ITRM20110248A1 - Method to prognose viral infection by measuring t cell response or auto-antibodies to apoptotic epitopes - Google Patents
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Description
Metodo per la prognosi di un’infezione virale mediante misurazione della risposta di cellule T o di autoanticorpi contro peptidi apoptotici
Campo dell’invenzione
L’invenzione si riferisce a un metodo per monitorare la progressione di un’infezione virale. Il metodo si basa sulla misurazione della risposta di cellule T o di autoanticorpi diretti verso epitopi apoptotici (determinanti antigenici).
Sfondo dell’invenzione
Un corretto priming di cellule T CD4<+>o CD8<+>naà ̄ve produce la generazione sia di cellule T di memoria effettrice (TEM) esprimenti vari programmi di differenziazione (tipo 1, 2, 17), a seconda dell’ambiente a cui sono esposte (1-8), sia di cellule T di memoria centrale (TCM) che proliferano prontamente e generano nuove ondate di cellule effettrici su richiesta (9-11). La proteina contenente il fattore di trascrizione T-box espressa nelle cellule T (T-bet) à ̈ la principale regolatrice del programma di differenziazione cellulare di tipo 1 associato alla produzione di IFN-γ, necessario per lo sviluppo di risposte immunitarie protettive contro i patogeni intracellulari (2). La proteina 3 GATA-legante (GATA-3) controlla lo sviluppo della discendenza cellulare di tipo 2 caratterizzata dalla produzione di IL-4, -5, e -13, che risulta fondamentale per l’immunità contro gli elminti e altri patogeni extracellulari (2). Il recettore orfano acido retinoico-correlato (ROR)-γt nei topi e il RORC ortologo umano negli esseri umani rappresentano i principali regolatori della differenziazione cellulare di tipo 17 che porta alla produzione di IL-17, particolarmente necessario per la protezione contro diversi tipi di infezioni batteriche extracellulari e intracellulari (1, 3-5). Tutte queste funzioni (tipo 1, 2, 17) possono elicitare effetti protettivi o dannosi, a seconda che siano eseguite da cellule T patogeno-specifiche o autoreattive o che le cellule patogeno-specifiche siano coinvolte durante un’infezione acuta in risoluzione o un’infezione cronica, rispettivamente.
Resta da stabilire il destino dell’enorme quantità di cellule apoptotiche derivanti dalle cellule T effettrici sottoposte ad apoptosi dopo aver svolto le loro funzioni durante infezioni acute o croniche (12, 13). In studi precedenti, l’autore ha scoperto che il proteoma delle cellule T apoptotiche comprende proteine cellulari caspasi-clivate prominenti e che un’elevata proporzione di diversi epitopi di cellule T in questi frammenti (epitopi apoptotici) può essere cross-presentata dalle DC in un ampio repertorio di cellule T CD8<+>autoreattive (14). Recenti rapporti hanno confermato il ruolo del clivaggio da parte della caspasi nell’elaborazione e nella presentazione di epitopi derivanti da cellule apoptotiche in diversi modelli (15-17). Nell’infezione da HIV cronica, queste cellule T CD8<+>autoreattive sono correlate alla proporzione di cellule T CD4<+>apoptotiche in vivo e sono coinvolte nella determinazione dell’attivazione di cellule T policlonali che nel lungo termine producono una generale disfunzione/deplezione delle cellule T (14). Inoltre, le cellule apoptotiche derivate da cellule T attivate (al contrario di quelle derivate da cellule T a riposo) trattengono l’espressione del ligando CD40 (L) e possono quindi condizionare l’acquisizione di elevate capacità di innesco o cross-innesco di cellule T autoreattive da parte delle DC CD40<+>(18, 19). Pertanto, l’espressione di CD40L sulle cellule T apoptotiche può superare gli effetti tollerogenici delle cellule apoptotiche convenzionali (vale a dire, quelle derivate dalle cellule epiteliali) e influenzare il passaggio da DC immature tollerogeniche a DC mature con elevate capacità stimolanti e migratorie (18, 19). Questo meccanismo à ̈ coerente con le prove secondo cui i segnali forniti dalle cellule apoptotiche CD40L<+>a differenza di quelli forniti dalle cellule apoptotiche convenzionali facilitano la nascita di risposte delle cellule T autoreattive verso autoantigeni apoptotici (18, 19).
Nella presente invenzione, gli autori hanno usato l’infezione da HCV come modello umano di infezione acuta che subisce generalmente una progressione cronica per verificare se le cellule T CD8<+>specifiche per gli autoepitopi apoptotici presentano un diverso fenotipo effettore di tipo 1, 2, o 17, per individuare quali di esse possa essere utile a determinare l’esito di un’infezione virale (recupero contro cronicità ), e ad accertare quali siano i meccanismi per cui tali risposte vengono indotte e mantenute.
Breve descrizione dell’invenzione
Il taglio caspasi-dipendente degli antigeni associati alle cellule apoptotiche presenta un ruolo prominente nella generazione di risposte delle cellule T CD8<+>in varie malattie infettive. L’autore ha scoperto che la creazione di un’ampia popolazione di cellule T effettrici CD8<+>autoreattive specifiche per gli autoepitopi associati alle cellule T apoptotiche supera le risposte antivirali nei pazienti affetti da infezione da HCV acuta. In maniera importante, esse forniscono risposte polifunzionali miste di tipo 1, di tipo 2 e di tipo 17 e sono correlate alla progressione cronica dell’infezione. Questa evoluzione à ̈ correlata alla selezione di cellule T CD8<+>autoreattive con una maggiore avidità dei TCR, mentre quelle con una minore avidità subiscono una forte contrazione nei pazienti che annullano l’infezione. Lo sviluppo di risposte miste con diversi requisiti di differenziazione à ̈ coerente con i diversi siti o le diverse cinetiche del priming delle cellule T CD8<+>in vivo. Queste scoperte dimostrano uno stretto legame, sinora non descritto, tra la creazione di elevate frequenze di cellule T CD8<+>autoreattive che producono un’ampia gamma di citochine (IFN-γ, IL-17, IL-4, IL-2, ecc.) e la progressione verso una malattia cronica in un modello umano di infezione acuta.
È pertanto un oggetto dell’invenzione un metodo per prevedere l’esito di un’infezione virale e/o per monitorare il progresso di un’infezione virale e/o per monitorare l’efficacia di una terapia per un’infezione virale in un soggetto affetto da detta infezione virale comprendente le fasi di:
a) isolamento di un campione biologico comprendente cellule T dal soggetto; b) incubazione del campione biologico isolato con almeno un peptide avente una lunghezza da 9 a 10 aa e avente una sequenza compresa in una sequenza selezionata tra:
-da aa 13 ad aa 465 della SEQ ID N. 366 di vimentina (VIME, numero di accesso P08670);
-da aa 126 ad aa 1930 della SEQ ID N. 367 di miosina non muscolare (MYH9, numero di accesso P35579);
-da aa 14 ad aa 386 della SEQ ID N.368 di Lamina B1 (LAM1, numero di accesso P20700);
-da aa 22 ad aa 196 della SEQ ID N. 369 di inibitore-2 di dissociazione di Rho GDP (GDIS, numero di accesso P52566);
-da aa 22 ad aa 433 della SEQ ID N. 370 di ribonucleoproteina K nucleare eterogenea (ROK, numero di accesso Q07244);
-da aa 12 ad aa 312 della SEQ ID N. 371 di actina citoplasmatica-1 (ACTB, numero di accesso P02570);
-da aa 90 ad aa 239 della SEQ ID N. 372 di fosfoglicerato mutasi-1 (PMG1, numero di accesso P18669);
-da aa 12 ad aa 328 della SEQ ID N. 373 di tropomodulina ubiquitaria (TMO3, numero di accesso Q9NYL9);
-da aa 45 ad aa 290 della SEQ ID N. 374 di proteina UNR-interagente (UNRI, numero di accesso Q9Y3F4);
-da aa 1 ad aa 214 della SEQ ID N. 375 di subunità -α di tipo 1 del proteasoma (PSA1, numero di accesso P25786);
-da aa 1 ad aa 94 della SEQ ID N. 376 di proteina ribosomiale acida P2 da 60S (RLA2, numero di accesso P05387);
-da aa 6 ad aa 259 della SEQ ID N. 377 di Annexin V (ANX5, numero di accesso P08758);
-da aa 11 ad aa 393 della SEQ ID N.378 di proteina p57 Coronina-similare (CO1A, numero di accesso P31146); o
-da aa 26 ad aa 516 della SEQ ID N.379 di subunità -β di proteina-1 di complesso T (TCBP, numero di accesso P78371);
in condizioni idonee per generare una risposta delle cellule T;
c) misurazione della risposta delle cellule T;
d) comparazione tra la risposta delle cellule T misurata e la risposta delle cellule T misurata di un campione di controllo idoneo.
Preferibilmente il campione biologico à ̈ un campione di PBMC o sangue.
In una forma di realizzazione preferita, l’almeno un peptide di fase b) comprende una sequenza essenzialmente costituita da una sequenza selezionata da SEQ ID N.1 a SEQ ID N.252.
