ITRM20000500A1

ITRM20000500A1 - Muteine del frammento peptidico cgrp 1-7 e loro uso come potenziatoridei recettori nicotinici neuronali.

Info

Publication number: ITRM20000500A1
Application number: IT2000RM000500A
Authority: IT
Inventors: Andrea Nistri; Angelantonio Silvia Di
Original assignee: S I S S A Scuola Internaz S Up
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2002-03-15
Also published as: US20030220235A1; JP2004509134A; WO2002022658A3; AU2001295872A1; WO2002022658A2; CA2420504A1; IT1317908B1; EP1317477A2; ITRM20000500A0; US7030081B2

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “Muteine del frammento peptidico CGRP 1-7 e loro uso come potenziatoli dei recettori nicotinici neuronali”

La presente invenzione concerne muteine del frammento peptidico CGRP 1-7 (Calcitonin Gene Related Peptide) e il loro uso terapeutico come potenziatori dei recettori nicotinici neuronali.

Più in particolare l’invenzione concerne muteine del frammento peptidico N-terminaie CGRP 1-7 del peptide di 37 amminoacidi, aventi almeno 4 amminoacidi e il loro uso per la preparazione di medicamenti per il trattamento di malattie neurologiche associate a deficit di funzione dei recettori nicotinici neuronali.

I recettori nicotinici sono le molecole chiave della trasmissione colinergica alla giunzione neuromuscolare dei muscoli striati (recettori nicotinici muscolari), alle sinapsi dei gangli periferici del sistema autonomo e in molte aree del cervello (recettori nicotinici neuronali) (Gotti et al. 1997; Paterson e Nordberg, 2000).

Tutti i recettori nicotinici sono un aggregato di 5 subunità, in modo da formare una struttura (inserita nella membrana cellulare) con un canale centrale. I recettori nicotinici esistono in varie combinazioni di subunità, e a seconda di tale combinazione hanno diverse proprietà funzionali e farmacologiche.

Le subunità sono state classificate come: subunità a (a1-a9), cioè subunità che legano l'agonista e contengono un ponte disulfuro tra residui cisteinid adiacenti, esemplificato dal ponte Cys192-Cys193 che si trova nella subunità muscolare α1 ; subunità non-α, che conferiscono particolari proprietà ai recettori, non contengono tali cisteine e sono denominate β1-β4, γ, ε e δ a seconda della loro sequenza amminoacidica. Tutte le subunità hanno una simile struttura topografica che comprende un esteso dominio extracellulare (N-terminale), quattro dominii transmembrana (M1-M4), un dominio intracellulare (la cui lunghezza dipende dalla subunità) che unisce i domini M3 e M4, ed un piccolo C-terminale extracellulare (Changeux e Edelestein, 1998).

L'analisi delle sequenze amminoacidiche delle varie subunità indica che i recettori nicotinici possono essere divisi in tre sottoclassi. La prima è la famiglia dei recettori eteromerici muscolari, tipica del muscolo scheletrico e degli organi elettrici dei pesci, con struttura pentamerica (α1)2β1γδ nella forma fetale, e struttura (α1)2β1γε nella forma adulta. Questi recettori muscolari sono selettivamente bloccati dalla a-bungarotossina.

La seconda famiglia comprende i recettori nicotinici neuronali (nAChR) formati da subunità eteromeriche insensibili all’abungarotossina. Anche questi ultimi hanno una struttura pentamerica formata da diverse combinazioni delle subunità α2, α3, α4, e α6 con β2 o β4, ed in alcuni casi anche con α5 o β3.

La terza famiglia consiste nei recettori nicotinici neuronali omomerici, che legano la α-bungarotossina, e che sono formati da 5 subunità identiche ( α7, α8 o α9).

Il sito di legame dell'acetilcolina ed altri agonisti è posto sul dominio extracellulare N-terminale al confine tra una subunità a ed una non-α. Nei recettori eteromerici neuronali le subunità a e β parimenti contribuiscono al sito di legame.

Lo studio di struttura, funzioni e farmacologia dei recettori neuronali è molto importante in quanto recenti lavori hanno evidenziato che tali recettori sono implicati in un gran numero di funzioni celebrali e meccanismi patologici di malattie del sistema nervoso (per recenti rassegne si veda Clementi e Adlkofer Special issue "nicotinic neuronal receptors ", 2000).

È pertanto comprensibile che agonisti, antagonisti e modulatori di tali recettori stimolino grande interesse terapeutico o diagnostico per varie condizioni neuropatologiche.

Alcune patologie dovute a disfunzione dei recettori nicotinici neuronali sono, ad esempio, la malattia di Alzheimer, il Morbo di Parkinson, l'epilessia, altre malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, la sindrome di Tourette, ansia e depressione.

Malattia di Alzheimer

L’Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce 1 individuo su 10 al di sopra dei 65 anni di età. È responsabile di più del 50% dei casi di demenza senile e della maggioranza dei casi di demenza pre-senile, ed è caratterizzata da un progressivo deterioramento delle funzioni cognitive superiori, inclusa la perdita di memoria. I cervelli di pazienti con AD, analizzati post-mortem, presentano due caratteristiche neuropatologiche, che costituiscono i due indicatori principali per la diagnosi dell'AD: depositi intracellulari di neurofilamenti, e placche extracellulari.

I cervelli con AD presentano una grave perdita dell'innervazione colinergica nella corteccia celebrale e nell'ippocampo (Coyle et al 1983). Questo ha portato all’idea che il deterioramento cognitivo sia strettamente associato alla degenerazione delle vie colinergiche (ipotesi colinergica; Bartus et al 1982).

Inoltre nei cervelli con AD il binding degli agonisti nicotinici è fortemente ridotto rispetto ai controlli. In tali cervelli comunque non c'è diminuzione nel binding dell'a-bungarotossina, e questo indica che apparentemente non c'è perdita dei recettori omomerici a7. Studi condotti su cervelli AD hanno evidenziato che α4β2 è la classe di recettori maggiormente danneggiata dall’AD (Warpman e Nordberg, 1995).

