ITRM20090328A1 - Agente anticancro specifico per i tumori cerebrali con meccanismo disoppressione di recq1 - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione avente per titolo: “AGENTE ANTICANCRO SPECIFICO PER I TUMORI CEREBRALI CON MECCANISMO DI SOPPRESSIONE DI RECQ1â€

Settore tecnico

La presente invenzione si riferisce al settore dell’ingegneria genetica e alle sue applicazioni in medicina.

In particolare, la presente invenzione si riferisce all’uso di un agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, comprendente almeno un composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1, più in particolare un siRNA (small interfering RNA), e ad una composizione farmaceutica comprendente tale agente anticancro.

Stato dell’Arte

Le elicasi RecQ sono una famiglia ubiquitaria di enzimi che svolgono il DNA coinvolti nel mantenimento della stabilità dei cromosomi. Nelle cellule umane sono stati trovati cinque membri della famiglia RecQ: BLM, RECQ1 (noto anche come RECQL o RECQL1), RECQ4, RECQ5 e WRN (Hickson, I.D. RecQ helicases: caretakers of the genome. Nat Rev Cancer 3, 169-78 (2003); Opresko, P.L., Cheng, W.H. & Bohr, V.A. Junction of RecQ helicase biochemistry and human disease. J Biol Chem 279, 18099-102 (2004); Wu, L. & Hickson, I.D. DNA helicases required for homologous recombination and repair of damaged replication forks. Annu Rev Genet 40, 279-306 (2006)). Mutazioni nei geni di tre membri umani della famiglia RecQ, sono collegate a disturbi genetici definiti, associati ad instabilità genomica, predisposizione al cancro e caratteristiche di invecchiamento prematuro; cioà ̈ sindrome di Bloom (mutazioni del gene BLM), sindrome di Werner (WRN), e sindrome di Rothmund-Thomson, sindrome di RAPADILINO e Baller-Gerold (tutte causate da mutazione di RECQ4) (Ellis, N.A. et al. The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases. Cell 83, 655-66 (1995); Yu, C.E. et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science 272, 258-62 (1996); Kitao, S., Lindor, N.M., Shiratori, M., Furuichi, Y. & Shimamoto, A. Rothmund-thomson syndrome responsible gene, RECQL4: genomic structure and products. Genomics 61, 268-76 (1999); Siitonen, H.A. et al. Molecular defect of RAPADILINO syndrome expands the phenotype spectrum of RECQL diseases. Hum Mol Genet 12, 2837-44 (2003), Van Maldergem, L. et al. Revisiting the craniosynostosis-radial ray hypoplasia association: Baller-Gerold syndrome caused by mutations in the RECQL4 gene. J Med Genet 43, 148-52 (2006)). Mutazioni nei geni RECQ1 e RECQ5 possono essere responsabili di ulteriori disturbi di predisposizione al cancro, ma questo deve ancora essere provato. A questo proposito, candidati interessanti sono pazienti con un fenotipo simile a quello degli individui con RTS che non portano nessuna mutazione nel gene RECQ4. Inoltre, studi recenti hanno collegato un polimorfismo a singolo nucleotide presente nel gene RECQ1 ad una ridotta sopravvivenza nei pazienti con cancro pancreatico (Li, D. et al. Single nucleotide polymorphisms of RECQ1, RAD54L, and ATM genes are associated with reduced survival of pancreatic cancer. J Clin Oncol 24, 1720-8 (2006); Li, D. et al. Significant effect of homologous recombination DNA repair gene polymorphisms on pancreatic cancer survival. Cancer Res 66, 3323-30 (2006)).

Studi biochimici hanno dimostrato che le elicasi RecQ svolgono il DNA con una polarità da 3’ a 5’ e, sebbene con alcune differenze, sono capaci di svolgere una varietà di strutture di DNA diverse da duplex standard di DNA di forma B. Coerentemente con la capacità di svolgere varie strutture del DNA, diverse funzioni cellulari sono state attribuite alle proteine RecQ, compresi i ruoli nella stabilizzazione e riparazione di forche di replicazione del DNA danneggiate, mantenimento dei telomeri, ricombinazione omologa, e segnalazione di controllo di danni al DNA (Bachrati, C.Z. & Hickson, I.D. RecQ helicases: guardian angels of the DNA replication fork. Chromosoma 117, 219-33 (2008); Bohr, V.A. Rising from the RecQ-age: the role of human RecQ helicases in genome maintenance. Trends Biochem Sci (2008); Ouyang, K.J., Woo, L.L. & Ellis, N.A. Homologous recombination and maintenance of genome integrity: cancer and aging through the prism of human RecQ helicases. Mech Ageing Dev 129, 425-40 (2008); Sharma, S., Doherty, K.M. & Brosh, R.M., Jr. Mechanisms of RecQ helicases in pathways of DNA metabolism and maintenance of genomic stability. Biochem J 398, 319-37 (2006)).

Studi biochimici e genetici supportano ruoli per tutte e cinque le RecQ elicasi umane nella replicazione del DNA, nella ricombinazione del DNA e nella risposta a danni al DNA, nonostante il preciso e unico ruolo di ciascuna elicasi RecQ umana non sia ancora stato ben definito, e molte domande riguardanti le distinte funzioni delle elicasi RecQ rimangono senza risposta. Quindi, capire come questi enzimi funzionino e regolino le loro attività di processamento del DNA à ̈ importante se vogliamo far luce sui meccanismi che controllano l’integrità del genoma, e prevenire il cancro e l’invecchiamento.

Per quanto riguarda RECQ1, un ruolo specifico di questa elicasi nel mantenere l'integrità del genoma à ̈ supportato da analisi di fibroblasti embrionali da topi mancanti di RECQ1 che sono ipersensibili a radiazioni ionizzanti e mostrano un maggiore livello di danno al DNA e scambi tra cromatidi fratelli (Sharma, S. et al. RECQL, a member of the RecQ family of DNA helicases, suppresses chromosomal instability. Mol Cell Biol 27, 1784-94 (2007)).