Preferibilmente l’almeno un peptide di fase b) comprende una sequenza essenzialmente costituita dalla sequenza selezionata tra LLQDSVDFSL (SEQ ID N. 204), QLFNHTMFI (SEQ ID N.64) o VLMIKALEL (SEQ ID N.78).
Ancora preferibilmente la fase b) comprende l’incubazione del campione biologico con un pool di peptidi selezionato tra i seguenti pool:
- pool 1: SEQ ID N.1, 2, 4, 5, 8 e 9;
- pool 2: SEQ ID N.14, 16, 19, 19 e 20;
- pool 3: SEQ ID N.27, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 37 e 40;
- pool 4: SEQ ID N.58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66 e 67;
- pool 5: SEQ ID N.68, 69, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 83, 84 e 88;
- pool 6: SEQ ID N. 89, 90, 91, 92, 99, 100, 104, 105, 106, 111, 117, 123, 126 e - pool 7: SEQ ID N.198, 199, 200, 201, 202, 204, 206, 210, 211 e 220;
- pool 8: SEQ ID N. 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243 e 244
o
- pool 9: SEQ ID N.245, 246, 247, 248 e 249.
In una forma di realizzazione preferita la risposte delle cellule T Ã ̈ una risposta delle cellule T CD8<+>.
Preferibilmente la risposta delle cellule T viene misurata mediante un saggio Elispot.
Ancora preferibilmente il saggio Elispot à ̈ un saggio Elispot di interferone-gamma, IL-17 o IL-4.
È un ulteriore oggetto dell’invenzione un metodo per prevedere l’esito di un’infezione virale e/o per monitorare il progresso di un’infezione virale e/o per monitorare l’efficacia di una terapia per un’infezione virale in un soggetto affetto da detta infezione virale comprendente la fase di rilevazione e/o quantificazione della quantità di autoanticorpi diretti contro almeno un peptide come sopra definito o contro l’intero frammento di proteina apoptotica.
La quantità di autoanticorpi diretti contro almeno un peptide può essere confrontata con i valori misurati in un campione di controllo idoneo.
In una forma di realizzazione preferita l’infezione virale à ̈ causata da un virus selezionato dal gruppo di HCV, HBV, HIV.
Nella presente invenzione l’esito di un’infezione virale può essere una risoluzione dell’infezione o la progressione verso l’infezione cronica.
I metodi della presente invenzione possono comprendere l’isolamento di un campione biologico fresco o l’utilizzo di un campione biologico congelato o crioconservato.
La risposta delle cellule T può inoltre essere misurata mediante metodi noti ai tecnici del ramo quali metodi di colorazione intracellulare, metodi citofluorimetrici, eccetera.
La risposta delle cellule T o la rilevazione e/o quantificazione di autoanticorpi contro i peptidi dell’invenzione può essere misurata a intervalli regolari (settimanalmente, o ogni seconda, terza o quarta settimana o a intervalli più lunghi, più corti e variabili) nel corso dell’infezione virale o nel corso della terapia. L’analisi delle risposte o la rilevazione/quantificazione degli autoanticorpi nei diversi punti temporali possono essere confrontate ai primi e/o precedenti esami per identificare relativi cambiamenti nelle risposte.
Un campione di controllo idoneo può essere un campione ottenuto o isolato prima dell’inizio di una terapia, il campione di un soggetto sano, il campione di un soggetto la cui infezione progredisce verso la risoluzione, un campione ottenuto o isolato in vari punti temporali nel corso dell’infezione o nel corso della terapia.
L’invenzione verrà ora illustrata mediante figure non limitative.
Figura 1: Multispecificità della cellula T CD8<+>verso gli epitopi apoptotici nella progressione di HCV cronica. (A,B) Numero medio di cellule formanti spot (SFC) da cellule T di memoria effettrice CD8<+>(TEM) (mediante saggio ELISPOT) in risposta a pool (si vedano le tabelle supplementari 1A-C e 2A-D) di autoepitopi apoptotici (A) o epitopi virali (B) in pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (cerchi pieni) o mostranti risoluzione dell’infezione (cerchi vuoti), valutato in diversi punti temporali dell’infezione. Ciascun cerchio rappresenta un singolo paziente. NS = non significativo.
(C) Correlazione rappresentativa (sesto mese dopo l’insorgenza clinica) tra il numero medio di SFC formate da cellule TEMCD8<+>fresche in risposta a pool di autoepitopi apoptotici e la carica virale (HCV-RNA copie/ml) in pazienti affetti da infezione cronica (cerchi pieni) o in fase di risoluzione dell’infezione (cerchi vuoti). Il grafico inserito evidenzia la stessa correlazione nei pazienti le cui variazioni nella carica virale non erano evidenti nel grafico principale. L’analisi statistica à ̈ stata condotta usando un test di Spearman non parametrico. (D) Analisi mediante citometria a flusso rappresentative delle cellule mononucleari di sangue periferico (PBMC), a doppia colorazione con un anticorpo monoclonale (mAb) rispetto a CD8 e pentameri esprimenti i peptidi indicati della catena pesante di miosina non muscolare 9 (MYH9) o vimentina (VIME). Le controanalisi mostrano la percentuale di cellule CD8<+>pentamero<+>. La percentuale di cellule à ̈ indicata in ciascun quadrante. I valori pentamerici erano < 0,02% (media ± d.s. = 0,0173% ± 0,0009% per tutti i pentameri complessati a epitopi apoptotici; 0,0052% ± 0,0035% per quelli complessati a epitopi virali) in 20 individui sani HLA- A2<+>; pertanto lo 0,02% à ̈ stato considerato il livello di sensibilità del saggio. (E,F) Percentuali di cellule CD8<+>pentamero+ provenienti da tutti i pazienti studiati (i simboli pieni e vuoti rappresentano i pazienti affetti da infezione cronica o mostranti risoluzione dell’infezione, rispettivamente), sono state valutate in diversi punti temporali. Ciascun simbolo rappresenta la specificità pentamerica indicata. NS = non significativo.
Figure da 2 a 18: Cellule T effettrici CD8<+>specifiche per epitopi apoptotici o virali in pazienti con infezione da HCV acuta. Cellule T CD8<+>fresche, purificate da PBMC di pazienti (Pt.) affetti da infezione da HCV cronica (C) o autolimitata (S), sono state in grado di formare prontamente spot IFN-γ entro 6 ore dal contatto con PBMC CD8-deplete irradiate autologhe, quali APC, oltre a peptide ex vivo, come rilevato mediante un saggio ELISPOT. I risultati sono espressi come cellule formanti spot (SFC) in 1 x 10<6>cellule T CD8<+>. I valori di SFC sono stati sottratti dallo sfondo (BG). A causa del ridotto numero di PBMC ottenute dai pazienti, si sono analizzate cellule T CD8<+>isolate fresche contro 9 pool di epitopi apoptotici (Pool di autopeptidi, si veda inoltre la tabella supplementare 1A-C) e 8 pool di peptidi virali (Pool di peptidi virali, si veda inoltre la tabella supplementare 2A-D). Le figure da 2 a 12 rappresentano le risposte provenienti da PBMC di pazienti affetti da infezione da HCV cronica, le figure da 13 a 18 rappresentano le risposte provenienti da PBMC di pazienti mostranti un’infezione da HCV autolimitata. I pool di autoepitopi apoptotici o epitopi virali sono indicati nelle tabelle supplementari 1A-C e 2A-D.
Figura 19: Cellule TEMCD8<+>polifunzionali specifiche per epitopi apoptotici distinguono i pazienti affetti da infezione cronica. (A,B) Analisi mediante citometria a flusso rappresentative di PBMC provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (A) o mostranti risoluzione dell’infezione (B) che sono state colorate con mAb diretti a CD8 e pentameri complessati agli epitopi apoptotici o virali indicati. Le cellule sono quindi state stimolate con i peptidi solubili rilevanti oltre al mAb anti-CD28 ed elaborate per la rilevazione di IL-17, IL-22, IFN-γ, IL-4, e IL-2 mediante saggio ICS con i mAb rilevanti. Le controanalisi sono separate per le cellule CD8<+>pentamero<+>e mostrano percentuali di cellule producenti citochine. La percentuale di cellule à ̈ indicata in ciascun quadrante. Gli istogrammi piccoli mostrano le analisi ICS della produzione di citochine rappresentativa (IL-17, IL-22, IFN-γ, IL-4, o IL-2) senza stimolazione antigenica mediante cellule CD8<+>pentamero<+>separate. Una produzione di citochine irrilevante (<0,1% di cellule) si à ̈ osservata quando si sono stimolate con questa procedura cellule T CD8<+>pentamero<+>specifiche per epitopi apoptotici o epitopi virali di 20 individui sani HLA-A2<+>; pertanto, l’autore ha considerato l’1% di cellule producenti citochine nelle cellule pentamero<+>come il livello di sensibilità di tale saggio. (C) Percentuale di cellule producenti le citochine indicate nelle cellule CD8<+>pentamero<+>in risposta agli epitopi apoptotici indicati (valutata nel punto temporale indicato mediante analisi di citometria a flusso) provenienti da pazienti affetti da infezione da HCV acuta mostranti infezione cronica (simboli pieni) o mostranti risoluzione di infezione (simboli vuoti). La linea tratteggiata orizzontale delimita uno sfondo arbitrario, basato sui valori di 20 individui sani HLA-A2<+>mostranti < 0,1% di cellule producenti citochine in ciascuna prova.
