ITRM20070254A1 - METHOD FOR GENOTYPEING OF HIV-1 AND RELATED DIAGNOSTIC KITS FOR MEDICINE-RESISTANCE DETECTION. - Google Patents
METHOD FOR GENOTYPEING OF HIV-1 AND RELATED DIAGNOSTIC KITS FOR MEDICINE-RESISTANCE DETECTION. Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE DESCRIPTION
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: "Metodo per la genotipizzazione di HIV-1 e relativi kit diagnostici per la ri-levazione di farmaco-resistenze" accompanying a patent application for industrial invention entitled: "Method for the genotyping of HIV-1 and related diagnostic kits for the detection of drug resistance"
La presente invenzione concerne un metodo per la genotipizzazione del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) tramite sequenziamento del gene gp41-env e relativi kit diagnostici per la rile-vazione di resistenze ai farmaci antiretrovirali che agiscono su gp41-env (i.e. inibitori della fusione). The present invention relates to a method for genotyping human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by sequencing the gp41-env gene and related diagnostic kits for detecting resistance to antiretroviral drugs acting on gp41-env (i.e. fusion inhibitors).
La rilevanza clinica della resistenza ai farma-ci antiretrovirali nell'infezione da virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) è un fenomeno molto studiato e ben conosciuto. I pazienti HIV-1 sieropositivi, infetti con ceppi di HIV-1 di cui è documentata la farmaco-resistenza sulla base di saggi genotipici o fenotipici, se non opportunamente trattati con difficoltà svilupperanno una risposta virologica adeguata (Deeks S.G. et al., 1999; Zolopa A.R. et al., 1999). Di contro, l'uso di farmaci per i quali il virus risulta sensibile aumenta la probabi-lità di ristabilire il controllo virologico nel pa-ziente, laddove precedenti regimi terapeutici non si sono mostrati efficaci (DeGruttola V., et al., 2000). The clinical relevance of antiretroviral drug resistance in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection is a well-studied and well-known phenomenon. HIV-1 seropositive patients infected with HIV-1 strains whose drug resistance is documented on the basis of genotypic or phenotypic assays will develop an adequate virological response if not appropriately treated with difficulty (Deeks S.G. et al., 1999; Zolopa A.R. et al., 1999). On the other hand, the use of drugs for which the virus is sensitive increases the probability of re-establishing virological control in the patient, where previous therapeutic regimens have not proved effective (DeGruttola V., et al., 2000) .
La resistenza ai farmaci antiretrovirali è un fenomeno associato a mutazioni, ben caratterizzate, a livello dei segmenti genetici di HIV-1 che codificano per proteine che rappresentano il naturale bersaglio dei farmaci attualmente impiegati nella pratica cli-nica. Sulla base delle classi farmacologiche oggi in uso, la resistenza ai farmaci antiretrovirali è asso-ciata a mutazioni presenti nei domini della proteasi e della retrotrascrittasi del gene poi di HIV-1 (E-shleman S.H., et al., 2005). L'uso di saggi di genotipizzazione per la rivelazione e la valutazione di tali mutazioni responsabili dei fenomeni di resistenza ai farmaci antiretrovirali all'interno di geni del virus HIV-1 (i.e. poi) è molto diffuso nella gestione clinica dell'infezione da HIV-1 e anche particolar-mente economico (Zolopa A.R. et al., 2006, Smith D et al., 2007). In commercio esistono due tipi di kit per la genotipizzazione di HIV-1 basati sul sequenziamen-to del gene poi di HIV-1 "ViroSeq Genotyping System" (Abbott/Celerà Diagnostics) e il "TRUGENE™ HIV-1 Ge-notyping System" (Bayer). Tali kit diagnostici commerciali hanno un limite di sensibilità pari a 10<3>copie HIV-RNA/mL, quindi difficilmente è possibile individuare mediante essi campioni a bassa viremia. Resistance to antiretroviral drugs is a phenomenon associated with well-characterized mutations in the genetic segments of HIV-1 that code for proteins that represent the natural target of drugs currently used in clinical practice. On the basis of the pharmacological classes in use today, resistance to antiretroviral drugs is associated with mutations present in the protease and retrotranscriptase domains of the HIV-1 gene (E-shleman S.H., et al., 2005). The use of genotyping assays for the detection and evaluation of these mutations responsible for the phenomena of resistance to antiretroviral drugs within the genes of the HIV-1 virus (i.e. then) is very widespread in the clinical management of HIV- 1 and also particularly economical (Zolopa A.R. et al., 2006, Smith D et al., 2007). There are two types of HIV-1 genotyping kits on the market based on the sequencing of the HIV-1 gene "ViroSeq Genotyping System" (Abbott / Celerà Diagnostics) and the "TRUGENE ™ HIV-1 Ge-notyping System" (Bayer). These commercial diagnostic kits have a sensitivity limit of 10 <3> HIV-RNA copies / mL, so it is difficult to identify low viremia samples with them.
Le linee guida internazionali, evidenziano che un utilizzo adeguato dei test genotipici di resisten-za possa migliorare 1'outcome clinico dei soggetti HIV-infetti; più recentemente, panel di esperti del settore hanno rivalutato le raccomandazioni sull'uso di tali test, suggerendone un'applicazione più ampia pressoché in tutte le fasi cliniche dell'infezione (Hirsch MS et al., 2003, Vandamme AM et al., 2004). The international guidelines show that an adequate use of genotypic resistance tests can improve the clinical outcome of HIV-infected subjects; more recently, panels of experts in the field have re-evaluated the recommendations on the use of these tests, suggesting their wider application in almost all clinical phases of infection (Hirsch MS et al., 2003, Vandamme AM et al., 2004 ).
Alla luce di tali evidenze, si ritiene che l'uso dei test genotipici possa essere considerato un segmento della diagnostica destinato a crescere nei prossimi anni, sia in termini di diffusione capillare sul territorio mondiale che di numerosità dei test richiesti. In light of these evidences, it is believed that the use of genotypic tests can be considered a segment of diagnostics destined to grow in the coming years, both in terms of widespread diffusion throughout the world and the number of tests required.
Recentemente sono stati sviluppati nuovi far-maci antiretrovirali (definiti inibitori della fusio-ne) diretti verso un target differente dai tradizio-nali geni gag/poi, ovvero è il gene codificante per la proteina gp41 nell'ambito del gene env; è quindi prevedibile che l'uso di tali farmaci determini nel tempo lo sviluppo di farmacoresistenze e, pertanto, essi necessiteranno di un efficace e rapido monitoraggio. Ad oggi non esistono in commercio kit e/o me-todi disponibili che consentano la genotipizzazione del gene gp41-env di HIV-1. Recently, new antiretroviral drugs (defined fusion inhibitors) have been developed aimed at a target different from the traditional gag / poi genes, ie it is the gene encoding the gp41 protein within the env gene; it is therefore foreseeable that the use of these drugs will determine the development of drug resistance over time and, therefore, they will require effective and rapid monitoring. To date, there are no commercially available kits and / or methods available that allow the genotyping of the HIV-1 gene gp41-env.
Risulta evidente l'esigenza di poter disporre di metodi di genotipizzazione di HIV-1 che siano ap-plicabili a tutte le varianti virali ad oggi note ed a campioni plasmatici con viremia molto bassa (alta sensibilità). There is a clear need for HIV-1 genotyping methods which are applicable to all the viral variants known to date and to plasma samples with very low viremia (high sensitivity).
Gli autori della presente invenzione hanno ora messo a punto un metodo e relativo kit diagnosti-co per la genotipizzazione di HIV-1 tramite amplifi-cazione e sequenziamento del gene gp41-env ad elevata sensibilità che consente l'analisi di campioni a bas-sa viremia nell'ordine di 10<1>-10<2>copie HIV-RNA/ml (vedere Figura 5) abbassando quindi il limite di sen-sibilità degli attuali sistemi diagnostici commercia-li (IO<3>copie HIV-RNA/mL) rivolti alla genotipizza-zione di diverse regioni genetiche di HIV-1 (i.e. poi) . The authors of the present invention have now developed a method and relative diagnostic kit for the genotyping of HIV-1 by amplifying and sequencing the high sensitivity gp41-env gene that allows the analysis of low-level samples. viremia in the order of 10 <1> -10 <2> HIV-RNA copies / ml (see Figure 5) thus lowering the sensitivity limit of current commercial diagnostic systems (10 <3> HIV-RNA copies / mL) aimed at the genotyping of different genetic regions of HIV-1 (i.e. then).
