ITRM20080641A1 - Uso della caspasi-3 per la malattia dell'alzheimer - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
“USO DELLA CASPASI-3 PER LA MALATTIA DELL’ALZHEIMERâ€
La presente invenzione si riferisce all’uso della caspasi-3 come biomarcatore per la diagnosi, la diagnosi precoce o il rilevamento della progressione di un disturbo neurodegenerativo, in particolare della malattia di Alzheimer, e a relative composizioni farmaceutiche e metodi.
Stato della tecnica
La malattia di Alzheimer (AD) à ̈ un disturbo neurodegenerativo sempre più prevalente che rappresenta circa 50-60% di tutti i casi di demenza tra persone di più di 65 anni. E’ caratterizzato da deficit cognitivi e da un’estesa perdita neuronale (Selkoe e Schenk, 2003). La durata del declino cognitivo progressivo à ̈ circa 7 anni dalla comparsa dei primi sintomi fino alla morte. E’ opinione largamente condivisa che la fase clinica à ̈ preceduta da un periodo pre-clinico di 15-30 anni durante il quale insorgono diverse alterazioni strutturali nel cervello.
Nel cervello post-mortem di pazienti AD, ed in particolare nell’ippocampo, sono state descritte diverse caratteristiche patologiche, tra cui placche di betaamiloide (Aβ), grovigli intracellulari neurofibrillari formati dalla proteina tau iperfosforilata, infiammazione ed estesa morte cellulare. Alterazioni cognitive e cambiamenti nel cervello sono comunque già presenti prima della diagnosi clinica, denotando così uno stadio “preclinico†di AD, durante il quale gli individui affetti esibiscono soltanto leggere alterazioni cognitive sebbene il processo della malattia sia già in corso (Elias et al., 2000; Kaà ̈ stato et al., 2003). In questa fase pre-clinica nessuna o una ridotta morte neuronale può essere individuata, nonostante esista un’alterazione nella connettività interneuronale (West et al., 2004).
Topi transgenici che esprimono la forma mutata della proteina precursore dell’amiloide (APPswe) associata con alcune forme familiari di AD hanno fornito importanti informazioni sugli effetti strutturali, neurofisiologici e comportamentali dell’accumulo di Aβ nel cervello (Hsiao et al., 1996). Tra i possibili bersagli anatomici della tossicità dell’Aβ, le spine dendritiche sono i migliori candidati per essere affette nel declino precoce cognitivo tipico dell’AD (Scheff et al., 2007). Le spine dendritiche sono infatti i siti predominanti delle sinapsi eccitatorie nelle cellule piramidali della regione CA1 dell’ippocampo. Evidenze sempre crescenti suggeriscono che i) la plasticità mediata dalle spine nell’ippocampo sia alla base dell’apprendimento e della memoria, infatti, deficienze di memoria nei ratti e la demenza senile nell’uomo correlano con una diminuita densità di spine nella regione del CA1 dell’ippocampo (de Ruiter et al., 1987; Avila-Costa et al., 1999), e ii) sezioni di ippocampo di pazienti AD mostrano una diminuzione significativa nella densità di spine dendritiche rispetto a controlli sani della stessa età . (Probst et al., 1983; Ferrer et al., 1990). Comunque, il nesso molecolare tra l’accumulo di Aβ e la perdita precoce di spine à ̈ lontano dall’essere chiarito. Nell’AD ed in altre malattie neurodegenarative, una grande varietà di meccanismi può contribuire alle perdita delle sinapsi, tra cui l’alterazione delle proteine sinaptiche, del traffico vescicolare e una perdita di funzione di plasticità .
Attualmente, la diagnosi clinica della malattia di Alzheimer può essere effettuata soltanto negli stadi tardivi della malattia, quando le capacità cognitive risultano significativamente diminuite e sono presenti diverse alterazioni strutturali del cervello. La diagnosi clinica richiede una storia medica molto attenta, un controllo medico e neurologico, controlli del sangue, dell’urina e del fluido cerebrospinale (CSF) per escludere altre condizioni patologiche che potrebbero mascherare la malattia di Alzheimer, controlli psicometrici dettagliati per valutare lo stato mentale e la capacità cognitiva, e tecniche di †̃imaging’, come TAC e risonanza magnetica del cervello. Le valutazioni diagnostiche nei centri specializzati raggiungono un’accuratezza di circa l’80-85%. Dal momento che questi test sono costosi e richiedono molto tempo, e poiché sono anche particolarmente inconvenienti per i pazienti, vi à ̈ un sempre maggiore bisogno di biomarcatori specifici e facilmente accessibili, che possono essere individuati nei fluidi corporei, come il CSF, il sangue o l’urina, e che hanno un alto valore di predizione positiva per la diagnosi della malattia di Alzheimer, o la diagnosi differenziale dell’AD e altre forme di demenza.
Inoltre, marcatori sensibili e affidabili per la progressione della malattia sono utili per la valutazione e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.
Poiché il liquido cerebrospinale circonda direttamente il cervello, cambiamenti nella sua composizione proteica e nella sua attività possono riflettere in un modo molto preciso le condizioni patologiche associate a specifiche alterazioni del profilo di espressione proteico. Durante il decennio passato, diverse alterazioni biologiche sono state riportate nel fluido cerebrospinale di pazienti AD, in particolare livelli alterati del frammento di Aβ1-42 e del suo precursore, insieme a livelli alterati della proteina tau iperfosforilata. La sensibilità e la specificità di questi marcatori à ̈ comunque bassa o soltanto modesta (The Ronald and Nancy Reagan Research Institute of the Alzheimer’s Association and the National Institute on Aging Working Group, 1998, Robles A 1998, Teunissen CE et al., 2002).
Dunque, esiste la necessità di nuovi biomarcatori, che siano facilmente accessibili, che ad es. possano essere rilevati nel sangue o nel fluido cerebrospinale, e che presentino sensibilità e specificità sufficienti per (i) rilevare il più presto possibile la malattia di Alzheimer, e (ii) consentire la diagnosi differenziale della malattia di Alzheimer e di altri tipi di demenza o di malattie neurodegenerative, e (iii) monitorare l’efficacia terapeutica di composti, ad es. nello sviluppo di farmaci per la clinica.
Sommario dell’invenzione
E’ uno scopo della presente invenzione fornire un biomarcatore per la diagnosi, la diagnosi precoce, o il rilevamento della malattia di Alzheimer. Secondo la presente invenzione questo scopo à ̈ raggiunto mediante l’uso della caspasi-3 secondo le rivendicazioni 1 a 5.
È un altro scopo della presente invenzione fornire una composizione farmaceutica comprendente un composto per modulare l’attività della caspasi-3 direttamente o indirettamente, e un relativo veicolo, stabilizzatore, diluente o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
È un ulteriore scopo questa della presente invenzione fornire un metodo per la diagnosi, la diagnosi precoce o il rilevamento della progressione di un disturbo neurodegenerativo comprendente le fasi di:
- isolare un campione biologico da un individuo; - quantificare il livello di attività della caspasi-3 in detto campione biologico;
- confrontare detto livello con un livello di riferimento.
Infine, Ã ̈ un ulteriore scopo della presente invenzione fornire un metodo per determinare se un composto sia efficace nel trattamento di un disturbo neurodegenerativo comprendente le fasi di:
- quantificare il livello di attività della caspasi-3 in un campione isolato da detto individuo prima del trattamento; e
- confrontare il livello quantificato dell’attività della caspasi-3 con uno o più livelli di riferimento dopo il trattamento.
Definizioni
I termini “precoce†come in “stadio precoce†, “diagnosi precoce†, “deficienze cognitive precoci†sono intesi essere riferiti allo stadio pre-clinico della malattia di Alzheimer, nel quale gli individui presentano alterazioni cognitive molto lievi malgrado la malattia sia in corso. In questa fase pre-clinica non può essere individuata una rilevante perdita neuronale, benché sia presente un deficit nella comunicazione tra neuroni. Nell’uomo questo stadio può essere considerato come corrispondente allo stadio 2-3 secondo il sistema †̃functional assessment staging’ (FAST) della malattia di Alzheimer (Reisberg, 1988).
Breve descrizione dei disegni
La presente invenzione sarà ora descritta con riferimento alle figure allegate, che mostrano forme di realizzazione dell’invenzione fornite a titolo di esempio non-limitativo, in cui:
- FIGURA 1 mostra i risultati relativi alle prestazioni comportamentali nel condizionamento contestuale di paura (Contextual Fear Conditioning, CFC) e all’analisi morfologica dei dendriti neuronali nella regione del CA1 in topi Tg2576 (Tg) e di controllo (WT) di 2 e 3 mesi di età .
(A-B) Rapporto di soppressione dell’attività motoria durante l’addestramento e il test. (A) Nel giorno dell’addestramento, l’attività motoria (tempo trascorso in movimento) à ̈ stata misurata 2 min prima (condizione di base) e 2 min dopo la somministrazione dello shock elettrico. Il rapporto di soppressione dell’attività viene definito come il tasso di attività dopo lo shock/(tasso di attività dopo lo shock tasso di attività di base). Durante l’addestramento, nei due genotipi in esame non vi à ̈ differenza nel rapporto di soppressione dell’attività indicando che la mutazione APPswe non altera la risposta di paura allo stimolo avverso. (B) Il giorno del test, l’attività à ̈ stata misurata durante i primi 2 min quando i topi sono stati riposizionati nel contesto sperimentale. Il rapporto di soppressione dell’attività à ̈ stato definito come il tasso di attività dopo lo shock/(tasso di attività dopo lo shock tasso di attività di base). Non si osserva nessuna differenza genotipo-dipendente del rapporto a 2 mesi di età (n=6 topi per ogni genotipo). Al contrario, i valori del rapporto risultano significativamente maggiori nei topi Tg2576 di 3 mesi di età rispetto ai controlli (WT), indicando la presenza di deficit comportamentali nel CFC test in topi transgenici a questa età . (** p<0.01, n=8 topi per ogni genotipo).
(C) Colorazione di Golgi dell’ippocampo. Pannello superiore: fotomicrografia rappresentativa della colorazione di Golgi di una sezione dell’ippocampo. Scala di riferimento, 100 µm. Panelli inferiori: ingrandimenti rappresentativi dei segmenti dendritici basali e apicali di neuroni ippocampali del CA1 in topi WT e Tg2576. Scala di riferimento, 10 µm.
(D) I topi Tg2576 mostrano una diminuzione nella densità di spine nei dendriti apicali dei neuroni ippocampali del CA1. La densità di spine nei dendriti basali non presenta differenze nei due genotipi. La densità d spine à ̈ espressa come la media del numero di spine per 1 µm di lunghezza del dendrite ± SEM (* p<0.05, n=5 animali per ogni genotipo).
(E) La lunghezza totale dei dendriti dei neuroni ippocampali del CA1 risulta ridotta nei topi Tg2576 rispetto ai controlli WT. I dati sono presentati come media ± SEM. (* p<0.05, n=5 animali per ogni genotipo).
- FIGURA 2 mostra la riduzione dei livelli della subunità GluR1 del recettore AMPA nell’ippocampo di topi Tg2576 (Tg).
(A) La sovra-espressione dell’APPswe causa un cambiamento nella composizione proteica delle densità postsinaptiche (Post-Synaptic Density, PSD). Pannello di sinistra: immagini rappresentative dell’analisi mediante Western Blot delle proteine estratte dalle PSD preparate dall’ippocampo di topi Tg2576 e di controllo (WT) a 3 mesi di età ; sono indicati gli specifici anticorpi utilizzati. Pannello di destra: quantificazione densitometrica dell’intensità delle bande ottenute mediante il Western Blot; i dati sono espressi come rapporto della media (Tg2576/WT) ± SD. Da notare che i livelli della subunità GluR1 del recettore AMPA (GluR1) e la sua forma fosforilata (GluR1pSer845) sono ridotti nei topi Tg2576 rispetto a quelli WT. (** p<0.01, n=5 topi per ogni genotipo). Abbreviazioni: GluR1, recettore del glutammato 1; GluR1pSer845, recettore del glutammato 1 fosfoSer845; GluR2/3, recettore del glutammato 2 & 3; NMDA ε1, subunità ε1 del recettore dell’N-metil-D-aspartato; mGluR5, recettore metabotropico del glutammato 5; PSD-95, proteina della densità post-sinaptica 95; NSF, proteina di fusione sensibile a N-etil-maleimide; αCaMKII, subunità α della proteina chinasi II Ca<2+/>calmodulina-dipendente.
