ITRM20000112A1

ITRM20000112A1 - Sistema portatile per il monitoraggio ambientale selettivo di erbicidi inquinanti basato sulla applicazione di un biosensore da fotosistema

Info

Publication number: ITRM20000112A1
Application number: IT2000RM000112A
Authority: IT
Inventors: Giancarlo Angelini; Maria Teresa Giardi; Esposito Dania; Giada Leonardi; Autar Matoo; Andrea Morganelli
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2000-06-03
Also published as: EP1134585A2; DE60116989D1; ATE317124T1; EP1134585A3; IT1315854B1; EP1134585B1; DE1134585T1; DE60116989T2

Description

Descrizione del’invenzione industriale dal titolo

Sistema portatile per il monitoraggio ambientale selettivo di erbicidi inquinanti basato sulla applicazione di un biosensore da Fotosistema II (PSII)

DESCRIZIONE

Ambito dell’ invenzione

Questa invenzione riguarda la realizzazione e la applicazione di un sistema portatile (denominato “Bioherbi”) per il monitoraggio ambientale selettivo di erbicidi inquinanti delle acque superficiali e sotterranee.

Il sistema oggetto di questa invenzione si basa su di un dispositivo innovativo che utilizza come biomediatore il complesso proteico Fotosistema I (PSII), isolato da organismi fotosintetici e loro mutanti resistenti a sottoclassi di erbicidi, interfacciato, mediante tecnica originale ed oggetto anch’essa di questa invenzione, con un sistema di trasduzione di fluorescenza. Questo sistema proteico, identificato come biosensore, è, in modo originale e parte integrante di questa invenzione, sensibile alla classe degli erbicidi che agiscono a livello della fotosintesi e distingue, all’interno di questa, le singole sottoclassi.

Usi

Monitoraggio del contenuto di erbicida (totale e per sottoclasse di composto chimico) nelle acque superficiali e sotterranee, come da direttive CEE ed USA.

Vantaggi

Tale sistema, come sensore per gli erbicidi, presenta i seguenti vantaggi:

i) di essere portatile;

ii) di avere un basso costo di realizzazione e di esercizio;

iii) di avere una sensibilità selettiva modulabile in base al tipo di preparazione del campione biologico;

iv) di permettere un riconoscimento della classe dell’ erbicida (fotosintetici nel nostro caso) e delle sottoclassi (per esempio triazinici o fenilureici, etc) e la loro quantificazione; v) di poter attuare un elevato numero di analisi a basso costo come prescreening focalizzando ulteriori analisi di laboratorio;

vi) di essere di facile utilizzazione senza necessità di personale tecnico specificatamente preparato.

Stato della tecnica

I principi su cui e’ basata l’invenzione sono riportati di seguito.

Biosensore

Il principio fondamentale che accomuna tutti i biosensori consiste nella loro capacita’ di rivelazione di un analita in concentrazione esigua, grazie all’interazione che avviene tra un sistema biologico/biochimico (opportunamente immobilizzato) e l' analita di interesse. Questa interazione comporta una risposta del sistema biologico/biochimico che viene rivelata (trasduzione del segnale) e continuamente monitorata.

La matrice biologico/biochimica può essere rappresentata da enzimi, anticorpi, macromolecole, cellule o strutture sovracellulari. I metodi di trasduzione del segnale possono essere elettrochimici, ottici, acustici, microgravimetrici, microcalorimetrici, capacitivi, etc. A seconda della scelta combinata tra “elemento biologico - trasduttore - sistema di processamene) del segnale” si ottengono biosensori che differiscono in quanto a capacità di riconoscimento e possibilità di utilizzo. Non tutte le combinazioni sono in realtà realizzabili o vantaggiose.

La scelta dell’ elemento biologico determina il grado di selettività e specificità del biosensore rispetto all’analita, ma e’ fondamentale anche il tipo di accoppiamento esistente tra strato biologico reattivo e trasduttore del segnale. Infatti nel momento in cui si ha un’interazione o una reazione fra l’elemento biologico e l’analita, questa comporta una modifica dei parametri chimico-fisici identificativi del complesso reattivo rispetto al suo stato di quiete. La misura di questa variazione determina il riconoscimento e la quantificazione dell’analita.

