ITRM20130522A1 - Trattamento e prevenzione per la sindrome di rett. - Google Patents

Description

PREVENZIONE E TRATTAMENTO DELLA SINDROME DI RETT

DESCRIZIONE

Campo dell’invenzione

La presente invenzione concerne l’uso di agonisti selettivi per i recettori 5-HT7 nel trattamento e la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett. In modo più specifico, l’invenzione concerne l’uso di agonisti del sottotipo recettoriale 5-HT7 per la stimolazione centrale del sistema neurochimico 5-HT7 nel trattamento e prevenzione dei severi deficit delle capacità motorie, emozionali e cognitivi che caratterizzano la sindrome di Rett.

Background dell’invenzione

La sindrome di Rett (RTT) è un raro disturbo del neurosviluppo che colpisce essenzialmente soggetti di sesso femminile con un’incidenza di 1 su 10.000 nate. Classificata nel DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition, 1994) nel gruppo dei disordini pervasivi dello sviluppo insieme all’autismo, RTT determina severi ritardi mentali e fisici. Una caratteristica peculiare della RTT è uno sviluppo alla nascita e perinatale apparentemente normale fino a 6-18 mesi di età, seguito da un periodo di regressione caratterizzato da una marcata perdita delle capacità acquisite nell’ambito dello sviluppo sociale, nella percezione dell’ambiente circostante, nella comunicazione, nell’uso delle mani e della coordinazione motoria generale, e da un rallentamento della crescita della testa che di solito conduce a microcefalia.

Un’ampia varietà di sintomi peculiari e di ritardi fisici caratterizza la sindrome di Rett, inclusi i movimenti stereotipici delle mani, irregolarità nel respiro, gonfiore, anormalità nell’EEG, convulsioni potenzialmente pericolose per la vita, irregolarità del sonno, disprassia nell’andatura, deformazioni della schiena, anomalie nell’alimentazione così come comportamenti di tipo autistico e sindromi ansiose (per una rassegna dettagliata dei sintomi, vedere Hagberg, 2002).

Un’origine monogenica, proposta per la prima volta nel 1999, caratterizza più del 95% dei casi classici di RTT: infatti, questi pazienti presentano una mutazione nel gene MeCP2, localizzato sul cromosoma Xq28, che codifica per la methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2) (Amir et al.

1999; Chahrour and Zoghbi 2007). La proteina MeCP2 lega i CpG metilati (regioni del DNA in cui il nucleotide citosina si trova vicino al nucleotide guanina, ad es. “-Cfosfato-G-“), che giocano un ruolo multifunzionale come regolatori della trascrizione (Guy et al., 2011). Sono state generate diverse linee di topi mutati che non esprimono la proteina MeCP2 o esprimono una forma troncata e che presentano una serie di caratteristiche cliniche della RTT (Ricceri et al., 2008; Ricceri et al.,2012). E’ importante sottolineare che questi modelli murini hanno permesso di dimostrare che l’inattivazione di MeCP2 a livello neuronale è sufficiente per causare sintomi riconducibili a RTT (Guy et al., 2001).

Nonostante i sintomi neurologici gravi, i cervelli dei modelli murini di RTT non mostrano alterazioni anatomiche o segni di neurodegenerazione, atrofia, gliosi, demielinizzazione o difetti nella migrazione neuronale. In accordo, l’analisi post-mortem dei cervelli di pazienti RTT ha rivelato che ridotti volumi cerebrali sono associati ad una diminuzione della dimensione del soma cellulare e ad anomalie strutturali delle sinapsi, quali ridotta arborizzazione dendritica in aree cerebrali ben definite (Armstrong, 2005). Analogamente, studi nei topi mutati MeCP2 hanno anche evidenziato difetti nella complessità dendritica, nel numero di spine, nella motilità e nel turnover, come evidenziato con studi di imaging a due fotoni (Boggio et al., 2011; Landi et al., 2011), e alterazioni nella trasmissione e nella plasticità sinaptica (Asaka et al., 2006; Moretti etal., 2006; Na et al., 2013). Questi dati implicano che la RTT non è un disturbo neurodegenerativo e suggeriscono che i sintomi neurologici della RTT possono derivare essenzialmente da sottili difetti di compartimenti subcellulari, come dendriti, assoni o strutture sinaptiche. Pertanto, le principali caratteristiche anatomiche nei cervelli dei pazienti RTT (così come nei topi MeCP2-null) sono una ridotta arborizzazione dendritica, minore formazione di spine dendritiche e ridotta plasticità sinaptica.

Queste conclusioni appaiono di particolare rilevanza alla luce della recente scoperta che i sintomi RTT nei topi, quando sono causati dalla mancanza di MeCP2, sono reversibili in seguito alla riattivazione del gene endogeno (Giacometti et al., 2007; Guy et al., 2007; Robinson et al., 2012). Questo suggerisce che i neuroni difettosi possono essere riparati e che lo sviluppo senza la normale MeCP2 non è irreversibile. Partendo dalla scoperta che i deficit neurologici derivanti dalla perdita di MeCP2 possono essere contrastati attraverso il ripristino della funzionalità del gene, è stato ipotizzato un possibile approccio terapeutico basato sulla terapia genica, che è attualmente in corso di valutazione.