Le terapie più diffuse per CAD sono mirate a ripristinare la trasmissione colinergica. Classicamente questa terapia ha utilizzato inibitori delle colinesterasi, come la tacrina, il donezepil e la rivastigmina, che evitano la degradazione di acetilcolina rilasciata dai neuroni colinergici, aumentandone di conseguenza la concentrazione disponibile per l'interazione con i nAChR. Questo tipo di farmaci ha un effetto solo palliativo sui sintomi, mentre resta discutibile la loro abilità nel rallentare la degenerazione progressiva (Amberla et al 1993, Maltby et al 1994, Nordberg et al 1998, Nordberg and Svesson 1998). È verosimile che i possibili benefici derivino da attivazione dei nAChR, sia tramite l’aumento della concentrazione extracellulare del neurotrasmettitore, sia attraverso la modulazione allosterica dei nAChR che tacrìna e galantamina attuano (Maelicke et al 1995, Nordberg and Svesson 1998).

Numerose osservazioni suggeriscono che l’attivazione di tali recettori sia importante per la terapia di AD:

1) L’attivazione di nAChR da parte della nicotina aumenta le capacità di memoria. Nei modelli animali si è visto che i topi senza la subunità p2 hanno deficit di memoria neH'apprendimento (Picciotto et al 1995), e che animali normali cronicamente trattati con nicotina hanno migliori capacità mnemoniche (Levin 1992). La nicotina aumenta le capacità di memoria anche nei pazienti con AD (Rusted et al 1994).

2) L'attivazione dei recettori nicotinici facilita il rilascio di molti neurotrasmettitori come ACh stessa, dopamina, GABA e glutammato (Wonnacott 1997).

3) L’attivazione dei nAChR protegge parzialmente contro la tossicità da p-amiloide. Infatti, la nicotina previene la morte cellulare indotta dalla p-amiloide in neuroni in cultura, un effetto bloccato dalia diidro-p-eritroidina, antagonista dei recettori α4β2. Anche la citisina, un altro agonista nicotinico, inibisce la tossicità della p-amiloide (Kihara et al 1998).

Quindi l'attivazione dei recettori nicotinici neuronali resta un obiettivo terapeutico importante ma finora scarsamente raggiungibile e non completamente compreso nelle sue implicazioni (Sjoberg et al 1998, Perry et al 2000).

Morbo di Parkinson

Come nell'AD anche nel morbo di Parkinson c’è una perdita dei neuroni colinergici nei nuclei della base accompagnata da una forte riduzione dei siti ad alta affinità' per la nicotina (Whitehouse et al 1983, Lange et al 1993). Oltre a disfunzioni motorie i pazienti con PD hanno spesso deficit cognitivi accompagnati da una perdita di nAChR (Perry et al 1995). Il fattore ambientale più importante nei pazienti PD è che tale patologia è meno frequente nei fumatori (Morens et al 1995); anche se nel tabacco sono presenti altre sostanze insieme alla nicotina, questa è il maggior candidato per tale effetto. Nei roditori il trattamento cronico con nicotina previene la degenerazione dei neuroni dopaminergic (Janson e Moller 1993). Nei topi lesionati con MPTP la nicotina è parzialmente neuroprotettiva, inoltre il nuovo agonista specifico dei recettori α4β2, SIB-1508Y aumenta le capacità cognitive in scimmie modello per il PD quando amministrato in combinazione con levodopa (Schneider et al 1998a, 1998b).

Epilessia

L'epilessia è un gruppo eterogeneo di disordini del sistema nervoso centrale. Tra questi l'Autosomal Frontal Lobe Epilepsy (ADNFLE) è un'epilessia parziale che causa brevi convulsioni durante il sonno. È stato dimostrato recentemente che l'ADNFLE risulta da una mutazione nel gene che codifica per la subunità a4 dei nAChRs. Tale mutazione consiste nella sostituzione di una serina (Ser247) del dominio transmembrana M2 con una fenilalanina (Steinlein et al 1995). Tale mutazione altera le proprietà del canale espresso in oociti di rana in combinazione con β2. Una seconda mutazione è stata trovata in un’altra famiglia con lo stesso tipo di epilessia, sempre nella subunità a4; tale mutazione consiste nell'inserzione di una leucina nella posizione 259 nel C-termina)e (extracellulare) del dominio M2 (Steinlein et al 1995). Seppure quest'ultima mutazione sia meglio tollerata, entrambe le mutazioni riducono la permeabilità al calcio dei recettori α4β2 (Weiland et al 1996).

Inoltre i recettori con la mutazione della serina 247 hanno un’affinità 7 volte minore per l’ACh rispetto ai recettori normali e desensitizzano più facilmente (Bertrand et al 1998).

Dato che classicamente l'epilessia è dovuta ad una attivazione eccessiva dei neuroni, sembra contraddittorio che una funzionalità ridotta dei recettori nicotinici porti a convulsioni. Una possibile spiegazione di ciò sta neli’azione presinaptica di recettori α4β2, che modulano il rilascio di neurotrasmettittori inibitori come GABA e glieina (Wonnacott 1997). Un maggior rilascio di GABA e glicina dai neuroni inibitori, o l’attivazione di tali neuroni mediata dai recettori α4β2, potrebbe prevenire gli attacchi epilettici che avvengono tra il sonno e le veglia, e quindi una ridotta funzionalità di tali recettori, come risulta dalle mutazioni trovate, potrebbe scatenare l’ADNFLE.

Alla luce di ciò, farmaci che potenzino direttamente questa classe di recettori potrebbero essere usati nel trattamento di questa forma di epilessia.

Altre malattie neuropsichiatrìche

Oltre a queste patologie, anche la schizofrenia è stata collegata all’attivazione dei nAChR, in quanto nei cervelli di malati di schizofrenia c'è una significativa riduzione di recettori a7 nella regione CA3 dell’ippocampo e nella corteccia frontale (Freedman et al 1997, 1995). Anche per la terapia della sindrome di Tourette si cerca di sviluppare una terapia che abbia come bersaglio i nAChR (Olale et al 1997). I recettori nicotinici sono apparentemente coinvolti nella fisiopatologia di ansia e depressione (Decker et al 1994, Maggio et al 1998).