Figura 20: Cinetiche delle cellule CD8<+>pentamero<+>producenti citochine in pazienti con infezione da HCV acuta. (A,B) Curve dose-risposta peptidiche di cellule CD8<+>pentamero<+>producenti citochine provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (A) o mostranti risoluzione di infezione (B). Le cellule sono state colorate con i pentameri esprimenti i peptidi indicati e stimolate per 6 ore con gli stessi peptidi solubili. Sono quindi state elaborate per la rilevazione delle diverse citochine indicate mediante saggio ICS. I valori sono mostrati già sottratti dallo sfondo. (C) Cellule TEMCD8<+>polifunzionali specifiche per epitopi apoptotici in pazienti con infezione da HCV acuta. Percentuale di cellule producenti le citochine indicate nelle cellule CD8+ pentamero+ in risposta agli epitopi apoptotici indicati (valutata nei punti temporali indicati mediante analisi di citometria a flusso) provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (simboli pieni) o mostranti risoluzione di infezione (simboli vuoti). La linea tratteggiata orizzontale delimita uno sfondo arbitrario, basato sui valori di 20 individui sani HLA-A2<+>mostranti < 0,1% di cellule producenti citochine in ciascuna prova.
Figura 21: Cellule TEMCD8<+>polifunzionali specifiche per epitopi virali in pazienti con infezione da HCV acuta. Percentuale di cellule producenti le citochine indicate nelle cellule CD8+ pentamero+ in risposta agli epitopi virali indicati (valutata nei punti temporali indicati mediante analisi di citometria a flusso) provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (simboli pieni) o mostranti risoluzione di infezione (simboli vuoti). La linea tratteggiata orizzontale delimita uno sfondo arbitrario, basato sui valori di 20 individui sani HLA-A2<+>mostranti < 0,1% di cellule producenti citochine in ciascuna prova.
Figura 22: Cellule TEMCD8<+>polifunzionali specifiche per epitopi apoptotici predicono la progressione cronica dell’infezione da HCV. (A) Cinetiche di HCV-RNA plasmatico e livelli di alanina aminotransferasi (ALT) fino a 15-24 mesi dall’insorgenza clinica dell’infezione. Ciascun simbolo rappresenta un singolo paziente. (B,C) Cinetiche delle medie di tutte le percentuali di cellule CD8<+>pentamero<+>(pent) che hanno prodotto prontamente le citochine indicate in risposta agli epitopi apoptotici (B) o virali (C). Le cellule sono state calcolate come percentuale del numero assoluto di cellule esprimenti CD8, ligandi pentamerici, e citochine nelle PBMC. I valori sono mostrati già sottratti dallo sfondo. I cerchi pieni rappresentano pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica; i cerchi vuoti rappresentano pazienti affetti da HCV mostranti risoluzione di infezione.
Figura 23: (A,B) Numero di pazienti mostranti un ampio repertorio di cellule T CD8<+>polifunzionali producenti una o due citochine in risposta ad epitopi apoptotici (A) o virali (B).
Figura 24: (A,B) Correlazione tra cellule TEMCD8<+>pentamero<+>producenti IFN-γ (A) o IL-17 (B) in risposta ad epitopi apoptotici e carica virale (copie HCV-RNA) o ALT in pazienti con infezione da HCV acuta mostranti infezione cronica o risoluzione di infezione.
L’analisi statistica à ̈ stata condotta usando un test di Spearman non parametrico. Figura 25: Le cellule TEMCD8<+>specifiche per epitopi apoptotici vengono attivate da epitopi apoptotici trattati in modo naturale e cross-presentati da cellule dendritiche (DC). (A) Un esempio rappresentativo di cinque esperimenti in cui le PBMC provenienti da un paziente con infezione da HCV acuta sono state sottoposte a doppia colorazione con mAb diretto a CD8 e pentameri complessati con l’epitopo apoptotico indicato, e coltivate con DC autologhe che erano state impulsate o meno con il peptide solubile rilevante, cellule T apoptotiche clonate (AC = cellule apoptotiche), AC precedentemente trattate con un controllo caspasi-negativo (K = Z-FA-FMK), o AC precedentemente trattate con l’inibitore 3 di caspasi (C3I = Z-DEVD-FMK). Dopo 6 ore, le cellule CD8<+>pentamero<+>sono state analizzate in merito alla loro capacità di produrre le diverse citochine indicate mediante saggio ICS. Le controanalisi sono separate per le cellule CD8<+>pentamero<+>e mostrano percentuali delle diverse cellule producenti citochine in ciascun quadrante. (B) Esperimenti cumulativi in 5 pazienti indipendenti, eseguiti come descritto in (A), mostranti le percentuali di cellule producenti le citochine indicate nelle cellule CD8<+>pentamero<+>in risposta ai seguenti stimoli: sole DC autologhe (a); DC impulsate con il peptide MYH9741-749(b); DC impulsate con AC, precedentemente trattate con un controllo caspasi-negativo (Z-FA-FMK) (c); o DC impulsate con AC precedentemente trattate con l’inibitore 3 di caspasi (Z-DEVD-FMK) (d). Ciascun simbolo rappresenta un singolo paziente. (C) Correlazione (analizzata al 15<o>mese dopo l’insorgenza clinica) tra la percentuale di cellule CD8<+>pentamero<+>specifiche per epitopi apoptotici e la percentuale di cellule T apoptotiche circolanti in pazienti con infezione da HCV acuta mostranti infezione cronica (cerchi pieni) o risoluzione di infezione (cerchi vuoti). L’analisi statistica à ̈ stata condotta usando un test di Spearman non parametrico.
Figura 26: Nessun difetto intrinseco delle funzioni effettrici nelle cellule T CD8<+>provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta. (A) Analisi mediante citometria a flusso rappresentativa in cui le PBMC provenienti da pazienti affetti da infezione da HCV acuta sono state colorate con mAb diretto a CD8 e il pentamero indicato, stimolate con PMA e ioni per 6 ore, ed elaborate per la rilevazione delle citochine indicate mediante saggio ICS con i mAb rilevanti. Le controanalisi sono separate per le cellule CD8<+>pentamero<+>e mostrano percentuali di cellule producenti citochine. La percentuale di cellule à ̈ indicata in ciascun quadrante. (B) Percentuale di cellule producenti le citochine indicate nelle cellule CD8<+>pentamero<+>in risposta a PMA e ioni (valutata nei punti temporali indicati mediante analisi di citometria a flusso) provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (simboli pieni) o mostranti risoluzione di infezione (simboli vuoti).
Figura 27: Cellule T CD8<+>di memoria effettrice, naà ̄ve e centrali specifiche per epitopi apoptotici o virali. (A) Analisi mediante citometria a flusso rappresentativa, i valori dei pazienti totali sono mostrati in (B), in cui le PBMC provenienti da un paziente affetto da infezione da HCV acuta sono state colorate con mAb diretto a CD8, CD45RO, e CD127 e con il pentamero complessato con il peptide apoptotico indicato. Le controanalisi sono separate per le cellule CD8<+>pentamero<+>e mostrano percentuali di cellule CD45RO<+>e/o CD127<+>. La percentuale di cellule à ̈ indicata in ciascun quadrante. (B) Percentuali di cellule CD45RO<+>CD127<–>, CD45RO<–>CD127<+>, o CD45RO<+>CD127<+>in cellule CD8<+>pentamero<+>provenienti da pazienti affetti da aHCV mostranti infezione cronica (cerchi pieni) o risoluzione di infezione (cerchi vuoti). (C) Esempio rappresentativo di sei analisi mediante citometria a flusso in cui le PBMC provenienti da un paziente affetto da infezione da HCV acuta sono state colorate con mAb diretti a CD8 e CD127 e con il pentamero complessato con il peptide indicato. Le cellule sono state stimolate con lo stesso peptide solubile per 6 ore e poi elaborate per la rilevazione delle citochine indicate mediante saggio ICS con i mAb rilevanti.
Figura 28: Cinetiche di decadimento della colorazione pentamerica delle cellule T CD8<+>. (A) Diagramma di decadimento rappresentativo del logaritmo naturale della fluorescenza normalizzata rispetto al tempo dopo l’aggiunta di mAb anti-HLA-A2 per le PBMC fresche colorate con i pentameri complessati con l’epitopo apoptotico indicato. Il t1/2rappresenta i tempi di dimezzamento di colorazione per i pentameri sulle cellule T CD8<+>. I cerchi pieni o vuoti rappresentano le PBMC provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica o mostranti risoluzione di infezione, rispettivamente. (B) t1/2per i pentameri (complessati con gli epitopi apoptotici o virali indicati) che legano le cellule T CD8<+>provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta affetti da infezione cronica (simboli pieni) o mostranti risoluzione di infezione (simboli vuoti).