Sebbene una reversibilità fenotipica della RTT sia stata dimostrata dai lavori sopra menzionati, aprendo così la strada a nuove ipotesi di intervento medico attraverso la terapia genica, al momento non è disponibile alcun trattamento terapeutico per RTT, e i trattamenti disponibili sono solamente focalizzati alla gestione dei sintomi, e di supporto, richiedendo un approccio multidisciplinare. Al momento sono disponibili solo alcune modalità di trattamento mirate a migliorare le condizioni e la qualità della vita dei pazienti RTT. Queste comprendono riabilitazione per il miglioramento dei deficit fisici, così come interventi alternativi sulla sintomatologia che includono l’agopuntura. Farmaci vengono utilizzati per le irregolarità nel respiro e le difficoltà motorie, così come farmaci anticonvulsivanti possono essere usati per controllare le convulsioni. e’ presente un costante controllo per la scoliosi e per possibili anomalie cardiache. alcuni ragazzi possono richiedere attrezzature ed ausili speciali per controllare la scoliosi, stecche per modificare i movimenti delle mani e programmi nutrizionali per aiutarli a mantenere un peso corporeo adeguato.

Considerando disturbi nel respiro, tipici di RTT, la domanda di brevetto internazionale WO2007/019880 (a nome di INSERM) si fonda sull’ipotesi che una anomala modulazione noradrenergica del network respiratorio midollare possa giocare un ruolo primario nei disturbi del respiro osservati nei topi MePC2-null e nei pazienti RTT. Di conseguenza, il documento propone l’uso di un inibitore selettivo della ricaptazione della norepinefrina (SNRI) per il trattamento e la prevenzione dei disordini respiratori associati a RTT. Secondo la descrizione, si considera SNRI un composto che mostra una costante di inibizione per il trasportatore della norepinefrina al di sotto di un determinato limite e, allo stesso tempo, una selettività da 5 a 20 volte verso il trasportatore della serotonina e verso il trasportatore della dopamina. Il documento menziona alcune molecole come possibili SNRI per il trattamento dei disturbi respiratori della RTT, già note come antidepressivi, quali atomoxetina o reboxetina.

Partendo dall’ipotesi che geni e molecole che incrementano la maturazione delle sinapsi potrebbero ripristinare le funzioni sinaptica e comportamentale nei topi MeCP2-knockout, gli autori della domanda di brevetto internazionale WO 2008/153929 (a nome del MIT e del Whitehead Institute for Biomedical Research) hanno proposto il fattore di crescita insulinosimile (IGF-1), il corrispondente tripeptide (1-3)IGF-1 o i loro analoghi come validi candidati per ripristinare la funzione nei topi MeCP2-knockout, così come il trattamento terapeutico per l’uomo (Tropea D. et al., 2009). IGF-1 è un ormone peptidico strutturalmente simile all’insulina, che può svolgere molteplici funzioni, incluso regolare la crescita corporea, promuovere l’integrità neuronale, la maturazione delle cellule nervose e aumentare la plasticità sinaptica. Secondo questo documento, sia IGF-1 che (1-3)IGF-1, quando sono somministrati per via sistemica, possono attraversare la barriera emato-encefalica e migliorare le immaturità neuronali che sono caratteristiche della fisiopatologia RTT, migliorando la sintomatologia Rett nel modello animale della malattia..

Un’altra possibile strategia terapeutica proposta recentemente per trattare la sintomatologia RTT è descritta nella domanda di brevetto internazionale WO2010/0200585 (INSERM) e propone l’uso di inibitori del reuptake della serotonina per il trattamento della sindrome di Rett. Sulla base della scoperta che iniezioni ripetute di fluoxetina, un noto antidepressivo appartenente alla classe degli inibitori del reuptake della serotonina (SRI), avessero indotto significativamente l’espressione di MeCP2 nel cervello di ratti adulti normali (Cassel et al., 2006), questa domanda di brevetto è indirizzata all’uso di un qualsiasi inibitore del reuptake della serotonina e, preferenzialmente, di un inibitore selettivo del reuptake della serotonina (SSRI) come farmaco per il trattamento sistemico di RTT. Nella descrizione è presentato il report di un caso di una paziente RTT che, trattata con dose di 20 mg/die di fluoxetina, ha mostrato un miglioramento dell’interazione con l’ambiente circostante, associato ad un miglioramento dell’umore dopo un periodo di trattamento di 10-12 giorni. Come noto, si ritiene che gli SRIs aumentino i livelli di serotonina attraverso l’inibizione della ricaptazione del neurotrasmettitore a livello del neurone presinaptico una volta che il neurotrasmettitore è stato rilasciato nello spazio sinaptico.

Nel quadro della ricerca che ha portato alla presente invenzione, si è considerato che le scoperte relative alla reversibilità del fenotipo RTT descritte sopra non solo aprono la prospettiva di una terapia di tipo genico, ma suggeriscono anche la possibilità che la plasticità neuronale e i deficit cognitivi possano essere migliorati attraverso trattamenti farmacologici che stimolano la connettività neuronale.

La serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT) è uno dei principali neurotrasmettitori ed è coinvolta in un’ampia varietà di processi nel sistema nervoso centrale, inclusi la regolazione del comportamento alimentare, aggressività, umore, percezione, dolore e ansia (Gaspar et al., 2003; Lesch and Waider, 2012). E’ noto che esistono sette classi principali che comprendono almeno quattordici diversi recettori che mediano gli effetti della serotonina nel sistema nervoso (Barnes and Sharp, 1999).