È stato, inoltre, evidenziato il ruolo dei recettori nicotinici nella dipendenza da tabacco. Il numero di recettori nicotinici aumenta a seguito di una prolungata esposizione alla nicotina. Studi postmortem di cervelli di fumatori rivelano un aumento di siti di legame della nicotina e dell’Ach in modo proporzionale al numero di sigarette fumate (Benwell et al 1988, Breese et al 1997). Inoltre il numero di tali siti di legame osservato nei cervelli di ex-fumatori è minore di quello dei non fumatori. L’interpretazione di questo fenomeno è che la desensitìzzazione e la iper-espressione dei nAChR, conseguenti all’esposizione cronica alla nicotina, siano alla base della tolleranza e della dipendenza da nicotina presenti nei fumatori (Dani e Heinemann 1996).

Alla luce di quanto sopra riportato, risulta pertanto evidente l'esigenza di identificare e poter disporre di sostanze chimiche per la terapia di malattie dovute a disfunzione dei nAChR in grado di potenziare rapidamente ed in maniera reversibile le risposte mediate dall'attivazione di nAChR senza parimenti desensitizzarti. Qualora tali sostanze abbiano la proprietà di agire direttamente sui siti di legame dell'agonista stesso (ACh o nicotina), si avrebbe un valore aggiunto in quanto l’effetto risultante avrebbe grande specificità di azione risparmiando la funzione di altri sistemi recettoriali.

Ad oggi sono state incontrate difficoltà nello studio dei suddetti recettori nei sistemi nativi, in primo luogo dovute al fatto che i nAChR sono localizzati sia a livello postsinaptico, nelle principali vie colinergiche del sistèma nervoso centrale e autonomo, sia a livello presinaptico in molte altre aree cerebrali (Lindstrom, 1997).

Molti studi sono stati condotti su sistemi di espressione eterologhi, facendo esprimere a cellule prive di recettori nicotinici diverse combinazioni di subunità, e caratterizzando in tal modo le diverse proprietà biofisiche e farmacologiche dei diversi aggregati.

il primo passo in quest'approccio è l’uso dell’espressione di tali recettori in oociti di Xenopus; molteplici studi in questo sistema hanno evidenziato le diverse cinetiche dei diversi aggregati, e hanno consentito di indurre mutazioni selettive nelle varie subunità e studiarne l'implicazione funzionale.

Tale approccio, in ogni modo, non riesce a chiarire molti aspetti del ruolo e delle funzioni dei recettori nativi, probabilmente perché nelle cellule anfìbie, con patrimonio genetico dimezzato, quali sono gli oociti di rana, avvengono modifiche post-translazionali che alterano la funzione dei nAChR di mammiferi. Per esempio atropina e invermectina, che modulano i nAChR espressi negli oociti, non hanno tale ruolo quando studiati su sistemi nativi (Krause et al 1998).

L'uso di cellule di mammifero, come le HEK, quali sistemi di espressione ha anche serie limitazioni, in quanto tali cellule non sono comunque cellule neuronali e mancano dei meccanismi di regolazione intracellulare tipici dei neuroni.

Le cellule che esprimono recettori nativi restano quindi indispensabili per lo studio biofisico e farmacologico dei nAChR, soprattutto in funzione dello sviluppo di farmaci capaci di agire sul sistema nervoso centrale e periferico nella cura e diagnosi di varie malattie neuropsichiatriche.

Un appropriato modello sperimentale, utilizzato nella presente invenzione, è rappresentato dalle cellule cromaffini di ratto, che costituiscono la parte midollare delle ghiandole surrenali. Tali ghiandole appartengono al sistema nervoso autonomo e le cellule cromaffini sono cellule che hanno la loro origine dalla cresta neurale.

Le cromaffini ricevono Ach liberata dal nervo splancnico e possiedono una elevata densità di nAChR. Per tale proprietà queste cellule sono state ampiamente impiegate per studi farmacologici e fisiologici atti a caratterizzare i nAChR (Khiroug et al 1998, 1997, Giniatullin et al 1999).

I recettori nicotinici muscolari sono noti per essere fortemente modulati dal neuropetide endogeno CGRP mediante attivazione di secondi messaggeri intracellulari (Calcitonin Gene Related Peptide; Mulle et ai., 1988; Miles et al., 1989; Lu et al., 1993). Gli autori hanno recentemente descrìtto che tale peptide agisce sui nAChR comportandosi anche da antagonista competitivo e cioè spiazzando l'agonista colinergico dal suo sito di legame sul nAChR (Giniatuilin et al 1999). È importante sottolineare che tale effetto non è mediato da convenzionali recettori per il CGRP accoppiati a G-proteine e sistemi di trasduzione intracellulare (Giniatuilin et al 1999). Attraverso studi struttura-azione è stato dimostrato come l’attività inibitoria del CGRP è già presente in maniera completa nel frammento N-terminale 1-7 (Giniatuilin et al 1999). Come il CGRP nativo anche il CGRP1-7 esercita un’azione di tipo antagonista competitivo a rapida insorgenza e reversibile dopo lavaggio (Giniatuilin et al 1999).

È stato ora sorprendentemente trovato che alcuni frammenti del peptide CGRP (muteine) potenziano in maniera rapida e reversibile le risposte mediate dall'attivazione di recettori nicotinici neuronali nativi. Tali recettori sono stati studiati in cellule cromaffini in cultura su cui è stata caratterizzata la tipologia dei recettori stessi. L’effetto osservato è ottenuto a concentrazioni submicromolari e dipende dalla concentrazione dell’agonista nicotinico. Risposte a dosi massimali di agonista non vengono, infatti, potenziate, mentre risposte dovute a piccole dosi dell’agonista vengono prontamente facilitate. In assenza di attivazione dei recettori nicotinici neuronali tali composti sono inattivi.

È stato, inoltre, osservato che un particolare peptide (CGRP1-6) non modifica le risposte dei recettori nicotinici muscolari, indicando quindi la sua selettività per quelli neuronali. Tali osservazioni suggeriscono per i derivati peptidici del CGRP 1-7 un insolito meccanismo di azione che implica una modulazione di tipo competitivo a livello del sito di legame dell’agonista. È stato altresì dimostrato che il frammento CGRP1-6 differisce nella sua azione da tipici modulatori allosterici quali la fisostigmina. Il CGRP 1-6 e suoi derivati possono pertanto essere impiegati per correggere quelle sintomatologie di malattie neurologiche associate a deficit di funzione dei recettori nicotinici neuronali.