Tale metodo offre anche il vantaggio di essere facilmente adattabile a campioni sia plasmatici sia linfocitari e pertanto in grado di valutare "preven-tivamente" le mutazioni genetiche potenzialmente coinvolte nei fenomeni di resistenza ai farmaci antiretrovirali, anche in pazienti controllo virologico ottimale (carica virale <47 copie HIV/RNA/ml - limite di sensibilità riconosciuto a livello internazionale) altrimenti non genotipizzabili (resistenze presunti-ve). This method also offers the advantage of being easily adaptable to both plasma and lymphocyte samples and therefore able to evaluate "preventively" the genetic mutations potentially involved in the phenomena of resistance to antiretroviral drugs, even in patients with optimal virological control (viral load < 47 HIV / RNA copies / ml - internationally recognized limit of sensitivity) otherwise not genotyped (presumed resistances).
Inoltre, avvalendosi delle metodiche one-step RT-PCR, il metodo offre tempi di lavorazione molto ridotti per quanto attiene all'operatore e il proto-collo stesso di PCR nell'ordine delle 5 ore. Furthermore, using the one-step RT-PCR methods, the method offers very reduced processing times as regards the operator and the PCR protocol itself in the order of 5 hours.
Infine, l'utilizzo della metodica one-step per la retrotrascrizione e per la successiva amplifica-zione del cDNA in dsDNA limita l'intervento dell'operatore e riduce i rischi di contaminazione del campione. Finally, the use of the one-step method for reverse transcription and subsequent amplification of the cDNA in dsDNA limits the operator's intervention and reduces the risk of sample contamination.
Forma, pertanto, oggetto della presente inven-zione un metodo per la genotipizzazione di HIV-1 com-prendente le seguenti fasi: Therefore, the object of the present invention is a method for the genotyping of HIV-1 comprising the following steps:
a) retrotrascrizione dell'RNA virale dell'HIV-1 da un campione biologico, utilizzando uno specifico primer anti-senso consistente nella sequenza nucleotidica 5'-TGC TTW TAT GCA GCA TCT GAG GG-3' (o in alternati-va 5'-GAA AGT CCC CAG CGG AAA GTC C-3') e successiva amplificazione del frammento dsDNA mediante reazione di PCR, utilizzando una coppia di primer esterni target-specifici costituiti da sequenze nucleotidiche scelte dal gruppo e che consiste in: a) reverse transcription of HIV-1 viral RNA from a biological sample, using a specific anti-sense primer consisting of the nucleotide sequence 5'-TGC TTW TAT GCA GCA TCT GAG GG-3 '(or alternatively 5' -GAA AGT CCC CAG CGG AAA GTC C-3 ') and subsequent amplification of the dsDNA fragment by PCR reaction, using a pair of target-specific external primers consisting of nucleotide sequences chosen by the group and consisting of:
al) Fw 5'-AGT TTY AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3'/Rv 5'-TGC TTW TAT GCA GCA TCT GAG GG-3'; al) Fw 5'-AGT TTY AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3 '/ Rv 5'-TGC TTW TAT GCA GCA TCT GAG GG-3';
o in alternativa: or alternatively:
a2) Fw 5'-AGT TTT AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3'/Rv 5'-GAA AGT CCC CAG CGG AAA GTC C-3'; in cui la retrotrascrizione e l'amplificazione avvengono in un unico passaggio; a2) Fw 5'-AGT TTT AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3 '/ Rv 5'-GAA AGT CCC CAG CGG AAA GTC C-3'; in which reverse transcription and amplification take place in a single step;
b) sequenziamento dell'amplicone ottenuto nella fase a) in reazioni indipendenti mediante ognuno dei se-guenti primer consistenti in ognuna delle seguenti sequenze nucleotidiche: b) sequencing of the amplicon obtained in step a) in independent reactions using each of the following primers consisting of each of the following nucleotide sequences:
bl) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3' o, in alternativa, Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3'; bl) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3 'or, alternatively, Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3';
b2) Fw 5'-GGC AAA GAG AAG AGT GGT-3' o, in alternati-va, Fw 5'-GGC AAR RAG AAG AGT GGT-3'; b2) Fw 5'-GGC AAA GAG AAG AGT GGT-3 'or, alternatively, Fw 5'-GGC AAR RAG AAG AGT GGT-3';
b3) Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA AC-3' o, in alter-nativa, Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA-3'; b3) Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA AC-3 'or, alternatively, Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA-3';
b4) Fw 5'-ATA ATG ATA GTA GGA GG-3'; b4) Fw 5'-ATA ATG ATA GTA GGA GG-3 ';
b5) Fw 5'-GGA RCC TGT GCC TCT TCA-3'; b5) Fw 5'-GGA RCC TGT GCC TCT TCA-3 ';
b6) Fw 5'-TAC CTA GAA GAA TMA GAC A-3'; b6) Fw 5'-TAC CTA GAA GAA TMA GAC A-3 ';
b7) Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT WA-3' o, in alternativa, Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT TA-3'; b7) Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT WA-3 'or, alternatively, Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT TA-3';
b8) Rv 5'-GTC CCA GAA GTT CCA CA-3'; b8) Rv 5'-GTC CCA GAA GTT CCA CA-3 ';
b9) Rv 5'-TYT TAT ATA CCA YAG CCA-3'; b9) Rv 5'-TYT TAT ATA CCA YAG CCA-3 ';
blO) Rv 5'-GTA TCT TTC YAC AGC CAG-3' o, in alternativa, Rv 5'-GTA TCT TTC YAY AGC CAG-3'. blO) Rv 5'-GTA TCT TTC YAC AGC CAG-3 'or, alternatively, Rv 5'-GTA TCT TTC YAY AGC CAG-3'.
c) assemblaggio dei segmenti interni ottenuti nella fase b) in una sequenza consensus. c) assembly of the internal segments obtained in step b) in a consensus sequence.
Secondo una forma di realizzazione del metodo dell'invenzione, quando non si ha amplificazione dal-la fase a) mediante RT-PCR, per avere una maggiore sensibilità è possibile che la fase a) comprenda ul-teriormente una fase di amplificazione mediante nested-PCR, utilizzando una coppia di primer interni target-specifici scelta tra le sequenze nucleotidiche: According to an embodiment of the method of the invention, when there is no amplification from step a) by RT-PCR, in order to have a greater sensitivity it is possible that step a) further comprises an amplification step by nested- PCR, using a target-specific internal primer pair chosen from the nucleotide sequences:
cl) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3'/Rv 5'-TAC TAG CTT GWA GCA CCA RCC AA-3'; o, in alternativa, c2) Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3'/Rv 5'-GTC AGC AGT CCT TGT AGT ACT CCG GAT-3'. cl) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3 '/ Rv 5'-TAC TAG CTT GWA GCA CCA RCC AA-3'; or, alternatively, c2) Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3 '/ Rv 5'-GTC AGC AGT CCT TGT AGT ACT CCG GAT-3'.
Sulla base della nomenclatura IUPAC-IUB le seguenti lettere identificano la presenza contemporanea di nucleotidi differenti: R (A o G) - Y (C o T) - M (A o C) - K (G o T) - S (G o C) - W (A o T) - H (A o C o T) - B (G o T o C) - V (G o C o A) - D (G o T o A) -N (G o A o T o C). Based on the IUPAC-IUB nomenclature, the following letters identify the simultaneous presence of different nucleotides: R (A or G) - Y (C or T) - M (A or C) - K (G or T) - S (G or C) - W (A or T) - H (A or C or T) - B (G or T or C) - V (G or C or A) - D (G or T or A) -N (G or A or T or C).
Tale metodo di genotipizzazione può trovare una utile applicazione pratica come metodo per l'individuazione delle mutazioni a livello del gene gp41-env che possono conferire resistenza ai farmaci antiretrovirali. In tal caso la fase c) del metodo di genotipizzazione comprendente le fasi a)-c) preceden-temente descritte, consiste nella produzione di una sequenza consensus ottenuta dai diversi segmenti nucleotidici generati e nel suo confronto con sequenze di riferimento, per l'interpretazione di mutazioni presenti nel gene gp41-env eventualmente associate a resistenza verso i farmaci anti-retrovirali (secondo le conoscenze scientifiche accreditate). This genotyping method can find a useful practical application as a method for the detection of mutations at the level of the gp41-env gene that can confer resistance to antiretroviral drugs. In this case, step c) of the genotyping method comprising steps a) -c) previously described, consists in the production of a consensus sequence obtained from the different nucleotide segments generated and in its comparison with reference sequences, for the interpretation of mutations present in the gp41-env gene possibly associated with resistance to anti-retroviral drugs (according to accredited scientific knowledge).