Delle cinque proteine umane appartenenti alla famiglia di RecQ elicasi, RECQ1, BLM, WRN e RECQ4 sono espresse a livelli trascurabili nelle cellule a riposo (resting cells), mentre sono espresse ad alti livelli nelle cellule la cui proliferazione à ̈ stata aumentata da trasformazione con virus (si veda Kawabe, T., Tsuyama, N., Kitao, S., Nishikawa, K., Shimamoto, A., Shiratori, M., Matsumoto, T., Anno, K., Sato, T., Mitsui, Y., Seki, M., Enomoto, T., Goto, M., Ellis, N.A., Ide, T., Furuichi, Y, and Sugimoto, M., "Differential regulation of human RecQ famiIy helicases in celI transformation and celI cycle.", Oncogene., 2000, VoI. 19, No. 41, pp. 4764-4772). Inoltre quando il promotore tumorale TPA viene aggiunto alle cellule a riposo, l’espressione di RECQ1, BLM, WRN e RECQ4 à ̈ indotta insieme con l’induzione della divisione cellulare (si veda Kawabe, T., Tsuyama, N., Kitao, S., Nishikawa, K., Shimamoto, A., Shiratori, M., Matsumoto, T., Anno, K., Sato, T., Mitsui, Y., Seki, M., Enomoto, T., Goto, M., Ellis, N.A., Ide, T., Furuichi, Y, and Sugimoto, M., "Differential regulation of human RecQ famiIy helicases in celI transformation and celI cycle.", Oncogene., 2000, VoI.19, No.41, pp. 4764-4772). Queste scoperte suggeriscono l’importanza delle elicasi di DNA RecQ nella proliferazione cellulare.

Inoltre, i livelli di espressione dei geni appartenenti alla famiglia di elicasi del DNA RecQ sono marcatamente più alti nelle cellule tumorali (domanda di brevetto pubblicazione No EP1625853).

Studi precedenti hanno dimostrato che BLM Ã ̈ altamente espressa nelle cellule di tumore sia di origine linfoide sia epiteliale e che questo riflette la maggioranza delle cellule proliferanti che sono presenti nei tumori rispetto ai tessuti normali della stessa origine (Turley, H., Wu, L., Canamero, M., Gatter, K.C. & Hickson, I.D. The distribution and expression of the Bloom's syndrome gene product in normal and neoplastic human cells. Br J Cancer 85, 261-5 (2001)).

Similarmente, Ã ̈ stato anche recentemente suggerito che WRN sia coinvolta nella promozione della crescita delle cellule tumorali (Opresko, P.L., Calvo, J.P. & von Kobbe, C. Role for the Werner syndrome protein in the promotion of tumor cell growth. Mech Ageing Dev 128, 423-36 (2007)).

Prese collettivamente, queste scoperte suggeriscono che le elicasi del DNA della famiglia RecQ possono essere potenziali molecole bersaglio per terapie anticancro.

In particolare RECQ1 può essere considerato come un nuovo bersaglio idoneo per lo sviluppo di terapie anticancro volte all’eliminazione delle cellule proliferanti del tumore, sebbene il suo ruolo come fattore correlato agli oncogeni non sia ancora stato descritto.

A riguardo di ciò, un ruolo di RECQ1 specifico nel cancro à ̈ supportato da due recenti articoli che mostrano che il silenziamento di RECQ1 nelle cellule di cancro risulta in una catastrofe mitotica e una somministrazione locale e sistemica di siRNA contro RecQL1 miscelati con polimeri di polietileneimmina o liposomi cationici previene la proliferazione delle cellule cancerogene in modelli di topo in vivo (Futami, K. et al. Induction of mitotic cell death in cancer cells by small interference RNA suppressing the expression of RecQL1 helicase. Cancer Sci 99, 71-80 (2008); Futami, K. et al. Anticancer activity of RecQL1 helicase siRNA in mouse xenograft models. Cancer Sci 99, 1227-36 (2008)).

Nella domanda di brevetto pubblicazione No EP1816194 vengono descritti degli inibitori della proliferazione cellulare specifici per il cancro comprendenti in particolare siRNA capaci di sopprimere l’espressione del gene RECQ1.

Nella domanda di brevetto pubblicazione No EP1625853 vengono descritti degli induttori dell’apoptosi per cellule cancerogene comprendenti in particolare siRNA che sopprimono l’espressione dei geni della famiglia di elicasi di DNA RecQ.

Nelle summenzionate domande di brevetto si sostiene che composti contro RECQ1 possono essere usati nella terapia di diversi tipi di tumore. Tuttavia, RECQ1 à ̈ normalmente presente anche nel relativo tessuto sano per cui, sebbene i composti descritti nei brevetti precedenti vengano definiti come specifici per le cellule cancerogene, i dati riguardanti la selettività dei composti descritti nei riguardi delle cellule cancerogene non sono così accurati da poter rendere i composti descritti sicuri e privi di pericoli ed effetti collaterali. In particolare, il fatto che nelle summenzionate domande di brevetto siano state usate cellule murine TIG3 come modello di cellule normali non à ̈ sufficiente a garantire la sicurezza dell’utilizzo di questi composti nell’uomo. A questo proposito, il topo knock-out di WRN non ha mostrato nessun fenotipo associabile alla sindrome di WRN (mentre un fenotipo simile alla sindrome di WRN à ̈ stato osservato nel topo solo nel caso del doppio knock-out di WRN e p53) sottolineando come vi siano delle significative differenze tra il modello murino e quello umano (Lebel, M. and Leder, P. A deletion within murine WRN syndrome helicase induces sensitivity to inhibitors of topoisomerase and loss of cellular proliferative capacity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13097-14012; Lombard, D.B. et al. Mutations in the WRN gene in mice accelerate mortality in a p53-null background. Mol. Cell. Biol. 20, 3286-3291; Lebel, M. et al. Tumorigenic effect of nonfunctional p53 or p21 in mice mutant in the Werner syndrome helicase. Cancer Res.61, 1816-1819).

Alla luce di quanto descritto nello stato dell’arte, l’esperto del settore non avrebbe la sicurezza che gli inibitori di RECQ1, in particolare come descritti nelle summenzionate EP1816194 e EP1625853, abbiano quella selettività tra tessuto tumorale e tessuto normale circostante tale tumore da consentire una terapia con effetti collaterali limitati o comunque accettabili.

E’ quindi tuttora sentita la necessità di avere dei composti da utilizzare nella terapia contro i tumori, che posseggano una tossicità selettiva verso le cellule cancerogene, e che non danneggino i tessuti sani circostanti il tumore.

Questa necessità à ̈ sentita in modo particolare per quei tumori di difficile trattamento o particolarmente aggressivi.

A questo proposito, il glioblastoma à ̈ l’istotipo più comune ed aggressivo di tumore cerebrale con una prognosi infausta (Mrugala, M.M. & Chamberlain, M.C. Mechanisms of disease: temozolomide and glioblastoma--look to the future. Nat Clin Pract Oncol 5, 476-86 (2008); Stummer, W. et al. Fluorescence-guided surgery with 5-aminolevulinic acid for resection of malignant glioma: a randomised controlled multicentre phase III trial. Lancet Oncol 7, 392-401 (2006)). Il tasso medio di sopravvivenza à ̈ solo 10-14 mesi, nonostante uno sforzo interdisciplinare terapeutico che comprende la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia (Sathornsumetee, S. & Rich, J.N. New treatment strategies for malignant gliomas. Expert Rev Anticancer Ther 6, 1087-104 (2006)).