È stato, inoltre, trovato che l'eliminazione dei settimo amminoacido dal peptide CGRP 1-7, che è la cisteina, rimuove l'unico ponte disolfuro presente nel peptide e quindi l'assenza di un anello stabile della struttura secondaria permette al frammento peptìdico di assumere nuove conformazioni spaziali.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione una muteina del peptide CGRP 1-7 di sequenza Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys, che abbia un’azione potenziatrice dell’attivazione dei recettori nicotinici neuronali.

Per muteina si intende un peptide modificato per sostituzione, modifica o delezione di uno o più amminoacidi.

Per potenziatore si definisce una sostanza che non ha diretta azione attivante i recettori ma aumenta la risposta del recettore agli agonistì.

La muteina del peptide CGRP 1-7 secondo l'invenzione può avere una sostituzione, modifica o delezione del residuo cisteinico in posizione 7 tale che non si fornii il ponte disolfuro con il residuo cisteinico in posizione 2.

Un esempio di tale muteina del peptide CGRP 1-7 è il peptide in cui la cisteina è stata sostituita con alanina e avente la seguente sequenza amminoacidica:

Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Ala (CGRP 1-7 A)

In una forma di attuazione la muteina del peptide CGRP ha una sequenza amminoacidica di almeno 4 amminoacidi, Ser-Cys-Asn-Thr; preferibilmente di 5 amminoacidi Ser-Cys-Asn-Thr-Ala; ancora più preferibilmente di 6 amminoacidi Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr.

Costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente almeno una muteina del peptide CGRP 1-7 ed uno o più coadiuvanti ed eccipenti farmacologicamente accettabili.

La composizione farmaceutica può comprendente ulteriormente uno o più modulatori allosterici dei nAChR quali, ad esempio, la fisostigmina.

La muteina secondo l'invenzione può essere utilizzata come medicamento, ad esempio, per il trattamento di sintomatologie di malattie neurologiche associate a deficit di funzione dei recettori nicotinici neuronali quali, ad esempio, la malattia di Alzheimer, il Morbo di Parkinson, l’epilessia, malattie neuropsichiatriche.

La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:

Figura 1 mostra le sequenze amminoacidiche del frammento terminale del CGRP. Il CGRP 1-7 possiede un ponte disolfuro tra le due cisteine poste in posizione 2 e 7.

Figura 2 riporta i risultati di analisi RT-PCR da singole cellule cromaffìni. Gli mRNA corrispondenti alle subunità nicotiniche espresse dalle cellule cromaffìni sono rappresentati da istogrammi che indicano la loro incidenza rispetto al totale (-1). Le principali subunità presenti sono α3, αδ, β2 e β4.

Figura 3 mostra l’effetto del CGRP1-6 sulle correnti ioniche mediate dai nAChR a seguito di attivazione mediante applicazione focale di nicotina. A: Le correnti submassimali indotte da un impulso non saturante di nicotina (20 ms) sono potenziate dal frammento peptìdico, mentre le correnti massimali non sono alterate (B). C: andamento temporale delazione del CGRP1-6 sui nAChR: il potenziamento viene indotto rapidamente e la corrente ritorna al valore iniziale dopo 45-60 s di lavaggio. D: curva dose (espressa come durata di applicazione)/ risposta (espressa come corrente ionica I e normalizzata rispetto a quella di controllo) della nicotina in controllo e in presenza del CGRP 1-6; l’azione del peptide sposta la curva verso sinistra in modo parallelo senza alterare le risposte massime (n=5-12).

Figura 4 riguarda l'analisi del meccanismo di azione del CGRP1-6. A: Il grafico mostra il potenziamento delle correnti nicotiniche (0.1 mM, 20 ms) per diverse concentrazioni di CGRP1-6; la soglia per l’azione potenziante è 0.1 μΜ; lo stesso comportamento si vede in B quando l’agonista usato è la citisina (0.1 mM, 20 ms). Ascissa: concentrazione di CGRP1-6 (unità logaritmiche); ordinata: rapporto fra la corrente potenziata e la corrente di controllo. C: istogrammi dimostranti che l’effetto di potenziamento delle correnti mediate dai nAChR è indipendente dal potenziale di membrana (indicato sotto ciascun istogramma dai valori in mV che corrispondono al potenziale di clampaggio; n=7). D: confronto fra l’azione del CGRP1-6 e il CGRP1-7 sui nAChR: si noti che l’azione potenziante del CGRP1-6 controbilancia l'antagonismo competitivo del CGRP1-7. Tutte le risposte sono espresse quali correnti indotte dalla nicotina in presenza di vari farmaci rispetto a quelle di controllo.

Figura 5 mostra l’azione dei frammenti CGRP1-5, 1-4 e 1-3 sui nAChR. A. Il grafico mostra che anche il frammento 1-5 del CGRP potenzia (e correnti mediate dai nAChR; l'azione è dipendente dalla concentrazione ma la capacità di potenziare le risposte dei recettori è minore di quella del frammento 1-6. B Istogramma riassuntivo dell’azione dei vari frammenti del CGRP sulle correnti nicotiniche. Il CGRP1-4 conserva un modesto effetto potenziante, mentre il CGRP 1-3 non è in grado di modulare i nAChR. Per confronto sono riportati i dati corrispondenti all'antagonismo del CGRP e del frammento 1-7.

Le risposte sono espresse come rapporto rispetto a quelle di controllo.

Figura 6 mostra l’effetto del frammento CGRP1-7A sulle risposte evocate dalla nicotina. A: esempi di correnti indotte da 20 ms di nicotina che sono potenziate dall'applicazione di 1 μΜ di CGRP1-7A. Tale effetto scompare dopo lavaggio del peptide (pannello di destra). B: Andamento temporale del potenziamento da parte del CGRP1-7A delle risposte a 20 ms di nicotina. Si noti la rapida insorgenza del potenziamento che raggiunge circa il 18 % entro pochi secondi ed è fàcilmente reversibile dopo lavaggio. C: curve dose/risposta per la nicotina (dosi espresse in durata di applicazione, ms) in soluzione di controllo ed in presenza di 1 μΜ CGRP1-7A. Tale trattamento sposta in maniera parallela la curva verso sinistra senza variarne la risposta massima.