Le caratteristiche essenziali dei biosensori sono la sensibilità e la selettività che la componente biologica è in grado di provvedere, in unione con la semplicità d'uso e la versatilità che derivano però dal metodo di trasduzione scelto, solitamente compatibile con la necessità di miniaturizzazione, di basso costo di esercizio e monitoraggio continuo (per informazioni sull’argomento vedi Techniques and instrumentation in analytical chemistry voi 11. Biosensors. Eds, F Scheller and F Schubert. Elsevier, Amsterdam, London, New York, Tokyo 1992). L’insieme di queste caratteristiche è particolarmente interessante nel settore ambientale per il rilevamento, controllo e misura di inquinanti, per esempio, delle falde acquifere, dell'ecosistema fluviale, lacustre e marino e la verifica del rispetto dei limiti stabiliti dalla legislazione vigente.

Erbicidi fotosintetici agenti sul Fotosistema 11 (PS11)

Derivati dell'urea, delle triazine, delle diazine, composti fenolici ed altri, rappresentano famiglie di composti di notevole importanza economica in molti settori della industria chimica, farmaceutica ed agrìcola. Essi costituiscono i prodotti basilari per il diserbo chimico di diverse colture. I composti appartenenti a queste classi (Ureici - p.e.: Diuron, Neburon, Isoproturon, Clortoluron, Linuron, Metobromuron, Cicluron, Metabenztiazuron, Etidimuro; Triazinici - p.e.: Simazina, Ametrina, Desmetrina, Prometrina, Terbutilazina, Terbutrina, Terbumeton, Clanazina, Metribuzin, Metamitron, Exazinone; Diazinici - p.e.: Bromacil, Lenacil, Cloridazon, Piridate, Bentazone; Fenolici - p.e.: Bromoxynil e Ioxynil) costituiscono circa il 50% degli erbicidi attualmente usati in agricoltura, con un consumo mondiale di molte tonnellate. I composti appartenenti a questi gruppi possono essere applicati sia in pre-emergenza che in post-emergenza ed il loro meccanismo di azione si esplica con la inibizione della fotosintesi clorofilliana attraverso il blocco del flusso elettronico a livello del Fotosistema II (PSD) e conseguente arresto della fotolisi dell'acqua e dello sviluppo di ossigeno (reazione di Hill). Questa azione è dovuta all'interazione che l'erbicida stabilisce con un componente proteico della membrana dei cloroplasti, che svolge un ruolo principale nel trasporto degli elettroni dall'acqua al NADP (per un libro sull’argomento vedi Herbicide Handbook of thè Weed Society of America. Ed C J Willard, Neil Street, Champaign, Illinois, 1994. Residue reviews, Eds FA Gunther and JD Gunther, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1970).

Il Fotosistema II (PSII) e’ stato isolato sia dai batteri fotosintetici che dalle piante superiori ed è già stato dimostrato che in forma isolata è ancora in grado di legare gli erbicidi fotosintetici (MT Giardi, J Barber, MC Giardina, and R Bassi. 1990, Z. Naturforsch, 45, 366-372. MT Giardi, J Marder , and J Barber 1988, Biochim et Biophys Acta, 934, 64-71).

Altra caratteristica degli erbicidi è la loro buona persistenza d'azione nel terreno dove sono adsorbiti dai colloidi e dalla sostanza organica. I composti più solubili sono soggetti a percolazione, soprattutto nei terreni sciolti sabbiosi e poveri di sostanza organica. La maggior parte di essi rimane però localizzata negli strati più superficiali del terreno e la loro persistenza nel terreno varia da media ad elevata, in funzione del principio attivo e delle condizioni pedoclimatiche. Tali sostanze o i loro prodotti di degradazione possono quindi sia percolare attraverso il terreno sotto azione delle piogge che, in soluzione o adsorbiti su particelle di terreno, raggiungere, tramite i canali di irrigazione, i corsi d’acqua superficiali e sottorranei. L'uso massiccio e prolungato di alcuni erbicidi, soprattutto atrazina, ha determinato la selezione e la successiva diffusione di biotipi resistenti agli erbicidi derivanti da specie infestanti sensibili (Weed and crop resistance to herbicides, Eds R De Prado, J Jorrin and L Garcia Torres. Kluwer Academic Publishers, 1997, ISBN 0-7923-4581-9). Nonostante che l'atrazina sia stata tolta dal commercio, molecole analoghe (quali la simazina che differisce solo per un metile della catena laterale) sono attualmente largamente utilizzate.