Il recettore 7 della serotonina, ossia la proteina 5-HT7 codificata dal gene HTR7, è il recettore accoppiato a proteina-G identificato più di recente. Le più alte densità dei recettori 5-HT7 nel cervello sono state osservate nel talamo e nell’ipotalamo, così come nell’ippocampo e nella corteccia. Grazie alla disponibilità di “tools” farmacologici (soprattutto antagonisti) e genetici (topi transgenici) specifici per il recettore 5-HT7 è stato possibile stabilire una chiara relazione tra recettori 5-HT7 e fenomeni neurofisiologici quali regolazione dei ritmi circadiani, sonno, umore e termoregolazione (Cifariello et al., 2008; Hedlund et al., 2003; Matthys et al., 2011).

Il possibile ruolo rilevante dei recettori 5-HT7 in diversi disordini psichiatrici e neurologici, quali ansia, schizofrenia, dolore ed epilessia, è stato anche studiato. Al momento, la maggior parte dei dati sperimentali confermano il ruolo dei recettori 5-HT7 nella depressione (Hedlund, 2009). I-noltre, un numero crescente di studi ha evidenziato il ruolo del recettore 5-HT7 nei processi cognitivi (in particolar modo l’apprendimento e la memoria ippocampo-dipendente), nella neurogenesi e nella regolazione della morfologia neuronale e nella funzione e plasticità sinaptiche (Sarkisyan and Hedlund, 2009; Roberts and Hedlund, 2012).

Recentemente, una nuova classe di derivati a struttura N-(1,2,3,4-tetraidronaftalen-1-il)-4-fenil)-1-piperazinoalchilammidica di formula generale è stata proposta come ligandi del recettore 5-HT7, come reso pubblico nel brevetto US 7,488,730 (Leopoldo et al., assegnato a Università degli Studi di Bari). Questo documento riporta che alcuni dei composti appartenenti a questa classe si comportano come agonisti pieni del recettore 5-HT7, mentre altri come agonisti parziali e altri agiscono come antagonisti dei recettori 5-HT7.

Più recentemente, gli stessi autori hanno riportato l’identificazione di una molecola del tutto nuova, N-(4-cianofenilmetil)-4-(2-bifenil)-1-piperazinoesanammide (chiamata LP-211) (Leopoldo et al., 2007; Leopoldo M. et al., 2008)

N-(4-cianofenil)-4-(2-bifenil)-1-piperazinoesanammide, LP-211

che è stata dimostrata essere in grado di agire come agonista selettivo 5-HT7, di accumularsi nel cervello e di possedere proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche adatte agli studi in vivo (Hedlund et al., 2010). Gli effetti modulatori di questo nuovo agonista su motivazione, profili associati all’ansia e il ritmo circadiano spontaneo sono stati confermati in vivo in topi CD-1 (Adriani et al., 2012).

Ancora più recentemente, gli stessi autori hanno descritto in un brevetto internazionale WO 2012/159662 (Università degli Studi di Bari) una nuova classe di derivati 1-arilpiperazinici che includono la sottoclasse con la seguente formula generale

in cui i sostituenti R1, R2, K, L, M, Q, X e Ar sono come specificati nelle rivendicazioni 1 e 4 del suddetto documento. I composti appartenenti alla detta sottoclasse mostrano proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche paragonabili a quelle di LP-211.

Sommario dell’invenzione

Alla luce dello stato dell’arte che precede, l’oggetto della presente invenzione è di fornire un nuovo strumento farmacologico per la terapia della sintomatologia RTT che potrebbe essere efficace nel revertire la grave compromissione delle capacità di movimento, di esplorazione e/o interazione con l’ambiente circostante, delle capacità emozionali e cognitive che caratterizzano la sintomatologia RTT.

Partendo dall’ipotesi che specifici sintomi della sindrome neurocomportamentale RTT possono essere migliorati attraverso la stimolazione farmacologica del recettore 5-HT7 e, avendo identificato questo sistema neurochimico come potenziale target per il trattamento di RTT, è stato trovato, secondo la presente invenzione, che la somministrazione di un agonista selettivo 5-HT7, in modo tale da ottenere una stimolazione subcronica dei recettori 5-HT7, reverte l’alterazione comportamentale correlata a RTT in un modello murino di RTT che reca una mutazione tronca del gene MeCP2 (topi MeCP2-308, secondo Shahbazian et al., 2002).

Come riportato in precedenza, severi deficit di coordinazione motoria rappresentano un aspetto fondamentale della sintomatologia RTT e l’attuale letteratura suggerisce che l’alterata funzione di aree cerebrali come il caudato-putamen (striato dorsale) e del cervelletto sono in generale responsabili di questi disordini comportamentali (Hagberg B., 2002). Considerando che è stato riportato che i recettori 5-HT7 sono poco espressi in queste aree cerebrali (Gustafson E.I., et al., 1996; Neumaier J.F., et al.

2001), i risultati ottenuti nell’ambito della presente invenzione, che mostrano l’effetto benefico del trattamento con l’agonista dei recettori 5-HT7, sono risultati particolarmente inattesi.