Presso http://www.iasusa.org, alla voce pubbli-cazioni August/September 2006 (Volume 14, Issue 3), è possibile scaricare l'ultimo prospetto delle mutazio-ni di cui, ad oggi, è nota l'associazione a resisten-za farmacologica (Johnson VA et al. 2006). At http://www.iasusa.org, under the item publications August / September 2006 (Volume 14, Issue 3), it is possible to download the latest prospectus of the mutations of which, to date, the association is known drug resistance (Johnson VA et al. 2006).
Il metodo secondo l'invenzione è molto versatile e può essere impiegato su campioni biologici diversi tra cui plasma e pellet linfocitario. The method according to the invention is very versatile and can be used on different biological samples including plasma and lymphocyte pellets.
La presente invenzione ha come oggetto un kit diagno-stico comprendente le seguenti componenti: The present invention relates to a diagnostic kit comprising the following components:
a) almeno una coppia di primer per l'amplificazione del frammento dsDNA mediante RT-PCR, consistenti nel-le sequenze nucleotidiche scelte tra: a) at least one primer pair for the amplification of the dsDNA fragment by RT-PCR, consisting of the nucleotide sequences chosen from:
al) Fw 5'-AGT TTY AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3'/Rv 5'-TGC TTW TAT GCA GCA TCT GAG GG-3'; al) Fw 5'-AGT TTY AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3 '/ Rv 5'-TGC TTW TAT GCA GCA TCT GAG GG-3';
ο in alternativa: ο alternatively:
a2) Fw 5'-AGT TTT AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3'/Rv 5'-GAA AGT CCC CAG CGG AAA GTC C-3'; a2) Fw 5'-AGT TTT AAT TGT RGA GGR GAA TTT-3 '/ Rv 5'-GAA AGT CCC CAG CGG AAA GTC C-3';
b) un set di primer per il sequenziamento dell'amplicone ottenuto mediante amplificazione con i primer al) o a2) consistente nelle seguenti sequenze nucleotidiche: b) a primer set for amplicon sequencing obtained by amplification with primers al) or a2) consisting of the following nucleotide sequences:
bl) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3' o, in alternativa, Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3'; bl) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3 'or, alternatively, Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3';
b2) Fw 5'-GGC AAA GAG AAG AGT GGT-3' o, in alternati-va, Fw 5'-GGC AAR RAG AAG AGT GGT-3'; b2) Fw 5'-GGC AAA GAG AAG AGT GGT-3 'or, alternatively, Fw 5'-GGC AAR RAG AAG AGT GGT-3';
b3) Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA AC-3' o, in alter-nativa, Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA-3'; b3) Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA AC-3 'or, alternatively, Fw 5'-TTG GGG YTG CTC TGG AAA-3';
b4) Fw 5'-ATA ATG ATA GTA GGA GG-3'; b4) Fw 5'-ATA ATG ATA GTA GGA GG-3 ';
b5) Fw 5'-GGA RCC TGT GCC TCT TCA-3'; b5) Fw 5'-GGA RCC TGT GCC TCT TCA-3 ';
b6) Fw 5'-TAC CTA GAA GAA TMA GAC A-3'; b6) Fw 5'-TAC CTA GAA GAA TMA GAC A-3 ';
b7) Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT WA-3' o, in alternativa, Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT TA-3'; b7) Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT WA-3 'or, alternatively, Rv 5'-TCT YAT TCT TTC CCT TA-3';
b8) Rv 5'-GTC CCA GAA GTT CCA CA-3'; b8) Rv 5'-GTC CCA GAA GTT CCA CA-3 ';
b9) Rv 5'-TYT TAT ATA CCA YAG CCA-3'; b9) Rv 5'-TYT TAT ATA CCA YAG CCA-3 ';
blO) Rv 5'-GTA TCT TTC YAC AGC CAG-3' o, in alternativa, Rv 5'-GTA TCT TTC YAY AGC CAG-3'. blO) Rv 5'-GTA TCT TTC YAC AGC CAG-3 'or, alternatively, Rv 5'-GTA TCT TTC YAY AGC CAG-3'.
Secondo una forma preferita di realizzazione del kit, l'invenzione comprende una ulteriore coppia di primer per l'eventuale amplificazione di un segmento più in-terno mediante nested-PCR, scelta tra le seguenti se-quenze nucleotidiche: According to a preferred embodiment of the kit, the invention comprises a further pair of primers for the possible amplification of a more internal segment by nested-PCR, selected from the following nucleotide sequences:
ci) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3'/Rv 5'-TAC TAG CTT GWA GCA CCA RCC AA-3'; o, in alternativa, c2) Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3'/Rv 5'-GTC AGC AGT CCT TGT AGT ACT CCG GAT-3'. ci) Fw 5'-TTR AAC CAY TAG GAR TAG CAC CCA-3 '/ Rv 5'-TAC TAG CTT GWA GCA CCA RCC AA-3'; or, alternatively, c2) Fw 5'-TTG AAC CAY TAG GAG TAG CAC CCA-3 '/ Rv 5'-GTC AGC AGT CCT TGT AGT ACT CCG GAT-3'.
La presente invenzione verrà ora descritta a ti-tolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare ri-ferimento alle figure dei disegni allegati, in cui: la Figura 1, mostra lo schema di reazione onestep RT-PCR e nested-PCR; The present invention will now be described by way of illustration, but not of limitation, according to its preferred embodiments, with particular reference to the figures of the attached drawings, in which: Figure 1 shows the RT-PCR onestep reaction scheme and nested-PCR;
la Figura 2, mostra la mappa del segmento gene-tico amplificato gp41-env ; Figure 2, shows the map of the amplified gene segment gp41-env;
la Figura 3, mostra lo schema del contributo dei "primer di sequenza" nella realizzazione della sequenza consensus finale; Figure 3, shows the scheme of the contribution of the "sequence primers" in the realization of the final consensus sequence;
la Figura 4, mostra lo schema riassuntivo della procedura di laboratorio per il test genotipico di resistenza sul gene gp41-env; Figure 4, shows the summary scheme of the laboratory procedure for the genotypic resistance test on the gp41-env gene;
la Figura 5, mostra le corse elettroforetiche su gel di agarosio di un pannello di campioni ottenu-to per diluizioni seriali 1:10 di un campione a con-centrazione virale nota; legenda: Figure 5 shows the electrophoretic runs on agarose gel of a panel of samples obtained by serial dilutions 1:10 of a sample with a known viral concentration; legend:
lkb) Standard di riferimento di peso molecolare; lkb) Molecular weight reference standard;
-) Campione negativo (plasma umano negativo per HIV-i); -) Negative sample (human plasma negative for HIV-i);
1:1) Campione intero. Viremia dosata: 110.000 copie HIV—1 RNA/mL; 1: 1) Whole sample. Viremia assayed: 110,000 HIV — 1 RNA copies / mL;
1:10) Campione diluito. Viremia stimata: 11.000 copie HIV—1 RNA/mL; 1:10) Diluted sample. Estimated viremia: 11,000 HIV — 1 RNA copies / mL;
1:100) Campione diluito. Viremia stimata: 1.100 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 100) Diluted sample. Estimated viremia: 1,100 HIV-1 RNA pairs / mL;
1:1.000) Campione diluito. Viremia stimata: 110 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 1,000) Diluted sample. Estimated viremia: 110 HIV-1 RNA pairs / mL;
1:10.000) Campione diluito. Viremia stimata: 11 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 10,000) Diluted sample. Estimated viremia: 11 HIV pairs — 1 RNA / mL;
1:100.000) Campione diluito. Viremia stimata: 1,1 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 100,000) Diluted sample. Estimated viraemia: 1.1 pairs of HIV — 1 RNA / mL;
p.HIVl) Campione positivo (HIV-1 near-full genome plasmidico) . p.HIVl) Positive sample (HIV-1 near-full genome plasmid).