(B) L’espressione di GluR1 à ̈ ridotta nella regione del CA1 di topi Tg2576. Panelli superiori: immagini rappresentative dell’analisi immunoistochimica di GluR1 e della sinaptofisina (che non varia nei due genotipi) in sezioni sagittali del cervello di topi WT e Tg2576. Scala di riferimento, 50 µm. Pyr, strato piramidale; rad, strato radiato. Pannello inferiore: quantificazione densitometrica dell’espressione proteica nello strato radiato dell’ippocampo di topi WT e Tg2576 marcati per la sinaptofisina (Synapt) e per GluR1. (** p<0.01, n=9 sezioni, N=3 animali per ogni genotipo).
- FIGURA 3 mostra l’alterazione della trasmissione sinaptica basale glutamatergica ma non del potenziamento a lungo termine dovuta alla riduzione precoce di GluR1 nelle PSD.
(A) Rapporto delle correnti AMPA/NMDA. Pannello di sinistra: tracce rappresentative di registrazioni condotte su cellule intere bloccando il potenziale a -65 mV e 20 mV, per topi di controllo (WT) e Tg2576 (Tg). I cerchi aperti indicano i punti ai quali sono stati valutate le componenti AMPA (picco) ed NMDA. Pannello di destra: il rapporto delle correnti AMPA/NMDA Ã ̈ significativamente diminuito nei topi Tg2576 rispetto ai WT. (* p<0.05).
(B) Rapporto dell’impulso accoppiato (paired pulse ratio). Pannello di sinistra: tracce rappresentative di registrazioni eseguite su cellule intere dove gli stimoli sono stati somministrati a intervalli di inter-stimolo di 100 ms. Pannello di destra: il rapporto medio degli impulsi accoppiati non à ̈ alterato nei topi Tg2576 rispetto ai topi WT.
(C) Tracce rappresentative dei potenziali postsinaptici eccitatori (fEPSPs) immediatamente prima (tracce nere) e dopo 50 min (tracce grigie) dalla stimolazione ad alta frequenza (HFS) in topi WT e Tg2576. Per ogni esempio sono mostrate le medie di 10 tracce. L’artefatto dello stimolo à ̈ stato digitalmente rimosso per la presentazione dei dati.
(D) Profilo temporale dei cambiamenti relativi alle curve di fEPSP in topi WT e Tg2576. L’HFS à ̈ stato somministrato al tempo 0. Non si osserva nessun cambiamento significativo nel potenziamento sinaptico nei topi WT e Tg2576.
- FIGURA 4 mostra che le spine dendritiche ippocampali di topi Tg2576 accumulano caspasi-3 nel compartimento postsinaptico e mostrano caratteristiche apoptotiche.
(A) L’attività della caspasi-3 à ̈ maggiore nell’ippocampo di topi Tg2576. L’attività della caspasi-3, visualizzata mediante un saggio fluorimetrico, à ̈ significativamente maggiore sia nei sinaptosomi ippocampali sia negli omogenati ippocampali totali preparati da topi Tg2576 di 3 mesi rispetto al gruppo di controllo (WT). L’istogramma mostra la media dei rapporti di attività della caspasi-3 (Tg2576 /WT) ± SD. (** p<0.01, n=4 animali per ogni genotipo e per ogni età ). Non si osserva alcuna differenza in topi più giovani (2 mesi).
(B) Arricchimento della caspasi-3 tagliata nei sinaptosomi ippocampali. Pannello superiore: Western Blot mostrante che la caspasi-3 tagliata à ̈ presente nella preparazione di sinaptosomi (Syn)di topi di 3 mesi. L’immunoreattività osservata à ̈ maggiore nei sinaptosomi Tg2576 rispetto ai sinaptosomi WT. Al contrario, la caspasi-3 tagliata non à ̈ individuabile negli omogenati totali (Tot) preparati dall’ippocampo. Inoltre, i livelli di procaspasi-3 sono più alti nei sinaptosomi rispetto agli omogenati totali. Come controllo positivo per il taglio della caspasi-3 (Ctrl) sono state utilizzate le proteine estratte da cellule proneurali esposte ad uno stimolo apoptotico (5 µM staurosporina per 12 ore). L’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento. Pannello inferiore: quantificazione densitometrica delle bande ± SD. (* p<0.05, n=3 topi per ogni genotipo).
(C) Localizzazione della caspasi-3 attiva nel compartimento post-sinaptico. Si osserva un numero maggiore di compartimenti post-sinaptici immunoreattivi per la caspasi-3 (frecce) attiva nelle spine dendritiche del CA1 di topi Tg2576 rispetto a topi WT. Le punte di freccia nel pannello di sinistra indicano spine dendritiche immunonegative per la caspasi-3 attiva. Scala di riferimento, 0.5 µm. M, mitocondrio; v, vescicole di neurotrasmettitore. Il grafico mostra la porzione di spine dendritiche immunopositive per la caspasi-3 attiva rispetto al numero totale di spine esaminate in tutti i campi analizzati. (* p<0.05; n=100 spine, N=3 topi per ogni genotipo).
(D) I sinaptosomi preparati da topi Tg2576 mostrano caratteristiche apoptotiche (sinaptosi). E’ mostrata l’analisi citofluorimetrica dell’apoptosi di sinaptosomi. Pannello superiore: tracciato di densità rappresentativa che mostra la fluorescenza della calceina AM vs. fluorescenza dell’anessina V per particelle sinaptosomali grandi. I dati sono stati raccolti per 20,000 particelle da ogni campione e 10,000 eventi sono stati tracciati. La percentuale di particelle totali à ̈ mostrata per ogni quadrante. Le particelle positive per entrambi i marcatori si trovano nel quadrante superiore di destra. Un aumento della marcatura di anessina V à ̈ stato osservato nei sinaptosomi ippocampali preparati da topi Tg2576 di 3 mesi. Risultati simili sono stati ottenuti in 3 esperimenti separati. Panelli inferiori: distribuzione della preparazione di sinaptosomi non-marcati (controllo negativo).
- FIGURA 5 mostra l’aumento di attività apoptosomadipendente della caspasi-3 nei dendriti di neuroni primari derivati dal tessuto cerebrale di embrioni Tg2576.
(A) L’attività della caspasi-3 à ̈ maggiore nei neuroni primari transgenici (Tg) rispetto a quelli di controllo (WT). L’attività della caspasi-3 à ̈ stata misurata sia a 7 sia a 12 giorni in vitro (Days In Vitro, DIV). Il grafico mostra il rapporto delle medie dell’attività della caspasi-3 (Tg/WT) ± SD. (* p<0.05, n=4).
(B) La caspasi-3 tagliata à ̈ maggiore nei neuroni primari Tg rispetto a quelli WT. La figura mostra un immunoblot eseguito utilizzando le proteine estratte da neuroni WT e Tg (a 7 e 12 DIV) impiegando un anticorpo specifico per la forma tagliata della caspasi-3. L’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento.
(C) L’aumento della caspasi-3 tagliata non correla con il processamento di PARP. Pannello superiore: immunoblot eseguito su proteine caricate come in (B) e saggiate con un anticorpo specifico per la forma tagliata di PARP. L’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento. Pannello inferiore: il grafico mostra la quantificazione densitometrica della caspasi-3 tagliata (barre bianche) e di PARP tagliata (barre grigie) ± SD. (* p<0.05, n=3).
(D) Gli eventi apoptotici sono invariati nei neuroni primari WT e Tg. Il saggio TUNEL (verde) e la marcatura con DAPI (blu) sono stati eseguiti su neuroni WT e Tg a 7 DIV. Le frecce bianche indicano alcuni neuroni TUNEL-positivi. Lo stesso campo rappresentativo à ̈ mostrato per entrambe le colorazioni. Il grafico rappresenta la media ± SD dei dati ottenuti da 3 esperimenti indipendenti. In tutto, 500 cellule sono state analizzate in tre campi selezionati casualmente da ogni genotipo. E’ da notare che non vi à ̈ alcuna differenza tra le colture WT e Tg.
(E) I sinaptosomi derivati da neuroni primari transgenici sono arricchiti in caspasi-3 tagliata. L’immunoblot mostra le proteine estratte da neuroni primari WT e Tg (cellule intere) e dai sinaptosomi preparati da questi ultimi, saggiate con un anticorpo specifico per la caspasi-3 tagliata. L’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento. Risultati simili sono stati ottenuti in 3 esperimenti indipendenti.
(F) I neuroni primari transgenici mostrano elevati livelli di caspasi-3 attiva nei dendriti. L’immagine mostra la doppia marcatura per l’attività della caspasi-3 (DEVD, verde) ed i nuclei (DAPI, blu) in neuroni WT e Tg. Un’estesa fluorescenza DEVD-associata à ̈ individuabile mediante microscopia confocale nella rete neuronale dendritica e, in misura minore, nel soma delle cellule. Le punte di freccia mostrano un nucleo apoptotico colorato positivamente per l’attività della caspasi-3. Gli inserti (ingranditi nei panelli inferiori) mettono in evidenza le differenze nell’attività della caspasi-3 tra i dendriti di cellule WT e Tg. (G-H) La via che coinvolge l’apoptosoma à ̈ la principale via di attivazione della caspasi-3 nei neuroni primari transgenici.
(G) I lisati totali preparati da neuroni primari transgenici, in presenza o assenza della proteina Apaf1 (Tg o Tg/Apaf1<-/->, rispettivamente) sono saggiati per la presenza di caspasi-3 e PARP tagliate. Nei neuroni Tg/Apaf1<-/->né la caspasi-3 né PARP vengono processate. L’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento.
(H) E’ mostrata la doppia marcatura con DEVD (verde) e DAPI (blu) su neuroni Tg e Tg/Apaf1<-/->. Come mostrato dalle immagini acquisite mediante microscopia confocale, la fluorescenza associata alla colorazione con il DEVD non à ̈ individuabile nei neuroni Tg/Apaf1<-/->.
- FIGURA 6 mostra che l’attività della caspasi-3 media la defosforilazione calcineurina-dipendente della subunità GluR1 e la rimozione di AMPAR dalla PSD.
(A) Il z-DEVD-fmk inibisce l’attività della caspasi-3 in sezioni ippocampali ottenute da topi Tg2576. Le sezioni ippocampali preparate da topi Tg2576 di 3 mesi sono state incubate in presenza di z-DEVD-fmk (2.5 µM e 5 µM) o DMSO (controllo) per 2 ore. L’attività della caspasi-3 à ̈ stata poi misurata mediante metodo fluorimetrico. I dati sono espressi come media ± SD. (* p< 0.05, n=4, U test di Mann-Whitney; il controllo à ̈ indicato come 100%).
(B) L’inibizione della caspasi-3 da parte del z-DEVD-fmk non protegge le sezioni da apotptosi. Dopo 2 ore di incubazione con il z-DEVD-fmk, le proteine estratte da ogni campione sono state analizzate per immunoblotting con un anticorpo specifico per la forma tagliata di PARP. L’analisi mostra che in entrambe le condizioni sperimentali PARP non viene processata. Ctrl: estratti proteici di sezioni trattate con 20 µM di staurosporina per 2 ore sono stati utilizzati come controllo positivo del processamento di PARP.
(C) L’inibizione della caspasi-3 in sezioni ippocampali preparate da topi Tg2576 causa un aumento nell’espressione di GluR1 a livello della PSD. Dopo 2 ore di incubazione con z-DEVD-fmk (2.5 e 5 µM), le sezioni sono state collezionate e sono state preparate le PSD. Le proteine estratte dalle PSD sono state poi analizzate mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti-GluR1, anti-GluR1pSer845 e anti-PSD-95 (pannello superiore). I blot sono stati analizzati mediante densitometria; i dati mostrati nel grafico (pannello inferiore) sono espressi come media ± SD. (* p< 0.05, n=3, U test di Mann-Whitney; il controllo à ̈ indicato come 100%). E’ da notare che l’inibizione della caspasi-3 non altera i livelli della proteina PSD-95.