Inoltre, la scarsa consapevolezza e la conseguente scarsa esplorazione e/o interazione con gli stimoli ambientali, insieme all’aumentata ansia e alle ridotte capacità cognitive, sono, in particolare, aspetti dei pazienti Rett che si ripetono nei topi RTT non trattati. La letteratura corrente suggerisce che lo “sforzo attenzionale” è cruciale per orientare il rilevamento e/o la discriminazione di stimoli significativi, con il neurotrasmettitore acetilcolina, a livello corticale, che gioca un ruolo fondamentale nel controllo top-down dell’orientamento attentivo. L’alterazione colinergica nella funzione di aree cerebrali quali le regioni corticali (pre)frontale, parietale e somato-sensoriale (specialmente visuale) è importante per i deficit nell’elaborazione attenzionale. Inoltre, la possibile interazione delle regolazioni colinergiche con i recettori 5-HT7 in queste aree cerebrali è stata poco studiata (Gustafson E.I., et al., 1996) rendendo, quindi, i risultati ottenuti qui particolarmente inattesi.

Breve descrizione delle figure

la Figura 1 mostra i risultati del trattamento sub-cronico con il composto preferito di questa invenzione (LP-211) sui comportamenti correlati all’ansia in un modello murino di sindrome di Rett;

la Figura 2 mostra i risultati del trattamento sub-cronico con LP-211 sui comportamenti marble burying/digging in un modello murino di sindrome di Rett;

la Figura 3 mostra i risultati del trattamento sub-cronico con LP-211 sulle capacità di coordinazione motoria in un modello murino di sindrome di Rett;

la Figura 4 mostra i risultati di un trattamento di 6 giorni con una dose bassa di LP-211 sui ritardi cognitivi correlati a RTT in un modello murino di sindrome di Rett.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Pertanto, la presente invenzione specificamente prevede un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett e altri disturbi simili alla sindrome di Rett.

Secondo una forma di realizzazione preferita, l’agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo l’invenzione è l’N-(4-cianofenil)-4-(2-bifenil)-1-piperazinoesanammide, ossia il composto arilpiperazinico denominato LP-211, o un derivato farmaceuticamente accettabile che abbia attività e selettività comparabile come agonista selettivo dei recettori 5-HT7. In particolare, tale derivato può essere un sale farmaceuticamente accettabile di LP-211 o un agonista 5-HT7 strutturalmente correlato a LP-211.

Più specificamente, l’agonista dei recettori 5-HT7 strutturalmente correlato a LP-211 potrebbe essere un composto 1-arilpiperazinico con la seguente formula

in cui

R1 è selezionato dal gruppo formato da idrogeno, (CH<2>)<n>F, (CH<2>)<n>OCH<3>, O(CH<2>)<n>F e n è compreso tra 1 e 3;

K, L, M, and Q sono CH o azoto;

X è CH<2>o O;

R<2>è idrogeno o –OH o F;

Ar è un anello aromatico con la seguente formula:

in cui X, Y e Z è CH o azoto e R3è un anello a cinque o sei termini selezionato dal seguente gruppo:

E’ da notare che LP-211 appartiene alla classe chimica delle 1-arilpiperazine. Ci sono molti farmaci commercializzati che appartengono a questa classe chimica (ad es. lurasidone, aripiprazolo, buspirone, gepirone, tandospirone). E’ da notare che questi farmaci sono indicati per il trattamento di condizioni quali depressione maggiore, psicosi, soprattutto nella popolazione adulta dal punto di vista psichiatrico. Nessuno di questi farmaci è stato mai proposto in alcun modo per il trattamento dei sintomi neuropsichiatrici nella popolazione pediatrica, nè per il trattamento di alcun aspetto correlato alla disabilità mentale o a qualsiasi altra malattia del neurosviluppo.

Come evidenziato in precedenza, la sintomatologia RTT che potrebbe beneficiare della somministrazione dell’agonista selettivo 5-HT7 di questa invenzione comprende i deficit nella coordinazione motoria, scarsa consapevolezza e esplorazione di e/o scarsa interazione con gli stimoli ambientali, ansia e ridotte capacità cognitive.

L’agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo l’invenzione potrebbe essere somministrato a livello sistemico, ad es. per via endovenosa o per via orale, ad un dosaggio preferibilmente compreso 0,01 mg/kg e 100 mg/kg di peso corporeo/die, più preferibilmente tra 0,05 mg/kg e 10 mg/kg di peso corporeo/die, molto preferibilmente tra 0,1 mg/kg e 0,5 mg/kg di peso corporeo/die. Secondo la forma di realizzazione più preferita, il composto preferito LP-211 è somministrato alla dose di 0,25 mg/kg di peso corporeo/die.

Una persona esperta nel campo riconoscerà che una quantità terapeuticamente efficace dell’agonista selettivo dei recettori 5-HT7 è la quantità sufficiente a stimolare la popolazione recettoriale 5-HT7 per revertire le alterazioni comportamentali correlate a RTT nel soggetto in questione, e che questa quantità varia inter alia, a seconda dello specifico agonista somministrato, delle condizioni del paziente, della modalità di somministrazione e di vari altri parametri che sono ben noti ad un tecnico esperto. In generale, una quantità idonea di agonista selettivo dei recettori 5-HT7 dell’invenzione da somministrare per ottenere la risposta terapeutica desiderata verrà determinata caso per caso dal medico curante.

L’agonista selettivo dei recettori 5-HT7 dovrebbe essere somministrato appena possibile, idealmente subito dopo la diagnosi, ma si prevede ugualmente efficace se somministrato negli stadi più avanzati della malattia. A seconda della gravità dei sintomi mostrati dai pazienti, regimi terapeutici che vanno dalla somministrazione giornaliera per tutta la vita a periodi di esposizione intermittenti potrebbero essere adottati.