ESEMPIO 1: Sviluppo del metodo di genotipizzazione di HIV-1 EXAMPLE 1: Development of the HIV-1 genotyping method
Il metodo, previa estrazione degli acidi nu-cleici, si basa sulla iniziale retro-trascrizione dell'RNA virale dell'HIV-1 in DNA complementare (cDNA) e sulla successiva amplificazione di un fram-mento a doppio filamento di DNA (dsDNA). The method, after extraction of the nucleic acids, is based on the initial retro-transcription of the HIV-1 viral RNA into complementary DNA (cDNA) and on the subsequent amplification of a double-stranded DNA fragment (dsDNA) .
A tale scopo, in un solo passaggio (One-step Re-verse Transcription-Polimerase Chain Reaction), un'unica provetta di reazione viene utilizzata sia per la reazione di retro-trascrizione, utilizzando uno specifico "primer anti-senso" denominato FTlgp41_Rev, che per la successiva reazione di ampli-ficazione di PCR di un "target" dsDNA, utilizzando una coppia di primer target-specifici (primer ester-ni, denominati FTlgp41_For ed FTlgp41_Rev) (Figura la e 3). Il test si avvale di un eventuale secondo pas-saggio di amplificazione (nested-PCR), per il poten-ziamento della sensibilità, utilizzando una differen-te coppia di primer target-specifici (primer interni, denominati FT2gp41_For ed FT2gp41_Rev) (Figura lb e 3). Le indicazioni delle sequenze dei primer sono ri-portate in Tabella 1. For this purpose, in a single step (One-step Re-verse Transcription-Polimerase Chain Reaction), a single reaction tube is used both for the retro-transcription reaction, using a specific "anti-sense primer" called FTlgp41_Rev , and for the subsequent PCR amplification reaction of a dsDNA "target", using a pair of target-specific primers (external primers, named FTlgp41_For and FTlgp41_Rev) (Figure 1a and 3). The test makes use of a possible second amplification step (nested-PCR), for the enhancement of sensitivity, using a different pair of target-specific primers (internal primers, called FT2gp41_For and FT2gp41_Rev) (Figure lb and 3). The indications of the primer sequences are reported in Table 1.
In alternativa alle coppie di primer FTlgp41_For /FTlgp41_Rev e FT2gp4l_For/FT2gp4l_Rev, possono essere utilizzate le coppie FTlgp41.b_For/FTlgp41.b_Rev e FT2gp41.b_For/FT2gp41.b_Rev (Tabella 1). As an alternative to the primer pairs FTlgp41_For / FTlgp41_Rev and FT2gp4l_For / FT2gp4l_Rev, the pairs FTlgp41.b_For / FTlgp41.b_Rev and FT2gp41.b_For / FT2gp41.b_Rev can be used (Table 1).
Il prodotto di PCR generato consiste in un frammento nucleotidico di circa 1720 paia di basi (bp), corri-spondente ad una regione posta tra i geni env e la 3'-LTR dell'HIV-1, che include integralmente il domi-nio della gp41 del gene env (Figura 2). In particola re il metodo proposto amplifica un frammento genetico compreso tra le posizioni nucleotidiche 7300 e 9500 (riferito alla sequenza di riferimento del subtipo B di HIV-1, HXB2 - GenBank Accession number K03455), che include integralmente il dominio della gp41 del gene env (vedere Figura 2). Sebbene le mutazioni cli-nicamente associate a resistenza verso gli inibitori della fusione vanno ricercate nel dominio HR1 del ge-ne gp41-env, è stato recentemente descritto il con-tributo di sostituzioni presenti nel dominio HR2 nel-la suscettibilità ai suddetti farmaci(Xu L et al., 2004; Poveda E et al., 2002) pertanto, si è scelto di valutare il gene gp-41-env nella sua totalità. The PCR product generated consists of a nucleotide fragment of about 1720 base pairs (bp), corresponding to a region located between the env genes and the 3'-LTR of HIV-1, which integrally includes the domain of the gp41 of the env gene (Figure 2). In particular, the proposed method amplifies a genetic fragment between the nucleotide positions 7300 and 9500 (referred to the reference sequence of the HIV-1 subtype B, HXB2 - GenBank Accession number K03455), which integrally includes the gp41 domain of the env gene (see Figure 2). Although clinically associated resistance mutations to fusion inhibitors are to be sought in the HR1 domain of the gp41-env gen, the contribution of substitutions present in the HR2 domain in susceptibility to the aforementioned drugs has recently been described (Xu L et al., 2004; Poveda E et al., 2002) therefore, it was decided to evaluate the gp-41-env gene in its entirety.
Il metodo può essere applicato indifferentemente: The method can be applied indifferently:
- a campioni di plasma, per la ricerca di RNA delle varianti virali circolanti (espressione di replica-zione virale in atto); - to plasma samples, to search for RNA of circulating viral variants (viral replication expression in progress);
- a campioni cellulari, per la ricerca di cDNA delle varianti virali integrate a livello linfocitario, an-che in soggetti con efficace controllo virologico (carica virale <47 copie HIV-RNA/mL) (ricerca delle "resistenze presuntive"). - to cellular samples, to search for cDNA of viral variants integrated at the lymphocyte level, even in subjects with effective virological control (viral load <47 HIV-RNA copies / mL) (search for "presumptive resistance").
Il frammento di PCR ottenuto viene quindi sequenziato, utilizzando la tecnologia "Big Dye terminator Cycle Sequencing", per svelarne in dettaglio la composizione nucleotidica (genotipizzazione); a tale scopo viene utilizzato un set di 11 diversi "primer di sequenza" denominati FT2gp41_For (oppure FT2gp41.b_For), FT2gp41_Rev (oppure FT2gp41.b_Rev), gp41Seql_For (oppure gp41Seql.b_For), gp41Seq2_For (oppure gp41Seq2.b_For), gp4lSeq3_For, gp41Seq4_For, gp41Seq5_For, gp41Seq6_Rev (oppure gp41Seq6.b_Rev), gp41Seq7_Rev, gp41Seq8_Rev e gp41Seq9_Rev (oppure gp41Seq9.b_Rev) (Tabella 1). The PCR fragment obtained is then sequenced, using the "Big Dye terminator Cycle Sequencing" technology, to reveal its nucleotide composition in detail (genotyping); for this purpose a set of 11 different "sequence primers" is used, named FT2gp41_For (or FT2gp41.b_For), FT2gp41_Rev (or FT2gp41.b_Rev), gp41Seql_For (or gp41Seql.b_For), gp41Seq2_Fore (or gp41Seq2_Fore (or gp41Sq_Fore), gp41Seq2_Fore (or gp41 gp41Seq4_For, gp41Seq5_For, gp41Seq6_Rev (or gp41Seq6.b_Rev), gp41Seq7_Rev, gp41Seq8_Rev and gp41Seq9_Rev (or gp41Seq9.b_Rev) (Table 1).
Tabella 1 Table 1
Pertanto, reazioni indipendenti condotte utilizzando ognuno dei differenti primer, consentono la genera-zione di sequenze nucleotidiche che, rispetto ad una sequenza di riferimento, risultano parzialmente so-vrapposte ed orientate in entrambe le direzioni (forward e reverse) (Figura 3). Therefore, independent reactions carried out using each of the different primers, allow the generation of nucleotide sequences which, with respect to a reference sequence, are partially overlapping and oriented in both directions (forward and reverse) (Figure 3).
I segmenti ottenuti vengono "assemblati" in una se-quenza "consensus" che può essere confrontata per va-lutare le mutazioni del gene gp41-env di HIV-1 di cui è nota l'associazione (o è in corso di validazione) con la resistenza verso i farmaci anti-retrovirali inibitori della fusione. Il sistema consente anche la determinazione del genotipo virale. The segments obtained are "assembled" in a "consensus" sequence that can be compared to evaluate the mutations of the HIV-1 gene gp41-env whose association is known (or is being validated) with resistance to anti-retroviral anti-fusion drugs. The system also allows the determination of the viral genotype.
Uno schema riassuntivo dell'intera procedura di labo-ratorio è rappresentato in Figura 4. A summary scheme of the entire laboratory procedure is shown in Figure 4.
Di seguito viene descritta in dettaglio la procedura di laboratorio applicata per la genotipizzazione del gene env-gp41 di HIV-1. Essa va intesa come semplice esemplificazione dell'invenzione e non come una limi-tazione della stessa. The laboratory procedure applied for genotyping the HIV-1 env-gp41 gene is described in detail below. It is intended as a simple example of the invention and not as a limitation thereof.