Figura 29: Collegamento tra carica virale e cinetiche di decadimento della colorazione pentamerica per le cellule T CD8<+>. Correlazione tra copie HCV-RNA plasmatiche e i tempi di dimezzamento di colorazione (t1/2) per i pentameri su cellule T CD8<+>provenienti da pazienti con infezione da HCV acuta mostranti infezione cronica (cerchi pieni) o risoluzione di infezione (cerchi vuoti). NS = non significativo.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
MATERIALI E METODI
Popolazione di studio
La coorte dello studio comprendeva 16 pazienti affetti da infezione da HCV acuta (4 donne, 12 uomini, età media 31 anni, intervallo da 22 a 57 anni). La diagnosi di infezione da HCV acuta si à ̈ basata su (1) elevati livelli di ALT sierica; (2) sieroconversione valutata mediante un saggio immunoassorbente legato a enzima di terza generazione, o positività anti-HCV al momento della diagnosi con un test anti-HCV negativo nei precedenti 12 mesi; (3) presenza di HCV-RNA in almeno il primo campione sierico, e (4) improvvisa insorgenza di sintomi di malattia epatica. Sono state escluse cause alternative di epatite acuta, quali altre infezioni virali, autoimmunità , alcol, farmaci e tossine. I pazienti con disturbi immunologici concomitanti o con coinfezione da HIV sono stati anch’essi esclusi dallo studio.
Preparazioni cellulari
Le PBMC sono state isolate e si sono generati i cloni di cellule T come descritto in precedenza (48). Le cellule T CD8<+>sono state purificate dalle PBMC mediante selezione positiva accoppiata a sfere magnetiche (MiltenyiBiotec) come descritto in precedenza (38). L’analisi mediante citometria a flusso ha mostrato > del 99% di cellule CD8<+>nella popolazione purificata positivamente e < del 5% nella popolazione CD8-depleta. Per purificare le cellule CD8<+>di tipo 17 antigene-specifiche, si sono stimolate le PBMC con il peptide rilevante insieme ad anti-CD28 (4 µg/ml) (BD Pharmingen). In seguito, le cellule sono state colorate con anti-CCR6 alloficocianina (APC)-marcato (R&D System) e anti-CCR4 PE-cianina 7 (PE-Cy7)-marcato (BD Pharmingen) e trattate con FACSAria (Becton Dickinson) per classificare le cellule CCR6<+>CCR4<+>: > del 98% di tali cellule hanno prodotto IL-17 in risposta al peptide rilevante e sono risultate suscettibili di colorazione con i pentameri rilevanti, come descritto di seguito. L’apoptosi spontanea delle PBMC provenienti dai pazienti à ̈ stata determinata mediante colorazione con Annexin-V (kit di apoptosi ApoAlert, Clontech Laboratories Inc), propidio ioduro (PI) (Sigma-Aldrich) e anti-CD3 PE-Cy7-marcato (BD Pharmingen) prima e dopo un’incubazione di 18 ore a 37°C. Le (i)DC immature sono state derivate da monociti periferici che erano stati purificati mediante selezione positiva con mAb anti-CD14 accoppiato a sfere magnetiche (MiltenyiBiotec). Le cellule CD14<+>sono state incubate per 5 giorni in terreno RPMI 1640 contenente il 5% di FCS, 2 mM di glutammina, l’1% di amminoacidi non essenziali, l’1% di piruvato di sodio, 50 Î1⁄4g/ml di kanamicina (Gibco BRL), 50 ng/ml di rGM-CFS (Novartis Pharma), e 1000 U/ml di rIL-4 (gentilmente fornito da A. Lanzavecchia, Bellinzona, CH). Le DC mature sono state ottenute mediante una stimolazione di 40 ore delle iDC con molecole di rCD40L solubili (Alexis Biochemicals, Alexis Corporation). La definizione delle DC derivate da monociti si à ̈ basata sul loro profilo fenotipico superficiale mediante colorazione con mAb anti-CD14, anti-CD86 (Caltag Laboratories), anti-CD1a, anti-CD1c, anti-CD11c, anti-CD32, anti-CD80 (BD PharMingen), Annexin-V (kit di apoptosi ApoAlert, Clontech Laboratories Inc), propidio ioduro (PI) (Sigma-Aldrich), e gli anticorpi marcati secondari idonei (BD PharMingen).
Saggio ELISPOT ex vivo
Cellule T CD8<+>altamente purificate (1 x 10<5>) provenienti da PBMC sono state stimolate per 4-6 ore con otto pool indipendenti di peptidi virali (genotipo 1b) e otto pool indipendenti di peptidi virali (genotipo 2c) (si vedano la tabella supplementare 1A-C, e la tabella supplementare 2A-D di seguito) (5 µg/ml per singolo peptide) e PBMC CD8-deplete autologhe irradiate, usate come APC, e analizzate mediante saggio ELISPOT, come descritto (14).
Colorazione con pentamero
Le PBMC sono state incubate con pentameri APC-marcati–HLA-A*0201 (complessati al peptide vimentina78-87[LLQDSVDFSL], miosina478-486non muscolare [QLFNHTMFI], o miosina741-749non muscolare [VLMIKALEL]) per gli epitopi apoptotici e con pentameri APC-marcati–HLA-A*0201 (complessati al peptide HCV-NS31073-1081[CINGVCWTV], HCV-NS31406-1415[KLVALGINAV] o HCV-Core132-140[DLMGYIPAV]) per gli epitopi virali (ProImmune Limited, Oxford, Regno Unito), in tampone FACS (PBS 1×, 2% di siero AB umano) per 10 minuti a 37 °C, seguito da lavaggio e ulteriore incubazione con mAb APC-Cy7-marcato diretto a CD8 (BD Pharmingen, San Diego, CA), anti-PD-1 FITC-marcato (BD Pharmingen), anti-CD127 PE-marcato (BD Pharmingen), anti-CD45RO FITC-marcato (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) per 20 minuti a 4 °C. I controlli negativi sono stati ottenuti colorando le cellule con un mAb con isotipo corrispondente irrilevante. Le cellule sono state lavate, acquisite con un citometro a flusso FACSCanto e il software di analisi FACSDiva (Becton Dickinson) o la versione 7.5.5 del software FlowJo (Tree star, Inc. San Carlos, CA).
Colorazione intracellulare di citochine
Le PBMC sono state colorate con pentameri e mAb diretti a CD8, e poi stimolate con o senza diverse concentrazioni del corrispondente peptide non complessato (ProImmune Limited) insieme a mAb anti-CD28 (4 µg/ml) (BD Pharmingen), o con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 µg/ml) (Sigma Aldrich, Milano, Italia), per 6 ore a 37°C. Alla seconda ora, si sono aggiunti 10 µg/ml di Brefeldin A (Sigma-Aldrich). Le cellule sono state lavate, fissate e permeabilizzate usando soluzione Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) a 4 °C per 20 minuti, rilavate con tampone Perm Wash (BD Pharmingen), e colorate intracellularmente con diverse combinazioni di anti-IL17A Alexa Fluor 488-marcato (eBioscience San Diego, CA), anti-IFN-γ PE-marcato, anti-IL-2 PE-marcato, anti-IL-4 FITC-marcato (BD Pharmingen), anti-RORC PE-marcato (eBioscience) o anti-T-bet purificato (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, California) per 30 minuti a 4 °C. Quando colorate con anticorpo specifico non marcato per rilevare T-bet, le cellule sono state lavate e colorate con l’anticorpo FITC-marcato secondario idoneo. Le cellule sono state lavate, acquisite con un citometro a flusso FACSCanto e il software di analisi FACSDiva (Becton Dickinson) o il software FlowJo (Tree star).
Cross-presentazione di cellule apoptotiche
Cellule T CD8<+>CD95<+>clonate (10–100 x 10<6>) sono state incubate in presenza o in assenza di 14 mg/ml di C3I (Z-DEVD-FMK), o un controllo caspasi-negativo (K, Z-FA-FMK) (BD Pharmingen) per 1 ora a 37°C in una piastra a 24 pozzetti. In seguito, si à ̈ indotta l’apoptosi delle cellule mediante incubazione con 500 ng/ml di anti-Fas (mAb anti-CD95 [clone CH11], Upstate Biotechnology) per almeno 6 ore. Le cellule apoptotiche sono state determinate mediante colorazione con Annexin-V (kit di apoptosi ApoAlert, Clontech Laboratories Inc), PI (Sigma-Aldrich) e analisi mediante citometria a flusso. Le PBMC sono state sottoposte a doppia colorazione con pentameri e mAb diretto a CD8 e coltivate con iDC che erano state impulsate o meno con cellule T apoptotiche clonate. Dopo 6–8 ore, le cellule sono state analizzate in merito alla loro capacità di produrre IL-17 e IFN-γ mediante colorazione delle citochine intracellulari (ICS) come sopra descritto. Le cellule sono state lavate, acquisite con un citometro a flusso FACSCanto e analizzate con il software di analisi FACSDiva (Becton Dickinson) o il software FlowJo (Treestar).