E’ anche possibile provvedere alla somministrazione dell’agonista dei recettori 5-HT7 dell’invenzione in combinazione con altre molecole con ulteriore attività o adiuvanti indicati per la terapia e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett o altri disordini correlati alla sindrome di Rett, quali gli SSRI (citalopram, sertralina, escitalopram, fluoxetina). Altri possibili ingredienti attivi che possono essere combinati sono gli inibitori selettivi del reuptake della noradrenalina (SNRIs) (quali reboxetina e atomoxetina), inibitori misti NA/5-HT (duloxetina, venlafaxina, milnacipram), antidepressivi classici che inibiscono il reuptake di tutte le ammine biogene (amitriptilina, nortriptilina). Inoltre, considerata l’incidenza dell’ansia nei pazienti di Rett, agenti ansiolitici quali benzodiazepine (diazepam o simili) o altri (buspirone e simili) possono essere considerati per una terapia combinata.

Secondo un ulteriore aspetto della stessa, la presente invenzione riguarda una preparazione farmaceutica che comprende una quantità terapeuticamente efficace dell’agonista dei recettori 5-HT7 o un sale farmaceuticamente accettabile dello stesso e un carrier o eccipiente farmacologicamente accettabile per l’uso nel trattamento e/o prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett o a disordini di tipo Rett.

Nella forma di realizzazione preferita della suddetta composizione farmaceutica, l’agonista selettivo è N-(4-cianofenilmetil)-4-(2-bifenil)-1-piperazinoesanammide (LP-211) o un sale farmaceuticamente accettabile dello stesso.

In un’altra forma di realizzazione preferita dell’invenzione, l’agonista selettivo dei recettori 5-HT7 della preparazione farmaceutica in oggetto è un composto 1-arilpiperazinico della classe definita sopra.

Come evidenziato in precedenza, la suddetta composizione farmaceutica potrebbe anche essere formulata per comprendere almeno un agente addizionale o adiuvante indicato per la terapia e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett o altri disturbi tipo Rett, così da ottenere una terapia combinata che può essere somministrata in alternativa alla somministrazione separata dei singoli agenti.

Esempi e risultati sperimentali

Alcuni risultati sperimentali, ottenuti attraverso l’applicazione di una specifica forma di realizzazione di questa invenzione, ossia l’agonista selettivo dei recettori 5-HT7 LP-211, sono forniti come esempio qui di seguito.

Nella sperimentazione presentata, topi maschi MeCP2-308 pienamente sintomatici (età 8 mesi) e topi del genotipo non modificato (wildtype, wt) sono stati trattati giornalmente per 6 giorni consecutivi con LP211 (0,25 mg/kg, iniezione intraperitoneale, ip) o con il controllo (1% DMSO, ip). La dose e il tempo di trattamento sono stati scelti sulla base di precedenti studi multidose effettuati per testare l’agonista LP-211 in topi CD-1 (Adriani et al., 2012).

Come riportato di seguito, una normalizzazione delle capacità di coordinazione motoria, dei livelli di ansia e del comportamento NEL TEST “marble burying”, un comportamento esplorativo tipico della specie (Deacon, 2006), è stato osservato nei topi pienamente sintomatici MeCP2-308 che hanno ricevuto il trattamento sub-cronico con LP-211. E’ da notare che la somministrazione di LP-211 ha migliorato in modo persistente la memoria di riferimento spaziale negli animali mutati.

Animali

Gli animali sperimentati sono topi maschi MeCP2-308 dell’età di 8 mesi [B6.129S-MeCP2tm1Hzo/J, stock number: 005439; incrociati con topi C57BL/6J per almeno 12 generazioni ottenuti da Jackson Laboratories (USA)] e il genotipo wild-type. Tutte le procedure sono state condotte in accordo con le direttive del Consiglio della Comunità Europea (86/609/EEC) e formalmente approvate dal Ministero della Salute italiano.

Farmaco e trattamento

LP-211 è stato preparato seguendo la stessa procedura sintetica descritta in letteratura (Leopoldo et al., 2007). Il composto è stato disciolto nella soluzione veicolo (1% di dimetilsolfossido, DMSO, in soluzione salina). Topi maschi MeCP2-308 omozigoti e il controllo wild-type sono stati iniettati ip giornalmente (tra le 9.00 e le 11.00 del mattino) per 6 giorni consecutivi con LP-211 (0,25 mg/kg) o con il veicolo (1% DMSO in soluzione salina). La dose e il tempo di trattamento sono stati scelti sulla base di precedenti studi condotti nel nostro laboratorio (Adriani et al., 2012).

Test comportamentale

Per valutare gli effetti del trattamento sub-cronico con LP-211, sul primo gruppo di animali (N= 8-10), è stata selezionata una batteria di test da eseguire dopo l’ultima iniezione (nel sesto giorno) usando i paradigmi comportamentali classici sviluppati per valutare ansia e coordinazione motoria nei topi:

Light/dark e Dowel test (De Filippis et al., 2012a; De Filippis et al., 2010).

Le prestazioni nel test del “marble burying” sono state anche valutate sulla base di dati precedenti che dimostravano che l’inattivazione o il blocco dei recettori 5-HT7 riduce il comportamento marble burying nei topi (Hedlund and Sutcliffe, 2007).

Per valutare gli effetti del trattamento sulle capacità cognitive, il test del labirinto di Barnes (Barnes, 1979) è stato eseguito su un secondo gruppo di animali (N= 7-12) cominciando 8 giorni dopo l’ultima iniezione ip.