PROCEDURA SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PROCEDURE
Il protocollo seguente è stato utilizzato per l'amplificazione di una regione di circa 1.7 kb del gene env-gp41 di HIV-1. The following protocol was used for amplification of an approximately 1.7 kb region of the HIV-1 env-gp41 gene.
Fase 1 - Preparazione dell ' RNA: Phase 1 - Preparation of the RNA:
Campioni di plasma, sia freschi che scongelati a tem-peratura ambiente, sono stati mescolati per agitazio-ne tramite vortex, a bassa velocità e per 3-5 secon-di, quindi brevemente centrifugati per raccogliere il campione al fondo della provetta. Plasma samples, both fresh and thawed at room temperature, were vortexed at low speed for 3-5 seconds, then briefly centrifuged to collect the sample at the bottom of the tube.
Per l'estrazione dell'RNA virale si è preferito adot-tare kit del commercio basati sulla tecnologia a mem-brane di silica-gel su colonnina. For the extraction of the viral RNA it was preferred to use commercial kits based on the column silica-gel membrane technology.
Estrazione da plasma/siero o altri liquidi biologici acellulari . Extraction from plasma / serum or other cellular biological liquids.
Il kit di estrazione è disegnato per il recupero di DNA/RNA rapido, efficiente ed altamente sensibile, da plasma o siero ed è in grado di concentrare fortemen-te acidi nucleici, anche quando presenti a titolo estremamente basso. I contaminanti e gli inibitori en-zimatici sono rimossi efficientemente dalle procedure di purificazione basate su membrane di silica-gel senza l'utilizzo di fenolo, cloroformio o altri sol-venti organici. The extraction kit is designed for rapid, efficient and highly sensitive DNA / RNA recovery from plasma or serum and is capable of strongly concentrating nucleic acids, even when present at extremely low titer. Contaminants and enzyme inhibitors are efficiently removed by purification procedures based on silica-gel membranes without the use of phenol, chloroform or other organic solvents.
Il kit consente di ottenere DNA/RNA virale altamente concentrato, da 1 mL di campione di plasma o siero che viene fatto equilibrare a temperatura ambiente (15-25°C) e dispensato in una provetta da centrifuga da 2 mL. Campioni più piccoli di 1 mL (> 200 μL) pos-sono essere portati ad 1 mL con soluzione PBS (phoshate-bufferd saline). Al campione, vengono aggiunti 800 μL di buffer contenente un reagente in grado di formare complessi con gli acidi nucleici e, pertanto, sedimentabili per centrifugazione a bassa forza di gravità per formare un pellet. Per favorire il recu-pero di acidi nucleici a bassissimo titolo, 5,6 μΐ di una soluzione di carrier RNA (1 ng/μΐ) viene aggiunta alla superficie del campione. The kit allows to obtain highly concentrated viral DNA / RNA, from 1 mL of plasma or serum sample which is equilibrated at room temperature (15-25 ° C) and dispensed into a 2 mL centrifuge tube. Samples smaller than 1 mL (> 200 μL) can be made up to 1 mL with PBS (phoshate-bufferd saline) solution. To the sample, 800 μL of buffer containing a reagent capable of forming complexes with nucleic acids and therefore settling by centrifugation at low gravity to form a pellet is added. To aid in the recovery of very low titre nucleic acids, 5.6 μΐ of a carrier RNA solution (1 ng / μΐ) is added to the sample surface.
La provetta con la miscela campione/reagenti viene mescolata prima per inversione (3 volte), poi per agitazione su vortex (10 s) e, quindi, messa ad incu-bare a temperatura ambiente (15-25°C) per 10 min. The tube with the sample / reagent mixture is mixed first by inversion (3 times), then by vortexing (10 s) and then placed in incubation at room temperature (15-25 ° C) for 10 min.
Dopo centrifugazione a 1200 x g per 3 min, il sovra-natante viene completamente eliminato e vengono ag-giunti 300 μL di un buffer di lisi contenente guanidina idrocloruro, pre-riscaldato a 60°C e 20 μΐ di una soluzione di proteinasi K. After centrifugation at 1200 x g for 3 min, the supernatant is completely eliminated and 300 μL of a lysis buffer containing guanidine hydrochloride, pre-heated to 60 ° C and 20 μΐ of a solution of proteinase K are added.
Il campione, agitato su vortex finche il pellet al fondo viene completamente risospeso, viene incubato in agitazione a 40°C per 10 min. The sample, stirred on vortex until the bottom pellet is completely resuspended, is incubated under stirring at 40 ° C for 10 min.
Dopo una breve centrifugazione per rimuovere le gocce dal tappo della provetta, al campione vengono aggiun-ti 300 μΐ di una soluzione contenente etanolo e un surfattante non-ionico tipo Nonidet P40, quindi agi-tato su vortex e brevemente centrifugato. After a short centrifugation to remove the drops from the tube cap, 300 μΐ of a solution containing ethanol and a non-ionic surfactant such as Nonidet P40 are added to the sample, then vortexed and centrifuged briefly.
La miscela del campione U sato viene applicata su membrana di silica-gel in colonna e centrifugato per 1 min a 3000-5000 x g. The mixture of the used sample is applied on a silica-gel membrane in a column and centrifuged for 1 min at 3000-5000 x g.
Per lavare e purificare il DNA/RNA estratto, l'eluato viene eliminato e la colonnina viene posta in un nuo-vo tubo di raccolta. Dopo l'aggiunta 500 μΐ di una soluzione contenente etanolo e guanidina idrocloruro, la colonnina viene centrifugata per 1 min a 6000 x g. L'eluato viene eliminato e la colonnina viene posta in un nuovo tubo di raccolta. Dopo l'aggiunta di 500 μΐ di una soluzione contenente etanolo, la colonnina viene centrifugata per 3 min a 20000 x g. To wash and purify the extracted DNA / RNA, the eluate is removed and the column is placed in a new collection tube. After the addition of 500 μΐ of a solution containing ethanol and guanidine hydrochloride, the column is centrifuged for 1 min at 6000 x g. The eluate is eliminated and the column is placed in a new collection tube. After the addition of 500 μΐ of a solution containing ethanol, the column is centrifuged for 3 min at 20,000 x g.
Per garantire l'asciugatura della membrana, dopo l'eliminazione dell'eluato, viene ripetuta la centri-fugazione per 3 min a 20000 x g. To ensure drying of the membrane, after elimination of the eluate, centrifugation is repeated for 3 min at 20,000 x g.
Dopo eliminazione della provetta contenente l'eluato, la colonnina viene posta in una nuova provetta steri le, vengono aggiunti 30 μΐ di tampone di eluizione e, per centrifugazione (1 min a 6000 x g), viene recupe-rato il DNA/RNA purificato. After elimination of the tube containing the eluate, the column is placed in a new sterile tube, 30 μΐ of elution buffer are added and, by centrifugation (1 min at 6000 x g), the purified DNA / RNA is recovered.
Il DNA/RNA purificato può essere utilizzato immedia-tamente o mantenuto a -80°C. The purified DNA / RNA can be used immediately or kept at -80 ° C.
In alternativa, il DNA virale integrato nel DNA genomico umano può essere valutato, previa estrazione da pellet linfocitari (PBMC), con analoghe procedure di estrazione in presenza di proteinasi K e purificazio-ne/lavaggi con etanolo. Alternatively, the viral DNA integrated into the human genomic DNA can be evaluated, after extraction from lymphocyte pellets (PBMC), with similar extraction procedures in the presence of proteinase K and purification / washing with ethanol.
Fase 2 - One step RT-PCR Phase 2 - One step RT-PCR
Le reazioni di trascrizione inversa e polimerizzazio-ne (PCR - primo step) vengono condotte in unico pas-saggio e nella stessa provetta (0,2 mL) su un thermal cycler tipo Applied Biosystems GenAmp<®>PCR System 9700; questo al fine di semplificare le procedure di laboratorio, incrementare la sensibilità del metodo e ridurre al minimo le possibili contaminazioni. The reverse transcription and polymerization reactions (PCR - first step) are carried out in a single step and in the same tube (0.2 mL) on a thermal cycler such as Applied Biosystems GenAmp <®> PCR System 9700; this in order to simplify laboratory procedures, increase the sensitivity of the method and minimize possible contamination.