Figura 7 si riferisce allo studio dell'interazione fra il frammento CGRP1-6 e fìsostigmina (Fis). A. La fìsostigmina è un modulatore allosterico dei nAChR: la figura mostra che, sulla stessa cellula, una bassa concentrazione (0.5 μΜ) potenzia le correnti indotte da nicotina (0.1 mM, 20 ms) mentre una concentrazione alta (5 μΜ) le deprime. B Curva dose risposta per la nicotina (0.1 mM) in controllo (a destra) e in presenza di fìsostigmina (a sinistra; 0.5 μιΜ; n=4-14). L'azione del modulatore allosterico potenzia tutte le risposte, compresa quella massima. C. Istogrammi confrontanti l’azione potenziente del CGRP1-6 (1 μΜ), della fìsostigmina (0.5 μΜ) e dell'associazione di queste due sostanze. Si noti l'effetto additivo. Gli asterischi indicano il livello di significatività (n=5 cellule). D. Istogrammi confrontanti l'azione deprimente della fìsostigmina (5 μΜ) sulle risposte prodotte dalla nicotina e la inversione di tale blocco dalla successiva applicazione di CGRP1-6 (1 μΜ). n=4. In questi grafici la risposta alla nicotina è espressa come rapporto fra la corrente in presenza del farmaco (I) e quella in soluzione di controllo (Icontroiio).

Esempio 1 : Preparazione delle cellule

Le culture di cellule cromaffine di ratto sono preparate seguendo il metodo di Brandt (Brandt et al., 1976, Giniatullin et al., 1999, Khiroug et al., 1997, 1998). I ratti, di età 25-35 giorni, sono anestetizzati con livelli crescenti di CO2 e quindi le loro ghiandole surrenali sono rimosse. Dalle ghiandole intere si separa la parte midollare da quella corticale in una soluzione tampone (pH 7.2) contenente (mM): NaCI 137, KCI 3, Na2HP04 0.7, HEPES 25, glucosio 10 e 350 U ml<-1 >di -«-penicillina e streptomicina.

Le cellule sono poi dissociate trattando il tessuto midollare frammentato a 37°C per circa 60 min sia enzimaticamente con collagenasi A e DNAsi I (0.5 U mi<-1 >and 10 pgml<-1>), sia meccanicamente aspirando il liquido con una pipetta Pasteur ogni 15 min. La sospensione contenente le cellule viene poi centrifugata a 750 g per 5 min, e lavata due volte in un medium tamponiate con HEPES. Le cellule risospese nel terreno di cultura DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) con aggiunta di 10% FCS (Siero fetale di vitello) vengono piastrate in capsule di Petri precedentemente trattate con poli-Lisina (5 mg/ml), e tenute in cultura a 37°C per 1-2 giorni in un’atmosfera contenente 5 % di C02.

Una serie di esperimenti è stata condotta utilizzando cellule I28 che rappresentano miotubi e quindi contengono recettori nicotinici di tipo muscolare. A tale fine le cellule sono state preparate secondo la procedura di Irintchev et al (1997).

Esempio 2: Registrazioni elettrofisiologiche con patch-clamp Le capsule contenenti cellule in coltura (usate da 0 a 3 giorni dopo la preparazione) sono poste sul piano di un microscopio invertito Nikon Diaphot e continuamente superfuse (5-10 ml/min) con una soluzione salina di controllo contente (mM): NaCI 135, KOI 5, MgCJ2 1, CaCl2 2, glucosio 15, HEPES 10 (pH portato a 7.4 con NaOH, osmolarità 285 mOsm). Le pipette da patch, ottenute da capillari di vetro sottile (1.5 mm o.d.) hanno resistenza di circa 5-6 ΜΩ quando sono riempite con soluzione intracellulare contenente: (mM) CsCI 120; HEPES 20; MgCI2 1; Mg2ATP3 3, BAPTA 10 (240 mOSM). Il pH della soluzione intracellulare è portato a 7.2 con CsOH. Le registrazioni, salvo diversamente indicato, sono fatte mantenendo la cellula ad un potenziale di membrana costante pari a -70 mV. Dopo aver ottenuto la configurazione di whole-cell (Hamill et al 1981) le cellule si stabilizzano per un periodo di 5 min, dopo il quale si registrano correnti ioniche di membrana mediate dall’attivazione di nAChR, filtrate a 1 kHz, e acquisite sul disco rigido di un PC con il programma pCLAMP 6.04 (Axon Instruments Ine., Foster City, California).

Esempio 3: Somministrazione delle sostanze

Gli agonisti dèi nAChR sono somministrati alla singola cellula con sistema a pressione da una micropipetta contenente una soluzione relativamente concentrata e posta ad una distanza di 15-25 μΐτι dalla cellula registrata. Test preliminari hanno indicato che questo metodo comporta una diluizione della sostanza a livello della membrana della cellula bersaglio di circa 3 volte rispetto alla concentrazione interna alla pipetta (Giniatullin et al., 1996). Tale metodo permette una rapidissima somministrazione di una sostanza chimica con latenze di pochi ms. Inoltre, per applicare antagonisti e/o soluzione di controllo viene usato uno strumento di perfusione rapida controllato dal PC (Bio-logic, Fra noe) costituito da un insieme di capillari di vetro (0.8mm o.d.) i quali ruotando rapidamente generano un flusso di soluzione sulla cellula registrata. In questo caso il tempo di scambio tra una soluzione e l’altra è circa 50 ms.

Esempio 4: PCR da singola cellula

Questa è preceduta da una reazione di trascrizione inversa (RT). A tale fine le cellule, dopo le registrazioni elettrofisiologiche, vengono aspirate sotto controllo visivo, usando una siringa da 10 cc attaccata alla pipetta di registrazione. Il citoplasma cosi raccolto viene aggiunto alla miscela per la reazione di transcriptasi inversa secondo la metodologia descrìtta in Jones et al., 1999. A seguito di questa reazione l'RNA contenuto in ciascuna cellula viene trasformato in DNA e conservato a 4°C.

Per il procedimento di PCR si procede come descritto di seguito. Il primo passo nell’analisi del DNA di ciascuna cellula è l'amplificazione, mediante un mix di oligonucleotidi appositamente costruiti, di tutte le sequenze corrispondenti a recettori nicotinici (per una descrizione completa della tecnica di PCR vedere il classico manuale Maniatis et al 1989). In questo modo il volume di ciascuna reazione è sufficientemente grande da permetterne la divisione necessaria all’amplificazione delle singole sequenze corrispondenti ai vari recettori (Jones et al 1999). Dopo questa preamplificazione i prodotti della reazione vengono suddivisi nelle singole reazioni di amplificazione, ciascuna con il suo primer specifico (Jones et al 1999).