Decadimento di colorazione con pentamero (cinetiche di dissociazione)
Le PBMC sono state colorate con quantità saturanti di pentameri APC-marcati-HLA-A*0201 e CD8 APC-Cy7-marcate (BD Pharmingen) per 45 minuti a temperatura ambiente (28). In seguito, le cellule sono state lavate tre volte con tampone (2% di FCS, 0,01 azide di sodio in PBS) e risospese in 500 Î1⁄4l di tampone con quantità saturanti di mAb diretto a HLA-A2 (BB7.2, ATCC). In vari punti temporali (0, 30’, 1 ora, 2 ore e 3 ore), si à ̈ lavata un’aliquota cellulare e si à ̈ determinata l’intensità di fluorescenza mediante analisi di citometria a flusso. Si à ̈ condotta in parallelo la doppia colorazione usando un TCRα/β antiumano (BD Pharmingen) e pentameri per normalizzare la fluorescenza del pentamero contro il TCR espresso. I valori sono stati quindi normalizzati alla percentuale della fluorescenza totale nel primo punto temporale e rappresentati graficamente su una scala logaritmica. I t1/2vengono determinati calcolando il valore (ln2)/pendenza media dei diagrammi di logaritmo naturale (ln) della fluorescenza del pentamero normalizzata per la fluorescenza del TCR. La pendenza à ̈ equivalente a ln(Fa/Fb)/t, in cui Fa à ̈ la fluorescenza normalizzata all’inizio dell’intervallo, Fb à ̈ la fluorescenza normalizzata alla fine dell’intervallo, e t à ̈ la lunghezza dell’intervallo (minuti).
Bloccaggio dell’interazione PD-1/PD-L1
Le PBMC sono state incubate per 10 giorni a 37°C con peptidi specifici (peptidi apoptotici o peptidi virali) e anti-PD-L1 (10 µg/ml) (R&D systems Minneapolis, MN) o anticorpo di controllo isotipico (10 µg/ml). Si à ̈ aggiunto IL-2 ricombinante (50 U/ml) (CHIRON Emeryville, California) nel giorno 4 della coltivazione. Nel giorno 10, le cellule sono state colorate con anticorpi superficiali, pentameri, mAb anti-IL-17A, anti-IFN-γ, anti-IL-2 e anti-IL-4. Le cellule sono state lavate, acquisite con un citometro a flusso FACSCanto e analizzate con il software di analisi FACSDiva (Becton Dickinson) o il software FlowJo (Tree star).
Polarizzazione di cellule T
Le PBMC sono state incubate per 10 giorni a 37°C con peptidi specifici (peptidi apoptotici o virali), rIL-6 umano (50 ng/ml), rIL-1β (10 ng/ml), rIL-23 (50 ng/ml) e rTGF-β (10 ng/ml) (R&D Systems) per la polarizzazione di cellule Th17. Per le condizioni di polarizzazione di cellule Th1, le PBMC sono state stimolate con antigene in presenza di rIL-12 ricombinante umano (10 ng/ml) e rIFN-γ (100 U/ml) (R&D Systems). Nel giorno 4 della coltivazione si à ̈ aggiunto IL-2 ricombinante (50 U/ml). Nel giorno 10, le cellule sono state colorate con anticorpi superficiali, pentameri, mAb anti-IL-17A, anti-IFN-γ, anti-IL-2 e anti-IL-4. Le cellule sono state lavate, acquisite con un citometro a flusso FACSCanto e analizzate con il software di analisi FACSDiva (Becton Dickinson) o il software FlowJo (Tree star).
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state condotte con il software Prism 4 (GraphPad) usando il test di correlazione di Spearman non parametrico, il test U di Mann-Whitney non parametrico per dati non accoppiati e il test di Wilcoxon per i dati accoppiati. Le differenze sono considerate significative a P < 0,05.
RISULTATI
Analisi proteomica di cellule vive o apoptotiche
Come riportato in (14), l’autore ha identificato le proteine espresse differenzialmente nelle cellule apoptotiche.
I risultati sono riportati nella tabella 1 di seguito.
Affinità di legame HLA-A2 di peptidi sintetici derivati da proteine frammentate
L’autore ha analizzato l’affinità di legame HLA-A2 di frammenti aventi da 9 a 10 amminoacidi delle proteine identificate e riportate nella tabella 1. I risultati sono riportati nelle tabelle S1A-S1H.
La multispecificità delle cellule TEMCD8<+>per gli epitopi apoptotici à ̈ correlata alla cronicità dell’infezione
L’autore ha analizzato longitudinalmente le risposte di 16 pazienti affetti da infezione da HCV acuta. Il follow-up andava dall’insorgenza della malattia acuta (insorgenza clinica) a 15-24 mesi (il sesto mese essendo considerato il tempo di conversione da un’infezione acuta a cronica). Dei 16 pazienti, 6 pazienti presentavano un’infezione autolimitata e 10 pazienti mostravano un’evoluzione cronica dell’infezione (Tabella 1a).
Tabella 1a. Parametri clinici di pazienti con infezione da HCV acuta
Inizialmente, le risposte effettrici sono state determinate mediante la capacità delle cellule T CD8<+>fresche isolate provenienti da pazienti HLA-A2<+>o controlli sani di formare spot IFN-γ entro 4-6 ore dal contatto con nove pool di peptidi apoptotici sintetici (tabella supplementare 1A-C) o otto pool di peptidi HCV (tabella supplementare 2A-D) selezionati per la loro capacità di legare la molecola HLA-A2 (14, 20), in un saggio ELISPOT.
Tabella supplementare 2A. Capacità di legame di HLA di classe I di epitopi HCV potenziali (Genotipo 1b)
Tabella supplementare 2B. Capacità di legame di HLA di classe I di epitopi HCV potenziali (Genotipo 1b)
Tabella supplementare 2C. Capacità di legame di HLA di classe I di epitopi HCV potenziali (Genotipo 2c)
Tabella supplementare 2D. Capacità di legame di HLA di classe I di epitomo HCV potenziale (Genotipo 2c)
I peptidi apoptotici sintetici usati sono stati preparati in base alla sequenza delle proteine caspasi-clivate precedentemente identificate mediante analisi proteomiche di cellule T apoptotiche (vale a dire, frammenti di actina citoplasmatica 1 [ACTB], proteina ribonucleica nucleare eterogenea [ROK], lamina B1 [LAM1], miosina non muscolare a catena pesante 9 [MYH9], vimentina [VIME], o componente proteasomico C2 [PSA1]) (14). L’autore ha scoperto un repertorio significativamente più ampio di cellule TEMIFN-γ<+>CD8<+>(come rilevato mediante ELISPOT) specifiche per diversi epitopi apoptotici in pazienti gravemente affetti da HCV mostranti un’evoluzione cronica rispetto ai pazienti con malattia autolimitata (Figura 1A e Figure da 2 a 18). Al contrario, il repertorio di cellule TEMIFN-γ<+>CD8<+>specifiche per diversi epitopi virali à ̈ risultato più ampio in pazienti mostranti un recupero (Figura 1B e Figure da 2 a 18). Inoltre, il repertorio di epitopo apoptotico riconosciuto dalle cellule T CD8<+>à ̈ risultato significativamente più ampio nei pazienti mostranti infezione cronica rispetto a quelli mostranti recupero (dati non mostrati). È interessante sottolineare che il numero medio di spot IFN-γ prontamente formati dalle cellule TEMCD8<+>in risposta a ciascun pool di epitopi apoptotici (ma non epitopi virali) à ̈ risultato direttamente correlato alla carica virale (HCV-RNA plasmatico), a sostegno della relazione tra tali risposte e l’evoluzione cronica (Figura 1C). Nessuno dei 21 donatori sani HLA-A2<+>ha mostrato risposte effettrici significative contro nessuno dei peptidi apoptotici o virali ex vivo. La restrizione HLA di queste risposte à ̈ stata dimostrata bloccando le risposte con un mAb anti-classe I idoneo e determinando un’assenza di risposta nei pazienti HLA-A2-.
