using the emulsion technique with some modifications. Briefly, 1 ml of an aqueous solution was added to a mixture of PLA (6 mg), Span (1% w / v), chloroform and dichloromethane (2 ml, 3: 1 v / v) and sonicated for 2 minutes. using a Sonopuls GM70 (Bandelin) with the instrument at 30% of its maximum power on ice. The suspension obtained was added to an aqueous solution containing SD (1% w / v) and glycerol (1 g) and homogenized at 24000 rpm for 1 min (Ultraturrax T25, <IKA®> Werke). The formulation was stirred for 3 hours at room temperature until the evaporation of the solvents and the formation of AcPLA nanocapsules, which were subsequently washed three times with distilled water by ultracentrifugation (Optima TL Ultracentrifuge, Beckman). ;; To prepare the PLA nanocapsules coated with the PEG (PEG-AcPLA), the DSPE-mPEG2000 (0.05 w / v) was dispersed in the polymeric organic solution, thus allowing the insertion of this substance into the surface of the colloids thanks to its phospholipid fraction. ;; The PEG-AcPLA nanocapsules containing the genetic material were prepared by adding the latter in the primary aqueous phase. ;; The fluorescently labeled nanoparticles were prepared by co-dissolving rhodamine-DHPE (0.1 mol%) with the polymer in the organic phase during the preparation procedure (Paolino et al., 2013). ;; Physico-chemical characterization of AcPLA nanocapsules; The average size, dimensional distribution and surface charge of the different formulations were analyzed by photocorrelation spectroscopy (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Spring Lane South, Worchester Shine, England) as previously reported (Paolino et al., 2013). ;; Interaction of miR34a with nanocapsules and protection assay ;; Binding of miR34a with PEG-AcPLA nanocapsules was determined by agarose gel electrophoresis. Briefly, the nanosystems were centrifuged and the pellet was destroyed with an aqueous solution of SDS (0.4% w / v) to investigate the presence of miRNA. 10 µl of each sample were mixed with 2 µl of loading dye. (loading dye) 6 × obtaining a final volume of 12 microliters. The complexes were loaded onto a 1 agarose gel and with Tris-acetate-EDTA (TAE) as a running buffer, containing 0.5 µg / µl of ethidium bromide, at 100 V for 30 minutes. The miR34a bands were visualized by UV light irradiation with a UV-20 transilluminator (Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San Francisco, CA, USA). Naked miR34a and blank nanoparticles were used as controls. ;; The exact amount of miR34a contained in the PEG-AcPLA nanocapsules was measured at 260 nm using a NanoDrop <®> ND1000 spectrophotometer. ;; In order to investigate the ability of the polymer formulation to protect miR34a, the same were conducted experiments after incubating the samples with an RNase A for 1 hour. ;; Cell Cultures ;; RPMI8226 and SKMM1 cells were suspended in flasks treated for tissue culture (75 cm <2>) in RPMI 1640 medium, while A549 cells and HeLa cells were cultured in plates of plastic (100 mm x 20 mm). All media were supplemented with 10% FBS (v / v), 100 µg / mL streptomycin, 100 IU / mL penicillin, 250 µg / mL amphotericin B and incubated at 37 ° C in a humidified environment at 5 % CO2 (Form <®> Series II Water-Jacketed CO2Incubator, Thermo Scientific, Germany). Fresh soil was replaced every 48 hours. ;; In vitro transfection and cell interaction analysis using Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) ;; Cells were cultured in 6-well plates (4 × 10 <5> cells / well for SKMM1 and 5 cells × 10 <4> cells / well for A549 and HeLa cells) for 24 h prior to experiments to achieve 75% confluence. Thereafter, the medium was replaced for 6 hours with an antibiotic-free medium containing the different formulations, i.e. PEG-AcPLA nanocapsules containing a labeled premiR-FAM ™ (1.5 µg of compound, designed to mimic mature endogenous miRNAs ), the empty PEGAcPLA nanocapsules (using the same quantity used in the case of the nanosystem containing the aforementioned probe), a positive control consisting of calcium phosphate complexed with the premiR labeled with FAM ™ (1.5 µg of compound). Untreated cells were used as a control. After 6 h of incubation, the cells were washed and incubated for 24 and 48 h with complete fresh medium. ;; Subsequently, the supernatant was removed and the pellet was resuspended with precooled PBS. The cells were transferred to a 5 ml round bottom polystyrene tube for flow cytometric analysis. ;; A similar experimental procedure was adopted using a plasmid coding for GFP (8 µg of plasmid / well). ;; The fluorescence intensity of A549, HeLa and