Sono stati elaborati protocolli molto complicati per trattare i tumori cerebrali, come ad esempio un metodo di radioimmunoterapia perioperativa a due stadi comprendente uno stadio locoregionale intraoperativo in cui viene introdotto un agente dotato di tropismo tumorale e un secondo stadio sistemico post-operativo in cui viene somministrata la dose di agente anticancro dotato di affinità per il primo agente (Domanda di brevetto US 2006-0251579 A1). Quindi, nuovi protocolli terapeutici sono estremamente necessari.

Sommario dell’invenzione

È stato ora sorprendentemente trovato che l’espressione di RECQ1 à ̈ drammaticamente elevata nel glioblastoma di cervello umano rispetto a tessuti di cervello di controllo suggerendo che questa elicasi à ̈ un bersaglio ideale di nuove terapie per tumori al cervello.

Pertanto, à ̈ un oggetto della presente invenzione l’uso di un agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, dove tale agente comprende almeno un composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1.

Descrizione dell’Invenzione

I presenti inventori hanno trovato che solamente nel caso del tumore al cervello, l’alta espressione di RECQ1 à ̈ accoppiata ad una quasi totale assenza della stessa proteina nei tessuti perilesionali e normali. Pertanto, RECQ1 à ̈ un bersaglio ideale per la chemioterapia, soprattutto nel caso di tumori cerebrali, poiché la sua deplezione tramite RNAi, o la sua inibizione mediante composti selettivi colpirebbero solo le cellule tumorali, prevenendo in questo modo possibili effetti negativi sulle cellule normali.

Oggetto della presente invenzione à ̈ l’uso di un agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, dove tale agente comprende almeno un composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1.

In una prima realizzazione preferita dell’invenzione detto composto à ̈ un siRNA avente un’attività di RNA interference contro RECQ1.

In una seconda realizzazione preferita dell’invenzione, detto siRNA à ̈ un dsRNA comprendente:

a. un RNA senso avente una sequenza omologa ad una sequenza arbitraria di 19-25 nucleotidi dell’RNA messaggero del gene RECQ1 e

b. un RNA antisenso avente la sequenza complementare a detto RNA senso ed eventualmente

c. avente una o due sporgenze nucleotidiche alle due estremità 3’.

In una ulteriore realizzazione dell’invenzione detto siRNA viene formato dopo trascrizione da un plasmide o sintesi esogena, ad esempio sintesi enzimatica in vitro mediante l’uso di appropriate enzimi di trascrizione.

Nella realizzazione della presente invenzione che prevede la formazione del siRNA da un plasmide, detto siRNA può essere uno short hairpin RNA formato dopo trascrizione da un singolo promotore di detto plasmide o può essere uno short dsRNA formato dopo trascrizione da due promotori convergenti fiancheggianti su detto plasmide.

In una forma di realizzazione della presente invenzione detto siRNA può essere generato dopo taglio con nucleasi da dsRNA più lunghi.

In un’ulteriore forma di realizzazione detto siRNA viene sintetizzato chimicamente.

Preferibilmente, uno dei due filamenti di detto siRNA comprende la sequenza nucleotidica di una qualsiasi di SEQ ID NO: 1-4: 5’-GAGCUUAUGUUACCAGUUA-3’ (SEQ ID NO: 1), 5’-CUACGGCUUUGGAGAUAUA-3’ (SEQ ID NO: 2), 5’-GAUUAUAAGGCACUUGGUA-3’ (SEQ ID NO: 3), 5’-GGGCAAGCAAUGAAUAUGA-3’ (SEQ ID NO: 4).

La presente invenzione sarà ora descritta in dettaglio anche per mezzo di esempi

e figure.

Nelle figure:

Figura 1. Espressione di RECQ1 in tessuto di glioblastoma. (A) Analisi immmunoistochimica del tessuto perilesionale e tumorale effettuata utilizzando l’anticorpo anti-RECQ1 RQ-FL mediante il dispositivo automatico Benchmark (Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA). I nuclei positivi per la proteina sono in marrone e i tessuti sono stati controcolorati con ematossilina (ingrandimento 400x). (B) Espressione di RECQ1 in tessuto cerebrale autoptico. L’analisi immmunoistochimica à ̈ stata effettuata manualmente utilizzando l’anticorpo anti-RECQ1 RQ-FL. I nuclei positivi per la proteina sono in marrone e i tessuti sono stati controcolorati con ematossilina (A: ingrandimento 200x; B: ingrandimento 400x). (C) Western blot. Analisi western blot di proteine estratte da tessuto perilesionale di glioblastoma (linee 2,4,6,8), da glioblastoma multiforme (linee 1,3,5,7,10), e da tessuto cerebrale autoptico (9,11) utilizzando l’anticorpo anti-RECQ1 RQ-FL. L’immunoblotting diretto contro l’α-tubulina à ̈ stato utilizzato come controllo interno, per verificare che la stessa quantità di proteina fosse caricata in ogni pozzetto del gel.

Figura 2. Espressione di RECQ1 in tessuti tumorali di diversa origine. (A) glioblastoma multiforme, (B) carcinoma del colon, (C) cancro del polmone e (D) cancro della tiroide. Nelle figure di sinistra, l’area perilesionale, in quelle di destra l’area tumorale. L’analisi immmunoistochimica à ̈ stata effettuata manualmente utilizzando gli anticorpi anti-RECQ1 RQ-FL. I nuclei positivi per la proteina sono in marrone e i tessuti sono stati controcolorati con ematossilina. (Ingrandimento 200x)

Figura 3. Capacità proliferativa delle cellule T98G trasfettate in maniera transiente con siRNA contro RECQ1. (A) Saggio di clonogenicità condotto nelle cellule controllo e nelle cellule silenziate transientemente per RECQ1. La figura mostra le colonie formate dopo la piastratura di 100, 200, 400, 800, 1600 e 3200 (rispettivamente dal pozzetto 1 al 6). L’efficienza di piastratura (PE) à ̈ data dal rapporto medio fra il numero di colonie formate e il numero di cellule piastrate, espresso in percentuale. (B) Analisi western blot di cellule T98G trasfettate con l’siRNA contro RECQ1 usando gli anticorpi anti-RECQ1 RQ-CT e anti-α-tubulina. (C) Quantificazione dei saggi di clonogenicità.