Cellule T CD8<+>specifiche per epitopo apoptotico polifunzionali miste nell’evoluzione cronica di HCV
L’autore ha enumerato le cellule T CD8<+>specifiche direttamente nel sangue periferico di pazienti usando pentameri di molecole HLA-A*0201 complessate agli epitopi apoptotici (MYH9478-486, MYH9741-749, VIME78-87) o virali (NS31073-1081, NS31406-1415, Core132-140) precedentemente identificati come quelli più immunogenici tra tutti i pazienti analizzati (Figura 1D). I valori pentamerici di sfondo erano < allo 0,02% (media ± d.s. = 0,0173% ± 0,0009% per tutti i pentameri complessati agli epitopi apoptotici; 0,0052% ± 0,0035% per quelli complessati agli epitopi virali) in 20 individui sani HLA-A2<+>; pertanto lo 0,02% à ̈ stato considerato il livello di sensibilità del saggio. I pentameri di controllo HLA-A*0201 complessati a un peptide irrilevante non naturale non sono stati in grado di colorare le cellule T CD8<+>in tutte le PBMC analizzate. Le frequenze totali delle cellule T CD8<+>specifiche per epitopo apoptotico o virale, come rilevato con i pentameri, non sono risultate diverse tra pazienti mostranti evoluzione cronica o di recupero in ciascun punto temporale analizzato (Figura 1D-F), ma sono risultate sostanzialmente superiori a quelle delle cellule TEMIFN-γ<+>CD8<+>precedentemente rilevate mediante saggio ELISPOT. Per determinare l’eventuale presenza di ulteriori sottoserie con diverse funzioni effettrici all’interno delle cellule T CD8<+>pentamero<+>totali, l’autore ha analizzato le frequenze di cellule T CD8<+>pentamero<+>fresche isolate che hanno prodotto un’ampia gamma di citochine (IL-17, IFN-g IL-4, IL-2) entro poche ore dal contatto con i peptidi rilevanti e concentrazioni ottimali di mAb anti-CD28, che hanno avuto la funzione di segnale costimolatorio surrogato. Una produzione di citochine irrilevante (<0,1% di cellule) si à ̈ osservata quando si sono stimolate con questa procedura cellule T CD8<+>pentamero<+>specifiche per epitopo apoptotico o epitopo virale di 20 individui sani HLA-A2<+>; pertanto, l’autore ha considerato l’1% di cellule producenti citochine nelle cellule pentamero<+>come il livello di sensibilità di tale saggio. Ancora più importante, le cellule TEMCD8<+>pentamero<+>specifiche per epitopo apoptotico hanno prodotto prontamente quantità notevoli e sostenute di tutte le citochine analizzate entro poche ore dal contatto con gli epitopi rilevanti, in quantità superiore nei pazienti mostranti infezione cronica rispetto a quelli mostranti risoluzione di infezione (Figura 19A-C). Le curve dose-risposta peptidiche di cellule CD8<+>pentamero<+>producenti citochine hanno enfatizzato questa differenza (Figura 20 A,B). La produzione di policitochine da parte delle cellule TEMCD8<+>pentamero<+>specifiche per epitopo apoptotico à ̈ risultata significativamente superiore nei pazienti mostranti infezione cronica al sesto mese dall’insorgenza clinica (Figura 19C), e tendeva ad essere superiore anche negli altri punti temporali analizzati (Figura 20C). Rispetto alle cellule TEMCD8<+>specifiche per epitopo apoptotico, le cellule TEMCD8<+>pentamero<+>virus-specifiche hanno prodotto quantità inferiori della stessa citochina in entrambe le categorie di pazienti senza alcuna differenza tra di esse (Figura 19 A,B, Figura 20 A,B e Figura 21). Analisi del decorso temporale, condotte longitudinalmente nel corso del follow-up, hanno rivelato che le frequenze delle cellule TEMCD8<+>specifiche per epitopo apoptotico polifunzionali (calcolate in termini del loro numero assoluto) sono risultate sostenute nel tempo in relazione alla carica virale sostenuta (copie HCV-RNA, segno di persistenza virale) e al declino progressivo dei livelli di alanina aminotransferasi (ALT) (segno di termine dell’infezione acuta) solo nei pazienti che hanno mostrato un’evoluzione nell’infezione cronica (Figura 22 A,B). In seguito, la maggior parte di queste frequenze cellulari tendeva a diminuire considerevolmente più tardi nei pazienti che mostravano un’evoluzione nell’infezione cronica rispetto a quelli mostranti una risoluzione dell’infezione (Figura 22B). Al contrario, non à ̈ stata confermata alcuna sostanziale differenza nel decorso temporale della risposta effettrice virus-specifica tra le due categorie di pazienti: le frequenze delle cellule TEMCD8<+>virus-specifiche sono risultate sostanzialmente inferiori rispetto a quelle specifiche per epitopo apoptotico e sono diminuite nel corso del tempo (Figura 22C). In particolare, le risposte polifunzionali nella maggior parte dei pazienti sono state mantenute dalla presenza parallela di diverse sottoserie di cellule T CD8<+>antigene-specifiche, ciascuna delle quali ha prodotto una singola citochina in tutti i punti temporali analizzati (popolazioni polifunzionali miste) (Figura 23 A,B). Al contrario, 4 pazienti sui 16 pazienti studiati hanno mostrato inoltre cellule in grado di produrre simultaneamente più di una citochina: in particolare, 4 pazienti hanno mostrato cellule in grado di produrre simultaneamente significative quantità di IFN-γ e IL-17, e due di questi 4 pazienti hanno mostrato cellule in grado di produrre simultaneamente quantità significative di IL-17 e IL-4 (Figura 19 A,B e Figura 23 A,B). Ancora più importante, le frequenze delle cellule TEMCD8<+>pentamero<+>che producono prontamente IFN-γ o IL-17 in risposta agli epitopi apoptotici rilevanti (Figura 24 A,B), ma non in risposta agli epitopi virali, tendevano ad essere direttamente correlate alla carica virale plasmatica o ai livelli sierici di ALT.
Risulta interessante la scoperta che le cellule TEMCD8<+>pentamero<+>specifiche per epitopo apoptotico fresche hanno prodotto prontamente IFN-γ o IL-17 ex vivo entro poche ore dal contatto con DC che erano state impulsate con cellule T apoptotiche (vale a dire, attraverso il meccanismo di cross-presentazione) (Figura 25 A,B). La cross-presentazione ha prodotto una marcata diminuzione nella produzione di IFN-γ o IL-17 quando le cellule apoptotiche erano state precedentemente trattate con un inibitore 3 caspasi-selettivo (C3I) (Figura 25 A,B). Questo fenomeno à ̈ stato confermato in cinque pazienti indipendenti (Figura 25B). Le frequenze delle cellule T CD8<+>specifiche per epitopo apoptotico (ma non quelle delle cellule T CD8<+>specifiche per epitopo virale [dati non mostrati]) sono risultate correlate al numero di cellule T apoptotiche circolanti (Figura 25C). La percentuale di cellule T apoptotiche nelle PBMC à ̈ risultata significativamente più elevata nei pazienti rispetto ai 20 donatori sani analizzati (11,0 ± 7,7 contro 3,9 ± 3,9; P < ,001).
Per comprendere il motivo per cui le cellule autoepitopo-specifiche di pazienti mostranti risoluzione mostrano funzioni polifunzionali significativamente inferiori rispetto ai pazienti mostranti infezione cronica (Figura 19 A-D e Figura 20), nonostante la frequenza simile delle cellule CD8<+>pentamero<+>totali (Figura 1 E,F), l’autore ha condotto una serie di esperimenti funzionali. Innanzitutto, l’autore ha escluso le possibilità che le cellule T CD8<+>specifiche per epitopo apoptotico provenienti da pazienti guariti esprimessero un difetto intrinseco delle funzioni cellulari effettrici, o fossero derivate dal repertorio di cellule T CD8<+>naà ̄ve (Figura 26 e 27).
Collegamento dell’avidità del TCR delle cellule T CD8+ specifiche per epitopo apoptotico all’esito dell’infezione
Infine, l’autore ha ipotizzato che le differenze nell’avidità del TCR possano rispondere della diversa reattività delle cellule T CD8<+>specifiche per epitopo apoptotico tra i pazienti mostranti infezione cronica e quelli mostranti risoluzione di infezione. Per valutare l’avidità del TCR, l’autore ha esaminato le cinetiche di dissociazione del legame peptide/pentamero HLA-A*0201 alle cellule T CD8<+>antigene-specifiche che erano state isolate dai due gruppi di pazienti (28). In particolare, l’autore ha sottoposto a colorazione le cellule T CD8<+>fresche con quantità saturanti di pentameri HLA-A*0201 che erano stati complessati a epitopi apoptotici o virali e un mAb anti-CD8 per 45 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono poi state lavate e incubate a 4 °C con quantità saturanti di un mAb anti-HLA-A2 per impedire un secondo legame dei pentameri durante il saggio di dissociazione pentamerica. Il tasso di decadimento à ̈ stato misurato mediante citometria a flusso in punti temporali idonei. L’autore ha ottenuto diagrammi di decadimento lineari del logaritmo naturale della fluorescenza normalizzata rispetto al tempo in tutti gli esperimenti condotti, il che à ̈ risultato indicativo del fatto che il decadimento pentamerico si verificava stocasticamente e che il risultante t1/2della colorazione con pentamero dovrebbe essere proporzionale al t1/2dei rispettivi complessi pentamero/TCR (Figura 28A). Il t1/2per la colorazione con il pentamero complessato a epitopo apoptotico delle cellule T CD8<+>fresche provenienti da pazienti mostranti infezione cronica à ̈ risultato significativamente più lungo del decadimento della colorazione con pentamero delle cellule T CD8<+>provenienti da pazienti mostranti risoluzione di infezione (Figura 28 A,B). Al contrario, il t1/2per i pentameri complessati a epitopi virali in cellule T CD8<+>non differisce tra i pazienti mostranti infezione cronica e quelli mostranti risoluzione di infezione (Figura 28 A,B). Il t1/2per la colorazione con pentamero complessato a epitopo apoptotico in cellule T CD8<+>tendeva ad essere direttamente correlato (anche se non significativamente) alla carica virale (Figura 29). Infine, gli esperimenti di controllo in cui i pentameri HLA-A*0201 sono stati complessati a un peptide irrilevante non naturale hanno mostrato che il t1/2per la colorazione in cellule T CD8<+>non era rilevabile (dati non mostrati).