Analisi statistica

I dati sono stati analizzati utilizzando l’analisi della varianza parametrica o non-parametrica a seconda della distribuzione della risposta variabile considerata. L’analisi post-hoc è stata eseguita utilizzando il test di Tukey HSD o il test Mann Whitney con la correzione di Bonferroni.

Esempio 1 – Light/dark test

Per valutare l’effetto subcronico di LP-211 sui comportamenti DI tipo ANSIOSO i topi di 4 gruppi sperimentali sono stati confrontati nel paradigma “light/dark” (15 minuti dopo l’ultima iniezione ip, nel giorno 6 del trattamento programmato) (De Filippis et al., 2010).

L’apparato sperimentale consiste in una scatola rettangolare di Plexiglass opaco (20x14x27 cm) con pareti sottili suddivisa in due compartimenti di uguale dimensione. Un compartimento ha pareti bianche ed è intensamente illuminato (250 lux), mentre l’altro è nero e schermato per prevenire l’ingresso della luce. I topi sono stati posti individualmente nell’area scura e una sessione di 10 minuti è stata eseguita. i test sono stati video registrati e valutati da un osservatore esperto non a conoscenza del genotipo del topo sotto osservazione, utilizzando un software dedicato (THE OBSERVER v2.0 for DOS, Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands). I seguenti parametri sono stati ottenuti: tempo speso in ogni compartimento, numero di transizioni tra i due compartimenti, latenza AD entrare nel compartimento luminoso.

Risultati e discussione

Nel “light/dark” test, non è stato evidenziato alcun effetto per il genotipo o il trattamento relativo al tempo trascorso nella porzione illuminata dell’apparato. tuttavia, il confronto post-hoc sull’interazione significativa genotipo*trattamento [F(1,31) = 8,038; p = 0,008] ha rivelato che i topi MeCP2-308 trattati con il veicolo hanno trascorso un tempo significativamente inferiore nel compartimento illuminato rispetto ai topi del genotipo wild type (Fig.1, € : wt Ctrl vs. hz Ctrl, p< .05; *: Hz Ctrl vs. Hz LP211, p< 0,05, dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento) confermando, quindi, l’aumento dei comportamenti di tipo ansioso (De Filippis et al., 2012b).

Il trattamento con LP-211 ripristina il tempo trascorso dai topi MeCP2-308 nel compartimento illuminato, conducendolo al livello dei topi wild-type di controllo [p < .05 dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento: F(1,31) = 8,038; p = 0,008] suggerendo quindi un effetto ansiolitico di LP-211 sui topi RTT.

Complessivamente, i risultati di questo test dimostrano che il trattamento sub-cronico con LP-211 comporta un recupero del fenotipo ansioso nei topi RTT.

Esempio 2 - Marble Burying test

Per valutare l’effetto di LP-211 sul comportamento esplorativo, 50 minuti dopo l’ultima iniezione con LP-211 o con il veicolo (nel giorno 6 del trattamento programmato), i topi sono stati valutati nel compito del marble burying, come descritto in precedenza (Deacon, 2006). Brevemente, una scatola di Plexiglas trasparente (38x22x30 cm) sul cui fondo è stato posto un letto di segatura alto approssimativamente 5 cm, leggermente pressato in modo da ottenere una superficie piatta. Su questa superficie sono state poste nove biglie equamente distribuite. Alla fine di una sessione di 30 minuti durante la quale i topi sono stati lasciati liberi di esplorare liberamente l’apparato, il numero di biglie sotterrate (ad almeno 2/3 della loro profondità) è stato contato. il test viene condotto in presenza di una luce soffusa.

Risultati e discussione

È stata osservata una performance deficitaria da parte dei topi mutati nel test del “marble burying”, con un numero significativamente più basso di biglie sotterrate da parte deI topi MeCP2-308 rispetto al genotipo wt [genotype: F(1,31) = 15,80 ; p < 0,001; Fig. 2, € : wt Ctrl vs. hz Ctrl, p< 0,05; : Hz Ctrl vs. Hz LP211, p< 0,05, dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento]. E’ da notare che in precedenza era stato riportato in letteratura che l’inattivazione o il blocco dei recettori 5-HT7 riduce il comportamento “marble burying” (Hedlund and Sutcliffe, 2007) evidenziando quindi un profilo comportamentale simile a quello osservato nei topi RTT nel presente studio.

Il confronto post-hoc su interazione genotipo*trattamento [F(1,31) = 4,53; p = 0,041] ha evidenziato che, quando trattati con LP-211, i topi mutati hanno significativamente migliorato le loro prestazioni (p< 0,05), raggiungendo così i livelli del genotipo wt.

Questi dati mostrano che il trattamento con l’agonista selettivo 5-HT7 secondo l’invenzione induce una normalizzazione del comportamento marble burying, un comportamento esplorativo tipico della specie, nei topi RTT.

Esempio 3 – Dowel test

Per valutare l’effetto di LP-211 sulla coordinazione motoria (De Filippis et al., 2010) è stato effettuato il “dowel” test, condotto due ore dopo l’ultima iniezione nel giorno 6 del trattamento programmato. l’apparato sperimentale consiste in un tassello rotondo di legno duro con un diametro di 9,0 mm ed una lunghezza di 35 cm. Il tassello è stato montato orizzontalmente 50 cm sopra un letto di segatura profondo 5 cm. All’inizio del test ogni topo viene posto al centro del tassello così che la lunghezza del suo corpo sia parallela al tassello. La latenza per cadere dal tassello sul letto di segatura è stato registrata (criterio 30 secondi). se i topi erano in grado di camminare lungo tutto il tassello, ricevevano un massimo punteggio di 30 secondi.