SKMM1 cells was recorded in the FL1 channel using a FACSCanto II flow cytometer (Becton Dickinson, USA). The experiments were performed in triplicate. ;; The interaction of PEG-AcPLA nanocapsules labeled with rhodamine-DHPE was also investigated on A549 cells by means of CLSM studies as previously described (Paolino et al., 2012). ;; Cytotoxic activity in vitro; colloidal formulations as a function of both the PLA or mir-34a concentration and the incubation time, as previously described (Cosco et al., 2009). ;; Antitumor activity in vivo of miR34a encapsulated in PEG-AcPLA nanocapsules ;; NOD-SCID immunodeficient mice (Harlan Italia srl, San Pietro al Natisone, Udine, Italy, 4-6 weeks) were inoculated subcutaneously with SKMM1 cells (1 × 10 <6>) suspended in saline phosphate buffer as previously described (Di Martino et al. Clin Cancer Res 2012). When the tumor volume reached approximately 10 mm <3>, as measured by a caliper, the animals were randomly separated into four groups (n = 5 animals per group) and treated peritumorally with 150 µl of the different formulations (PEG-AcPLA nanocapsules loaded with miR-34a, or Nano-miR34a, and PEG-AcPLA nanocapsules loaded with negative control, or Nano-NC). The group of control mice (n = 5) was treated with 150 µl of saline solution, while the "empty" mice (n = 5) were treated with the empty PEG-AcPLA nanocapsules (Nano). Body weight, eating behavior and motor activity were assessed as indicators of the overall health of the mice. The formula: V = 0.5 × ab <2> (a and b are the long and short diameters of the tumor, respectively) was used to calculate the tumor volumes. Body weight, eating behavior and motor activity were assessed as indicators of the overall health of the mice. ;; Statistical analysis; One-way ANOVA was used for the statistical analysis of the various experiments. Bonferroni's post-hoc t-test was performed to verify the ANOVA test. A p value of 0.05 was considered statistically significant. Values are reported as mean ± standard deviation. ;; Example 1 ;; Encapsulation of miR34a in PEG-AcPLA nanocapsules ;; PEG-AcPLA nanocapsules showed average dimensions of about 200 nm and a polydispersion index (PI) of ~ 0.1 while the surface charge is was about -30 mV; encapsulation of the gene material, for example miR34a, did not modify the mean diameter and the polydispersion index of the nanosystems while preserving the spherical shape of the structure, but it led to a reduction of the surface charge up to about -50 mV, probably as a consequence of the interaction of miR34a with the PEG fractions (Figure 1). ;; The encapsulation efficiency of miR34a was investigated by an agarose gel assay. In particular, the breaking of the PEG-AcPLA nanocapsules showed a high concentration of the compound while the amount contained in the supernatant after centrifugation was undetectable (Figure 2). More in detail, the spectrophotometric analysis showed a high encapsulation efficiency of miR34a when the amount of drug initially added was 300 µg (Figure 1C). Furthermore, a prerequisite of an innovative system for gene delivery should be its ability to protect against DNA / RNase, for this reason the miR-34a encapsulated inside the PEG-AcPLA nanocapsules was incubated with a ribonuclease A to investigate the attitude of nanosystems to preserve gene material with respect to its free form. After 1 h of incubation, the free miR-34a was totally degraded by the enzyme while it was efficiently protected by the polymer capsules, thus ensuring a nondestabilization of its structure (Figure 2). ;; Example 2 ;; Cell transfection with PEG-AcPLA nanocapsules in different cell lines ;; On the other hand, a gene delivery system should ensure a good degree of cell transfection, thus allowing cell uptake / internalization of the trapped compound (s). Then, transfection experiments were performed on different cell lines using miRNA-FAM ™ as a fluorescent model compound, useful for mimicking the chemical structure of miR-34a; SKMM1 cells were chosen as a model of myeloma cells and represent the cells used in cytotoxicity experiments concerning the antitumor action of miR-34a, while A549 cells and HeLa cells were used as models of frequently adhering cell lines used in transfection experiments. ;; As can be seen in Figure 3, where the fluorescence shift provides an indication of the presence of a fluorescent compound (i.e. miRNA), the PEG-AcPLA nanocapsules have allowed a good degree of transfection in all cell lines used; in more detail, it is possible to observe a significant shift in the intensity of the peak after 24 hours which becomes more