DISCUSSIONE
Nella presente invenzione, l’autore dimostra per la prima volta che la comparsa di risposte delle cellule TEMCD8<+>polifunzionali miste (di tipo-1,-2, -17) agli autoepitopi apoptotici à ̈ correlata all’evoluzione cronica di un’infezione acuta. In effetti, la multispecificità , l’intensità , e la forza polifunzionale delle risposte delle cellule TEMCD8<+>dirette verso gli autoepitopi apoptotici sono risultate sorprendentemente ampie e robuste durante la fase acuta dell’infezione da HCV, in particolare nei pazienti mostranti progressione cronica rispetto a quelli mostranti risoluzione di infezione. Le risposte sono risultate quindi sostenute nel tempo in relazione alla persistenza virale, suggerendo che siano in grado di contribuire all’immunopatologia e all’evoluzione cronica dell’infezione da HCV acuta. Questa ipotesi à ̈ ulteriormente supportata dalla prova di una diretta correlazione tra le frequenze delle cellule TEMCD8<+>pentamero<+>che producono prontamente IFN-γ o IL-17 in risposta agli epitopi apoptotici rilevanti, e la carica virale plasmatica o i livelli sierici di ALT (che rappresentano i più importanti segni clinici di danno epatico).
Recentemente, diversi modelli di infezione virale cronica hanno dimostrato che le cellule T CD4<+>o CD8<+>virus-specifiche che producono elevati livelli di IL-17 risultavano correlate alla persistenza virale o a una sindrome di disfacimento con infiltrazione neutrofila organica multipla (7, 29, 30). Attualmente, i nostri dati suggeriscono che la comparsa di elevate frequenze di cellule T CD8<+>autoreattive miste che producono un’ampia gamma di citochine (comprendenti IL-17) piuttosto che la disfunzione o la qualità alterata delle cellule T CD8<+>virus-specifiche à ̈ correlata alla progressione verso una malattia cronica nel modello umano di infezione da HCV acuta (31-35). In effetti, l’autore ha scoperto che le frequenze delle cellule effettrici virus-specifiche (che producono le diverse citochine analizzate) risultavano estremamente ridotte rispetto a quelle specifiche per epitopo apoptotico. Ciò à ̈ coerente con la maggior parte degli studi che rivelano che l’intensità delle risposte effettrici delle cellule T CD8 HCV-specifiche non à ̈ correlata all’esito clinico o virale dell’infezione da HCV acuta (Rif. in 35). In particolare, à ̈ stato riportato che le cellule T CD8 HCV-specifiche esprimono un fenotipo disfunzionale (scarse proliferazione, produzione di IFN-γ, e citotossicità ) e maggiori livelli di PD-1, noti per essere associati al fenotipo esaurito, indipendentemente dalla progressione dell’infezione (Rif. in 35).
La produzione di policitochine (IL-17, IFN-γ, IL-2, e IL-4) da parte delle cellule TEMCD8<+>autoreattive può avere importanti implicazioni nell’immunopatologia HCV-correlata, il che sottolinea l’importanza delle infezioni nell’induzione e nel mantenimento dell’autoimmunità (36). La produzione di IL-17 può rispondere dell’infiltrazione intraepatica transitoria di neutrofili riscontrata solamente nella fase precoce di un’infezione da HCV acuta (37). Pertanto, una tempestiva diminuzione del danno epatocitario e della conseguente evoluzione verso uno stato di malattia epatica cronica di basso livello, nei pazienti che sviluppano persistenza virale, può essere ottenuta attraverso la presenza simultanea di cellule TEMCD8<+>autoreattive di tipo 1, 2, e 17, che possono regolarsi tra di loro, e anche la capacità delle cellule TEMCD8<+>di tipo 17 di esprimere un certo grado di plasticità (2, 21-24), e di convertirsi in cellule TEMCD8<+>con caratteristiche combinate delle cellule di tipo 17 e 1. Pertanto, il contesto ambientale durante una malattia infiammatoria acuta sembra dover essere affrontato per garantire la polarizzazione coesistente delle cellule TEMCD8<+>di tipo 1, 2, e 17. Ciò à ̈ possibilmente richiesto per limitare l’eccessivo danno tissutale dell’ospite da parte di cellule TEMCD8<+>autoreattive di tipo 1 o di tipo 17 correttamente polarizzate, nonostante le risposte polifunzionali precedano quelle virus-specifiche, e può fornire immunopatologia cronica in uno stato di persistenza virale. In questo contesto, à ̈ interessante osservare che l’espressione di PD-1 (27) non à ̈ correlata all’esaurimento delle cellule T CD8<+>autoreattive, poiché queste continuano a produrre una vasta gamma di citochine ex vivo, e sono limitate solo parzialmente dalla capacità inibitoria della PD-1 in vitro. Una possibile spiegazione di ciò à ̈ data dal fatto che tali cellule T CD8<+>autoreattive possono essere meno suscettibili di esaurimento, probabilmente poiché vengono sottoposte più tardi a priming rispetto a quelle virus-specifiche, che al contrario mostrano un profondo fenotipo di esaurimento nei pazienti con epatite acuta o cronica (27, 33, 35). La sintonizzazione delle funzioni delle cellule TEMCD8<+>autoreattive PD-1-dipendente, nonché le elevate frequenze delle cellule TEMCD8<+>specifiche per epitopo apoptotico producenti IL-4, possono avere un ruolo chiave nella limitazione delle eccessive risposte funzionali, permettendo quindi l’evoluzione verso una malattia epatica infiammatoria cronica di basso livello (6, 38-40). A supporto di questa ipotesi, il nostro studio parallelo in pazienti affetti da infezione da HCV cronica a lungo termine dimostra che le cellule TEMCD8<+>specifiche per autoepitopo apoptotico sono rilegate nel fegato infiammato, in cui producono elevati livelli di IFN-γ e IL-2 che sono significativamente inferiori rispetto a quelli prodotti nei pazienti con epatite acuta, nonché livelli molto bassi o irrilevabili di IL-17. Alla luce di queste prove, l’autore può ragionevolmente presumere che le cellule TEMCD8<+>autoreattive polifunzionali miste possano provocare una robusta risposta antinfiammatoria nel fegato tramite l’effetto bystander delle citochine proinfiammatorie nei pazienti affetti da infezione da HCV acuta, nonostante la difficoltà di ottenere prontamente accesso alle cellule T che si infiltrano nel fegato provenienti da pazienti affetti da epatite acuta per ovvie ragioni etiche. Questa risposta acuta non sembra minacciare la sopravvivenza dell’ospite, probabilmente a causa dei vari meccanismi di controllo sopra menzionati, e subisce progressivamente un parziale esaurimento/contrazione nei pazienti con epatite cronica a lungo termine.
Diverse forme di malattie infiammatorie (14, 41), comprendenti infezione da HCV (42) sono correlate a una forte iper-reattività policlonale delle cellule T e B (attivazione immunitaria sistemica), che porta a una continua rotazione tra cellule T e B (42). In studi precedenti, l’autore ha fornito prove per cui il clivaggio da parte della caspasi permette il rilascio di frammenti autoantigenici provenienti da cellule apoptotiche e la successiva cross-presentazione dei peptidi elaborati rilevanti in un elevato numero di cellule T CD8<+>autoreattive (14). L’osservazione che la cross-presentazione di cellule T apoptotiche da parte delle DC attiva prontamente le cellule TEMCD8<+>specifiche per gli autoepitopi apoptotici caspasi-clivati ex vivo indica che questo meccanismo può essere attivo nell’induzione delle risultanti risposte autoreattive polifunzionali nei pazienti affetti da infezione da HCV acuta che mostrano una progressione cronica. Questa forma di attivazione autoimmunitaria sistemica à ̈ correlata infine all’evoluzione da infezione acuta a cronica e può avere un ruolo nell’immunopatologia epatica attraverso l’effetto by-stander delle citochine proinfiammatorie.
Un importante aspetto delle nostre scoperte à ̈ dato dal fatto che esse dimostrano la presenza di un collegamento tra l’avidità del TCR di cellule T CD8<+>autoreattive e la differenza nella reattività delle cellule T CD8<+>specifiche per epitopo apoptotico mostrata dai pazienti mostranti infezione cronica e da quelli mostranti risoluzione di infezione. Le cinetiche di dissociazione del legame peptide/pentamero HLA-A*0201 alle cellule T CD8<+>antigene-specifiche dimostrano chiaramente che il t1/2per la colorazione con il pentamero complessato a epitopo apoptotico in cellule T CD8<+>provenienti da pazienti mostranti infezione cronica à ̈ risultato significativamente più lungo del decadimento della colorazione con pentamero in pazienti mostranti risoluzione di infezione. Il t1/2per la colorazione con pentamero à ̈ stato rilevato su cellule T CD8<+>fresche isolate, suggerendo che l’avidità del TCR misurata da questo sistema riflette probabilmente ciò che avviene in vivo. Nello studio originale, questo approccio metodologico ha permesso di postulare che le cellule T con TCR leganti i complessi peptide/MHC per una durata maggiore sono selettivamente conservate rispetto alle cellule T che esprimono TCR con una minore avidità (28). Studi recenti suggeriscono che in risposta a diverse infezioni microbiche, inizialmente le cellule T naà ̄ve con un’ampia gamma di avidità vengono efficacemente reclutate ed espanse (43, 44); successivamente, quelle con una minore avidità subiscono una contrazione prematura, per cui quelle con maggiore avidità vengono selezionate a causa di una più prolungata espansione e sono correlate alla protezione (43, 44). I risultati ottenuti dall’autore forniscono un’ulteriore sfida a questo modello, e suggeriscono che le cellule T CD8<+>con una maggiore avidità per gli autoepitopi apoptotici sono sostenute nel tempo e sono correlate alla progressione verso l’infezione cronica. La selezione delle cellule T CD8<+>autoreattive con maggiori livelli di avidità avviene probabilmente a causa di una maggiore stimolazione da parte degli antigeni apoptotici (14). Al contrario, cellule T CD8<+>aventi una minore avidità in presenza di stimoli più deboli subirebbero una rapida contrazione, come riscontrato nel sangue periferico di pazienti con infezione da HCV autolimitata. Il livello della carica virale iniziale, che l’autore ha scoperto essere collegato al livello dell’avidità del TCR, può fornire le condizioni che influenzano la disponibilità di forti stimoli antigenici apoptotici. Inoltre, il nostro modello non esclude la possibilità che le cellule T CD8<+>cross-reattive, esprimenti anche due TCR (45), possano intervenire in questo processo.