Risultati e discussione

In linea con precedenti dati di letteratura, è stato evidenziato che i topi RTT cadono dal tassello significativamente prima rispetto al genotipo wt (p<0,05 dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento: F(1,31) = 5,17; p = 0,030; Fig. 3, € : wt Ctrl vs. hz Ctrl, p< 0,05; *: Hz Ctrl vs. Hz LP211, p< .05, dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento).

Il trattamento con LP-211 migliora significativamente le prestazioni dei topi mutati [p < ,05 dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento]. Le capacità motorie dei topi RTT sono, dunque, ripristinate a seguito del trattamento con LP-211.

Esempio 4 - Barnes maze Test

Per determinare se il trattamento con LP-211 esercitasse effetti benefici duraturi sui deficit della memoria di riferimento spaziale che caratterizza i topi RTT, è stato effettuato il test del labirinto di Barnes a partire dal giorno 8 dopo l’ultima iniezione ip (Barnes, 1979).

In questo test i topi sono stati addestrati ad individuare una via di fuga, un foro tramite il quale accedere a una scatola nera (7x3x9 cm) posta sotto uno dei 12 fori (4 cm di diametro) uniformemente distribuiti intorno al perimetro di una piattaforma circolare di colore grigio (95 cm di diametro) sopraelevata (36 cm sopra il pavimento), e illuminata con una luce bianca fluorescente sovrastante (85 lux). Il foro corrispondente alla scatola di fuga è disegnato come il “target”, ed ha una funzione analoga alla piattaforma nascosta presente nel più classico test del “Morris water maze”. La localizzazione del target è coerente per uno specifico topo ma casuale tra i topi. per prevenire l’individuazione del target prima dell’inizio della prova, i topi sono stati inizialmente posti al centro della piattaforma sotto un cilindro di colore nero (12 cm di diametro). Il cilindro viene rimosso dopo 10 secondi e la prova comincia. Il labirinto è stato pulito con una soluzione etanolica al 20% tra ogni prova. Il test comportamentale è consistito in un periodo di adattamento, una fase di acquisizione e 2 probe trial.

Durante la fase di adattamento (giorno 14 del programma), ai topi è consentito esplorare la piattaforma per due trial consecutivi. Se trascorre un minuto senza che i topi entrino nel foro target, questi vengono posti al lato del foro target e aiutati gentilmente ad entrare nella scatola di fuga. Una volta dentro la scatola di fuga, il topo vi può permanere per due minuti. Nessun parametro viene registrato in questa fase.

Durante la fase di acquisizione (giorni 15-20), i topi sono sottoposti a due prove al giorno durante i quali la latenza per entrare nel foro target e la lunghezza totale del percorso vengono registrati. Quando la prova finisce (ossia quando il topo entra nella scatola di fuga o dopo che siano trascorsi 3 minuti), il topo viene lasciato permanere nella scatola di fuga per un minuto. Un intervallo di almeno 10 minuti intercorre tra le due prove. Durante la fase di acquisizione, la latenza per entrare nel foro target e la lunghezza del percorso per entrare nel foro target vengono misurati. Per l’analisi statistica, i parametri sono stati mediati in gruppi di prove per giorno (media ± S.E.M).

Nel giorno 21 (24 ore dopo l’ultimo trial di training), viene condotto il primo probe trial (Probe 1) volto a valutare la ritenzione della memoria di riferimento a breve termine. Per valutare la ritenzione a lungo termine, il secondo probe trial viene condotto nel giorno 28 (7 giorni dopo il primo probe, Probe 2). Nessun trial di training viene condotto tra i due test probe. Durante i probe test, il foro target viene chiuso per confermare che i topi abbiano usato solo stimoli di orientamento ambientali extra-labirinto per raggiungere la scatola di fuga. Una sessione di 90 secondi è stata utilizzata durante la quale la latenza primaria (ossia dal primo nose poke nel foro target virtuale) e gli errori primari (ossia nose pokes prima di arrivare al target) sono stati misurati.

Risultati e discussione

Acquisizione. Come atteso, la latenza ad entrare nel foro target è diminuita durante i trials durante la fase di acquisizione (giorni 15-20) [misure ripetute: F(9,351) = 10,86; p> 0,001], confermando che tutti i topi imparano a localizzare il foro target durante le sessioni di addestramento. Un profilo analogo è stato evidente anche per la lunghezza del percorso per entrare nel foro target (dati non mostrati). Nessun trattamento o interazione genotipo*trattamento sono stati evidenziati per questi parametri. complessivamente, i topi mutati non differiscono dai controlli wt nei trial di addestramento (nessuna interazione genotipo nè genotipo*misure ripetute è stata osservata) confermando che la funzione motoria nei topi MeCP2-308 non è così compromessa da influenzare le prestazioni in questo compito cognitivo. I risultati indicano anche UNA uguale motivazione a localizzare il foro target tra i topi MeCP2-308 e topi wt.