Figura 4. Capacità proliferativa delle cellule T98G trasfettate stabilmente con un shRNA contro RECQ1. (A) Saggio di clonogenicità condotto nelle cellule controllo e nei cloni silenziati per RECQ1. La figura mostra le colonie formate dopo la piastratura di 100, 200, 400, 800, 1600 e 3200 (rispettivamente dal pozzetto 1 al 6). L’efficienza di piastratura (PE) à ̈ data dal rapporto medio fra il numero di colonie formate e il numero di cellule piastrate, espresso in percentuale. (B) Quantificazione dei saggi di clonogenicità

Figura 5. Il silenziamento di RECQ1 induce l’accumulo spontaneo di foci γ-H2AX. (A) L’immagine mostra l’immunocolorazione delle proteine endogene RECQ1 e γ-H2AX in cellule T98G dopo trattamento con siRNA anti-RECQ1 e in cellule T98G non trattate, usate come controllo. (B) I grafici mostrano la distribuzione percentuale delle cellule positive per i foci γ-H2AX, espressa come numero di foci per cellula.

Figura 7. Il silenziamento di RECQ1 induce l’accumulo spontaneo di foci RAD51 durante la fase S del ciclo cellulare. (A) L’immagine mostra l’immunocolorazione della proteina endogena RAD51 e l’incorporazione di BrdU in cellule T98G dopo trattamento con RNAi anti-RECQ1 e in cellule T98G non trattate, usate come controllo. (B) I grafici mostrano la distribuzione percentuale delle cellule positive per i foci RAD51, espressa come numero di foci per cellula.

Modi per Realizzare l’Invenzione

Ai sensi della presente invenzione, per “composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1†si intende un composto che, agendo ai diversi livelli dell’espressione genica, impedisce la formazione della proteina RECQ1.

Ai sensi della presente invenzione, per “impedisce la formazione della proteina RECQ1†si intende che l’espressione della proteina à ̈ nulla o ridotta a un livello significativo dal punto di vista clinico.

Come detto sopra, l’alta espressione di RECQ1 nel glioblastoma del cervello umano à ̈ accoppiata ad una quasi totale assenza della stessa proteina nei tessuti perilesionali e normali.

Ai sensi della presente invenzione, per “quasi totale assenza†di RECQ1 nei tessuti perilesionali e normali si intende una quantità non significativamente rilevabile della proteina oppure una quantità tale che, alle dosi terapeutiche dell’agente che sopprime l’espressione del gene RECQ1, non vi sono effetti negativi nei confronti dei tessuti perilesionali e normali.

Quindi, l’uso di un agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, dove tale agente comprende almeno un composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1 costituisce una soluzione al problema della cura del tumore cerebrale, in particolare del glioblastoma, in maniera specifica, ossia senza effetti collaterali e tossici nei confronti del tessuto sano.

Questo aspetto soddisfa anche quella parte di problema generale della terapia dei tumori, ancora oggi affetta da fenomeni di tossicità e di scarsa tollerabilità da parte del paziente.

In una forma particolare della presente invenzione, tale agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, comprende siRNA aventi un’attività di RNA interference contro RECQ1.

Il termine “RNAi†o “RNA interference†si riferisce ad un fenomeno di silenziamento post-trascrizionale sequenza-specifico mediato da “piccoli RNA interferenti†(small interfering RNA, siRNA) (Fire et al., Nature, 391, 806-11 (2001)) dove l’espressione del gene bersaglio à ̈ inibita inducendo la degradazione dell’mRNA del gene bersaglio. Questa degradazione à ̈ causata tramite introduzione nelle cellule di un RNA a doppio filamento (dsRNA) che comprende, a) un RNA senso avente una sequenza omologa ad una sequenza dell’RNA messaggero di un gene bersaglio e b) un RNA antisenso comprendente una sequenza complementare all’RNA senso. Mentre il meccanismo preciso dell’RNAi rimane ancora non del tutto chiaro, si pensa che un enzima chiamato DICER (un membro della famiglia di nucleasi RNasi III) contatti l’RNA a doppio filamento, lo degradi in piccoli frammenti chiamati “piccoli RNA interferenti†(small interfering RNA) o “siRNA†. Gli siRNA derivati dall’attività di DICER sono formati tipicamente da circa 21-23 nucleotidi in lunghezza e includono duplex di circa 19 coppie di basi. Gli RNA a doppio filamento della presente invenzione comprendenti gli effetti di RNAi si riferiscono preferibilmente a questi siRNA.

La risposta dell’RNAi à ̈ caratterizzata anche da un complesso endonucleasico contenente un siRNA, chiamato comunemente RISC (“RNA-induced silencing complex†) che media il taglio di RNA a singolo filamento avente una sequenza complementare al filamento antisenso del duplex dello siRNA (Elbashir et al., Nature, 411, 494-498 (2001).

Gli siRNA possono essere costituiti in vitro utilizzando oligonucleotidi sintetici o appropriati enzimi di trascrizione o in vivo utilizzando appropriati enzimi di trascrizione o vettori di espressione.

Nella presente invenzione l’agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, non à ̈ limitato agli siRNA ma può comprendere altri agenti, quali ad esempio microRNA aventi un’attività di silenziamento posttrascrizionale contro RECQ1, comprendenti un filamento di RNA avente una sequenza parzialmente complementare a una sequenza arbitraria di 19-25 nucleotidi dell’RNA messaggero del gene RECQ1.

L’esperto dell’arte può facilmente ottenere informazioni sulle sequenze nucleotidiche del gene RECQ1 della presente invenzione dai database genici pubblici (ad esempio GenBank).

I geni di RECQ1 della presente invenzione includono tipicamente, ma non sono limitati a, quelli derivati dagli animali, più preferibilmente quelli derivati dai mammiferi e più preferibilmente quelli derivati dagli umani.

La presente invenzione si riferisce all’uso di RNA a doppio filamento che sono RNA (siRNA) comprendenti un RNA senso avente una sequenza omologa ad una sequenza arbitraria di 19-25 nucleotidi dell’RNA messaggero del gene RECQ1 e un RNA antisenso, avente la sequenza complementare a detto RNA senso.

In generale, dato che gli RNA a doppio filamento con una sporgenza al 3’ di alcuni nucleotidi ad una terminazione hanno effetti forti di RNAi, gli RNA a doppio filamento usati nella presente invenzione comprendono preferibilmente una sporgenza di alcuni nucleotidi ad una terminazione. La lunghezza dei nucleotidi che formano la sporgenza come anche la sequenza non sono particolarmente limitate. Queste sporgenze possono essere di DNA o RNA. Per esempio, la sporgenza à ̈ di due nucleotidi. Entrambi i filamenti dell’siRNA possono includere una sporgenza ad una terminazione, la cui lunghezza può essere la stessa o diversa per ciascun filamento. Preferibilmente detta sporgenza può essere presente su entrambi i filamenti degli siRNA. Le sporgenze possono anche essere stabilizzate contro la degradazione, includendo nucleotidi purinici o sostituendo nucleotidi pirimidinici con analoghi modificati.