In conclusione, i dati ottenuti dall’autore dimostrano che le risposte delle cellule T CD8 autoreattive contro gli epitopi associati a cellule T apoptotiche sono strettamente dipendenti dalla persistenza virale e correlate all’immunopatologia mediante l’ampia produzione di citochine infiammatorie. Questo modello rappresenta un esempio notevole dell’importanza delle infezioni nell’induzione e in particolare nel mantenimento dell’autoimmunità . Inoltre, il nostro studio fornisce una possibile spiegazione in merito al motivo per cui l’enorme espansione di cellule T attivate, durante infezioni virali persistenti, à ̈ solo minimamente attribuibile a cellule T virus-specifiche (14). L’autore può prevedere il seguente modello multifase. In condizioni di evasione immunitaria di HCV, si generano continue ondate di cellule T virus-specifiche disfunzionali, che possono fornire gli stimoli antigenici apoptotici iniziali per il priming delle cellule T apoptotiche antigene-specifiche.
In seguito, queste ultime possono eseguire le proprie funzioni proinfiammatorie attraverso la produzione di un’ampia gamma di citochine, subire apoptosi, diventare esse stesse un nuovo substrato per la selezione di cellule T apoptotiche antigene-specifiche con elevata avidità del TCR, e così via. A lungo termine, questa spirale viziosa può contribuire all’esito irreversibile che porta alla malattia epatica cronica. Al contrario, ciò non avverrebbe nei pazienti mostranti risoluzione di infezione, poiché il virus viene efficacemente annullato dalle risposte immunitarie protettive, e la radicale contrazione di queste ultime non permetterebbe lo stabilirsi dei pre-requisiti (precedentemente illustrati) necessari per avviare e sostenere risposte di cellule T apoptotiche ad elevata avidità antigene-specifiche. Per studiare se tali risposte sono tuttavia in grado di automantenersi indipendentemente dalla presenza virale in particolari circostanze, sono in corso ulteriori studi per verificare se queste scompaiono nei pazienti affetti da HCV in risposta alla terapia antivirale, o se persistono in quella minoranza di pazienti che continuano a mostrare infiammazione epatica, nonostante la clearance virale.
Infine, i risultati ottenuti dall’autore hanno implicazioni cliniche. Forniscono un’importante piattaforma per la progettazione di strategie terapeutiche innovative per riformulare risposte immunitarie protettive in infezioni persistenti. Le cellule T CD8<+>polifunzionali specifiche per gli epitopi apoptotici possono prevedere l’infezione cronica in altre infezioni acute (vale a dire, HBV o HIV) che sviluppano persistenza virale. Di conseguenza, le terapie antivirali possono essere somministrate prima in modo tale da migliorare i tassi di clearance virale nei pazienti infetti che si presume possano entrare in uno stato di infezione cronica (46, 47). La rilevazione di queste cellule T CD8<+>autoreattive può inoltre essere rilevante per determinare se la contrazione o la variazione qualitativa delle risposte polifunzionali possono essere usate come biomarcatori per verificare gli effetti protettivi di terapie antivirali convenzionali o innovative.
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48. Barnaba V Nature. 1990;345(6272):258-260.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per prevedere l’esito di un’infezione virale e/o per monitorare il progresso di un’infezione virale e/o per monitorare l’efficacia di una terapia per un’infezione virale in un soggetto affetto da detta infezione virale comprendente le fasi di: a) isolamento di un campione biologico comprendente cellule T dal soggetto; b) incubazione del campione biologico isolato con almeno un peptide avente una lunghezza da 9 a 10 aa e avente una sequenza compresa nella sequenza selezionata tra: -da aa 13 ad aa 465 della SEQ ID N. 366 di vimentina (VIME, numero di accesso P08670); -da aa 126 ad aa 1930 della SEQ ID N. 367 di miosina non muscolare (MYH9, numero di accesso P35579); -da aa 14 ad aa 386 della SEQ ID N.368 di Lamina B1 (LAM1, numero di accesso P20700); -da aa 22 ad aa 196 della SEQ ID N. 369 di inibitore-2 di dissociazione di Rho GDP (GDIS, numero di accesso P52566); -da aa 22 ad aa 433 della SEQ ID N. 370 di ribonucleoproteina K nucleare eterogenea (ROK, numero di accesso Q07244); -da aa 12 ad aa 312 della SEQ ID N. 371 di actina citoplasmatica-1 (ACTB, numero di accesso P02570); -da aa 90 ad aa 239 della SEQ ID N. 372 di fosfoglicerato mutasi-1 (PMG1, numero di accesso P18669); -da aa 12 ad aa 328 della SEQ ID N. 373 di tropomodulina ubiquitaria (TMO3, numero di accesso Q9NYL9); -da aa 45 ad aa 290 della SEQ ID N. 374 di proteina UNR-interagente (UNRI, numero di accesso Q9Y3F4); -da aa 1 ad aa 214 della SEQ ID N. 375 di subunità -α di tipo 1 del proteasoma (PSA1, numero di accesso P25786); -da aa 1 ad aa 94 della SEQ ID N. 376 di proteina ribosomiale acida P2 da 60S (RLA2, numero di accesso P05387); -da aa 6 ad aa 259 della SEQ ID N. 377 di Annexin V (ANX5, numero di accesso P08758); -da aa 11 ad aa 393 della SEQ ID N.378 di proteina p57 Coronina-similare (CO1A, numero di accesso P31146); o -da aa 26 ad aa 516 della SEQ ID N.379 di subunità -β di proteina-1 di complesso T (TCBP, numero di accesso P78371); in condizioni idonee per generare una risposta delle cellule T; c) misurazione della risposta delle cellule T; d) comparazione tra la risposta delle cellule T misurata e la risposta delle cellule T misurata di un campione di controllo idoneo.
- 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il campione biologico à ̈ un campione di PBMC.
- 3. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’almeno un peptide di fase b) comprende una sequenza essenzialmente costituita da una sequenza selezionata da SEQ ID N.1 a SEQ ID N.252.
- 4. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’almeno un peptide di fase b) comprende una sequenza essenzialmente costituita dalla sequenza selezionata tra LLQDSVDFSL (SEQ ID N. 204), QLFNHTMFI (SEQ ID N. 64) o VLMIKALEL (SEQ ID N.78).
- 5. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase b) comprende l’incubazione del campione biologico con un pool di peptidi selezionato tra i seguenti pool: - pool 1: SEQ ID N.1, 2, 4, 5, 8 e 9; - pool 2: SEQ ID N.14, 16, 19, 19 e 20; - pool 3: SEQ ID N.27, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 37 e 40; - pool 4: SEQ ID N.58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66 e 67; - pool 5: SEQ ID N.68, 69, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 83, 84 e 88; - pool 6: SEQ ID N. 89, 90, 91, 92, 99, 100, 104, 105, 106, 111, 117, 123, 126 e 127; - pool 7: SEQ ID N.198, 199, 200, 201, 202, 204, 206, 210, 211 e 220; - pool 8: SEQ ID N. 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243 e 244 o - pool 9: SEQ ID N.245, 246, 247, 248 e 249.
- 6. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la risposta delle cellule T Ã ̈ una risposta di cellule T CD8<+>.
- 7. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la risposta delle cellule T viene misurata mediante un saggio Elispot.
- 8. Il metodo secondo la rivendicazione 7, in cui il saggio Elispot à ̈ un saggio Elispot di interferone-gamma, IL-17 o IL-4.
- 9. Un metodo per prevedere l’esito di un’infezione virale e/o per monitorare il progresso di un’infezione virale e/o per monitorare l’efficacia di una terapia per un’infezione virale in un soggetto affetto da detta infezione virale comprendente la fase di rilevazione e/o quantificazione della quantità di autoanticorpi diretti contro almeno un peptide definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1, 3, 4 o 5.
- 10. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’infezione virale à ̈ causata da un virus selezionato dal gruppo di HCV, HBV, HIV.
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