Test probe. Nel giorno 21 del programmato (24 h dopo l’ultimo trial di training) e nel giorno 28 (7 giorni dopo il primo test probe) il foro target è stato chiuso e i probe trial sono stati condotti per valutare la ritenzione della memoria spaziale. Durante entrambi i test probe, la latenza per il primo nose poke nel foro target virtuale (latenza primaria) [p< 0,05 dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento p: F(1,37) = 9.28; p = 0,004; Fig. 4a, €: wt Ctrl vs. hz Ctrl, p< ,05; *: Hz Ctrl vs. Hz LP211, p<.05, dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento] e gli errori primari [p < 0,05 dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento: F(1,37) = 5,64; p = 0.023; Fig. 4b] sono risultati significativamente aumentati negli animali mutati rispetto al controllo wt, confermando pertanto la presenza di un deficit nella ritenzione della memoria spaziale di riferimento nei topi MeCP2-308 pienamente sintomatici (Moretti et al., 2006). E’ da notare che il trattamento con LP-211 si è rilevato in grado di invertire questo deficit e di ripristinare livelli simili agli animali wt per entrambi i parametri [p< 0.05 dopo comparazione post-hoc su interazione genotipo*trattamento; Fig.2].

È da notare che i topi sono stati valutati nel labirinto di Barnes dopo 2 (Probe 1) e dopo 3 (Probe 2) settimane dall’ultima iniezione di LP-211. Pertanto, questo studio suggerisce effetti benefici persistenti di un trattamento subcronico (6 giorni) con l’agonista dei recettori 5-HT7, LP-211, sulle capacità cognitive nei topi RTT.

Conclusioni

I risultati sperimentali appena descritti mostrano che un trattamento sub-cronico con LP-211 migliora significativamente le capacità di coordinazione motoria, I profili di ansia e il comportamento “marble burying” e il comportamento esplorativo nei topi MeCP2-308 sintomatici. Inoltre, la somministrazione di LP-211 influenza positivamente anche le capacità di memoria di riferimento spaziale nei topi mutati nel test del labirinto di Barnes.

In particolare, la valutazione delle capacità cognitive in questo test è stata eseguita 2-3 settimane dopo l’ultima iniezione ip, suggerendo pertanto effetti persistenti del trattamento con LP-211 sul deficit cognitivo associato a RTT.

Complessivamente, i risultati sopra descritti nei topi transgenici evidenziano la possibilità che i sintomi specifici RTT possono essere migliorati significativamente attraverso la stimolazione della popolazione recettoriale 5-HT7 presente nel cervello e identificano questo sistema neurochimico come un potenziale target per il trattamento della RTT.

La presente invenzione è stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma si dovrebbe comprendere che variazioni o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione come definito nelle annesse rivendicazioni.

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Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 per l’uso nel trattamento e/o prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett e ad altri disturbi simili alla sindrome di Rett.
2. 2. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo la rivendicazione 1, in cui detto agonista selettivo è N-(4-cianofenilmetil)-4-(2-bifenil)-1-piperazinoesanammide (LP-211) o un sale farmaceuticamente accettabile dello stesso.
3. 3. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo la rivendicazione 1, in cui detto agonista selettivo è un composto 1-arilpiperazinico della seguente formula in cui R1è selezionato dal gruppo formato da idrogeno, (CH<2>)<n>F, (CH<2>)<n>OCH<3>, O(CH<2>)<n>F e n è compreso tra 1 e 3; K, L, M, and Q sono, ciascuno indipendentemente, CH o azoto; X è CH<2>o O; R<2>è idrogeno o –OH o F; Ar è un anello aromatico con la seguente formula: in cui ciascuno di X, Y e Z è indipendentemente CH o azoto e R3è un anello a cinque o sei termini selezionato tra i seguenti gruppi: o un sale farmaceuticamente accettabile dello stesso.
4. 4. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detta sintomatologia comprende deficit della coordinazione motoria, scarsa consapevolezza ed esplorazione di e/o scarsa interazione con gli stimoli ambientali, ansia e ridotte capacità cognitive.
5. 5. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detto agonista è somministrato per via sistemica ad un dosaggio compreso tra 0.01 mg/kg e 100 mg/kg di peso corporeo/die.
6. 6. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo la rivendicazione 5, in cui detto dosaggio è compreso tra 0,05 mg/kg e 10 mg/kg di peso corporeo/die.
7. 7. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo la rivendicazione 6, in cui detto dosaggio è compreso tra 0,1 mg/kg e 0,5 mg/kg di peso corporeo/die
8. 8. Un agonista selettivo dei recettori 5-HT7 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detto agonista è somministrato in combinazione con uno o più ingredienti attivi indicati per la terapia e/o la prevenzione della sintomatologia della sindrome di Rett.
9. 9. Un preparato farmaceutico che comprende una quantità terapeuticamente efficace di un agonista selettivo 5-HT7 o di un sale farmaceuticamente accettabile dello stesso e un carrier o eccipiente farmaceuticamente accettabile per l’uso nel trattamento e/o prevenzione della sintomatologia associata con la sindrome di Rett e altri disordini simili alla sindrome di Rett.
10. 10. Un preparato farmaceutico secondo la rivendicazione 9, in cui detto agonista selettivo è N-(4-cianofenilmetil)-4-(2-bifenil)-1-piperazinoesanammide (LP-211) o un sale farmaceuticamente accettabile dello stesso.
11. 11. Un preparato farmaceutico secondo la rivendicazione 9, in cui detto agonista selettivo è un composto 1-arilpiperazinico come riportato nella rivendicazione 3.
12. 12. A Un preparato farmaceutico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9-11, che comprende inoltre almeno un ingrediente attivo addizionale indicato per la terapia e/o prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett e ad altri disordini simili alla sindrome di Rett.