La porzione di RNA duplex dello siRNA può essere parte di un breve RNA a forcina (short hairpin RNA, shRNA). Quindi shRNA possono ugualmente essere utilizzati nella presente invenzione. La struttura a forcina può anche contenere porzioni sporgenti al 3’ o al 5’.

Quindi, molecole che possono formare una struttura di RNA a doppio filamento intramolecolare possono essere utilizzate nella presente invenzione.

Gli RNA utilizzati per ottenere RNAi non devono essere necessariamente completamente identici (omologhi) al gene dell’elicasi RECQ1 o ad una porzione del gene; tuttavia à ̈ preferibile un RNA di questo tipo.

Gli siRNA aventi un’attività di RNAi contro i geni RECQ1 utilizzati nella presente invenzione possono essere idoneamente prodotti dall’esperto del ramo basandosi sulle sequenze nucleotidiche di RECQ1. Se uno dei filamenti à ̈ stato determinato, la sequenza nucleotidica dell’altro filamento (il filamento complementare) può essere facilmente determinato dall’esperto dell’arte. Gli siRNA utilizzati nella presente invenzione possono essere prodotti in maniera idonea dall’esperto dell’arte utilizzando sintetizzatori di acidi nucleici disponibili in commercio. Comuni servizi di sintesi personalizzati possono anche essere usati per sintetizzare gli RNA desiderati. Gli siRNA possono essere sintetizzati come due molecole di RNA separate e complementari o come una singola molecola di RNA con due regioni complementari.

Gli siRNA utilizzati nella presente invenzione possono derivare da dsRNA più lunghi che possono essere processati a siRNA più corti, per esempio in presenza dell’enzima Dicer.

Una forma di realizzazione preferita della presente invenzione utilizza siRNA nei quali uno dei due filamenti comprende la sequenza nucleotidica di una qualsiasi di SEQ ID NO: 1-4: 5’-GAGCUUAUGUUACCAGUUA-3’ (SEQ ID NO: 1), 5’-CUACGGCUUUGGAGAUAUA-3’ (SEQ ID NO: 2), 5’-GAUUAUAAGGCACUUGGUA-3’ (SEQ ID NO: 3), 5’-GGGCAAGCAAUGAAUAUGA-3’ (SEQ ID NO: 4).

Inoltre, à ̈ anche compreso nella presente invenzione l’uso di DNA che permettono l’espressione degli siRNA qui utilizzati. In maniera specifica, la presente invenzione riguarda DNA (vettori o plasmidi) che permettono l’espressione di RNA a doppio filamento utilizzati nella presente invenzione. In una forma di realizzazione, il plasmide à ̈ progettato per includere una sequenza codificante per il filamento senso e una per l’antisenso dell’RNA a doppio filamento. Le sequenze codificanti possono essere la stessa sequenza, ad esempio fiancheggiata da promotori invertiti (si veda la domanda di brevetto WO01/77350), o possono essere due sequenze separate ciascuna sotto il controllo trascrizionale di promotori separati. Dopo che la sequenza codificante viene trascritta, i trascritti di RNA complementari si appaiano per formare un dsRNA. L’esperto del ramo può facilmente preparare un DNA come descritto sopra con tecniche di ingegneria genetica convenzionali. Più specificatamente i vettori di espressione usati nella presente invenzione possono essere preparati inserendo in maniera appropriata il DNA codificante gli RNA usati nella presente invenzione in vari vettori di espressioni noti.

Detti DNA vengono introdotti nelle cellule ospite tramite trasfezione con qualsiasi procedura utile per l’introduzione in una particolare cellula, ad esempio metodi biologici o fisici, per produrre una cellula avente il DNA ricombinante stabilmente integrato nel suo genoma o esistente come elemento episomale, in modo che le molecole di DNA usate nella presente invenzione siano espresse dalla cellula ospite. Metodi fisici per introdurre un doppio filamento di DNA o RNA in una cellula ospite includono ma non sono limitati a precipitazione con calcio fosfato, lipofezione, DEAE-destrano, bombardamento di particelle, microiniezione, elettroporazione, immunoliposomi, lipidi, lipidi cationici, fosfolipidi o liposomi o simile.

L’esperto dell’arte capirà che qualsiasi metodo può essere usato per trasportare duplex di DNA o RNA.

Vettori virali come retrovirus, adenovirus, e virus Sendai e vettori non virali come liposomi possono essere usati per somministrare i DNA che esprimono gli siRNA utilizzati nella presente invenzione nei viventi soggetti da trattare. La somministrazione include per esempio, metodi in-vivo ed ex-vivo. Detti soggetti da trattare sono preferibilmente umani, ma non sono particolarmente limitati ad essi, ed essi possono essere anche animali.

La presente invenzione fornisce una composizione farmaceutica che comprende come ingrediente attivo un composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1 in una quantità sufficiente a sottoregolare l’espressione di detto gene.

Gli agenti farmaceutici della presente invenzione possono essere forniti come miscela con un veicolo farmaceuticamente accettabile. Questi veicoli farmaceuticamente accettabili possono includere ma non sono limitati a, per esempio, detergenti, eccipienti, coloranti, aromatizzanti, conservanti, stabilizzanti, tamponi, sospensioni, isotonizzanti, leganti, disintegranti, lubrificanti, fluidizzanti, e correttivi. Altri veicoli convenzionali possono anche essere utilizzati in maniera appropriata.

La preparazione delle composizioni farmaceutiche della presente invenzione rientra nelle conoscenze generali dell’esperto del settore e non abbisognano di particolare descrizione. Esempi di conoscenze generali sono contenuti in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Pub., ultima edizione.

Nel caso specifico di siRNA, si può far riferimento alla letteratura citata e anche, ad esempio, a WO 2005/097207 e WO 2006/039253.

In generale, la somministrazione ad individui può essere effettuata tramite metodi noti agli esperti dell’arte.

Le dosi degli agenti farmaceutici o della composizione farmaceutica della presente invenzione possono essere determinate in maniera appropriata da un medico considerando il tipo di forma di dosaggio, il metodo di somministrazione, l’età del paziente, il peso, i sintomi e così via. Anche questa attività rientra nella normale attività dell’esperto del settore, ad esempio seguendo le linee guida delle varie autorità regolatrici per lo sviluppo di farmaci, ad esempio la FDA o l’EMEA.

Il seguente esempio illustra ulteriormente l’invenzione.

Esempio

Materiale e Metodi:

Tutti gli esperimenti sono stati svolti nei laboratori della richiedente, i microrganismi sono stati acquistati secondo le vigenti normative.