relevant after 48 hours. This is probably linked to the massive internalization of the colloidal systems that released the fluorescent compound, thus inducing an increase in fluorescence. Similar experiments were performed using a plasmid encoding for GFP obtaining a high degree of transfection as a result of the high expression of the protein. Furthermore, the cellular interaction of the PEG-AcPLA nanocapsules has been demonstrated by marking the polymeric shell of the systems with a suitable probe (rhodamine-DHPE); in fact, after 6 hours of incubation, the colloidal nanodevices were effectively internalized by the A549 cells, thus conferring the characteristic red coloring of the probe to the cells (Figure 4, the marked cells are in light gray). In addition, the uptake of the particles was revealed by the Z-stack analysis which showed the presence of colloids throughout the cellular cytosolic compartment (Figure 4, A ', B', C '). This trend and the previous FACS results clearly demonstrate that the miR-34a encapsulated in the polymeric colloids, after physical trapping, is rapidly internalized inside the cells and released, thus effectively exerting its pharmacological action. ;; Example 3 ;; Antitumor activity in vitro and in vivo of the PEG AcPLA nanocapsules loaded with miR-34a ;; The antitumor activity of the PEG-AcPLA nanocapsules loaded with miR34a was studied on the two myeloma cell lines (RPMI8226 and SKMM1). First, the maximum tolerated concentration of the nanosystems was investigated as a function of both the polymer concentration and the incubation time. As can be seen in Figure 5, only a PLA concentration higher than 30 µg / ml was found to have significant cell toxicity, but considering that this concentration was never reached during the following experiments, the concentration of polymeric capsules used has been considered safe. ;; The antitumor effect of encapsulated miR-34a was barely noticeable on both cell lines after 24 hours of incubation at a miRNA concentration ≥50 nM. After 48 and 72 hours of incubation, this trend was confirmed, although a reduction in cell viability was visible at lower concentrations of the compound. In particular, at a concentration of miR-34a of 20 nM, it was possible to appreciate a reduction in cell viability of ~ 20% after 72 hours of incubation, while the higher concentration of drug induced a cell survival of only ~ il 55 and ~ 40% in SKMM1 and RPMI-8226 cells, respectively. ; The antitumor activity of PEG-AcPLA nanocapsules was investigated on SCID mice with MM xenograft. SKMM1 cells were injected into mice subcutaneously (sc); when tumors became palpable (approximately 30 mm <3>), mice were randomized and treated intratumorally with 20 µg of PEG-AcPLA nanocapsules loaded with miR-34a (Nano miR-34a) or with the control (s) (Nano-NC, Nano Blank, or Phosphate Buffered Saline, PBS). Xenografts of palpable subcutaneous tumors were treated repeatedly every three days. Tumors were measured with an electronic caliper every 3 days. P-values were calculated for Nano-miR-34a versus Nano-NC (Student's two-tailed t-test). (*) indicates the significant values of P (P <0.01). After 4 injections (3 days apart) of miR-34a formulated in PEG-AcPLA nanocapsules, highly significant (P <0.01) inhibition of tumor growth was detected in mice treated with miR-34a (Figure 6 We therefore conclude that intratumorally administered miR-34a-PEG-AcPLA nanocapsules are highly effective against MM xenografts.
Riferimenti References
Aliabadi HM, Landry B, Sun C, Tang T, Uludağ H. Supramolecular assemblies in functional siRNA delivery: where do we stand? Biomaterials.2012;33(8):2546-69. Aliabadi HM, Landry B, Sun C, Tang T, Uludağ H. Supramolecular assemblies in functional siRNA delivery: where do we stand? Biomaterials. 2012; 33 (8): 2546-69.
Cosco D, Bulotta A, Ventura M, Celia C, Calimeri T, Perri G, Paolino D, Costa N, Neri P, Tagliaferri P, Tassone P, Fresta M. In vivo activity of gemcitabine-loaded PEGylated small unilamellar liposomes against pancreatic cancer. Cancer Chemother Pharmacol.2009;64(5):1009-20. Cosco D, Bulotta A, Ventura M, Celia C, Calimeri T, Perri G, Paolino D, Costa N, Neri P, Tagliaferri P, Tassone P, Fresta M. In vivo activity of gemcitabine-loaded PEGylated small unilamellar liposomes against pancreatic cancer . Cancer Chemother Pharmacol. 2009; 64 (5): 1009-20.
David S, Pitard B, Benoît JP, Passirani C. Non-viral nanosystems for systemic siRNA delivery. Pharmacol Res.2010;62(2):100-14. David S, Pitard B, Benoît JP, Passirani C. Non-viral nanosystems for systemic siRNA delivery. Pharmacol Res. 2010; 62 (2): 100-14.