Nota l’alta tossicità degli erbicidi per l’uomo e gli animali, il loro uso indiscriminato comporta seri problemi ambientali. Infatti il problema dell’ inquinamento da erbicidi dei fiumi, laghi e falde sotterranee è largamente noto. Per esempio il dinoseb è stato proibito negli USA e in molti altri paesi per la sua tossicità (US Federai Register, 1986) e anche l’atrazina è stata vietata (US EPA, 1988). La CEE, introducendo il documento “European Drinking Water Act of 1980”, ha stabilito concentrazioni di erbicida nell’acqua che non eccedano 0.1 mg/L per singolo erbicida oppure 0.5 mg/L di erbicida totale.

E’ quindi evidente che per rivelare tali concentrazioni residue siano necessari metodi di analisi estremamente sensibili ed affidabili.

Biomediatore

Il cuore sensibile del biosensore è la sua componente biologica (chiamata biomediatore) da cui dipendono le peculiarità del dispositivo. Nel nostro caso, il Fotosistema II (PSII), risulta estremamente interessante ed adatto per lo sviluppo di un biosensore. Infatti, se sottoposto ad illuminazione esso presenta sia fluorescenza che sviluppo di ossigeno e trasferimento di carica, tutte attività inibite dalla presenza di erbicidi fotosintetici. Il vantaggio offerto dall'uso del PSII consiste nella particolare semplicità della trasduzione del segnale di variazione dell’attività biologica e che quindi può essere misurata direttamente senza richiedere l’uso di alcun tipo di “marcatori” o la introduzione di competitori che complicano sia le metodiche di analisi che le apparecchiature di misura.

L'idea di utilizzare il PSII per monitorare gli erbicidi risale al 1960 quando cellule intatte di microrganismi fotosintetici sono state utilizzate in laboratorio a questo scopo. Tuttavia l’uso su larga scala di tale importante componente biologica è stato limitato a causa della sua intrinseca instabilità, che ne inficiava la applicazione analitica (C Loranger and R Carpentier, 1994, Biotechnology Bioengineering, 44, 178-183).

Recentemente si sono ottenuti notevoli avanzamenti nel miglioramento della “stabilizzazione” del Fotosistema Π (PSII) (M Koblizek, J Masojidek, J Komenda, T Kucera, R Pilloton, A Mattoo, MT Giardi, 1998, Biotechnology and Bioengineermg, 60, 664-669), soprattutto da quando siamo riusciti ad immobilizzare il PSD isolato da cianobatteri termofilici. L’aver selezionato questo particolare organismo fotosintetico ha permesso l’uso di un biomediatore che si è rivelato stabile per molte ore a temperatura ambiente e nelle condizioni di misura (cella a flusso munita di elettrodo di Clark per la misura della inibizione dello sviluppo di ossigeno in presenza di erbicidi), mostrando inoltre una notevole sensibilità (p.e. da IO'10 moli/L per il Diuron a 10' moli/L per il Bromoxynil). Anche questo sistema comunque presentava problemi operativi: complessità di utilizzo, elevati tempi di messa a regime della misura, apparecchiatura ingombrante, etc.

Queste premesse ci hanno spinto a sviluppare quanto è oggetto di questa invenzione. Verrà di seguito descritta nel dettaglio la invenzione e le sue componenti principali.

Invenzione

L’apparecchiatura (vedi schema a blocchi di Fig. 1) e’ costituita da:

1. una cella a flusso dove è inserito un blocco intercambiabile ed a tenuta, dotato di setto filtrante dove e’ immobilizzato il biomediatore;

2. una pompa peristaltica che attua il movimento 1) del campione acquoso, contenente l’erbicida oggetto di misura, dentro la cella a flusso e quindi attraverso il biomediatore e 2) del tampone di lavaggio e rigenerazione del biomediatore. 1 flussi sono alternati con opportuna valvola a tre vie anche temporizzata;

3. un sensore di fluorescenza (dispositivo normalmente in commercio) che fornisce la luce di eccitazione e rivela il segnale di fluorescenza. La luce di eccitazione è emessa da un sistema con LED a corona focalizzati sulla cella a flusso e sul biomediatore, che fornisce la luce di eccitazione (a 650 nm) al sistema. Il sistema a diodi ha il vantaggio di fornire luce con ridotta cessione termica e di emettere il segnale molto rapidamente. Un circuito ottico a “feedback” controlla e corregge le variazioni di intensità luminosa emessa e dovute a variazioni di temperatura esterna;

4. una fibra ottica, trasduttrice di fluorescenza ed intimamente connessa alla cella a flusso; 5. un analizzatore - misuratore di fluorescenza, intimamente collegato alla fibra ottica;