Nel nostro caso abbiamo amplificato le seguenti subunità: α2, α3, α4, α5, α6, α7, β2, β3, β4. I prodotti della PCR sono poi analizzati con elettroforesi standard (Jones et al 1999).

Esempio 5: Sintesi di frammenti peptidici

a. Assemblaggio

I peptidi sono stati assemblati seguendo la strategia di sintesi Fmoc su stato solido usando bufile terziario (per dettagli su questa tecnica si veda Chan e White, 2000).

Le resine di partenza sono Fmoc-Rinke-Amide-Aminometil PS, oppure Fmoc-AA-Wang PS, entrambe incrociate con DVB all’1%.

La procedura di protezione usata è descritta qui di seguito:

1. DMF (3X30 sec)

2. Piperidina 25% (3X3 min)

3. DMF (6X30 sec)

A. Accoppiamento con DMF (1x15 min)

5. Accoppiamento con DMF (1x15 min)

Per ogni passaggio sono stati usati 10ml/g di resina peptidica.

L' 'accoppiamento degli amminoacidi (in eccesso di 5 volte) è stato fatto in DMF in presenza di BOP, Hobt e DIEA.

I seguenti reagenti sono stati impiegati per la protezione delle catene laterali:

- ter-butyl per Serina o T reonina

- trityl per Asparagina o Cisteina

b.Rottura dei legami peptidici (clivaggio)

I peptidi vengono separati dalla resina e la protezione è rimossa con acido trifluoroacetico.

Primo passaggio:

- il coniugato resina-peptide viene messo in TFA e agitato per 2 h 30 min in presenza di fenolo, etanditiolo, tioanisolo e acqua come “scavengers".

Secondo passaggio:

- La soluzione viene raffreddata e il peptide isolato per precipitazione con metil t-butil etere e successiva centrifugazione.

Il peptide grezzo viene poi disciolto in una mistura di acetonitrile/acqua/addo acetico (70/30/1) e liofilizzato.

Analisi dei dati

I dati sono presentati come media±deviazione standard (n=numero di cellule); la significatività statistica è studiata con il Wilcoxon test (se i dati non sono parametrici) o con il paired t-test (per dati distribuiti gaussianamente). Ogni differenza è ritenuta statisticamente significativa quando P≤0.05.

Esempio 6: Studio degli effetti delle muteine del peptide CGRP sulla risposta mediata dall'attivazione dei recettori nicotinici neurali Utilizzando le metodiche descrìtte negli esempi 1-5, è stato effettuato uno studio che ha evidenziato i seguenti aspetti:

- Subunità che costituiscono i nAChR di cellule cromaffini di ratto;

- Potenziamento delle risposte mediate da nAChR da parte del CGRP1-6;

- Indipendenza dell’effetto del CGRP1-6 dal potenziale di membrana; - Confronto fra CGRP1-6 e CGRP1-7;

- Effetto di frammenti più brevi del CGRP1 -6;

- Effetto del frammento CGRP1-7A;

- Interazione tra frammenti del CGRP e modulatori allosterici dei nAChR;

- Effetto del CGRP1-6 sui recettori nicotinici muscolari.

Subunità che costituiscono i nAChR di cellule cromaffini di ratto L’eterogeineità dei nAChR impone, quale stadio prodromico per lo studio di sostanze colinergiche altamente selettive, la descrizione dei tipi recettorìali presenti nelle cellule in esame in quanto ogni effetto farmacologico osservato sulle risposte mediate da nAChR può essere ritenuto selettivo nei confronti di una particolare sottoclasse dei nAChR laddove l’identità di questi sia stata predeterminata.

La Fig. 2 mostra il risultato dell’analisi del contenuto in mRNA di 15 cellule cromaffini ottenuto tramite reazioni di RT-PCR da singola cellula. Come si può vedere le cellule cromaffini di ratto possiedono recettori nicotinici neuronali eteromerìci costituiti dalle subunità α3, a6, β2 e β4. Mentre α3β4 è il recettore prevalente nei gangli del sistema autonomo, a6 e β2 sono subunità tìpiche del sistema nervoso centrale, ed in particolare sono le subunità principali delie vie colinergiche del sistema dopaminergico (Ferrari et al 1999, Le Novere et al 1999, 1996, Charpantier et al 1998). Inoltre da studi condotti in sistemi di espressione eterologhi si è visto che a6 può formare recettori funzionali sia con β2 sia con la combinazione α3β4 (Fucile et al 1998). Questi risultati permettono di considerare le cellule cromaffini di ratto validi modelli contenenti recettori di tipo α3β4, α6β2, α6β4 ed infine α3α6β4.

Potenziamento delle risposte mediate da nAChR da parte del CGRP1-6

La Fig. 3 mostra tipici dati ottenuti applicando un breve impulso di nicotina (tipico agonista dei nAChR; 0.1 mM in pipetta; durata variabile dell’impulso come mostrato in Fig 3) ad una cellula cromaffine. La Fig. 3A dimostra il sorprendente potenziamento in presenza di CGRP1-6 (1 μΜ) delle risposte nicotiniche submassimali indotte da un'applicazione quale per esempio di 20 ms. Sulla stessa cellula tale potenziamento è invece assente se l’impulso di nicotina è sufficientemente lungo (200 ms) da saturare i nAChR e generare una corrente massimale (Fig. 3 B). L'effetto del CGRP1-6 si produce in maniera molto rapida tanto che si manifèsta perfino se applicato solo 5 s prima della nicotina ed è facilmente reversibile dopo circa 1 min di lavaggio (Fig. 3 C). Tale fenomeno non è associato ad alcuna diretta azione de) CGRP1-6 sulla conduttanza di riposo di tali cellule o sulla loro corrente di base. Pertanto il CGRP1-6 è un modulatore dei recettori nicotinici ma non agisce su di questi in assenza di agonista.