Anticorpi

L’anticorpo policlonale di coniglio contro la regione C-terminale di RECQ1 (RQ-CT) à ̈ stato preparato dalla Sigma Genosys utilizzando un peptide di 16 amminoacidi corrispondente ai residui 634-649 di RECQ1 (C-SGSKNTGAKKRKIDDA) e contenente un residuo di cisteina all’N-terminale coniugato ad una proteina carrier chiamata “keyhole limpet hemocyanin†(KLH). L’anticorpo policlonale di coniglio contro l’elicasi RECQ1 intera (RQ-FL) à ̈ stato prodotto nel laboratorio dell’inventore iniettando i conigli con la proteina intera espressa e purificata da cellule di insetto con il protocollo precedentemente descritto (Cui, S. et al. Analysis of the unwinding activity of the dimeric RECQ1 helicase in the presence of human replication protein A. Nucleic Acids Res 32, 2158-70 (2004)). Gli anticorpi contro RECQ1 (sc-25547), RAD51 (sc-8349) e CENP-F (sc-22791) sono stati acquistati dalla Santa Cruz Biotechnology. Gli anticorpi anti-γ-H2AX pSer139 (05-636), anti-BrdU (347580) e anti-α-Tubulina (T6074) sono stati acquistati rispettivamente dalla Upstate, BD Bioscience e Sigma. Gli anticorpi secondari coniugati con i fluorofori Alexa 488 e Alexa 594 sono stati ottenuti dalla Invitrogen Molecular Probes.

Linee cellulari

La linea cellulare umana T98G di glioblastoma (ATCC, CRL-1690) à ̈ stata mantenuta in un terreno DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) contenente Glutamax (Life Technologies, Inc.) e 10% (v/v) di siero fetale bovino (Life Technologies, Inc.).

Tessuti

I tessuti tumorali e perilesionali di cervello sono stati forniti dall’Unità di Neurochirurgia dell’ospedale “Santa Maria della Misericordia†di Udine, mentre i tessuti tumorali e perilesionali di colon, polmone, tiroide e il tessuto cardiaco sono stati forniti dal Dipartimento di Patologia dell’ospedale Cattinara di Trieste. I tessuti sono stati ottenuti mediante rimozione chirurgica e sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina. Nel caso dei tumori cerebrali, una parte del tessuto bioptico à ̈ stato congelato in azoto liquido immediatamente dopo la chirurgia e mantenuto a -80<o>C per le successive analisi di western blot. La diagnosi del tumore à ̈ stata confermata in tutti i casi dall’analisi istopatologica.

Analisi di Western

Gli estratti proteici da tessuto cerebrale sono stati preparati usando un tampone TNEN (50mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 and 0,3% NP-40) seguendo la stessa procedura descritta precedentemente (Odreman, F. et al. Proteomic studies on low- and high-grade human brain astrocytomas. J Proteome Res 4, 698-708 (2005)). Gli estratti totali di cellule T98G sono stati preparati usando un tampone HNNG (15 mM Hepes pH 7,5, 250 mM NaCl, 1% (v/v) NP-40, 10% (v/v) glycerol, 1 mM PMSF) con l’aggiunta di 0,2 mM sodio ortovanadato (Sigma), 10 mM sodio glicerol-2-fosfato (Sigma), 25 mM NaF (Sigma) e il cocktail di inibitori di proteasi della Roche. Le analisi di immunoblotting sono state effettuate usando da 2 a 5 µg di estratto cellulare totale. Le proteine sono state separate mediante gel SDS-PAGE contente il 12% di acrilammide e sono state visualizzate mediante immunoblotting usando il “SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate†della Pierce.

Immunoistochimica

Per l’analisi immunoistochimica sono state tagliate al microtomo sezioni di tessuto dello spessore di 4 µm a partire da campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina, rappresentativi dei seguenti tumori: glioblastoma, carcinoma del colon, cancro della tiroide, cancro del polmone. Le sezioni sono state depositate su vetrini SuperFrost<®>Plus ed incubati per almeno 12 ore a 37°C. Le reazioni di immunoistochimica sono state effettuate sia automaticamente con il dispositivo Benchmark (Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) che manualmente, utilizzando il metodo di smascheramento antigenico indotto da calore. La localizzazione di RECQ1 à ̈ stata effettuata utilizzando sia l’anticorpo policlonale, prodotto in coniglio, che riconosce l’intera sequenza proteica (RQ-FL), sia l’anticorpo diretto contro gli ultimi 16 residui all’estremità C-terminale (RQ-CT); gli anticorpi, diluiti 1:150, sono stati rilevati utilizzando il cromogeno diaminobenzidina (DAB). Per la rivelazione manuale, le incubazioni sono state effettuate in una cameretta umida. Brevemente, dopo la deparaffinazione, le sezioni state immerse per 30’ in xilene e quindi idratate in una serie decrescente di alcoli. L’attività della perossidasi endogena à ̈ stata bloccata incubando le sezioni per 20 minuti in 0,3% H2O2. Le sezioni sono quindi state sottoposte a smascheramento antigenico immergendo i vetrini per 20 minuti in una vaschetta contenente tampone citrato 10 mM pH 6,0 bollente. Le sezioni sono state poi incubate per 20 minuti con il siero bloccante (Vectastain Universal Elite ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e per 60 minuti con l’anticorpo primario diretto contro RECQ1, diluito 1:150. Le sezioni non incubate con l’anticorpo primario sono servite come controlli negativi. I vetrini sono quindi stati lavati alcune volte con PBS e 0,1% Triton X-100 ed incubati per 60 minuti con l’anticorpo secondario biotinilato e con il sistema Vectastain ABC per 30 minuti (Vectastain Universal Elite ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA); la rilevazione à ̈ stata effettuata utilizzando una soluzione contenente DAB e H2O2(DAB substrate kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina di Mayer. Per dimostrare la specificità dell’anticorpo à ̈ stata effettuata una prova di pre-assorbimento dell’anticorpo, utilizzando un eccesso dello specifico peptide (1:5 a 37°C per 30 min).

RNA interference

Per ridurre il livello di espressione di RECQ1 nella linea cellulare di glioblastoma (T98G), le cellule sono state trasfettate transientemente con una miscela di 4 siRNA contro RECQ1 (ON-TARGETplus, human RECQ1, NM_032941, DHARMACON) (Sequenze bersaglio (target): 5’-GAGCUUAUGUUACCAGUUA-3’ (SEQ ID NO: 1), 5’-CUACGGCUUUGGAGAUAUA-3’ (SEQ ID NO: 2), 5’-GAUUAUAAGGCACUUGGUA-3’ (SEQ ID NO: 3), 5’-GGGCAAGCAAUGAAUAUGA-3’ (SEQ ID NO: 4)) per 72 ore ad una concentrazione finale di 100 nM usando il sistema di trasfezione Hyperfect della QIAGEN e seguendo le istruzioni del manuale QIAGEN. Gli esperimenti di controllo sono stati effettuati utilizzando un siRNA contro la luciferasi della Dharmacon. In alternativa, un’efficiente riduzione del livello di espressione di RECQ1 nelle cellule T98G à ̈ stata anche ottenuta mediante trasfezione con un plasmide pcDNASup (plasmide ibrido ottenuto da una combinazione di pcDNA3 (Invitrogen, life technologies) e pSUPER (OligoEngine) ) che codifica per un shRNA (short hairpin RNA) contro l’mRNA di RECQ1 (sequenza bersaglio (target): 5’-GAGCUUAUGUUACCAGUUA-3’ (SEQ ID NO: 1)). I cloni delle cellule T98G con una ridotta espressione di RECQ1 sono stati ottenuti mediante selezione con l’antibiotico Geneticin G418 (0,5 mg/L) (GIBCO BRL).