Per la reazione di RT-PCR si è scelto di adottare un kit del commercio specificatamente disegnato per l'analisi e la rivelazione end-point di molecole di RNA tramite RT-PCR, con alta sensibilità ed alta fe-deltà. For the RT-PCR reaction it was decided to adopt a commercially available kit specifically designed for the analysis and end-point detection of RNA molecules by RT-PCR, with high sensitivity and high fidelity.
Il sistema utilizza una miscela di SuperScript III<®>Reverse Transciptase e Platinum<®>Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) per alte rese e fedeltà di RT-PCR, anche da templati lunghi. The system uses a blend of SuperScript III <®> Reverse Transciptase and Platinum <®> Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) for high yields and fidelity of RT-PCR, even from long templates.
Le condizioni di reazione sono le seguenti: The reaction conditions are as follows:
a) buffer di reazione contenente dATP, dCTP, dGTP e dTTP (ciascuno a concentrazione finale di 0,2 mM) ed MgS04(concentrazione finale 1,7 mM); a) reaction buffer containing dATP, dCTP, dGTP and dTTP (each with final concentration of 0.2 mM) and MgSO4 (final concentration 1.7 mM);
b) primer senso (FTlgp41_For) ed antisenso (FTlgp4l_Rev) (ciascuno a concentrazione finale di 0,4 μΜ), b) sense (FTlgp41_For) and antisense (FTlgp4l_Rev) primers (each at a final concentration of 0.4 μΜ),
c) templato di RNA (> 1 pg), c) template of RNA (> 1 pg),
d) H20 RNAsi free q.b. a 50 μΡ finali. d) H20 RNase free q.b. at 50 μΡ final.
Protocollo termico : Thermal protocol:
52°C 60 min 52 ° C 60 min
94°C 2 min 94 ° C 2 min
10 cicli : 10 cycles:
94°C 15 sec 94 ° C 15 sec
52°C 30 sec 52 ° C 30 sec
68°C 3 min 68 ° C 3 min
30 cicli : 30 cycles:
94°C 15 sec 94 ° C 15 sec
52°C 30 sec 52 ° C 30 sec
68°C 3 min 5 sec/ciclo 68 ° C 3 min 5 sec / cycle
68°C 10 min 68 ° C 10 min
4°C 4 ° C
Previa verifica dell'avvenuta amplificazione (vedere Fase 4) , il dsDNA ottenuto può essere utilizzato per i successivi passaggi di genotipizzazione o conserva-to a -20°C. After verification of the amplification (see Phase 4), the obtained dsDNA can be used for the subsequent genotyping steps or stored at -20 ° C.
Quando il singolo passaggio di RT-PCR non è suffi-ciente a fornire una adeguata amplificazione, è pos-sibile proseguire nella procedura con un secondo step di PCR (nested-PCR), utilizzando i "primer interni" (senso, FT2gp41_For o, in alternativa, FT2gp41.b_For, ed antisenso, FT2gp41_Rev o, in alternativa, FT2gp41.b_Rev), secondo il protocollo di seguito de-scritto. When the single step of RT-PCR is not sufficient to provide adequate amplification, it is possible to continue the procedure with a second step of PCR (nested-PCR), using the "internal primers" (sense, FT2gp41_For or, alternatively, FT2gp41.b_For, and antisense, FT2gp41_Rev or, alternatively, FT2gp41.b_Rev), according to the protocol described below.
Fase 3 - nested-PCR Phase 3 - nested-PCR
La reazione di nested-PCR viene condotta utilizzando come DNA polimerasi la Platinum<®>Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/μΙ) (Invitrogen), costituita da una miscela di Taq DNA Polymerase ricombinante, Pyrococcus species GB-D polimerasi (attività esonucleasica con correzione di bozze) e Platinum<®>Taq Antibody. Tale enzima, consente la procedura "hot-start" che impedisce la polimerizzazione a temperatura ambiente, permettendo l'amplificazione di DNA con alte rese, sensibilità e specificità, anche da templati lunghi. Le condizioni di reazione sono le seguenti: The nested-PCR reaction is carried out using Platinum <®> Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U / μΙ) (Invitrogen) as DNA polymerase, consisting of a mixture of recombinant Taq DNA Polymerase, Pyrococcus species GB-D polymerase (activity proofreading exonuclease) and Platinum <®> Taq Antibody. This enzyme allows the "hot-start" procedure which prevents polymerization at room temperature, allowing the amplification of DNA with high yields, sensitivity and specificity, even from long templates. The reaction conditions are as follows:
a) buffer di reazione contenente: 600 mM Tris-S04- pH 8.9, 180 mM ammonio solfato; a) reaction buffer containing: 600 mM Tris-SO4- pH 8.9, 180 mM ammonium sulphate;
b) dATP, dCTP, dGTP e dTTP (ciascuno a concentrazione finale di 0,2 mM); b) dATP, dCTP, dGTP and dTTP (each at a final concentration of 0.2 mM);
c) MgS04(concentrazione finale 1,7 mM); c) MgSO4 (final concentration 1.7 mM);
d) primer senso (FT2gp41_For o, in alternativa, FT2gp41.b_For) ed antisenso (FT2gp41_Rev o, in alternativa, FT2gp41.b_Rev) (ciascuno a concentrazione fi-nale di 0,4 μΜ); d) sense primer (FT2gp41_For or, alternatively, FT2gp41.b_For) and antisense (FT2gp41_Rev or, alternatively, FT2gp41.b_Rev) (each with a final concentration of 0.4 μΜ);
e) Platinum<®>Taq DNA Polymerase High Fidelity (2 U); e) Platinum <®> Taq DNA Polymerase High Fidelity (2 U);
f) templato di dsDNA (da RT-PCR) 5 μΐ,; f) dsDNA template (from RT-PCR) 5 μΐ ,;
g) H20 RNAsi free q.b. a 50 μΐ.finali. g) H20 RNase free q.b. to 50 μΐ.finals.
Protocollo termico : Thermal protocol:
94 °C 2 min 94 ° C 2 min
10 cicli : 10 cycles:
94°C 15 sec 94 ° C 15 sec
58°C 30 sec 58 ° C 30 sec
68°C 3 min 68 ° C 3 min
20 cicli : 20 cycles:
94°C 15 sec 94 ° C 15 sec
58°C 30 sec 58 ° C 30 sec
68°C 3 min 5 sec/ciclo 68 ° C 3 min 5 sec / cycle
68°C 10 min 68 ° C 10 min
4°C 4 ° C
Previa verifica dell'avvenuta amplificazione (vedi Fase 4) , il dsDNA ottenuto può essere utilizzato per i successivi passaggi di genotipizzazione o conserva-to a -20°C. After verification of the amplification (see Phase 4), the obtained dsDNA can be used for the subsequent genotyping steps or stored at -20 ° C.
Fase 4 - purificazione ed analisi dei prodotti di PCR I prodotti di PCR ottenuti vengono purificati e vi-sualizzati tramite elettroforesi su gel di agarosio, prima della successiva analisi di genotipizzazione. Procedura : Phase 4 - purification and analysis of the PCR products The PCR products obtained are purified and visualized by agarose gel electrophoresis, before the subsequent genotyping analysis. Procedure:
300 μΐ. di H20 sterile e tutti i 50 μΐ.del prodotto di RT-PCR/nested-PCR vengono pipettati su microconcen-tratori Microcon 100 (Millipore) e centrifugati per 15 min a 550 x g. 1/eluato viene eliminato e sulla membrana del microconcentratore vengono dispensati 35 μΐ, di H20 sterile; la colonnina Microcon 100 viene posta in posizione invertita su una nuova provetta tipo Eppendorf da 1,5 mL. Dopo centrifugazione per 5 min a 550 x g, il campione purificato (dsDNA) viene trasferito nella nuova provetta. 300 μΐ. of sterile H20 and all 50 μΐ of the RT-PCR / nested-PCR product are pipetted onto Microcon 100 (Millipore) microconcentrators and centrifuged for 15 min at 550 x g. 1 / eluate is eliminated and 35 μΐ of sterile H20 are dispensed onto the membrane of the microconcentrator; the Microcon 100 column is placed in the inverted position on a new 1.5 mL Eppendorf type tube. After centrifugation for 5 min at 550 x g, the purified sample (dsDNA) is transferred to the new tube.