(D) L’attività della caspasi-3 correla in maniera inversa con l’espressione di GluR1 a livello delle PSD. La regressione lineare à ̈ stata eseguita sui dati di attività della caspasi-3 e le misure di immunoreattività di GluR1. Ogni punto del diagramma di dispersione rappresenta un singolo esperimento dove sull’asse delle X à ̈ riportato il rapporto di attività della caspasi-3 (z-DEVD-fmk/controllo), e sull’asse delle Y, il rapporto dei livelli di GluR1 (z-DEVD-fmk/controllo). Il coefficiente di correlazione ottenuto (r) à ̈ -0.98 (p <0.01, test di correlazione di Pearson).
(E) L’inibizione della caspasi-3 ha un effetto sulla fosforilazione di GluR1 a livello della Ser845. Dopo incubazione con 5µM di z-DEVD-fmk o con DMSO per 2 ore, le sezioni sono state utilizzate per l’estrazione delle proteine totali. I campioni sono stati analizzati mediante immunoblotting con anticorpi anti-GluR1 e anti-GluR1pSer845 (pannello superiore). La tubulina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento. Le lastre sono state analizzate mediante densitometria; e i dati mostrati nel grafico (pannello inferiore) sono espressi come media ± SD. (*p< 0.05, n=3, U test di Mann-Whitney; il controllo à ̈ indicato come 100%). L’inibizione della caspasi-3 non ha nessun effetto sui livelli di GluR1 totale ma solamente su quelli di GluR1pSer845.
(F) La calcineurina A (CN-A) à ̈ un substrato della caspasi-3 nell’ippocampo dei topi Tg2576. Dopo incubazione con 5 µM di z-DEVD-fmk o con DMSO per 2 ore, le sezioni sono state utilizzate per l’estrazione delle proteine totali. I campioni sono stati analizzati mediante immunoblotting usando un anticorpo anti-CN-A. La tubulina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento. Le lastre sono state analizzate mediante densitometria ed i dati mostrati nel grafico (pannello inferiore) sono espressi come media ± SD. (* p< 0.05, n=3; U test di Mann-Whitney; il controllo à ̈ indicato come 100%).
(G) L’inibizione della caspasi-3 causa la riduzione dell’attività della calcineurina. Dopo 2 ore di incubazione con 5 µM di z-DEVD-fmk, le sezioni sono state analizzate per l’attività della calcineurina monitorando il rilascio di 32P dal substrato RII marcato radioattivamente. E’ da notare la significativa riduzione di attività calcioindipendente della calcineurina nelle sezioni trattate con z-DEVD-fmk rispetto ai controllo. (* p< 0.05, n=3; U test di Mann-Whitney; il controllo à ̈ indicato come 100%).
- FIGURA 7 mostra la caratterizzazione delle preparazioni di PSD.
(A) Analisi mediante immunoblotting del frazionamento di PSD. La figura mostra un immunoblot rappresentativo eseguito utilizzando la frazione corrispondente ai componenti citosolici delle sinapsi (Triton Soluble Fraction, TSF) e la frazione arricchita in PSD (Triton Insoluble Fracion, TIF). E’ da notare che la proteina presinaptica sinaptofisina, non à ̈ individuabile nella frazione arricchita in PSD.
(B) Le proteine estratte dalle PSD (15 µg di proteine) preparate da topi di controllo (WT) e Tg2576 (Tg) sono state separate mediante SDS-PAGE e colorate con il blu Coomassie. Non si osservano differenze tra le diverse preparazioni.
- FIGURA 8 mostra l’analisi al citofluorimetro eseguita su preparazioni di nuclei di neuroni ippocampali di topi WT e Tg di 3 mesi. Pannello superiore: non si osservano differenze nell’incorporazione di ioduro di propidio (PI) nei due genotipi. Risultati simili sono stati ottenuti in 3 esperimenti separati. Pannello inferiore: distribuzione dei nuclei non-marcati (controllo negativo).
FIGURA 9 mostra un’analisi dell’attivazione delle caspasi in neuroni primari transgenici (Tg) e transgenici in assenza della proteina Apaf1 (TgApaf<-/->).
I lisati totali di cellule Tg e Tg/Apaf1<-/->sono stati saggiati, mediante immunoblot, per il processamento delle caspasi-8,-7, e -6. Sia nei neuroni Tg sia in quelli Tg/Apaf1<-/->nessuna delle caspasi analizzate viene tagliata. L’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento.
- FIGURA 10 mostra un’analisi mediante immunoblotting del danno ossidativo.
Pannello di sinistra: immunoblotting che mostra il danno ossidativo valutato come carbonilazione delle proteine estratte dall’ippocampo di topi di 3 mesi. Pannello di destra: à ̈ stata eseguita l’analisi densitometrica di ogni corsia e l’actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento. L’istogramma mostra i valori medi ± SEM. Nei topi Tg2576 (Tg) il livello di carbonilazione delle proteine à ̈ maggiore rispetto al controllo (WT). (* p<0.05, n=7).
- FIGURA 11 à ̈ un diagramma che mostra l’aumento di attività della caspasi-3 nel liquido cerebro-spinale (CSF) di topi Tg2576 rispetto a topi WT di 3 mesi.
- FIGURA 12 à ̈ un diagramma che mostra l’aumento di attività della caspasi-3 nel sangue di topi Tg2576 rispetto a topi WT di 3 mesi.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Secondo la presente invenzione la caspasi-3 Ã ̈ utilizzata come biomarcatore per la diagnosi, la diagnosi precoce e il rilevamento della progressione di un disturbo neurodegenerativo in un individuo o in un campione isolato da un individuo.
In particolare, un composto per modulare direttamente o indirettamente l’attività della caspasi-3 à ̈ utilizzato per la preparazione di un medicamento per il trattamento di un disturbo neurodegenerativo in un individuo.
Preferibilmente, il disturbo neurodegenerativo à ̈ una malattia caratterizzata dalla formazione di placche amiloidi. Più preferibilmente, il disturbo neurodegenerativo à ̈ la malattia di Alzheimer.
Secondo la presente invenzione à ̈ inoltre fornita una composizione farmaceutica comprendente un composto per modulare l’attività della caspasi-3 direttamente o indirettamente, e un relativo veicolo, stabilizzatore, diluente o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
Alternativamente il biomarcatore à ̈ utilizzato in combinazione con almeno un altro biomarcatore.
Secondo la presente invenzione à ̈ fornito un metodo per la diagnosi, la diagnosi precoce o il rilevamento della progressione di un disturbo neurodegenerativo in un individuo comprendente le fasi di:
- isolare un campione biologico da un individuo;
- quantificare il livello di attività della caspasi-3 in detto campione biologico;
- confrontare detto livello con un livello di riferimento.
Secondo la presente invenzione à ̈ anche fornito un metodo per determinare se un composto sia efficace nel trattamento di un disturbo neurodegenerativo comprendente le seguenti fasi di:
- quantificare il livello di attività della caspasi-3 in un campione isolato da detto individuo prima del trattamento; e
- confrontare il livello quantificato di attività della caspasi-3 con uno o più livelli di riferimento dopo il trattamento.
Preferibilmente il campione organico à ̈ un fluido biologico. Più preferibilmente il campione organico à ̈ sangue, plasma, siero o fluido cerebrospinale.
Preferibilmente la quantificazione della caspasi-3 Ã ̈ eseguita mediante una tecnica selezionata dal gruppo che consiste in saggi colorimetrici, fluorimetrici, calorimetrici, chemiluminescenti, radiometrici e cromatografici.
E’ stato dimostrato che la caspasi-3 attiva si accumula nei terminali post-sinaptici dei neuroni ippocampali del modello murino transgenico Tg2576 (Tg), che contiene l’allele umano mutante APPswe e presenta deficit cognitivi precoci. Un aumento dell’attività della caspasi-3 nelle sinapsi ippocampali dei topi Tg à ̈ stato osservato all’età di 3 mesi, molto prima che la formazione di placche amiloidi sia individuabile. Inoltre, à ̈ stato dimostrato che l’aumento di attività della caspasi-3 dipende dall’attività dell’apoptosoma ed à ̈ associata a i) una riduzione significativa della densità di spine dendritiche nella regione CA1 dell’ippocampo; ii) un’alterazione nell’apprendimento ippocampale valutato mediante il condizionamento contestuale di paura (Contextual Fear Conditioning, CFC); iii) una significativa riduzione dei livelli della subunità GluR1 del recettore AMPA a livello delle densità post-sinaptiche (Post-Synaptic Density, PSD); e iv) una significativa alterazione della trasmissione sinaptica glutamatergica basale, senza coinvolgere il potenziamento a lungo termine (Long Term Potentiation, LTP). Invece, animali transgenici esaminati in più giovane età non mostrano questo fenotipo. Nel complesso, questi risultati mostrano che l’accumulo di Aβ, una conseguenza della sovra-espressione dell’APPswe (Kawarabayashi et al., 2001), induce un’alterazione delle PSDs e la perdita delle spine dendritiche, causando deficit cognitivi, mediante l’attività della caspasi-3. Più importante, à ̈ stato dimostrato che bloccando l’attività della caspasi-3 à ̈ possibile prevenire l’alterazione delle PSD. L’uso di farmaci specifici in grado di inibire il meccanismo di degenerazione sinaptica mediato dalla caspasi-3 potrebbe dunque risultare utile nelle terapie “sinaptoprotettive†, per rallentare o prevenire la progressione della malattia.
I livelli dell’attività enzimatica della caspasi-3 sono stati anche analizzati nel liquido cerebro-spinale (CSF) di topi che presentano i primi deficit cognitivi, come valutato mediante test comportamentali (CFC). Tali livelli di attività sono risultati maggiori nei topi che sviluppano un fenotipo simile all’AD rispetto ai controlli della stessa età . Nessuna differenza nell’attività della caspasi-3 à ̈ stata trovata in topi più giovani. Un aumento nell’attività della caspasi-3 à ̈ stato anche osservato in campioni di sangue prelevati da ottenuti da topi che sviluppano un fenotipo simile all’AD rispetto ai controlli della stessa età .
I topi Tg2576 mostrano un’alterazione nel CFC test correlata all’etÃ
L’AD à ̈ una malattia caratterizzata da una progressiva perdita cognitiva, per la maggior parte dipendente dalla degenerazione neuronale, che inizialmente coinvolge l’ippocampo e poi si estende alle regioni corticali temporali e frontali. Il CFC sfrutta la capacità dei topi di associare uno stimolo avverso (shock elettrico agli arti) al contesto sperimentale nel quale sono stati sottoposti a tale stimolo. Questa capacità dipende, a sua volta, dalla formazione di una rappresentazione contestuale che à ̈ dipendente dall’integrità dell’ippocampo (Phillips e LeDoux, 1992). Di conseguenza, le prestazioni nel CFC sono fortemente disturbate negli animali con una disfunzione ippocampale (Jacobsen et al., 2006). Poiché l’immobilità à ̈ un comportamento adattativo esibito dagli animali in ambienti potenzialmente pericolosi, la prestazione CFC à ̈ valutata in base alla risposta di “freezing†mostrata dai topi quando vengono posti nuovamente nella camera di condizionamento 24 ore dopo aver ricevuto lo stimolo avverso. Siccome durante il test nessuno shock viene somministrato, à ̈ assunto che la risposta sia un indice della memoria delle esperienze avverse precedenti. In questo studio, topi Tg2576 (Tg) e controlli non transgenici (WT) sono stati studiati mediante il CFC all’età di 2 e 3 mesi. Durante l’allenamento (Figura 1A) non à ̈ stato individuato nessun effetto del genotipo (F1,24=0.99; p>0.1) o dell’età (F1,24=0.44; p>0.1), indicando che la mutazione APPswe non influisce sull’intensità della risposta di paura. Durante il test (Figura 1B), si osserva un significativo effetto del genotipo (F1,24=7.84; p<0.01) e dell’interazione genotipo x età (F1,24=4.32; p<0.05). Le analisi post hoc hanno evidenziato che i topi WT e Tg di 2 mesi non mostrano differenze nella soppressione dell’attività motoria quando posti nuovamente nel contesto sperimentale (F1,10=1.48; p>0.1). Al contrario, una significativa riduzione nella soppressione dell’attività motoria si à ̈ registrata in topi Tg2576 di 3 mesi (F1,14=9.66; p<0.01), indicando un deficit nel CFC. In questo modello, l’età di 3 mesi può quindi essere considerata paragonabile allo stadio 2-3 della malattia di Alzheimer negli esseri umani secondo il sistema di †̃functional assessment staging’ (FAST) (Reisberg, 1988). La densità delle spine dendritiche e la lunghezza totale dei dendriti à ̈ ridotta nei topi Tg2576
L’ippocampo svolge un ruolo fondamentale nella memoria episodica/dichiarativa (Tulving e Markovitsch, 1998) infatti, ratti con deficit di memoria (Avila-Costa et al., 1999) o esseri umani affetti da demenza senile (de Ruiter et al.,1987; Probst et al., 1983; Ferrer et al., 1990), mostrano una riduzione della densità di spine nella regione CA1 dell’ippocampo. Inoltre, poiché diversi dati dimostrano che questa regione à ̈ criticamente coinvolta nel recupero delle prestazioni nel CFC nei ratti (Lee e Kesner, 2004), ci siamo proposti di indagare se il declino cognitivo precoce nei topi Tg2576 (Tg) fosse associato alla perdita delle spine dendritiche nella sub-regione CA1 dell’ippocampo.