6. un computer per il controllo del sistema e la analisi dei dati di fluorescenza;

7. un temporizzatore con 1) un attuatore stopped - flow, per l’automatismo della misura di fluorescenza nella cella a flusso contenente il biomediatore supportato ed eseguita a flusso bloccato e 2) un ritardatore-attuatore, per abilitare il sensore di fluorescenza alla misura, dopo un tempo stabilito dal blocco del flusso;

8. blocchi intercambiabili di biomediatore “wild-type” e “mutante” immobilizzato;

9. contenitore per il tampone di lavaggio e rigenerazione del biomediatore.

Questa apparecchiatura è stata realizzata, nel suo complesso, in struttura portatile, in modo da renderne versatile e semplice l’uso in condizioni reali di impiego, abbattendo sia il costo di esercizio che di realizzazione.

Il biosensore, nel suo complesso, ha il vantaggio rispetto ai sistemi precedenti basati sull’elettrodo di Clark (M Koblizek, J Masojidek, J Komenda, T Kucera, R Pilloton, A Mattoo, MT Giardi, 1998, Biotechnology and Bioengineering, 60, 664-669) di essere, oltre che portatile, di uso immediato; rispetto ai bio sensori basati sulla fluorescenza della clorofilla (D Merz, M Geyer, M Moss, DA Anche, 1996, Fresenius J Analitica! Chemistry 354, 299-305) di dare una misura di tempi di inibizione e/o area integrata della fluorescenza rispetto a misure di picco, migliorando nettamente la sensibilità e precisione della misura. Inoltre il nostro biosensore, come meglio verrà descritto di seguito, ha rispetto a tutti i sistemi precedenti ( per una review sull’ argomento vedi JL Marty, D Garcia, R Rouillon, Trends in analytical chemistry, 14, 329-332), la caratteristica originale di essere in grado di distinguere le sottoclassi di erbicidi fotosintetici utilizzando specifici biomediatori immobilizzati isolati da organismi mutati. Tali organismi mutati risultano “resistenti” ad una sottoclasse di erbicidi fotosintetici ma non alle altre (p.e. un mutante è resistente alle triazine ma sensibile, con variazione di emissione di fluorescenza, agli ureici, see D Lazar, 1999, Biochim Biophys Acta, 1-28). Quindi un organismo “wild-type” (il tipo naturale selvatico) è sensibile alle triazine mentre il corrispondente mutato non è sensibile. Da cui una risposta con variazione di fluorescenza nel primo caso associata ad una “non risposta” con i mutati, ne identifica con certezza la sottoclasse.

Biomediatore

La realizzazione di un biosensore di tal genere ha comportato la produzione e l'isolamento di “particolati” di PSII in detergenti non ionici e la loro caratterizzazione chimico-fisica e strutturale (MT Giardi, 1993, Pianta, 190, 107-113). Si sono ottenuti particolati di PSII sia da piante superiori (con il limite di stabilità fino a 5°C) che da cianobatteri termofilici, (questi ultimi risultano stabili sino a temperature relativamente elevate: 50 - 60°C). Per aumentare la stabilità del biomediatore abbiamo utilizzato la capacità di adattamento degli organismi fotosintetici alle alte temperature per cui essi sono stati fatti crescere a temperature relativamente elevate (33-35°C) oppure sottoposti per 48 ore ad uno stress termico moderato (33-40°C) (E Franco, S Alessandrelli, J Masojidek, A Margonelli and MT Giardi, 1999, Plani Science, 144, 53-61 ).

Sono state inoltre prese in considerazione sia le principali tecniche di ancoraggio di proteine su superfici ottiche (legami covalenti, adsorbimento fisico, etc), che il filmaggio della proteina mediante cross-linking (p.e. su superficie d’oro), per ottimizzare l’orientazione ed il compattamento delle molecole di biomediatore (T Wink, SJ van Zuilen, A Bult and WP van Bennekom, 1997, Analyst, 122, 43-50).

Si è notato sperimentalmente che la tecnica di ancoraggio del PSII su superfici mediante crosslinking chimico (BSA-GA) comporta sia perdita di attività in risposta di fluorescenza che perdita di sensibilità verso l’erbicida. Si è inoltre notato che la tecnica di intrappolamento fisico in membrana del particolato di PSII, pur non comportando apprezzabili perdite di attività, creava problemi sia nella permeazione dell’erbicida che nella successiva operazione di lavaggio dello stesso per rigenerarlo.