Un'aliquota del campione (5-10 μΐ.), mescolata con un tampone di caricamento per elettroforesi su gel (con-tenente 40% saccarosio w/v, blu di bromofenolo 0,25% w/v, xilene cianolo FF 0,25% w/v), viene analizzata su gel di agarosio all'1% contenente 0,5 μg/mL di bromuro di etidio. Il confronto del prodotto amplifi cato viene effettuato con uno standard di riferimento - High DNA mass ladder (Invitrogen, markers per frammenti di DNA di 10, 6, 4, 3, 2 e 1 kb. L'elettroforesi di 4 μΐ dell'High DNA Mass Ladder produce bande contenenti rispettivamente 200, 120, 80, 60, 40 e 20 ng - 520 ng totali di DNA). La se-quenza target amplificata viene sottoposta ad elet-troforesi a 10 V/cm per 45-60 min. Dopo trans-illuminazione in luce UV, l'amplificato target verrà visualizzato in corrispondenza della banda da 3 kb (tra 2 kb e 3 kb). An aliquot of the sample (5-10 μΐ.), Mixed with a loading buffer for gel electrophoresis (containing 40% sucrose w / v, bromophenol blue 0.25% w / v, xylene cyanol FF 0, 25% w / v), is tested on 1% agarose gel containing 0.5 μg / mL of ethidium bromide. The comparison of the amplified product is carried out with a reference standard - High DNA mass ladder (Invitrogen, markers for DNA fragments of 10, 6, 4, 3, 2 and 1 kb. Electrophoresis of 4 μΐ of the High DNA Mass Ladder produces bands containing 200, 120, 80, 60, 40 and 20 ng - 520 ng total DNA respectively). The amplified target sequence is subjected to electrophoresis at 10 V / cm for 45-60 min. After transillumination in UV light, the amplified target will be displayed at the 3 kb band (between 2 kb and 3 kb).
Prima di procedere nella procedura di genotipizzazione, il campione amplificato viene diluito con H20 sterile in proporzione dell'intensità della banda vi-sualizzata su gel. Se l'intensità della banda risul-tasse inferiore a quelle corrispondenti tra 4 kb e 3 kb, il campione amplificato potrebbe non essere suf-ficiente per il successivo sequenziamento. Before proceeding with the genotyping procedure, the amplified sample is diluted with sterile H20 in proportion to the intensity of the band displayed on the gel. If the intensity of the band is lower than the corresponding ones between 4 kb and 3 kb, the amplified sample may not be sufficient for subsequent sequencing.
Fase 5 - sequenziamento della sequenza tarqet ampli -ficata (qenotipizzazione) Step 5 - sequencing the amplified tarqet sequence (qenotyping)
Per il sequenziamento dell'intero segmento genetico amplificato, possono essere impiegati fino a 11 primer differenti (Figura 3 e Tabella 1) identificati con le etichette FT2gp41_For (oppure FT2gp41.b_For), FT2gp41_Rev (oppure FT2gp41.b_Rev), gp41Seql_For (oppure gp41Seql.b_For), gp41Seq2_For (oppure gp41Seq2.b_For), gp41Seq3_For, gp41Seq4_For, gp41Seq5_For, gp41Seq6_Rev (oppure gp41Seq6.b_Rev), gp41Seq7_Rev, gp41Seq8_Rev e gp41Seq9_Rev (oppure gp41Seq9.b_Rev) (Tabella 1). I primer contrassegnati con ".b" sono da considerarsi alternativi al primer originario. For the sequencing of the entire amplified genetic segment, up to 11 different primers can be used (Figure 3 and Table 1) identified with the labels FT2gp41_For (or FT2gp41.b_For), FT2gp41_Rev (or FT2gp41.b_Rev), gp41Seql_For (or gp41Seql). b_For), gp41Seq2_For (or gp41Seq2.b_For), gp41Seq3_For, gp41Seq4_For, gp41Seq5_For, gp41Seq6_Rev (or gp41Seq6.b_Rev), gp41Seq7_SeqRev (gp41Seq7_Rev_Rev) Primers marked with ".b" are to be considered as alternatives to the original primer.
A tale scopo, reazioni indipendenti (provette separate da 0,2 mL) vengono condotte su un thermal cycler tipo Applied Biosystems GenAmp<®>PCR System 9700, aggiungendo ogni singolo primer di sequenza in una miscela di Big Dye<®>Terminator Ready Reaction Mix (Big Dye<®>Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) alla concentrazione finale di 3,2 pmol (secondo le specifiche del produttore). For this purpose, independent reactions (separate 0.2 mL tubes) are carried out on a thermal cycler such as Applied Biosystems GenAmp <®> PCR System 9700, adding each single sequence primer in a mix of Big Dye <®> Terminator Ready Reaction Mix (Big Dye <®> Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) at the final concentration of 3.2 pmol (according to the manufacturer's specifications).
Il protocollo termico applicato è il seguente: 96°C 1 min The applied thermal protocol is the following: 96 ° C 1 min
25 ci eli : 25 us eli:
96°C 10 sec 96 ° C 10 sec
50°C 5 sec 50 ° C 5 sec
60°C 4 min 60 ° C 4 min
4°C 4 ° C
Fase 6 - purificazione ed analisi dei prodotti di se-quenza Phase 6 - purification and analysis of sequence products
I prodotti di sequenza ottenuti vengono purifi-cati su colonnina Centri-Sep<™>(Princeton Separation, costituita da resina di Sephadex<™>G-50 Fine - Amersham), per la rimozione di eccesso di terminatori BigDye<®>, sali ed impurità di basso peso molecolare. The sequence products obtained are purified on a centri-Sep <™> column (Princeton Separation, consisting of Sephadex <™> G-50 Fine - Amersham resin), for the removal of excess BigDye <®> terminators, salts and low molecular weight impurities.
I prodotti di sequenza vengono preventivamente trattati con SDS (Sodio Dodecil Solfato al 2,2%) ag-giungendo 2 μΐ, di SDS ogni 20 μΐ. di prodotto di se-quenza (concentrazione finale 0,2%) e sottoponendo la miscela ad un ciclo termico di 98°C per 5 min seguito da 25°C per 10 min. The sequence products are previously treated with SDS (Sodium Dodecyl Sulphate at 2.2%) adding 2 μΐ, of SDS every 20 μΐ. of sequence product (final concentration 0.2%) and subjecting the mixture to a thermal cycle of 98 ° C for 5 min followed by 25 ° C for 10 min.
La miscela viene quindi purificata su colonnina Centri-Sep<™>o con procedure alternative, come racco-mandato dal produttore (Etanolo/EDTA, Etanolo/EDTA/Sodio acetato). The mixture is then purified on the centri-Sep <™> column or with alternative procedures, as recommended by the manufacturer (Ethanol / EDTA, Ethanol / EDTA / Sodium acetate).
I prodotti di sequenza purificati vengono ana- The purified sequence products are analyzed
, , , , ,TM ,,,,, TM
lizzati, dopo denaturazione termica con Hi-Di Formamide (Formamide deionizzata), tramite elettroforesi su sequenziatore automatico. lized, after thermal denaturation with Hi-Di Formamide (deionized formamide), by electrophoresis on an automatic sequencer.
Le sequenze generate vengono analizzate per con-fronto con sequenze poi di HIV-1 "wild-type" per la ricerca delle mutazioni associate a resistenza ai farmaci antiretrovirali e degli eventuali polimorfi-smi presenti. The generated sequences are analyzed by comparison with sequences of "wild-type" HIV-1 to search for mutations associated with resistance to antiretroviral drugs and for any polymorphs present.
Sensibilità del metodo Sensitivity of the method
Elettroforesi Electrophoresis
Sono state condotte diverse corse elettroforeti-che su gel di agarosio di un pannello sperimentale di campioni ottenuto per diluizioni seriali, in ragione di 1:10, di un campione a concentrazione virale nota. Several electrophoretic runs were carried out on agarose gel of an experimental panel of samples obtained by serial dilutions, in the ratio of 1:10, of a sample with known viral concentration.