Le caratteristiche morfologiche dei neuroni piramidali del CA1 dell’ippocampo dorsale, colorati mediante tecnica Golgi (Figura 1C), sono stati esaminati all’età di 3 mesi, quando i topi Tg2576 (Tg) e quelli di controllo (WT) hanno esibito differenze nelle prestazioni nel CFC. Le analisi statistiche, eseguite sulle misure morfologiche, hanno evidenziato che i topi Tg2576 presentano una significativa riduzione della densità di spine (F1,55=4.02; p<0.05) nei dendriti apicali, che si proiettano nello strato radiato, rispetto a quelli dei topi WT. Nessuna differenza (F1,58=0.76; p>0.1) si à ̈ invece osservata a livello dei dendriti basali che si proiettano nello strato oriens (Figura 1D). Inoltre, la lunghezza totale dei dendriti (Figura 1E) à ̈ risultata significativamente ridotta in topi Tg2576 rispetto ai loro controlli WT (F1,32=8.31; p<0.01). Nel complesso, questi dati implicano una consistente riduzione dell’input sinaptico a livello dei neuroni piramidali del CA1 nei topi Tg2576 di 3 mesi.
I livelli della subunità GluR1 del recettore AMPA sono ridotti nelle densità post-sinaptiche dei topi Tg2576
Si ipotizza che alterazioni strutturali a carico delle densità post-sinaptiche (Post-Synaptic Density, PSD) precedano le alterazioni morfologiche delle spine (Abel et al., 2008). Per indagare le basi molecolari responsabili della perdita delle spine dendritiche, che causano le alterazioni cognitive, abbiamo valutato la composizione delle PSD nei topi che presentano le prime alterazioni comportamentali. Con questo scopo, le proteine estratte da preparazioni isolate di PSD preparate dall’ippocampo di topi Tg2576 e di controllo di 3 mesi, sono state analizzate mediante tecnica di immunoblotting e saggiate utilizzando anticorpi diretti contro i componenti principali delle PSD (Figura 2A). Questi includono diverse subunità dei recettori del glutammato, componenti del citoscheletro subsinaptico ed enzimi coinvolti nella segnalazione subsinaptica. Mentre le quantità relative dei componenti subsinaptici rimangono essenzialmente invariate nelle preparazioni di PSD, i livelli della subunità GluR1 del recettore AMPA e della sua forma fosforilata (GluR1pSer845) risultano significativamente ridotti nelle PSD dei topi Tg2576 rispetto ai controlli WT. Per determinare la qualità delle preparazioni di PSD e per escludere la presenza di contaminazioni durante il processo di frazionamento, le proteine estratte dalle PSD sono state saggiate con un anticorpo diretto contro la sinaptofisina, coinvolta nel meccanismo di rilascio pre-sinaptico. Inoltre, la possibile degradazione proteica nei campioni esaminati à ̈ stata esclusa analizzando i gel mediante colorazione Coomassie (Figura 7AB).
Per meglio caratterizzare la riduzione di GluR1 nell’ippocampo dei topi Tg2576, à ̈ stata eseguita un’analisi di immunoistochimica su sezioni sagittali di cervello (Figura 2B). Si à ̈ osservato che nello strato radiato del CA1 i topi Tg2576 presentano un’espressione minore di GluR1 rispetto ai controlli WT; al contrario non si osservano differenze tra i due genotipi per quanto riguarda i livelli del marcatore pre-sinaptico sinaptofisina.
Nel complesso, questi risultati indicano che i livelli di GluR1 e di GluR1pSer845 sono selettivamente ridotti nelle PSD dell’ippocampo di topi Tg2576.
La riduzione precoce di GluR1 nelle PSD influisce sulla trasmissione sinaptica glutamatergica ma non sul potenziamento a lungo termine
Le alterazioni nella composizione delle PSD dei neuroni ippocampali dei topi Tg2576 di 3 mesi potrebbero causare cambiamenti nelle proprietà elettrofisiologiche dell’ippocampo. Poiché i livelli della subunità NMDA ε1 (ortologo dell’NR2A di ratto), che rappresenta la subunità NR2 più abbondante del recettore NMDA (NMDAR) nel cervello adulto, non risultano alterati, non si prevede nessuna variazione nella trasmissione NMDAR-dipendente. La riduzione della subunità GluR1 del recettore AMPA (AMPAR) e della sua forma fosforilata sulla Ser845 osservata nelle PSD di topi Tg2576 di 3 mesi, potrebbe causare una riduzione delle correnti post-sinaptiche mediate dall’AMPAR nei neuroni del CA1. Per confermare questa ipotesi, sono state eseguite registrazioni su cellule intere in sezioni ippocampali ottenute da topi WT e Tg2576. Sono stati confrontati i contributi relativi degli AMPARs ed NMDARs alle correnti eccitatorie post-sinaptiche (EPSCs), evocate dalla stimolazione delle collaterali di Schaffer. La misura del rapporto tra le EPSCs AMPAR-dipendenti ed NMDAR-dipendenti minimizza l’innata variabilità cellula-cellula ed à ̈ una procedura utilizzata con successo, in quanto misura i cambiamenti della forza sinaptica in diverse condizioni (Saal et al., 2003; Marie et al., 2005). I rapporti sono stati calcolati mantenendo le cellule a -65 mV per ottenere le EPSCs AMPAR-mediate e poi depolarizzando le cellule a 20 mV, punto in cui à ̈ possibile ottenere una misura delle EPSCs NMDAR-mediate (Figura 3A). Si à ̈ osservato che il rapporto AMPAR/NMDAR risulta significativamente ridotto in topi Tg2576 di 3 mesi rispetto ai topi WT (Tg: 20.2±4.6, n=9 neuroni, N=4 animali; WT: 39.3±6.7, n=8, N=3). Questa riduzione potrebbe essere almeno parzialmente dovuta alla diminuzione dell’EPSC di AMPAR risultante dalla perdita della subunità GluR1 dalla PSD.
Per escludere la possibilità che la diminuzione della componente AMPAR-mediata della risposta sinaptica fosse dovuta alle alterazioni delle proprietà di rilascio presinaptico, sono stati misurati i rapporti di coppie delle ampiezze dei EPSC AMPAR-mediati evocate da uno stimolo con intervallo corto (100 ms) mentre il potenziale postsinaptico veniva mantenuto a -65 mV (paired-pulse ratio, PPR) (Figura 3B). Questo saggio correla con la probabilità di rilascio di neurotrasmettitore ed à ̈ ampiamente utilizzato per valutare i cambiamenti nella funzione presinaptica (Zucker e Regehr, 2002). Come anticipato, il PPR di reazioni sinaptiche CA3-CA1 non mostra differenze in topi Tg2576 vs. WT (Tg: 1.42±0.18, n=15, N=4; WT: 1.40±0.07, n=10, N=3), escludendo qualsiasi alterazioni in probabilità di rilascio a questa età .
Il traffico di GluR1 a livello della PSD e la fosforilazione di questa subunità dell’AMPAR sul residuo Ser845 sono importanti processi regolatori per l’espressione del potenziamento a lungo termine NMDAR-dipendente (LTP) di trasmissione sinaptica eccitatoria (Malinow e Maschinka, 2002). Sono state quindi eseguite analisi elettrofisiologiche volte a stabilire se i cambiamenti di espressione di GluR1 e GluR1pSer845 a livello della PSD dei topi Tg2576 conducano ad una riduzione dell’LTP nei topi Tg2576 di 3 mesi. L’LTP dei campi post-sinaptici eccitatori (fEPSP) à ̈ stato evocato mediante singole stimolazioni ad alta frequenza (HFS, 1 s, 100 Hz) in entrambi i genotipi (Figura 3C). Sono stati osservati simili livelli di potenziamento sinaptico nei topi WT e Tg2576 (slope fEPSP normalizzato a 50 min dopo l’HFS, WT: 1.31±0.08, n=20 sezioni, N=8 animali, p>0.05; Tg: 1.5±0.11, n=14, N=8) (Figura 3D). Questi risultati suggeriscono che, sebbene i livelli di GluR1 siano ridotti a livello delle PSD dei topi Tg2576 di 3 mesi, i meccanismi coinvolti nel traffico di GluR1 alle PSD durante l’induzione dell’LTP siano intatti, come riportato in precedenza da altri (Chapman et al., 1999).
Aumento precoce dei livelli di attività della caspasi-3 a livello delle sinapsi ippocampali dei topi Tg2576
Si ipotizza che, nell’AD e in altre malattie neurodegenerative, un meccanismo apoptotico caspasi-3-dipendente localizzato possa contribuire all’iniziale perdita sinaptica (Mattson e Duan, 1999); il meccanismo(i) di questo processo rimane però da chiarire.
Differenti approcci sono stati quindi utilizzati per stabilire se l’attività della caspasi-3 possa essere responsabile della perdita di spine e dell’alterazione nella composizione delle PSDs osservate nell’ippocampo dei topi Tg2576. L’attività della caspasi-3 à ̈ stata valutata mediante metodo fluorimetrico negli estratti cellulari totali e nei sinaptosomi preparati dall’ippocampo di topi Tg2576 e di controllo a 2 e 3 mesi di età . Nessun cambiamento nell’attività della caspasi-3 à ̈ stato osservato tra i due diversi genotipi a 2 mesi di età . Al contrario, a 3 mesi di età , i topi Tg2576 hanno mostrato un aumento significativo nell’attività della caspasi-3, sia negli omogenati ippocampali totali (Tg/WT=1.30±0.09) sia nella preparazione di sinaptosomi (Tg/WT=1.84±0.11) (Figura 4A).
Mediante tecnica di immunoblotting, la forma tagliata della caspasi-3 à ̈ stata individuata nelle preparazioni di sinaptosomi, e l’immunoreattività à ̈ risultata maggiore nei topi Tg2576 rispetto ai controlli (Tg/WT=1.60±0.11) (Figura 4B). In accordo con risultati precedenti (Vaisid et al., 2007), nessuna o poca immunoreattività à ̈ stata individuata negli omogenati totali di ippocampo. E’ interessante osservare che la procaspasi-3 risulta più abbondante nella frazione sinaptosomale, rispetto all’omogenato totale. Questo dato suggerisce che la caspasi-3 à ̈ preferenzialmente localizzata, e selettivamente attivata, nel compartimento sinaptico.
Per meglio investigare la localizzazione sinaptica della caspasi-3 attiva nell’ippocampo, à ̈ stata eseguita un’immunoistochimica su sezioni ultrasottili, utilizzando un anticorpo specifico per caspasi-3 tagliata. Le spine immunopositive sono significativamente più abbondanti nei neuroni dei topi Tg2576 rispetto ai loro controlli WT (Figura 4C). Nella spina, gli immunoprecipitati risultano specificamente concentrati a livello delle densità postsinaptiche (PSD). Nessuna immunoreattività à ̈ stata trovata nel soma, nei nuclei, nei terminali pre-sinaptici, o nelle protuberanze gliali circostanti.