Di Martino MT, Leone E, Amodio N, Foresta U, Lionetti M, Pitari MR, Cantafio ME, Gullà A, Conforti F, Morelli E, Tomaino V, Rossi M, Negrini M, Ferrarini M, Caraglia M, Shammas MA, Munshi NC, Anderson KC, Neri A, Tagliaferri P, Tassone P. Synthetic miR-34a Mimics as a Novel Therapeutic Agent for Multiple Myeloma: In Vitro and In Vivo Evidence. Clin Cancer Res. Di Martino MT, Leone E, Amodio N, Foresta U, Lionetti M, Pitari MR, Cantafio ME, Gullà A, Conforti F, Morelli E, Tomaino V, Rossi M, Negrini M, Ferrarini M, Caraglia M, Shammas MA, Munshi NC, Anderson KC, Neri A, Tagliaferri P, Tassone P. Synthetic miR-34a Mimics as a Novel Therapeutic Agent for Multiple Myeloma: In Vitro and In Vivo Evidence. Clin Cancer Res.
2012;18(22):6260-6270. 2012; 18 (22): 6260-6270.
Karmali PP, Chaudhuri A. Cationic liposomes as non-viral carriers of gene medicines: resolved issues, open questions, and future promises. Med Res Rev.2007;27(5):696-722. Karmali PP, Chaudhuri A. Cationic liposomes as non-viral carriers of gene medicines: resolved issues, open questions, and future promises. Med Res Rev. 2007; 27 (5): 696-722.
Köping-Höggård M, Vårum KM, Issa M, Danielsen S, Christensen BE, Stokke BT, Artursson P. Improved chitosan-mediated gene delivery based on easily dissociated chitosan polyplexes of highly defined chitosan oligomers. Gene Ther.2004;11(19):1441-52. Köping-Höggård M, Vårum KM, Issa M, Danielsen S, Christensen BE, Stokke BT, Artursson P. Improved chitosan-mediated gene delivery based on easily dissociated chitosan polyplexes of highly defined chitosan oligomers. Gene Ther. 2004; 11 (19): 1441-52.
Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release.2006;114(1):100-9. Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release. 2006; 114 (1): 100-9.
Nimesh S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent Pat DNA Gene Seq.2012;6(2):91-7. Nimesh S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent Pat DNA Gene Seq. 2012; 6 (2): 91-7.
Paolino D, Cosco D, Celano M, Moretti S, Puxeddu E, Russo D, Fresta M. Gemcitabine loaded biocompatible nanocapsules for the effective treatment of human cancer. Nanomedicine (Lond). Paolino D, Cosco D, Celano M, Moretti S, Puxeddu E, Russo D, Fresta M. Gemcitabine loaded biocompatible nanocapsules for the effective treatment of human cancer. Nanomedicine (Lond).
2013, 8(2):193-201. 2013, 8 (2): 193-201.
Paolino D, Cosco D, Cilurzo F, Trapasso E, Morittu VM, Celia C, Fresta M. Improved in vitro and in vivo collagen biosynthesis by asiaticoside-loaded ultradeformable vesicles. J Control Release. Paolino D, Cosco D, Cilurzo F, Trapasso E, Morittu VM, Celia C, Fresta M. Improved in vitro and in vivo collagen biosynthesis by asiaticoside-loaded ultradeformable vesicles. J Control Release.
2012;162(1):143-51. 2012; 162 (1): 143-51.
Reischl D, Zimmer A. Drug delivery of siRNA therapeutics: potentials and limits of nanosystems. Nanomedicine.2009;5(1):8-20. Reischl D, Zimmer A. Drug delivery of siRNA therapeutics: potentials and limits of nanosystems. Nanomedicine. 2009; 5 (1): 8-20.
Scholz C, Wagner E. Therapeutic plasmid DNA versus siRNA delivery: common and different tasks for synthetic carriers. J Control Release.2012;161(2):554-65. Scholz C, Wagner E. Therapeutic plasmid DNA versus siRNA delivery: common and different tasks for synthetic carriers. J Control Release. 2012; 161 (2): 554-65.