Il pannello comprende i seguenti campioni: lkb) Standard di riferimento di peso molecolare; The panel includes the following samples: lkb) Molecular weight reference standard;
-) Campione negativo (plasma umano negativo per HIV-i); -) Negative sample (human plasma negative for HIV-i);
1:1) Campione intero. Viremia dosata: 110.000 copie HIV—1 RNA/mL; 1: 1) Whole sample. Viremia assayed: 110,000 HIV — 1 RNA copies / mL;
1:10) Campione diluito. Viremia stimata: 11.000 copie HIV—1 RNA/mL; 1:10) Diluted sample. Estimated viremia: 11,000 HIV — 1 RNA copies / mL;
1:100) Campione diluito. Viremia stimata: 1.100 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 100) Diluted sample. Estimated viremia: 1,100 HIV-1 RNA pairs / mL;
1:1.000) Campione diluito. Viremia stimata: 110 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 1,000) Diluted sample. Estimated viremia: 110 HIV-1 RNA pairs / mL;
1:10.000) Campione diluito. Viremia stimata: 11 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 10,000) Diluted sample. Estimated viremia: 11 HIV pairs — 1 RNA / mL;
1:100.000) Campione diluito. Viremia stimata: 1,1 co-pie HIV—1 RNA/mL; 1: 100,000) Diluted sample. Estimated viraemia: 1.1 pairs of HIV — 1 RNA / mL;
p.HIVl) Campione positivo (HIV-1 near-full genome plasmidico) . p.HIVl) Positive sample (HIV-1 near-full genome plasmid).
La viremia stimata di ogni singolo campione diluito è stata successivamente dosata tramite un si-stema diagnostico commerciale approvato FDA-USA, ba-sato sulla tecnologia "real-time" e con sensibilità di 47 copie HIV-1 RNA/mL The estimated viremia of each single diluted sample was subsequently determined by means of a commercial diagnostic system approved by FDA-USA, based on "real-time" technology and with sensitivity of 47 HIV-1 RNA copies / mL.
L'elevata sensibilità del test, verificata in questa fase sperimentale (vedere Figura 5), eventual-mente potenziata da una successiva amplificazione nested-PCR, consente la genotipizzazione anche di cam-pioni plasmatici a viremia molto bassa (10<1>-10<2>copie HIV-RNA/mL), abbassando il limite di sensibilità de-gli attuali sistemi diagnostici commerciali diretti ad altre regioni (IO<3>copie HIV-RNA/mL). The high sensitivity of the test, verified in this experimental phase (see Figure 5), possibly enhanced by a subsequent nested-PCR amplification, allows the genotyping of plasma samples with very low viremia (10 <1> -10 <2> HIV-RNA copies / mL), lowering the detection limit of current commercial diagnostic systems directed to other regions (10 <3> HIV-RNA copies / mL).
La presente invenzione è stata descritta a ti-tolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma è da intendersi che variazioni/miglioramenti (i.e. riduzione dei tem-pi di esecuzione, profilo termico di PCR, calibrazio-ne delle concentrazioni chimiche dei reagenti utiliz-zati, etc.) potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni al-legate. The present invention has been described for illustrative but not limiting purposes, according to its preferred embodiments, but it is to be understood that variations / improvements (i.e. reduction of execution times, PCR thermal profile, calibration of chemical concentrations of the reagents used, etc.) may be introduced by those skilled in the art without thereby departing from the relative scope of protection, as defined by the attached claims.
BIBLIOGRAFIA BIBLIOGRAPHY
- Deeks S.G., Hllmann N.S., Grant R.M., Parkin N.T., Petropoulos C.J., Becker M., Symonds W., Chesney M., Volberding P.A. J. Infect . Dls. 1999; 179:1375-1381. - Zolopa A.R., Shafer R.W., Warford A., Montoya J.G., Hsu P., Katzenstein D., Merigan T.C., Efron B. Ann . Intern . Med. 1999; 131:813-821. - Deeks S.G., Hllmann N.S., Grant R.M., Parkin N.T., Petropoulos C.J., Becker M., Symonds W., Chesney M., Volberding P.A. J. Infect. Dls. 1999; 179: 1375-1381. - Zolopa A.R., Shafer R.W., Warford A., Montoya J.G., Hsu P., Katzenstein D., Merigan T.C., Efron B. Ann. Intern. Med. 1999; 131: 813-821.
- DeGruttola V., Dix L., D'Aquila R., Holder D., Phi-lips A.N., AitKhaled M., Baxter J.D., Clevenbergh P., Hammer S., Harrigan R.P., Katzenstein D., Lanier R., Miller M.D., Para M., Yerly S., Zolopa A.R., Murray J.S., Patick A., Miller V., Castrilo S., Pedneault L., Mellors J. Antivir. Ther. 2000; 5:41-48. - DeGruttola V., Dix L., D'Aquila R., Holder D., Phi-lips A.N., AitKhaled M., Baxter J.D., Clevenbergh P., Hammer S., Harrigan R.P., Katzenstein D., Lanier R., Miller M.D., Para M., Yerly S., Zolopa A.R., Murray J.S., Patick A., Miller V., Castrilo S., Pedneault L., Mellors J. Antivir. Ther. 2000; 5: 41-48.
- Eshleman S.H., Crutcher G., Petrauskene 0., Kunstman K., Cunningham S.P., Trevino C., Davis C., Kennedy J., Fairman J., Foley B., Kop J. Journal of Clinical Microbiology, 2005; 43:813-817. - Eshleman S.H., Crutcher G., Petrauskene 0., Kunstman K., Cunningham S.P., Trevino C., Davis C., Kennedy J., Fairman J., Foley B., Kop J. Journal of Clinical Microbiology, 2005; 43: 813-817.
- Xu L, Pozniak A, Wildfire A, et al . Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:1113-1119. - Xu L, Pozniak A, Wildfire A, et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 1113-1119.
- Kliger Y, Shai Y. J Mol Biol 2000; 295:163-168. - Kliger Y, Shai Y. J Mol Biol 2000; 295: 163-168.
- Rimsky LT, Shugars DC, Matthews TJ. J Virol 1998; 72:986-993. - Rimsky LT, Shugars DC, Matthews TJ. J Virol 1998; 72: 986-993.
- Derdeyn CA, Decker JM, Sfakianos JN. et al . J Virol 2000, 74:8358-8367. - Derdeyn CA, Decker JM, Sfakianos JN. et al. J Virol 2000, 74: 8358-8367.
- Greenberg ML, Cammack N, Salgo M, et al . Rev Med Virol 2004; 14:1-17. - Greenberg ML, Cammack N, Salgo M, et al. Rev Med Virol 2004; 14: 1-17.
- Kemp SD, Ruiz L, Lucas AM, et al . Antivir Ther 2002; 7:SII. - Kemp SD, Ruiz L, Lucas AM, et al. Antivir Ther 2002; 7: SII.
- Sista P, Melby T, Davison D, et al . AIDS 2004; 18:1-8. - Sista P, Melby T, Davison D, et al. AIDS 2004; 18: 1-8.
- Greenberg ML, Cammack N. J Antimicrob Chemother 2004; 54:333-340. - Greenberg ML, Cammack N. J Antimicrob Chemother 2004; 54: 333-340.
- Xu L, Pozniak A, Wildfire A, et al . In: Proceedings of thè llth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infectlons, 2004 [Abstract 659]. - Xu L, Pozniak A, Wildfire A, et al. In: Proceedings of the llth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infectlons, 2004 [Abstract 659].
- Poveda E, Rodés B, Toro C, et al . AIDS 2002; 16:1959-1961. - Poveda E, Rodés B, Toro C, et al. AIDS 2002; 16: 1959-1961.
- Hirsch MS, Brun-Vezinet F, Clotet B, et al . Clln Infect Dis 2003; 37:113-128. - Hirsch MS, Brun-Vezinet F, Clotet B, et al. Clln Infect Dis 2003; 37: 113-128.
- Vandamme AM, Sonnerborg A, Ait-Khaled M, et al . Antivir Ther 2004; 9:829-848. - Vandamme AM, Sonnerborg A, Ait-Khaled M, et al. Antivir Ther 2004; 9: 829-848.
- Zolopa AR. J Infect Dis 2006; 194 Suppl l:S59-64. Review. - Zolopa AR. J Infect Dis 2006; 194 Suppl l: S59-64. Review.
- Johnson VA, Brun-Vezinet F, Clotet B, et al . Top HIV Med 2006; 14:125-130. - Johnson VA, Brun-Vezinet F, Clotet B, et al. Top HIV Med 2006; 14: 125-130.
- Smith D, Moini N, Pesano R, et al . Clin Infect Dis 2007; 44:456-458. - Smith D, Moini N, Pesano R, et al. Clin Infect Dis 2007; 44: 456-458.
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