Per comprendere il meccanismo di azione di questo frammento peptidico è necessario fare una curva dose risposta per la nicotina prima e durante applicazione di CGRP1-6. A causa della rapida desensitizzazione dei nAChR è diffìcile costruire tale curva applicando dosi crescenti di nicotina in un ampio spettro di concentrazioni. Un metodo per evitare questo problema tecnico consiste nel mantenere costante la concentrazione di nicotina (applicata nella pipetta) e di cambiare invece la durata dell'impulso il quale pertanto libera in soluzione quantità crescenti di nicotina in un tempo peraltro sempre molto ristretto (decine di millisecondi; vedi Giniatullin et al 1999). La curva dose risposta della nicotina in condizioni di controllo è quindi mostrata in figura 3D (quadratini). Quando gli stessi impulsi di nicotina sono ripetuti in presenza di CGRP1-6 (1 μΜ) la curva si sposta in modo parallelo a sinistra, senza alterazione della risposta massima. Gli asterischi indicano quelle risposte potenziate che sono statisticamente diverse dai rispettivi controlli. Tale spostamento parallelo suggerisce che, sulla base delle conoscenze attuali sul funzionamento dei recettori di membrana (Colquhoun 1998), il sito di azione del CGRP1-6 sia comune con quello deH'agonista colinergico e che l'interazione di queste due sostanze con il recettore dipenda da proprietà quali la relativa affinità di legame e la concentrazione della sostanza.

Recentemente è stato dimostrato come alcune sostanze classificate quali “ligandi potenzienti allosterici’’ (APL) (Maelicke e Albuquerque 2000) facilitino le risposte dei nAChR anche se con proprietà farmacologiche diverse quali per esempio una gamma molto limitata di concentrazioni capaci di esercitare tale effetto. Viceversa, il CGRP1-6 mostra la sua azione potenziarite sui nAChR in un ampio spettro di concentrazioni: avendo noi testato concentrazioni 1000 volte diverse (0.05-50 μΜ) abbiamo osservato che l'azione potenziante del CGRP1-6 ha una soglia di 0.1 μΜ (105±7%, n=7), ed aumenta significativamente fino ad un massimo che corrisponde a 50 μΜ (156±6%, n=5). Tale fenomeno è rappresentato in Fig. 4 A che mostra l'incremento nella risposta ad una dose costante di nicotina (20 ms; 0.1 mM) ai crescere delie concentrazioni di CGRP1-6. L’effetto potenziante del CGRP1-6 si manifesta anche quando i nAChR sono attivati dalla citisina (20 ms; 0.1 mM; Fig. 4 B) confermando che tale facilitazione è indipendente dal tipo di agonista nicotinico impiegato. L'Ach non è stata usata in quanto tale sostanza è rapidamente idrolizzata dalle colinesterasi rendendo instabile la riproducibilità delle risposte.

Indipendenza dell'effetto del CGRP1-6 dal potenziale di membrana

L'azione potenziante del peptide è indipendente dal potenziale di membrana come indicato in Fig. 4 C rappresentante i dati relativi a 6 cellule in cui il potenziale di membrana è stato fissato a -40, -70 e -100 mV. L'entità del potenziamento rimane invariata indicando che la sensibilità delle cellule all’azione del CGRP1-6 non è pertanto influenzata dal grado di attività delle cellule stesse.

Confronto fra CGRP1-6 e CGRP1-7

Abbiamo esaminato se l’abilità potenziante dei CGRP1-6 potesse competere con l’inibizione indotta dal CGRP1-7. La Fig. 4 D mostra che mentre il CGRP1-6 potenzia in media del 31 % ed il CGRP1-7 inibisce del 42 %, la contemporanea applicazione di questi due frammenti (alla stessa concentrazione 1 μΜ) abolisce sia l'uno che l'altro effetto e perciò non c’è variazione significativa delle correnti di membrana (99+4 %, n=6). Questo risultato suggerisce che entrambi i peptidi agiscano sullo stesso sito recettoriale seppure con effetti opposti.

Effetto di frammenti più brevi del CGRP1-6

La Fig. 5 A mostra come anche il CGRP1-5 riesca a potenziare le correnti nicotiniche con un’azione dipendente dalla sua concentrazione. Tale azione potenziante è comunque minore di quella del CGRP1-6. Infatti mentre il CGRP1-6 (1μΜ) potenzia del 31 ±7% (n=30), un effetto di pari entità è ottenuto con una concentrazione di CGRP1-5 10 volte maggiore (26±4% per 10 μΜ, n=5).

Anche il CGRP1-4 (1μΜ) conserva un modesto effetto potenziante (8±1%; n=14) mentre il CGRP1-3 (1 μΜ) non altera le correnti indotte da nicotina (0±1%, n=7). Tale situazione è riassunta in Fig. 5 B, in cui sono anche riportati i dati relativi all’antagonismo osservato con il CGRP intero od il suo frammento 1-7. Tali risultati pertanto indicano che esiste una serie di frammenti peptidid corrispondenti ad una catena terminale del CGRP tutti dotati di attività potenziante sui nAChR ma con diversa potenza. Tale fenomeno permette quindi di gettare le basi per futuri studi su struttura-azione.

Effetto del frammento CGRP1-7A

Vista l'azione potenziante dei frammenti 1-6, 1-5 ed 1-4 che contrasta con l'effetto inibitorio del frammento 1-7, abbiamo notato come quest’ultimo possieda un ponte disulfurico collegante due cisteine (in posizione 2 e 7). Tale ponte disulfurico rappresenterebbe quindi una struttura inibente l'attività del recettore nicotinico mentre i frammenti più corti ne sono privi. A sostegno di questa ipotesi abbiamo testato l’effetto del frammento 1-7A in cui la cisteina in posizione 7 è stata sostituita daH'amminoacido alanina. La Fig. 6 A mostra che il frammento 1-7A potenzia (+18 %) la corrente generata da un impulso di 20 ms di nicotina e che tale effetto sia reversibile dopo lavaggio di circa 1 minuto. La Fig. 6 B indica l'andamento temporale dell'azione del CGRP1-7A sulla risposta alla nicotina: tale potenziamento si instaura rapidamente e raggiunge apparenti condizioni di equilibrio (massimo potenziamento=17±4 %; n=8) con facile reversibilità dopo lavaggio. La Fig. 6 C presenta curve dose/risposta per la nicotina in controllo (quadrati) o in presenza di 1 μΜ CGRP 1-7 A La curva è significativamente spostata a sinistra senza incremento della massima risposta (n=4-6 cellule).

Questi esperimenti dimostrano che il frammento 1-7 del CGRP a cui sia stata tolta la cisteina in posizione 7 e quindi la possibilità di formare mediante ponte disulfurico una struttura ciclica, diventa in grado di potenziare l’azione della nicotina sulle cellule cromaffini.