L’esposizione della fosfatidilserina (PS) sulla membrana plasmatica à ̈ normalmente considerata un evento a valle dell’attivazione delle caspasi ed una caratteristica dell’apotptosi (Stennicke e Salvesen, 1998; van Engelend et al., 1998). Per studiare eventuali variazioni nell’esposizione della PS nella frazione sinaptosomale in relazione all’aumento di attività della caspasi-3, abbiamo utilizzato un metodo citofluorimetrico per analizzare le preparazioni di sinaptosomi (Gylys et al., 2004). Marcando i sinaptosomi con l’annessina V e con un marcatore di vitalità cellulare (calceina AM) prima dell’analisi al FACS (separazione di cellule basata sull’attivazione della fluorescenza), à ̈ possibile valutare i livelli di morte sinaptica (sinaptosi) nelle preparazioni di sinaptosomi intatti ottenute dall’ippocampo di topi WT e Tg2576 di 3 mesi (Figura 4D). L’esposizione della PS risulta maggiore nei sinaptosomi di topi Tg2576 rispetto a quelli WT (43.4±8.2% vs. 22.3±6.8%, n=6, p<0.05). Per escludere la possibilità che l’esposizione della PS apoptosi-dipendente sia una conseguenza del processo di preparazione dei sinaptosomi, sono stati analizzati i nuclei preparati dall’ippocampo mediante marcatura con ioduro di propidio (PI). La marcatura con PI non ha evidenziato alcuna differenza genotipo-dipendente (WT: 5.9±1.7%, Tg: 5.3±1.5%,n=6) (Figura 8).
Nel complesso, questi risultati indicano che la caspasi-3, ed in particolare la sua forma attiva, si localizza a livello delle PSDs e può correlare con la degenerazione delle spine dendritiche. Inoltre, l’aumento di positività per anessina V osservato nei sinaptosomi preparati dai topi Tg2576 non à ̈ associato a classica morte neuronale. Questo sembra contraddire il canonico ruolo dell’attivazione della caspasi-3, che à ̈ spesso considerata la tappa terminale nella cascata biochimica che conduce alla morte apoptotica delle cellule. (Salvesen e Dixit, 1997).
L’accumulo di Aβ in neuroni primari mutanti APPswe à ̈ associata con l’attivazione della caspasi-3
Come riportato da altri (Takahashi et al., 2004; Lesné et al., 2006), l’Aβ si accumula e oligomerizza nel citosol dei neuroni primari mutanti per l’APP (APPswe) in maniera tempo-dipendente (dati non mostrati). Per verificare se la sovra-produzione di Aβ possa indurre in vitro l’attivazione della caspasi-3 senza morte neuronale, sono state utilizzate colture primarie neuronali, preparate dal tessuto corticale e ippocampale di embrioni transgenici (Tg) e WT della stessa cucciolata allo stadio di sviluppo 15 (E15). Mediante saggio fluorimetrico diretto e mediante immunoblotting, à ̈ stato osservato un significativo aumento dell’attività della caspasi-3 (Figura 5A) e del suo processamento (Figura 5B), sia a 7 sia a 12 giorni di coltura in vitro (Days In Vitro, DIV), nei neuroni Tg rispetto a loro controlli WT. Questo aumento dei livelli di attività della caspasi-3 non determina alcuna differenza nel tasso di morte apoptotica neuronale, come evidenziato mediante diversi saggi che misurano i livelli di apoptosi, come la quantificazione dei livelli di frammentazione del DNA (dati non mostrati), il processamento della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) (Figura 5C) e il saggio TUNEL (Figura 5D).
Studi recenti, eseguiti su neuroni transgenici in coltura (Almeida et al., 2005), suggeriscono che le progressive alterazioni sinaptiche dipendenti dal tempo in coltura sono accompagnate, e probabilmente causate, dall’aumento dei livelli di Aβ.
L’attivazione locale della caspasi-3 nei dendriti, che abbiamo osservato in vivo, può essere riprodotta in una coltura neuronale primaria transgenica (APPswe)? Per individuare i siti di accumulo della caspasi-3 attivata in questi neuroni mutanti, sono state analizzate preparazioni di sinaptosomi ottenute da colture a 7 DIV (Figura 5E); à ̈ stata inoltre visualizzata l’attività della caspasi-3 in situ (Figura 5F) (Keller et al., 1998). Mediante tali approcci si à ̈ osservato un forte arricchimento di caspasi-3 tagliata nei sinaptosomi rispetto ai lisati cellulari totali (Figura 5E). La marcatura con il DEVD (un indicatore di attivazione della caspasi-3) ha confermato l’ipotesi che i neuroni mutanti APPswe accumulano caspasi-3 attiva lungo i dendriti (Figura 5F).
La via intrinseca, che coinvolge l’apoptosoma, à ̈ il principale meccanismo di attivazione della caspasi-3 nei neuroni primari Tg2576-derivati
La canonica attivazione della caspasi-3 si verifica in un ampio spettro di sistemi cellulari ed in vivo mediante due principali pathway: il pathway estrinseco di morte cellulare, mediato dalla famiglia dei recettori di morte e dalla caspasi-8, ed il pathway intrinseco (mitocondriale) di morte cellulare, mediato dall’apoptosoma centrato sulla proteina Apaf1 (Verde e Kroemer, 2004; Schulze-Osthdif, 1998). Per stabilire quale’à ̈ il principale meccanismo di attivazione della caspasi-3 nelle colture transgeniche à ̈ stato studiato il ruolo dei due diversi pathway. L’attivazione delle caspasi-6 e -7, due caspasi effettrici che agiscono in parallelo alla caspasi-3, e quella della caspasi-8, la caspasi iniziatrice del pathway estrinseco, à ̈ stata analizzata nei neuroni primari APPswe. Tutte le suddette caspasi non vengono processate (Figura 9, corsa di sinistra).
Per valutare il coinvolgimento dell’apoptosoma nei neuroni primari Tg-derivati, sono stati studiati neuroni Tg che mancano della proteina Apaf1 (Tg/Apaf1<-/->doppi mutanti), una proteina che partecipa alla formazione dell’apoptosoma nei mammiferi (Zou et al., 1997). I lisati totali preparati dai neuroni Tg e Tg/Apaf1<-/->(7 DIV) sono stati saggiati per il processamento della caspasi-3 e di PARP, un substrato della caspasi-3. Nei neuroni Tg/Apaf1<-/->, la caspasi-3 non viene attivata e PARP non à ̈ tagliata (Figura 5G). Inoltre, come previsto, l’assenza di Apaf1 non influenza l’attivazione delle caspasi-6, -7 e -8 (Figura 9, corsa di destra). Infine, l’attivazione della caspasi-3 non à ̈ individuabile nei neuroni Tg/Apaf1<-/->neanche mediante microscopia confocale (Figura 5H).
Questi risultati dimostrano il ruolo cruciale ed esclusivo del pathway mediato dall’apoptosoma nell’attivazione della caspasi-3, attivazione indotta dalla sovra-espressione dell’APPswe.
La caspasi-3 media la defosforilazione calcineurinadipendente della subunità GluR1 e la rimozione del recettore AMPA dalla PSD
Poiché l’attività della caspasi-3 risulta aumentata nel compartimento post-sinaptico e, viceversa, la subunità GluR1 di AMPAR e la sua forma fosforilata (GluR1Ser845) risultano ridotte nelle PSDs dei neuroni ippocampali transgenici, à ̈ stata eseguita un’analisi volta a determinare se le due molecole fossero epistaticamente correlate. E’ stato sviluppato un saggio in vitro, utilizzando sezioni ippocampali preparate da topi Tg2576 di 3 mesi e trattate in acuto, per correlare l’attività della caspasi-3 con il contenuto di GluR1. Le misure fluorimetriche dell’attività della caspasi-3 sono state eseguite sugli estratti proteici ottenuti dalle sezioni ippocampali, dopo incubazione di 2 ore con l’inibitore della caspasi-3 z-DEVD-fmk a diverse concentrazioni. Trattando le sezioni con l’inibitore alle concentrazioni finali di 2.5 o 5 µM i valori di attività della caspasi-3 risultano inferiori del 25 e 50%, rispettivamente, se confrontati con quelli dei controlli trattati con il veicolo (DMSO) (Figura 6A). La forma tagliata di PARP, un’indicazione di morte cellulare apoptotica, non à ̈ individuabile in nessuna delle condizioni sperimentali, escludendo quindi la possibilità che il z-DEVD-fmk possa proteggere i neuroni da un’apoptosi indotta dalle condizioni di incubazione (Figura 6B).
Dopo l’incubazione con 2.5 o 5 µM di z-DEVD-fmk, due sezioni sono state utilizzate per l’analisi fluorimetrica diretta dell’attività della caspasi-3, come sopra, mentre le sezioni rimanenti sono state utilizzate per eseguire delle preparazioni di PSD. L’analisi mediante immunoblotting delle PSD ottenute dalle sezioni ippocampali di topi Tg2576 trattate con z-DEVD-fmk hanno mostrato un aumento dei livelli di GluR1 e GluR1pSer845, rispetto al controllo Tg2576 trattato solo con il veicolo. Al contrario, l’inibizione della caspasi-3 non ha alcun effetto sui livelli del marcatore post-sinaptico PSD-95 (Figura 6C). L’analisi di regressione lineare ha mostrato che l’aumento di GluR1 a livello delle PSD à ̈ inversamente correlato ai livelli di attività della caspasi-3 (Figura 6D).
Considerato che in condizioni normali la PSD à ̈ arricchita della forma fosforilata di GluR1 (Lee et al., 2003), abbiamo voluto stabilire se la caspasi-3 causasse la riduzione degli AMPAR contenenti GluR1, tagliando GluR1 direttamente (Lu et al., 2002) o attivando delle fosfatasi coinvolte nella mobilità del recettore AMPA. E’ stato dunque analizzato il contenuto di GluR1 nell’omogenato totale ottenuto da sezioni ippocampali (dove GluR1 può essere rinvenuto in entrambe le forme, fosforilata e defosforilata) trattate con z-DEVD-fmk o lasciate senza trattamento. Come mostrato in Figura 6E, l’inibizione della caspasi-3 causa un aumento dei livelli di GluR1pSer845 ma non ha effetto sui livelli del GluR1 totale. Questo risultato suggerisce che, in queste condizioni sperimentali, la caspasi-3 non tagli direttamente la subunità GluR1.
Per chiarire il meccanismo molecolare attraverso il quale agisce caspasi-3, diverse ipotesi sono state testate. Una possibile spiegazione deriva dall’osservazione che la calcineurina à ̈ necessaria per l’eliminazione sinaptica Aβmediata di AMPAR, causando la perdita delle spine dendritiche (Hsieh et al., 2006). Poiché à ̈ stato dimostrato che la calcineurina A (CN-A) viene attivata proteoliticamente dalla caspasi-3 (Mukerjee et al., 2000), l’ipotesi à ̈ che l’attività della CN-A possa aumentare in seguito al taglio da parte della caspasi-3.
Per valutare se la CN-A fosse un substrato della caspasi-3 nell’ippocampo, à ̈ stata eseguita un’analisi mediante immunoblotting degli omogenati totali preparati dalle sezioni trattate con il z-DEVD-fmk e dalle sezioni di controllo, utilizzando un anticorpo diretto contro la regione N-terminale della CN-A. La CN-A à ̈ organizzata in quattro domini (dall’N- al C-terminale: dominio catalitico, dominio di legame alla CN-B, dominio di legame alla CaM, dominio autoinibitorio) e, in seguito al taglio da parte della caspasi-3, vengono generati due frammenti di 45 e 12 kDa, derivanti rispettivamente dalle regioni N- e C-terminale. Il processamento della CN-A risulta ridotto nelle sezioni ippocampali di topi Tg2576 trattate con l’inibitore della caspasi-3 z-DEVD-fmk, rispetto alle sezioni di controllo, confermando un ruolo per la caspasi-3 nel taglio della CN-A in vivo (Figura 6F). Poiché il frammento di 45 kDa della CN-A prodotto dal taglio da parte della caspasi-3 contiene l’intero dominio catalitico ma manca di quello autoinibitorio, abbiamo saggiato l’attività della CN-A in risposta alla inibizione della caspasi-3. L’attività della CN-A à ̈ stata misurata in un mezzo privo calcio per escludere la componente di attività calciodipendente (Figura 6G). Nelle sezioni trattate con il z-DEVD-fmk à ̈ stata osservata una significativa riduzione dell’attività della CN-A calcio-indipendente rispetto alle sezioni di controllo non trattate, indicando che il taglio da parte della caspasi-3 causa un’attivazione permanente della CN-A.