Suzuki T, Shin BC, Fujikura K, Matsuzaki T, Takata K. Direct gene transfer into rat liver cells by in vivo electroporation. FEBS Lett.1998;425(3):436-40. Suzuki T, Shin BC, Fujikura K, Matsuzaki T, Takata K. Direct gene transfer into rat liver cells by in vivo electroporation. FEBS Lett. 1998; 425 (3): 436-40.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000635A ITRM20130635A1 (en) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | PLA-NANOCAPSULE PEGILATE WITH AQUEOUS CORE AS AN EFFECTIVE HALF OF GENE VEHICLE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000635A ITRM20130635A1 (en) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | PLA-NANOCAPSULE PEGILATE WITH AQUEOUS CORE AS AN EFFECTIVE HALF OF GENE VEHICLE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITRM20130635A1 true ITRM20130635A1 (en) | 2015-05-19 |
Family
ID=49958606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000635A ITRM20130635A1 (en) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | PLA-NANOCAPSULE PEGILATE WITH AQUEOUS CORE AS AN EFFECTIVE HALF OF GENE VEHICLE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITRM20130635A1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012031205A2 (en) * | 2010-09-03 | 2012-03-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lipid-polymer hybrid particles |
-
2013
- 2013-11-18 IT IT000635A patent/ITRM20130635A1/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012031205A2 (en) * | 2010-09-03 | 2012-03-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lipid-polymer hybrid particles |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BOUCLIER CÉLINE ET AL: "Physicochemical characteristics and preliminary in vivo biological evaluation of nanocapsules loaded with siRNA targeting estrogen receptor alpha.", BIOMACROMOLECULES OCT 2008, vol. 9, no. 10, October 2008 (2008-10-01), pages 2881 - 2890, XP055130421, ISSN: 1526-4602 * |
| P. TAGLIAFERRI ET AL: "Promises and Challenges of MicroRNA-based Treatment of Multiple Myeloma", CURRENT CANCER DRUG TARGETS, vol. 12, no. 7, 1 August 2012 (2012-08-01), pages 838 - 846, XP055129665, ISSN: 1568-0096, DOI: 10.2174/156800912802429355 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lee et al. | MicroRNA delivery through nanoparticles | |
| Wan et al. | Material solutions for delivery of CRISPR/Cas-based genome editing tools: Current status and future outlook | |
| Kaczmarek et al. | Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality | |
| Zhang et al. | Recent advances in exosome-mediated nucleic acid delivery for cancer therapy | |
| Xi et al. | Drug loading techniques for exosome-based drug delivery systems | |
| Liu et al. | Responsive nanocarriers as an emerging platform for cascaded delivery of nucleic acids to cancer | |
| ES2808750T3 (en) | Oligonucleotide compounds targeting huntingtin mRNA | |
| Boca et al. | Nanoscale delivery systems for microRNAs in cancer therapy | |
| Charbgoo et al. | MUC1 aptamer-targeted DNA micelles for dual tumor therapy using doxorubicin and KLA peptide | |
| Ozpolat et al. | Liposomal siRNA nanocarriers for cancer therapy | |
| Kim et al. | Highly efficient gene silencing and bioimaging based on fluorescent carbon dots in vitro and in vivo | |
| Yin et al. | Non-viral vectors for gene-based therapy | |
| Yu et al. | Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery | |
| Tyagi et al. | Exploiting nanotechnology for the development of microRNA-based cancer therapeutics | |
| Hom et al. | Mesoporous silica nanoparticles facilitate delivery of siRNA to shutdown signaling pathways in mammalian cells | |
| Liu et al. | Enhanced gene transfection efficiency in CD13-positive vascular endothelial cells with targeted poly (lactic acid)–poly (ethylene glycol) nanoparticles through caveolae-mediated endocytosis | |
| Tahara et al. | Chitosan-modified poly (D, L-lactide-co-glycolide) nanospheres for improving siRNA delivery and gene-silencing effects | |
| Ma et al. | Annealing novel nucleobase-lipids with oligonucleotides or plasmid DNA based on H-bonding or π-π interaction: Assemblies and transfections | |
| Lu et al. | Multi-functional self-assembled nanoparticles for pVEGF-shRNA loading and anti-tumor targeted therapy | |
| Huang et al. | Nonviral delivery systems for antisense oligonucleotide therapeutics | |
| Liu et al. | Current status of nonviral vectors for gene therapy in China | |
| Hu et al. | Nanobiomaterial vectors for improving gene editing and gene therapy | |
| Manikkath et al. | Nanoparticulate strategies for the delivery of miRNA mimics and inhibitors in anticancer therapy and its potential utility in oral submucous fibrosis | |
| Liu et al. | Development of delivery strategies for CRISPR‐Cas9 genome editing | |
| Yi et al. | A LIGHTFUL nanomedicine overcomes EGFR-mediated drug resistance for enhanced tyrosine-kinase-inhibitor-based hepatocellular carcinoma therapy |