Saggi di clonogenicità

I saggi di clonogenicità sono stati eseguiti in vitro come descritto precedentemente (Franken, N.A., Rodermond, H.M., Stap, J., Haveman, J. & van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc 1, 2315-9 (2006)). Brevemente, i saggi sono stati effettuati in piastre da sei pozzetti, usando dei cloni di controllo prodotti mediante trasfezione delle cellule T98G con il vettore vuoto o i cloni ottenuti dalle cellule T98G trasfettate con lo stesso vettore contenente RECQ1-shRNA. Le cellule sono state poi depositate a diverse diluizioni (100, 200, 400, 800, 1600 e 3200 cellule per pozzetto) nei piatti a sei pozzetti e le colonie formatesi dopo almeno una settimana di crescita sono state contate usando lo strumento VersaDoc 4000 imaging system (BioRad). La capacità di proliferazione delle cellule T98G di controllo e delle stesse cellule mancanti di RECQ1 à ̈ stata espressa come efficienze di piastratura (plating efficiency, PE). La PE à ̈ calcolata come il rapporto medio tra il numero di colonie che si sono formate e il numero di cellule che sono state piastrate, espresso in percentuale.

Immunofluorescenza

Per gli esperimenti di immunofluorescenza le cellule sono state piastrate in appositi vetrini provvisti di singole camerette (NALGENE), dopo aver ridotto il livello di espressione di RECQ1 transientemente mediante RNA interference per 24 ore. Una seconda trasfezione con siRNA à ̈ stata ripetuta immediatamente dopo aver piastrato le cellule nei vetrini. Le cellule sono state lasciate in questa condizione per 72 ore, dopo di che il terreno di cultura à ̈ stato rimosso e i vetrini sono stati lavati, fissati e immunocolorati mediante una serie anticorpi specifici, seguendo il protocollo precedentemente descritto (Marcello, A. et al. Recruitment of human cyclin T1 to nuclear bodies through direct interaction with the PML protein. Embo J 22, 2156-66 (2003)). Gli anticorpi primari usati per l’analisi di immunofluorescenza sono riportati nel primo paragrafo dei Materiali e Metodi. La colorazione con BrdU à ̈ stata effettuata dopo incubazione delle cellule con 10 Î1⁄4M BrdU (Sigma) per 60 minuti e denaturazione del DNA con una soluzione 2N di HCl (Merck). Successivamente i vetrini sono stati incubati con gli anticorpi secondari coniugati con i fluorofori Alexa 488 e Alexa 594 (Invitrogen, Molecular Probes).

L’analisi di immunofluorescenza à ̈ stata infine effettuata usando il microscopio confocale LSM 510 Meta della Zeiss. Le immagini sono state successivamente acquisite usando il software LSM. Le cellule contenenti foci di γ-H2AX e RAD51 sono state contate in almeno 100 nuclei.

Risultati

Le analisi immunoistochimiche di tessuto di glioma di cervello umano hanno mostrato che RECQ1 era sovraespresso in campioni di tumore rispetto ai tessuti perilesionali (Figura 1A). L’espressione di RECQ1 era confinata nei nuclei e più del 90% delle cellule in ciascun campione di tumore si à ̈ colorato positivamente per RECQ1 utilizzando sia l’anticorpo contro il C-terminale (RQ-CT) sia l’anticorpo contro la proteina a lunghezza intera (RQ-FL). Al contrario, solo una piccola percentuale di cellule in ciascun campione si à ̈ colorata positivamente per RECQ1 nei tessuti perilesionali e nei tessuti di cervello normale autoptico (Figura 1B). La specificità dei due anticorpi anti-RECQ1 à ̈ stata confermata tramite esperimenti di pre-adsorbimento che mostrano che dopo il pre-adsorbimento del tessuto con la proteina ricombinante RECQ1 solamente una colorazione minima non specifica poteva essere rilevata. La più alta espressione di RECQ1 nei gliomi del cervello à ̈ stata confermata tramite un’analisi Western Blot che mostra che la quantità di proteina RECQ1 à ̈ almeno 10 volte più alta nei campioni tumorali rispetto ai campioni di cervello perilesionale o normale, dove RECQ1 à ̈ quasi completamente assente (Figura 1C).

La stessa analisi à ̈ stata ripetuta poi su tessuti dal carcinoma al colon, cancri al polmone e tiroide (Figura 2). Il risultato ha mostrato chiaramente che RECQ1 era molto abbondante in tutti questi tumori di diverso tipo. Comunque, RECQ1 sembrava essere altamente espresso anche nelle regioni perilesionali di questi tessuti tumorali.

Per verificare il ruolo di RECQ1 nella crescita e proliferazione cellulare del glioblastoma, à ̈ stata confrontata la proprietà di formare colonie della linea cellulare di glioblastoma (T98G) trasfettata transientemente con una miscela di 4 siRNA contro RECQ1 rispetto ad una linea cellulare T98G trasfettata con un siRNA di controllo che sopprime l’espressione del gene della luficerasi (Figura 3). In primo luogo, un’efficace deplezione di proteina RECQ1 à ̈ stata osservata negli estratti cellulari totali di T98G trattati con l’siRNA contro RECQ1 rispetto ai campioni di controllo (Figura 3B). I saggi di formazione di colonie hanno dimostrato una significativa riduzione sia nella dimensione sia nel numero delle colonie quando le cellule T98G erano state sottoregolate per RECQ1 in maniera transiente. In particolare, le cellule di glioblastoma RECQ1-deplete hanno mostrato una riduzione nella loro capacità proliferativa, in confronto a campioni di cellule di controllo, come indicato dai valori di efficienza di piastratura (PE) (Figura 3A). Gli stessi esperimenti sono stati poi ripetuti con la linea cellulare di glioblastoma (T98G) trasfettata stabilmente con plasmidi codificanti shRNA RECQ1-specifici rispetto ad una linea cellulare T98G trasfettata con un plasmide di controllo (Figura 4). L’analisi dei cloni selezionati G418 resistenti che portano il plasmide codificante lo shRNA di RECQ1 rispetto ai campioni di cellule di controllo ci ha consentito di valutare l'effetto della deplezione di RECQ1 sulla capacità di formare colonie delle cellule T98G RECQ1-deplete in vitro. Anche in questo caso, i saggi di formazione di colonie hanno confermato una significativa riduzione sia nella dimensione sia nel numero delle colonie quando le cellule T98G erano state stabilmente sottoregolate per RECQ1. In particolare, le cellule di glioblastoma RECQ1-deplete hanno mostrato una riduzione di circa 10 volte (PE: 5,3%) nella loro capacità proliferativa, in confronto a campioni di cellule di controllo (PE: 59,4%) (Figura 4B). In conclusione, i presenti dati indicano un ruolo regolatore di RECQ1 umano nella proliferazione attiva nelle cellule di glioblastoma.