Si è quindi messa a punto una metodica innovativa ed originale di cross-linking ed intrappolamento del biomediatore. Questa consiste in un trattamento con soluzione di CdC12 , che causa il cross-linking tra i gruppi SH delle proteine del Fotosistema II, formando un reticolo più compatto e meno dilavabile dall’effluente contenete l’erbicida, ottenendo inoltre una maggiore stabilità del biomediatore ed un aumento della sensibilità verso l’erbicida: la sensibilità Verso l’erbicida è dell’ordine di 10-100 volte maggiore nell’immobilizzato con CdC12.

Il biomediatore così trattato viene ulteriormente immobilizzato su di un setto poroso, di materiale vetroso con spessore da 0,5 mm a 6.0 mm e dimensione dei pori da Gl a G5, componente della cella di misura a flusso.

Per aumentare ulteriormente la stabilità del biomediatore si è notato sperimentalmente la utilità di un sistema di refrigerazione della soluzione contenente erbicida inviata nella cella di misura. Si dà di seguito, una. breve descrizione delle migliori condizione di utilizzo in cui si è ottenuta la migliore risposta da PSII isolato a) da piante superiori trattate ad alta temperatura (33°C -40°C) per più giorni ed incubate con una soluzione di CdC12 (0.2 mM a 10 mM) per varie ore e b) da cianobatteri termofilici cresciuti a più di 50°C e trattati anch’essi con CdCl2, e sistema di refrigerazione a 5°C, flusso da 0.2 mL/m a 2.0 mL/m di soluzione di erbicida. In tali condizioni sono state raggiunte sensibilità p.e. sotto il nanomolare per la Atrazina, la Simazina ed il Diuron, mentre per il Bromoxynil e lo Ioxynil si ha un ordine di grandezza superiore. Comunque la sensibilità è risultata dipendente dai tempi di lavaggio del biomediatore con la soluzione contenente l' erbicida per cui è possibile ottenere sensibilità dell’ordine di 10<-10 >M protraendo però i tempi di ogni analisi oltre i 60 min.

La stabilità in condizioni operative del biomediatore può essere definita come il tempo necessario ad avere una. diminuzione della attività della metà che nel nostro caso è di 48 ore. Con un opportuno sistema di lavaggio e rigenerazione ( tampone Tricina, 50mM e pH=7, contenente NaCl, 1,0 - 5.0 mM, MgCl2 5.0 - 20mM e CdCl20.2 - 5.0mM) si possono ottenere misure riproducibili per due giorni utilizzando un unico corpo contenente il biomediatore che viene rigenerato dopo ogni misura.

Specificità del biomediatore

Per rendere specifico il segnale per una classe di erbicidi si sfruttano le peculiari proprietà di mutanti selezionati in campo di piante superiori resistenti all’ Atrazina (p.e.: Senecio vulgaris, Poa annua, Amaranthus retroflexus, etc.). Tale approccio è stato perseguito, poiché è noto che la mutazione di un singolo amminoacido sulla proteina D1 (prodotto dal gene psbA) è in grado di indurre “resistenza” all’erbicida (per esempio la sostituzione di una serina con una glieina induce “resistenza” alla Atrazina ma non agli altri erbicidi) (W Oettmeier, 1999, CMLS, 55, 1255-1277). Il biomediatore, costituito da PSII isolato, immobilizzato come già descritto, è resistente alla classe dei composti triazinici e quindi selettivo per le classi di erbicidi diversi dalla triazina (sensibile quindi agli erbicidi fenolici, ureici, diazinici). Mutanti resistenti sensibili a diverse classi di erbicidi sono disponibili in ricerca ((W Oettmeier, 1999, CMLS, 55, 1255-1277), per cui è possibile ottenere una larga varietà e selettività dall’utilizzo in serie di tali biomediatori. Mutanti ipersensibili sono stati precedentemente utilizzati per aumentare la sensibilità del biomediatore (KH Pastrik, U Kaerst, RD Schmid, D Rolf, 1991, Abt. Enzymtechnol., Ges. Biotechnol. Forsch., Braunschweig, Fed. Rep. Ger. Z. Wasser Abwasser Forsch. 24(1), 12-15).

Per ottenere una maggiore stabilità dei particolati di biomediatore si possono utilizzare mutanti di cianobateri termofilici (p.e.: Synechococcus elongatus ) ottenuti tramite la tecnica della “Side-Directed Mutagenesis” (W Oettmeier, 1999, CMLS, 55, 1255-1277).