L’attività della caspasi-3 à ̈ maggiore nel CSF e nel sangue di topi Tg2576 di 3 mesi rispetto ai topi di controllo.
I livelli dell’attività enzimatica della caspasi-3 sono stati analizzati nel CSF e nel sangue di topi che presentano i primi deficit cognitivi, come valutato mediante test comportamentali (CFC). I livelli di attività enzimatica della caspasi-3 (attività DEVDasica) sono stati misurati mediante saggio fluorimetrico (Calbiochemâ„¢) secondo le istruzioni fornite dal produttore. Nel CSF, i livelli di attività della caspasi-3 sono più alti (n=5, p<0.05) nei topi (3 mesi di età ) che sviluppano un fenotipo simile all’AD (Alzheimer’s Disease) rispetto ai controlli della stessa età . Nessuna differenza nell’attività della caspasi-3 à ̈ stata trovata in topi più giovani (Figura 11). Un aumento significativo dell’attività della caspasi-3 (n=5, p<0.05) à ̈ stato anche trovato nei campioni di sangue ottenuti mediante prelievo dalla vena caudale di topi Tg2576 (Figura 12).
In conclusione, la caspasi-3 à ̈ una proteina chiave coinvolta nella degenerazione sinaptica all’inizio delle alterazioni comportamentali, morfologiche, biochimiche ed elettrofisiologiche in un modello animale di AD. In particolare, le prime alterazioni comportamentali, valutate mediante il CFC test, si osservano a 3 mesi di età e riflettono una riduzione della densità di spine nella regione CA1 dell’ippocampo. Queste alterazioni comportamentali e morfologiche sono associate ad un aumento della caspasi-3 attiva nei terminali post-sinaptici della regione CA1, che à ̈ responsabile di una specifica riduzione dei livelli della subunità GluR1 di AMPAR e correla con una alterata trasmissione sinaptica glutamatergica basale.
Parte sperimentale
Animali
Topi maschi Tg2576 emizigoti (Hsiao et al., 1996) e topi di controllo (Wt) della stessa cucciolata sono stati utilizzati per tutti gli studi. I topi Tg2576 derivano dal reincrocio di topi Tg2576 con topi di ceppo misto B6SJLF1. Gli esperimenti sono stati condotti secondo il Direttivo del Consiglio della Comunità Europea 86/609/EEC. L’approvazione formale degli esperimenti descritti à ̈ stata ottenuta dal Ministero Italiano della Salute (D.L.vo 116/92).
Test comportamentali
Topi Tg2576 e topi WT sono stati esaminati per CFC in una camera di condizionamento che consiste di una gabbia di plexiglas (28x28 cm) la cui base à ̈ composta da una griglia di acciaio inossidabile, secondo un protocollo precedentemente descritto (Frankland et al., 2004). Il comportamento dei topi à ̈ stato videoregistrato e la memoria di paura à ̈ stata valutata misurando i livelli dell’attività motoria con uno specifico software (Sistema Ethovision Noldus, Olanda). I valori sono riportati come rapporto di soppressione della attività motoria.
Colorazione Golgi e misura della densità di spine
Sono stati preparati, trattati, acquisiti ed analizzati sia i dendriti apicali sia quelli basali delle cellule piramidali nella regione dorsale ippocampale CA1 come precedentemente descritto (Restivo et al., 2005). Tutte le misure morfologiche sono state eseguite in cieco. Preparazione in vitro delle sezioni ed elettrofisiologia Sezioni ippocampali sono state preparate da topi maschi di 3 mesi come descritto da Bacci et al. (2003). I potenziali eccitatori post-sinaptici (fEPSPs) sono stati registrati nello strato radiato dell’area CA1 dell’ippocampo e amplificati utilizzando un amplificatore Multiclamp 700B patch-clamp (Molecular Devices). Un Digidata 1320 e PClamp9 (Molecular Devices) sono stati utilizzati per l’acquisizione dei dati, l’analisi e la generazione degli stimoli. Per gli esperimenti di LTP, i fEPSPs sono stati evocati a 0.1 Hz. Se il potenziale rimaneva stabile per almeno 10 min, l’LTP era indotto da una serie di 100 stimoli a 100 Hz. E’ stata fatta una media in intervalli di 0.5 min.
Registrazioni †̃patch clamp’ su cellule intere sono state ottenute da cellule piramidali del CA1 mediante †̃voltage clamp’. La soluzione intracellulare usata era composta da 117.5 mM CsMeSO4, 15.5 mM CsCl, 10 mM TEACl, 8 mM NaCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES, 0.25 mM EGTA, 4 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP, pH 7.3, osmolarità ~290 mOsm. Le registrazioni sono state fatte utilizzando un amplificatore Multiclamp 700B (Axon Instruments) e resistenze in serie (10-20 MW) e input (100-200 MW) sono state monitorate online durante ogni esperimento. Le cellule erano mantenute a -65 mV per registrare le correnti AMPA-mediate, e a 20 mV, per registrare le correnti NMDA-mediate. I dati sono stati digitalizzati con un strumento National Instruments BNC-2090 e acquisiti con Igor Pro (Wavemetrics Inc.). Posizione e intensità dello stimolo sono state selezionate per evocare una EPSC di ~-50 a -100 pA (durata dello stimolo: 100 ns, range di intensità : 10-50 nA). Nelle misure di †̃paired pulse’, i due impulsi sono stati forniti per 100 ms, ogni 10 s, ad un potenziale di-65 mV, ed à ̈ stata fatta la media da 20 scansioni per cellula. Sono state calcolate le ampiezze di corrente eccitatoria postsinaptica (EPSC), misurando il picco (la sua media ad un intervallo di 1 ms) confrontato alla baseline (anche su un intervallo di 1 ms). Per il rapporto AMPA/NMDA, à ̈ stata calcolata una media di 30 risposte (registrate a 0.1 Hz) e sono state calcolate le ampiezze di EPSC di NMDA misurando l’ampiezza (intervallo di 2 ms), confrontata alla baseline, 60 ms dopo l’inizio dell’EPSC, per evitare contaminazioni della risposta da parte del recettore AMPA (Marie et al., 2005).
Preparazione di densità post-sinaptica (PSD)
Per isolare le PSD dall’ippocampo di topi WT e Tg2576 di 3 mesi, à ̈ stato seguito un metodo descritto (Gardoni et al., 2006) apportando piccole modifiche.
Microscopia ottica ed elettronica
Per l’immunoistochimica ottica ed elettronica, gli animali sono stati fissati mediante perfusione come specificato (Moreno et al., 1995); i cervelli sono stati dissezionati e tagliati lungo il piano medio-sagittale. Una metà , dopo inclusione in paraffina e sezionamento di microtomo, à ̈ stata utilizzata per la microscopica ottica. Sezioni sagittali sono state immunomarcate per GluR1 o sinaptofisina. L’altra metà del cervello à ̈ stata tagliata al vibratomo e trattata per la microscopia elettronica con la tecnica del pre-embedding con l’anticorpo specifico per la forma attiva della caspasi-3, secondo procedure descritte prima (Moreno et al., 1995).
Preparazione di omogenato totale e sinaptosomi da ippocampo di topi
Le preparazioni degli omogenati ippocampali totali e della frazione sinaptosomale (CSF) sono state condotte come descritto precedentemente (Hruska-Hetà man et al., 2002). Saggio fluorimetrico di attività di caspasi-3
I sinaptosomi e gli omogenati totali sono stati lisati in un tampone di lisi (100 mM Hepes pH 7.4, 0.1% Chaps, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 1 mM PMSF) per mezzo di congelamento (in azoto liquido) e scongelamento a 37°C per tre volte. Dopo centrifugazione a 11,500 × g a 4°C per 5 min la concentrazione proteica del sovranatante risultante à ̈ stata determinata e la stessa quantità di proteine (20 µg per ogni campione) à ̈ stata incubata a 37°C nel tampone di lisi contenente 50 µM Ac-DEVD-AMC (Calbiochem). La fluorescenza à ̈ stata misurata, a differenti tempi di incubazione, utilizzando una lunghezza d’onda di eccitazione di 380 nm e una lunghezza di onda di emissione di 460 nm.
Isolamento di nuclei
La preparazione dei nuclei per la citofluorimetria à ̈ stata eseguita come descritto prima (Portier et al., 2006), utilizzando lo stesso omogenato iniziale da cui sono stati preparati i sinaptosomi.
Citometria a Flusso
Il pellet di sinaptosomi à ̈ stato risospeso in un tampone la cui composizione à ̈ indicata(10 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2). Aliquote di 100 ml sono state incubate per 10 min a temperatura ambiente con una soluzione contenente il colorante e poi diluite in PBS (volume finale 500 microlitri) per l’analisi di citometria a flusso. La concentrazione finale del colorante à ̈ stata di 100 nM per calceina AM (Molecular Probes) e 1 mg/ml per PE-Anessina V (BD Pharmingen). I campioni sono stati analizzati con un citometro a flusso FACS Canto. Biglie di polistirene (0.75, 1.4 e 4.5 mm) sono state fatte correre sullo strumento per standardizzare misure di †̃forward scatter’. Il pellet di nuclei à ̈ stato risospeso in PBS e, una soluzione di ioduro di propidio (PI) (Sigma) à ̈ stata aggiunta ad ogni campione a realizzare una concentrazione finale di 1 mg/ml. I campioni sono stati immediatamente analizzati con opportuno software (FACS Canto e FACS Diva; Becton Dickson). Profili di scatter per le intensità di fluorescenza FL-2 (PI) sono state tracciati. La percentuale di particelle (sinaptosomi à ̈ stata determinata con il programma Flowjo versione 8.6.1. ed à ̈ mostrata in ogni quadrante.
Trattamento di sezioni ippocampali
Sezioni coronali di cervello Tg2576 (di 3 mesi) sono state preparate come descritto sopra nel paragrafo “ Preparazione in vitro di sezioni e elettrofisiologia†. Ogni sezione coronale à ̈ stata tagliata lungo il piano sagittale in due emisezioni. Le sezioni omolaterali sono state incubate per 2 ore con z-DEVDfmk (Imgenex) e le sezioni controlaterali con DMSO. Dopo incubazione l’ippocampo à ̈ stato isolato e utilizzato per preparare le PSD, per il saggio di attività della caspasi-3, per il saggio di attività della calcineurina o per la preparazione di omogenato totale.
Saggio di attività della calcineurina
L’attività della calcineurina (CaN) à ̈ stata saggiata in estratti ottenuti da sezioni ippocampali di topi Tg2576 di 3 mesi incubate in presenza di z-DEVD-fmk o DMSO (veicolo di controllo) per 2 ore.
L’attività della CaN à ̈ stata saggiata secondo il metodo descritto in Ferri et al. (2000) monitorando il rilascio di 32P dal substrato marcato radioattivamente (peptide RII).
Colture primarie neuronali
Colture primarie di cellule neuronali sono state preparate da tessuto corticale e ippocampale di embrioni E15. Femmine di Apaf1<+/->(Cecconi et al., 1998) sono state incrociate con maschi Tg2576/Apaf1<+/->per ottenere neuroni WT, transgenici e transgenici mancanti della proteina Apaf1.
Per il saggio di attività della caspasi-3 le cellule sono state lisate in un tampone di lisi come descritto prima; il saggio à ̈ stato eseguito utilizzando 10 µg di proteine.
Per l’analisi di immunoblotting i neuroni sono stati staccati in tampone RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% Triton X-100, 0.25% Na-deossicolato, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, proteasi inibitori), sonicati, incubati per 20 min in ghiaccio e centrifugati a 11,500 × g per 10 min a 4°C. Successivamente à ̈ stato determinato il contenuto proteico totale del sovranatante risultante.