Le elicasi RecQ sono coinvolte nella stabilizzazione e riparazione delle forche di replicazione del DNA danneggiate in risposta a stress endogeni o danni esogeni al DNA. Un errore nello stabilizzare le forche può portare al collasso della forca e a rotture del doppio filamento. Coerentemente, precedenti studi con cellule HeLa mancanti di RECQ1 hanno mostrato un aumentato livello di danni al DNA e scambi di cromatidi fratelli (Sharma et al., 2007). Per esaminare il ruolo di RECQ1 nella prevenzione e nella risposta a danni del DNA in cellule di glioblastoma, à ̈ stata analizzata la portata della formazione spontanea di foci γ-H2AX nelle cellule di controllo o T98G trasfettate con siRNA per RECQ1 (Figura 5). I presenti risultati indicano che la deplezione di RECQ1 risulta in un drammatico aumento nella formazione spontanea di foci γ-H2AX che indica che la ridotta espressione di RECQ1 à ̈ associata a difetti nella riparazione del DNA. Circa il 90% delle cellule in cui RECQ1 à ̈ depleto contenevano più di dieci γ-H2AX foci per nucleo, rispetto al solo 15% per le cellule selvatiche. Studi precedenti con altri enzimi RecQ umani suggerirono che questi enzimi svolgessero un ruolo importante nella riparazione mediante ricombinazione omologa (HR: Homologous Recombination) presso i siti di danno al DNA cromosomico. Per studiare se anche RECQ1 potesse avere un ruolo in questa via, à ̈ stata analizzata la capacità di Rad51, una delle principali proteine coinvolte nello stadio d’invasione dei filamenti di riparazione HR, a formare foci in cellule di controllo T98G e RECQ1-deplete. Come mostrato in figura 6, le cellule RECQ1-deplete mostravano un aumentato numero di foci spontanei Rad51 rispetto alle cellule di controllo. Il numero significativamente più alto di foci spontanei Rad51 in cellule T98G RECQ1-deplete può denotare un accumulo di intermedi di ricombinazione incompleta o una maggiore quantità di danni endogeni al DNA in assenza di RECQ1.

Applicazione Potenziale

La presente invenzione trova applicazione nel settore medico nel trattamento dei tumori cerebrali, in particolare del glioblastoma.

Poiché à ̈ stato trovato che l’alta espressione di RECQ1 nel glioblastoma del cervello umano à ̈ accoppiata ad una quasi totale assenza della stessa proteina nei tessuti perilesionali e normali, composti che sopprimono l’espressione del gene RECQ1 possono essere utilizzati nel trattamento dei tumori cerebrali, in particolare del glioblastoma, in maniera specifica, ossia senza effetti collaterali e tossici nei confronti del tessuto sano.

A questo riguardo, la presente invenzione dimostra che l’uso di composti che sopprimono l’espressione del gene di RECQ1 compromette in maniera significativa la capacità proliferativa di cellule di glioblastoma.

SEQUENCE LISTING

<110> INTERNATIONAL CENTRE FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY

<120> Anticancer agent specific for brain tumors with mechanism of RECQ1 suppression

<130> 08161MS

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> siRNA against RECQ1 which suppresses RECQ1 gene expression <400> 1

gagcuuaugu uaccaguua 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> siRNA against RECQ1 which suppresses RECQ1 gene expression <400> 2

cuacggcuuu ggagauaua 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> siRNA against RECQ1 which suppresses RECQ1 gene expression <400> 3

gauuauaagg cacuuggua 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> siRNA against RECQ1 which suppresses RECQ1 gene expression <400> 4

gggcaagcaa ugaauauga 19

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di un agente anticancro specifico per i tumori cerebrali, in particolare per il glioblastoma, dove tale agente comprende almeno un composto che sopprime l’espressione del gene RECQ1.
2. 2. L’uso secondo la rivendicazione 1, dove detto composto à ̈ un siRNA avente un’attività di RNA interference contro RECQ1.
3. 3. L’uso dell’agente anticancro secondo la rivendicazione 2, dove detto siRNA à ̈ un dsRNA comprendente: a. un RNA senso avente una sequenza omologa ad una sequenza arbitraria di 19-25 nucleotidi dell’RNA messaggero del gene RECQ1 e b. un RNA antisenso avente la sequenza complementare a detto RNA senso ed eventualmente c. avente una o due sporgenze nucleotidiche alle due estremità 3’.
4. 4. L’uso dell’agente anticancro secondo la rivendicazione 2 o 3, dove detto siRNA viene formato dopo trascrizione da un plasmide o sintesi esogena.
5. 5. L’uso dell’agente anticancro secondo la rivendicazione 4, dove detto siRNA à ̈ uno short hairpin RNA formato dopo detta trascrizione da un singolo promotore di detto plasmide.
6. 6. L’uso dell’agente anticancro secondo la rivendicazione 4, dove detto siRNA à ̈ uno short dsRNA formato dopo detta trascrizione da due promotori convergenti fiancheggianti su detto plasmide.
7. 7. L’uso dell’agente anticancro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6 dove detto siRNA viene generato dopo taglio con nucleasi da dsRNA più lunghi.
8. 8. L’uso dell’agente anticancro secondo la rivendicazione 2 o 3 dove detto siRNA viene sintetizzato chimicamente.
9. 9. L’uso dell’agente anticancro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 8, dove uno dei due filamenti di detto siRNA comprende la sequenza nucleotidica di una qualsiasi di SEQ ID NO: 1-4: 5’-GAGCUUAUGUUACCAGUUA-3’ (SEQ ID NO: 1), 5’-CUACGGCUUUGGAGAUAUA-3’ (SEQ ID NO: 2), 5’-GAUUAUAAGGCACUUGGUA-3’ (SEQ ID NO: 3), 5’-GGGCAAGCAAUGAAUAUGA-3’ (SEQ ID NO: 4).