Interazione tra frammenti del CGRP e modulatori allosterici dei nAChR

Un confronto tra frammenti del CGRP e sostanze ad azione APL si rende necessario sia per verificare se esistano sinergie di azione sia per comprendere meglio il meccanismo di azione dei frammenti del CGRP stesso. La fisostigmina (eserina), un inibitore delle colinesterasi, è nota avere anche un effetto allosterico sui recettori nicotinici, a dosi più basse di quelle bloccanti le colinesterasi (Maelicke et al 1997; Maelicke and Albuquerque 2000). Inizialmente noi abbiamo verificato se l’azione della fisostigmina sui nAChR di cellule cromaffini fosse la stessa di quella descrìtta in letteratura. A tale fine la nicotina era applicata in presenza di una bassa (0.5 μΜ) o alta (5 μΜ) concentrazione di fisostigmina. La Fig. 7 A mostra come 0.5 μΜ fisostigmina potenzi la risposta alla nicotina (in media del 28±5 % n=14) mentre la concentrazione 5 μΜ la deprìma (in media del 48±2% n=4, nicotina 0.1 mM, 20 ms). Precedenti studi (Maelicke et al 1997) hanno suggerito che la concentrazione di fisostigmina che evoca il massimo potenziamento corrisponde a 0.5 μΜ. Incrementando la dose la risposta alla nicotina viene rapidamente inibita. Tali osservazioni coincidono con i nostri esperimenti e quindi questi dati confermano che la fisostigmina agisce sulle cellule cromaffini con un comportamento tipico dei composti APL, diverso dal CGRP1-6. La Fig. 7 B mostra la curva dose risposta della nicotina in controllo ed in presenza di fisostigmina 0.5 μΜ: in questo caso la curva è spostata sulla sinistra ma risulta anche cambiata nella sua forma a causa di un aumento della risposta massima e della sua pendenza. Nessuna di queste proprietà viene riscontrata negli esperimenti fatti con CGRP1-6 (vedi Fig. 3 D).

La Fig. 7 C mostra i valori medi di esperimenti in cui, dopo avere previamente verificato il significativo potenziamento ottenuto con il CGRP1-6 (1 μΜ) o con la fìsostigmina (0.5 μΜ) separatamente, la nicotina viene applicata in presenza di entrambe le sostanze. In tal caso si osserva un potenziamento che corrisponde al 37 ± 6 % cioè praticamente alla somma dei due effetti separati (21 ± 4 % e 10 ± 1 % per CGRP e fìsostigmina; n = 5). Viceversa l’applicazione di una dose elevata di fìsostigmina (5 μΜ) determina una riduzione della risposta alla nicotina del 77 ± 1 %. In tale circostanza, la simultanea applicazione del CGRP 1-6 (1 μΜ) è in grado di contrastare parzialmente l'inibizione da parte della fìsostigmina tanto che i valori delie risposte alla nicotina corrispondono al 79 ± 1 % del controllo (n=4). Questi risultati dimostrano chiaramente la separazione degli effetti della fìsostigmina da quelli del CGRP1-6 ed indicano che tali molecole interagiscono in maniera del tutto distinta sui nAChR.

Studio dell’effetto del CGRP1-6 sui recettori nicotinici muscolari

Gli esperimenti sopracitati hanno dimostrato un'interessante azione potenziante del CGRP1-6 ma non hanno chiarito se questa sia specifica nei confronti dei recettori nAChR. A tale fine abbiamo studiato se questo peptide abbia effetto sulle correnti nicotiniche registrate da cellule muscolari in coltura (miotubi I26). Tali cellule venivano tenute ad un potenziale di -60 mV mediante l'elettrodo di patch. Applicazione di nicotina (100 μΜ mediante la soluzione di superfusione) generava risposte medie di 1.06±0.22 nA (n=7) facilmente reversibili dopo lavaggio. Tale concentrazione di nicotina corrispondeva alla dose che induceva una risposta uguale al 50 % della massima risposta. In presenza di 1 μΜ CGRP1-6 (pre-applicato per 2 min) le risposte alla nicotina non variavano di ampiezza (1.09+0.24 nA che corrisponde a 101 ±2 % dei controlli; n=7). Tali osservazioni confermano che il CGRP1-6 ha un’azione selettiva sui nAChR.

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Muteina del peptide CGRP 1-7 di sequenza Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys ad azione potenziatrice dell'attivazione dei recettori nicotinici neuronali.
2. Muteina secondo la rivendicazione 1, in cui il peptide CGRP 1-7 ha una sostituzione, modifica o delezione del residuo cisteinico in posizione 7, tale che non si formi il ponte disolfuro con il residuo cisteinico in posizione 2.
3. Muteina secondo la rivendicazione 2, in cui il peptide ha la seguente sequenza amminoacidica: Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Ala.
4. Muteina secondo la rivendicazione 1, in cui il peptide ha una sequenza amminoacidica di almeno 4 amminoacidi: Ser-Cys-Asn-Thr.
5. Muteina secondo la rivendicazione 4, in cui il peptide ha una sequenza amminoacidica di almeno 5 amminoacidi: Ser-Cys-Asnthr-Ala.
6. Muteina secondo la rivendicazione 5, in cui il peptide ha una sequenza amminoacidica di almeno 6 amminoacidi: Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr.
7. Composizione farmaceutica comprendente almeno una muteina del peptide CGRP 1-7 secondo le rivendicazioni precedenti ed uno o più coadiuvanti ed eccipienti farmacologicamente accettabili.
8. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7, comprendente ulteriormente uno o più modulatori allosterici dei nAChR.
9. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, in cui il modulatore aflosterìco è la fisostigmina.
10. Muteina secondo le rivendicazioni 1-6 per l’uso come medicamento.
11. Uso della muteina secondo le rivendicazioni 1-6 per la preparazione di un medicamento per il trattamento di sintomatologie di malattie neurologiche associate a deficit di funzione dei recettori nicotinici neuronali.
12. Uso secondo la rivendicazione 11, in cui per malattie neurologiche associate a deficit di funzione dei recettori nicotinici neuronali si intende la malattia di Alzheimer, il Morbo di Parkinson, l’epilessia, malattie neuropsichiatriche.