Per il saggio TUNEL abbiamo utilizzato il †̃ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosi Detection Kit’ acquistato da Chemicon e il saggio à ̈ stato eseguito secondo le istruzioni fornite dal produttore. Le immagini della marcatura TUNEL e DAPI sono state acquisite utilizzando un microscopio Axioskop 2 (Zeiss) corredato di fotocamera digitale ProgRes C10plus; luminosità e contrasto sono stati regolati utilizzando Adobe Photoshop CS3.
I sinaptosomi dai neuroni in coltura sono stati isolati come descritto nel sito web di Michael D. Ehlers’ (http://www.ehlerslab.org/protocolli/psd.html).
L’individuazione della caspasi-3 attiva in situ à ̈ stata eseguita col metodo pubblicato precedentemente (Keller et al., 1998), con piccole modifiche. In questa procedura i neuroni sono stati incubati con 10 µg/ml di DEVD-CHO (Calbiochem), che lega la caspasi-3 attiva, e con 5 µg/ml Oregon Verde Streptavidin (Molecular Probes) che lega la biotina. La fluorescenza à ̈ stato acquisita su quattro campioni per genotipo utilizzando un microscopio confocale con laser di scansione (Leica). Luminosità e contrasto sono stati regolati utilizzando Leica Application Suite (LAS AF).
Immunoblotting e anticorpi
Le proteine sono state separate per SDS-PAGE e trasferite su una membrana di PVDF. L’analisi di immunoblotting à ̈ stata eseguita utilizzando un kit di individuazione di chemiluminescenza (Amersham Biosciences). I livelli relativi di immunoreattività sono stati determinati per densitometria utilizzando il software ImageQuant 5.0. Anticorpi per la caspasi-3, caspasi-3 tagliata, PARP tagliata, caspasi-6 e caspasi-7 sono stati acquistati da Cell Signaling; caspasi-8 e Apaf1 da Alexis Biochemicals; GluR1 da Upstate; GluR1pSer845, GluR2/3, PSD 95 e calcineurina da Chemicon; NMDA-espilon-1 da Santa Cruz; NSF da Synaptic Systems; CaMKII da Zymed Laboratories; mGluR5 e sinaptofisina da Abcam; actina e beta-tubulina da Sigma.
Test Comportamentali
Il giorno dell’addestramento, i topi sono stati introdotti nella camera di condizionamento per un periodo di esplorazione libera di 2 min e poi esposti a cinque shock elettrici agli arti (0.6 mA, della durata di 2 sec) somministrati a intervalli di 60 sec. I topi sono stati rimessi nella loro gabbia 60 sec dopo l’esposizione all’ultima scossa. Il CFC à ̈ stato valutato 24 ore più tardi, riposizionando i topi per 5 min nella camera di condizionamento e nessuno shock elettrico à ̈ stato somministrato. L’attività motoria (tempo trascorso in movimento) à ̈ stata misurata 2 min prima della scossa iniziale (attività di base) e 2 min dopo la somministrazione dell’ultimo shock elettrico, ed à ̈ stato calcolato il rapporto di soppressione dell’attività motoria [tasso di attività dopo lo shock/( tasso di attività dopo lo shock tasso di attività di base)]; Anagnostaras et al., 2002]. Nel giorno del test, l’attività motoria à ̈ stata misurata durante i primi 2 min dopo che i topi sono stati reintrodotti nella camera di condizionamento ed à ̈ stato calcolato il rapporto di soppressione dell’attività motoria [tasso di attività dopo lo shock/( tasso di attività dopo lo shock tasso di attività di base)]. Valori del rapporto di soppressione dell’attività motoria più bassi di 0.5 indicano livelli alti di paura, valori di circa 0.5 indicano livelli bassi di paura, mentre il valore 0.5 indica nessuna paura.
Colorazione Golgi e misura della densità di spine
I topi sono stati anestetizzati con idrato di cloralio (400 mg/kg) e perfusi per via intracardiaca con 200 ml di soluzione salina 0.9%. I cervelli sono stati rimossi dalla scatola cranica e impregnati in una soluzione Golgi-Cox (1% dicromato di potassio, 1% cloruro mercurico, 0.8% cromato di potassio) a temperatura ambiente per 6 giorni. Al termine del periodo di impregnazione, i campioni sono stati immersi in 30% saccarosio per due giorni, e sezionati coronalmente (100 micron) utilizzando un vibratomo. Le sezioni sono state montate su vetrini gelatinizzati, colorate secondo il metodo Gibb and Kolb (1998), e coperte con Permount. Sei neuroni per topo per ogni emisfero (ingrandimento: 63x) sono stati selezionati nella regione dorsale del CA1 ippocampale secondo i criteri seguenti: i neuroni dovevano essere pienamente impregnati, dovevano apparire intatti nella piano di sezione, e non dovevano mostrare alcun contatto con vasi di sangue o grovigli di dendriti di cellule vicine. Le misure morfologiche sono state eseguite utilizzando un opportuno software (Neurolucida, Microbrightcampo). Le misure hanno incluso la lunghezza di dendriti totali e densità di spine. La lunghezza dei dendriti totali à ̈ stata automaticamente calcolata per mezzo di software Neurolucida dopo aver tracciato ogni neurone. La densità di spine à ̈ stata valutata contando il numero di spine (ingrandimento:100x) in cinque segmenti di dendriti di 20 mm per neurone scelti in 2°-4° ordine di arborizzazione di dendriti apicali e basali. Tutte le protuberanze, con o senza espansione bulbosa ma non più lunghe di 2 mm, sono state contate come spine, ammesso che fossero in continuità con l’arborizzazione dendritica. La densità media di spine (numero di spine per segmento di 1 micron di lunghezza) à ̈ stata calcolata per un numero medio di neuroni. Tutte le misure morfologiche sono state eseguite in cieco.
Preparazione in vitro di sezioni e elettrofisiologia
I topi sono stati anestetizzati per inalazione di isoflurano, decapitati, e i cervelli sono stati rapidamente rimossi e immersi in una soluzione fredda di taglio contenente: 234 mM saccarosio, 11 mM glucosio, 24 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl,1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4, 0.5 mM CaCl2, gassata con 95% O2 / 5% CO2. Per gli esperimenti di registrazione di campi, le sezioni coronali (300 micron) sono state tagliate al vibratomo. Per gli esperimenti di registrazione su cellula intera l’ippocampo à ̈ stato sezionato in sezioni trasversale di 250 micron. In entrambi i casi, le sezioni sono state incubate in fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) ossigenato contenente 126 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glucosio, gassato con 95% O2 / 5% CO2, pH 7.4; inizialmente a 35°C per un’ora e, successivamente, a temperatura ambiente. Le sezioni sono state poi trasferite in una camera di registrazione e mantenute a 32 ± 1°C mentre erano perfuse da aCSF fresco e ossigenato a un tasso di ~2-3 ml/min. Le registrazioni sono state eseguite in presenza di 100 nM di picrotossina per bloccare la trasmissione inibitoria GABAergica. Gli elettrodi di stimolazione e gli elettrodi monopolari di registrazione consistevano di pipette di vetro (0.5 –1 MW) riempite con aCSF e posizione nel mezzo dello strato radiato.
Preparazione delle densità post-sinaptiche (PSD)
Dopo decapitazione, il cervello à ̈ stato rapidamente sezionato e l’ippocampo à ̈ stato omogeneizzato in 2 ml di tampone di omogeneizzazione (320 mM saccarosio, 1 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 20 mM -glicerofosfato, 5mM NaF, con inibitori delle proteasi) mediante 10 strokes con un omogenizzatore tissutale (Dounce) di vetro (7ml; Wheaton). L’omogenato à ̈ stato centrifugato a 1000 × g per 10 min e il supernatante risultante à ̈ stato centrifugato a 3000 × g per 15 min. Il pellet à ̈ stato risospeso in 1 mM HEPES pH 7.4 contenente inibitori delle proteasi in un omogenizzatore Dounce e centrifugato a 100,000 × g per 1h. Il pellet risultante à ̈ stato risospeso in un tampone contenente 75 mM KCl, 1% Triton X-100 e inibitori delle proteasi e centrifugato a 100,000 × g per 1h. Il supernatante à ̈ stato conservato come Frazione Solubile in Triton X-100 (TSF). Il pellet finale contenente la frazione di PSD (Frazione Insolubile in Triton X-100, TIF) à ̈ stato risospeso in tampone RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% Triton X-100, 0.25% Na-deossicolato, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, inibitori delle proteasi), sonicato e incubato in ghiaccio per 20 min. I campioni sono stati centrifugati a 11,500 × g per 10 min e la concentrazione proteica del supernatante risultante à ̈ stata determinata con il metodo di Bradford. Per ogni condizione sperimentale la stessa quantità di proteine à ̈ stata separata per SDS-PAGE ed sottoposta a trasferimento elettrico. Le proteine delle PSD (15 mg) sono state separate per mezzo di SDS-PAGE e colorate con la colorazione Blu-Coomassie. Dopo elettroforesi i gel sono stati fissati per 30 min in soluzione fredda di fissazione (50 MetOH: 10 acido acetico: 40 ddH2O), colorati con soluzione di Coomassie (0.2% Coomassie blu , 20% MetOH, 10% acido acetico) per 30 min e lavati abbondantemente con soluzione fredda per la rimozione della marcatura (45 MetOH: 10 acido acetico: 45 ddH2O).
Immunoistochimica con microscopia ottica e microscopia elettronica.
I topi sono stati perfusi attraverso l’aorta con un variante di soluzione Ringer senza calcio, seguito da soluzione di fissazione contenendo 4% paraformaldeide depolimerizzata in tampone di fosfato di sodio 0.12 M, pH 7.2. I cervelli sono stati sezionati e divisi lungo il piano medio-sagittale. Una di queste parti à ̈ stata disidratata e inclusa in paraffina secondo protocolli convenzionali, e successivamente sezionata con un microtomo, mentre l’altra metà à ̈ stata utilizzata per la microscopia immunoelettronica, come descritto sotto. Per l’immunoistochimica basata su perossidasi, le sezioni deparaffinate di 5 micron di spessore sono state incubate durante la notte a 4°C con anticorpo policlonale di coniglio specifico per GluR1 (Upstate) o per sinaptofisina (Dako) diluita 1:100 in PBS, contenente 2.5% latte in polvere. Dopo lavaggio in PBS, le sezioni sono state incubate con IgG anti-coniglio biotinilate (1:200; Vector). Le sezioni sono state poi lavate in PBS e incubate in una soluzione con complesso biotina-avidina accoppiato a perossidasi (Elite ABC kit, Vector) e gli immunocomplessi sono stati evidenziati con DAB 0.05%, H2O20.01% in PBS. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Olympus BX 51 collegato ad una fotocamera digitale Leica DFC 420. L’analisi densitometrica quantitativa di immunomarcatura di GluR1 e di sinaptofisina à ̈ stato eseguita utilizzando software ImageJ 1.40g. Specificamente, tre sezioni ippocampali per ogni genotipo sono state fotografate ad un ingrandimento 40X. Poi, in ogni sezione, cinque aree non-sovrapposte di strato radiato di CA1 e strato piramidale sono state analizzate separatamente. L’analisi statistica à ̈ stata eseguita con il test di Student, utilizzando software GraphPad Prism 4, e p<0.05 à ̈ stato considerato come statisticamente significativo. Per la microscopia immunoelettronica, il cervello à ̈ stato tagliato con un vibratomo lungo il piano sagittale, per ottenere sezioni di uno spessore di 80 micron. Le sezioni flottanti sono state incubate con un anticorpo di coniglio, policlonale, specifico per la caspasi-3 tagliata (1:100; Cell Signaling). Dopo immunoreazione, le sezioni sono state post-fissate con 1% OsO4, disidratate, infiltrate in resina epossidica e incluse in strato singolo nello stesso mezzo. Campi ippocampali CA1 sono stati re-inclusi e tagliati ulteriormente con un ultramicrotomo, Reichert Ultracut S (Leica Microsistemas), per ottenere sezioni ultrasottili(70-80 nm). Queste sono state raccolte su griglie di nichel, contrastate leggermente con acetato di uranile e citrato di piombo e infine osservate al microscopio elettronico CM120 (Philips),corredato di una videocamera. Le immagini sono state elettronicamente acquisite ed elaborate in Adobe Photoshop CS3. Per valutare quantitativamente il numero di spine contenenti caspasi-3 nei due genotipi, abbiamo analizzato sezioni ultrasottili colorati con DAB. Un minimo di 100 spine per ogni genotipo (n=3) sono state contate ed à ̈ stata calcolata la percentuale di quelle positive.
Preparazione di omogenato totale e sinaptosomi da ippocampo di topo
Dopo decapitazione, i cervelli sono stati rapidamente rimossi, due ippocampi per ogni condizione sperimentale sono stati uniti e omogeneizzati in 3.6 ml di tampone di omogeneizzazione (320 mM saccarosio, 4 mM Hepes pH 7.4, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, con inibitori delle proteasi) con 10 strokes di un omogenizzatore tissutale, Dounce, di vetro (7 ml, Wheaton). L’omogenato à ̈ stato centrifugato a 1000 × g a 4°C per 10 min e il supernatante risultante à ̈ stato centrifugato a 12,000 × g a 4°C per 15 min. Il pellet à ̈ stato risospeso in tampone di omogeneizzazione e centrifugato a 13,000 × g a 4°C per 15 min per ottenere il pellet finale.Per l’analisi di immunoblotting i sinaptosomi sono stati risospesi in tampone di omogeneizzazione.
Un’aliquota del primo omogenato à ̈ stato utilizzato per l’analisi proteica totale.
Preparazione di nuclei
L’omogenato iniziale (vedi preparazione di sinaptosoma) à ̈ stato centrifugato a 800 × g per 5 min a 4°C, il pellet à ̈ stato lavato due volte con PBS freddo, risospeso in tampone di lisi ipotonico (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1 M saccarosio, 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, con inibitori delle proteasi), agitato per 15 sec e incubato in ghiaccio per 15 min. Quindi , à ̈ stato aggiunto saccarosio.
1.8 M, i campioni sono stati agitati e caricati su uno strato di saccarosio 1.1 M e centrifugati a 14,700 × g per 25 min a 4°C con un rotore SW60Ti. Il pellet risultante à ̈ stato risospeso in PBS e centrifugato a 1000 × g per 5 min a 4°C per ottenere il pellet finale contenente nuclei.
Saggio di attività della calcineurina
Le sezioni sono state omogeneizzate in tampone A (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM CaCl2, 1 mM PMSF, 1 mM DTT). Sono state sottoposte a cicli di congelamento e scongelamento a 37°C, centrifugate a 17,000 × g per 10 min a 4°C, e il supernatante à ̈ stato trattato per determinare l’attività fosfatasica. L’attività della calcineurina à ̈ stata saggiata monitorando rilascio di 32P dal peptide (RII) marcato radioattivamente. In breve, 10 microgrammi di proteine totali sono stati diluite in un volume uguale di tampone B (100 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM MnCl2, 0.1 mM CaCl2, 1 mM DTT) e immediatamente usate per il saggio enzimatico. L’aggiunta di 1 mM NiSO4 nel tampone B à ̈ stata fatta per ottenere un’attivazione massimale dell’enzima. L’acido okadaico (200 nM) à ̈ stato addizionato per inibire altre attività fosfatasiche. Condizioni †̃Calcium-free’ sono state ottenute escludendo il calcio in entrambi i tamponi A e B.
Quantificazione della carbonilazione di proteine Proteine carbonilate sono state individuate utilizzando il kit Oxyblot(Chemicon) secondo istruzioni per l’uso. In breve, 5 Î1⁄4g di proteine sono state fatte reagire con soluzione di dinitrofenilhidrazina (DNP) per 15 min a 25°C. Le proteine reagite sono state risolte su gel 10% SDS-PAGE e sono state identificate per immunoblotting utilizzando un anticorpo anti-DNP.
Coltura di neuroni primari: preparazione e analisi
Al tempo designato (E15) topine gravide sono state sacrificate e gli embrioni sono stati raccolti in PBS freddo. Il tessuto corticale e ippocampale degli embrioni à ̈ stato dissociato in Tripsina 0.025% (7 min a 37°C), la dissociazione à ̈ stata bloccata con l’aggiunta di FBS e i campioni sono stati centrifugati per 3 min a 220 × g. Il tessuto à ̈ stato risospeso nel terreno MEM#1 (25 mM glucosio, 1% FBS, 2 mM L-glutammina, 0.1 mg/ml gentamicina, mezzo MEM) pipettando, e poi centrifugato 10 min a 220 × g. Il pellet di cellule à ̈ stata risospeso nel terreno MEM#2 (25 mM glucosio, 5% FBS, 5% HS, 2 mM L-glutammina, 0.1 mg/ml gentamicina,mezzo MEM) ed à ̈ stato determinato il numero di cellule. Le cellule sono state piastrate nel mezzo MEM#2 e incubate in un incubatore umidificato a 37°C con 5% CO2; dopo 1 hr tutto il terreno (MEM#2) à ̈ stato sostituito con Neurobasal (2% B-27 meno AO, 2 mM L-glutammina, 0.1 mg/ml gentamicina, mezzo Neurobasal ) e i neuroni primari sono stati tenuti in coltura per 7-12 giorni. L’individuazione di caspasi-3 attiva in situ à ̈ stata eseguita bloccando neuroni primari a 7 DIV. Le cellule sono state rapidamente lavate con soluzione fredda, soluzione di Locke (154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 2.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 3.6 mM NaHCO3, 5.0 mM Hepes pH 7.4, 5 mM glucosio) e incubate per 5 min in soluzione di Locke contenendo 0.01% digitonina. Le cellule sono state poi lavate con soluzione di Locke, incubate per 20 min in presenza di 10 ng/ml DEVD-biotina (diluita in soluzione di Locke), lavate con PBS e fissate per 30 min in 3.7% formaldeide fredda. Dopo fissazione le cellule sono state lavate con PBS, incubate per 5 min in PBS contenendo 0.2% Triton X-100, lavate con PBS e poi incubate per 30 min in 5 ng/ml Oregon Verde Streptavidin (diluito in PBS). Dopo incubazione le cellule sono state lavate in PBS, incubate per 5 min con PBS contenendo DAPI, lavate con PBS e coperte con una soluzione acquosa per il montaggio adatto alla fluorescenza.
Per la preparazione di sinaptosomi, le cellule sono state staccate in un tampone di omogeneizzazione (320 mM saccarosio, 4 mM HEPES, 1 mM PMSF, 1 mM Na-orthovanadate, 20 mM b-glicerofosfato, 5 mM NaF, con inibitori delle proteasi), omogeneizzate in una omogenizzatore e centrifugate a 900 × g per 10 min a 4°C. Il supernatante risultante à ̈ stato centrifugato a 10,000 × g per 15 min, il pellet à ̈ stato risospeso in tampone di omogeneizzazione e centrifugate a 10,000 × g per 15 min. Il pellet risultante à ̈ stato omogeneizzato in dH2O fredda contenente inibitori delle proteasi con un omogenizzatore eppendorf. I campioni sono stati mescolati per 30 min a 4°C e centrifugati a 18000 × g per 30 min. Il pellet risultante à ̈ stato risospeso in tampone RIPA e lisato.
Il saggio di attività per la caspasi-3
I livelli di attività enzimatica di caspasi-3 (attività DEVDasica) sono stati misurati con un saggio fluorimetrico (Calbiochemâ„¢, cat. No.264150) seguendo le istruzioni per l’uso. La valutazione di attività di caspasi-3 à ̈ determinata dal rilascio di substrato fluorogenico, misurato utilizzando un lettore di pistra con eccitazione a 460 nm.
Per l’analisi di attività intracellulare di caspasi-3, campioni (plasma e CSF, 5 topi per età e genotipo) sono stati diluiti con un tampone contenente il substrato (60 mM DEVD-afc (Calbiochem) in 50 mM Hepes, pH 7.4, 1% saccarosio, 0.1% Chaps, 10 mM DTT, e la generazione di afc libero à ̈ stato seguita per fluorescenza (eccitazione, 385 nm; emissione, 505 nm).La Concentrazioni di proteina dei campioni correspondenti sono stati valutati con il saggio Pierce (Pierce, IL). Una unità rappresenta 1 mmol di afc generato in 1 min dalla quantità indicata di proteina.
Prelievo di Fluido Cerebrospinale dalla Cisterna Magna Topi Tg2576 sono stati anestetizzati utilizzando isoflurane e il CSF à ̈ stato rimosso, bucando la cisterna magna con una cannula 21G. Campioni di CSF con contaminazione visibile di sangue sono stati scartati. E’ evidente a una persona esperta che delle modificazioni potrebbero essere effettuate sia ai metodi che e alle procedure senza allontanarsi dallo scopo dell’invenzione come chiarito nelle richieste allegate.
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Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso della caspasi-3 come biomarcatore per la diagnosi di un disturbo neurodegenerativo in un individuo o in un campione isolato da un individuo.
- 2. Uso della caspasi-3 come biomarcatore per la diagnosi precoce di un disturbo neurodegenerativo in un individuo o in un campione isolato da un individuo.
- 3. Uso della caspasi-3 come biomarcatore per il rilevamento della progressione di un disturbo neurodegenerativo in un individuo o in un campione isolato da un individuo.
- 4. Uso di un composto per modulare direttamente o indirettamente l’attività della caspasi-3 o la caspasi-3 per la preparazione di un medicamento.
- 5. Uso di un composto per modulare direttamente o indirettamente l’attività della caspasi-3 o la caspasi-3 per la preparazione di un medicamento per il trattamento di un disturbo neurodegenerativo in un individuo.
- 6. Composizione farmaceutica comprendente un composto per modulare direttamente o indirettamente l’attività della caspasi-3 o la caspasi-3, e un suo veicolo, stabilizzatore, diluente o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
- 7. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto disturbo neurodegenerativo à ̈ il morbo di Alzheimer.
- 8. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto biomarcatore à ̈ usato in combinazione con almeno un altro biomarcatore.
- 9. Metodo per la diagnosi, la diagnosi precoce o il rilevamento della progressione di un disturbo neurodegenerativo in un individuo comprendente le fasi di: - isolare un campione biologico da un individuo; - quantificare il livello di attività della caspasi-3 in detto campione biologico; - confrontare detto livello con un livello di riferimento.
- 10. Metodo per determinare se un composto sia efficace nel trattamento di un disturbo neurodegenerativo comprendente le fasi di: - quantificare il livello di attività della caspasi-3 in un materiale di campione isolato da detto individuo prima del trattamento, e - confrontare il livello quantificato di attività della caspasi-3 con uno o più livelli di riferimento dopo il trattamento.
- 11. Metodo secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui detto disturbo neurodegenerativo à ̈ una malattia da placche amiloidi.
- 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto disturbo neurodegenerativo à ̈ il morbo di Alzheimer.
- 13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 12, in cui detto campione organico à ̈ un fluido biologico.
- 14. Metodo secondo la rivendicazione 13, in cui detto fluido biologico à ̈ selezionato dal gruppo che consiste di sangue, plasma, siero e fluido cerebrospinale.
- 15. Metodo secondo le rivendicazioni 9 a 14, in cui la quantificazione della caspasi-3 Ã ̈ eseguita mediante una tecnica selezionata dal gruppo che consiste di saggi colorimetrici, fluorimetrici, calorimetrici, chemioluminescenti, radiometrici e cromatografici.
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| Title |
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| AOKI K ET AL: "THERAPEUTIC EFFECT OF CASPASE INHIBITORS IN THE PREVENTION OF APOPTOSIS AND REVERSAL OF CHRONIC CEREBRAL VASOSPASM", JOURNAL OF CLINICAL NEUROSCIENCE, CHURCHILL LIVINGSTONE, GB, vol. 9, no. 6, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 672 - 677, XP008071836, ISSN: 0967-5868 * |
| GERVAIS F G ET AL: "INVOLVEMENT OF CASPASES IN PROTEOLYTIC CLEAVAGE OF ALZHEIMER'S AMYLOID-BETA PRECURSOR PROTEIN AND AMYLOIDOGENIC ABETA PEPTIDE FORMATION", CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, NA, US, vol. 97, no. 3, 30 April 1999 (1999-04-30), pages 395 - 406, XP000919376, ISSN: 0092-8674 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1392238B1 (it) | 2012-02-22 |
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