Per quanto riguarda questo brevetto sono stati utilizzati entrambi i tipi di mutanti (da piante superiori e da cianobatteri) in confronto ai loro “wild-type”.

Apparecchiatura

Da un esame delle problematiche progettuali per la realizzazione del sensore, sono state quindi valutate, dal punto di vista modellistico e sperimentale, le configurazioni possibili per il biosensore, al fine di determinare la struttura più idonea, la geometria del sistema e i parametri progettuali optoelettronici e chimico-fisici. Su tali specifiche è stata progettata la cella di misura, individuati i componenti da utilizzare e la procedura sperimentale da seguire per lanalisi degli erbicidi mediante il biosensore. Il dispositivo è conforme al sistema di trasduzione scelto.

In una formulazione particolarmente vantaggiosa, il Bioherbi è un apparecchio che complessivamente pesa circa 6Kg occupa uno spazio di circa 30x30x20 cm ed è costituito come di seguito riportato.

a) cella a flusso dove e’ immobilizzato il biomediatore. Il disegno (vedi Fig. 2) rappresenta la cella schematizzata che è costituita da materiale plastico nero ed ha un diametro di circa 4 cm. Il materiale plastico nero permette l’adattamento del biomediatore al buio. Il biomediatore è intrappolato nella sezione interna. La tenuta superficiale del foro di lettura è realizzata con un vetrino coprioggetti per microscopia. La cella interna, dove è intrappolato il biomediatore, è tra i 50 e i 300 microlitri.

b) una pompa peristaltica è la parte idraulica per il prelievo del campione contenente l’erbicida da analizzare, che attua il movimento del campione stesso attraverso la cella a flusso e lo pone in stretto contatto con il biomediatore. In una realizzazione particolarmente vantaggiosa viene previsto un unico blocco come contenitore di erbicida e pompa peristaltica. Il flusso può essere variato da 0.2-2 mL/min dipendendo dal campione. Un flusso più elevato aumenta la sensibilità all’erbicida poiché l’erbicida scambia con un numero maggiore di siti di legame sul PSII.

In base alle prove di laboratorio, si è trovato che con flusso della soluzione di erbicida, la efficienza della misura della fluorescenza potrebbe essere inficiata da effetti di scattering della luce. Per cui si è preferito effettuare la misura in condizioni di stopped-flow, con la messa in opera di un interruttore di flusso.

11 biomediatore immobilizzato nella cella a flusso è, dopo ogni misura, lavato e rigenerato con una opportuna soluzione tampone. Una valvola consente di inviare alternativamente il flusso di tampone o la soluzione da analizzare contenente l’erbicida.

c) sensore di fluorescenza a fibra ottica collegato strettamente alla cella a flusso.

La fluorescenza emessa dalle piante verdi riflette la attività fotosintetica. Studi recenti sulle tecniche di misura di fluorescenza hanno reso tale caratteristica un mezzo molto importante nella ricerca di base ed applicata alla fisiologia delle piante (D Lazar, 1999, Biochim Biophys Acta, 1-28).

L’analizzatore Bioherbi misura la fluorescenza emessa da complessi fotosintetici e le modifiche causate dalla presenza di diserbanti.

Il sensore è collegato strettamente alla cella a flusso, per evitare la minima infiltrazione di luce esterna, e fornisce la luce di eccitazione rivelando il segnale di fluorescenza. La luce di eccitazione è emessa da un diodo emittente alla lunghezza d’onda molto stretta di 650 nm, che è assorbita rapidamente dal Fotosistema II degli organismi fotosintetici ed ha il vantaggio di fornire luce con ridotto riscaldamento e di emettere il segnale molto rapidamente. Un circuito ottico a “feedback” controlla e corregge le variazioni di intensità luminosa emessa anche dovute a variazioni di temperatura. L’analizzatore è un fotodiodo ad alta capacità, associato con un amplificatore. Il sistema ottico risponde perfettamente alla lunghezza d’onda di emissione della fluorescenza di 700 nm e blocca la luce di riflessione di lunghezza d’onda più corta causata dalla luce di emissione. Il sensore è collegato al computer di controllo con una fibra di circa 30 cm di lunghezza.

In una variante del biosensore abbiamo utilizzato un sistema di fluorescenza più complesso, modulabile come luce di eccitazione, in modo da permettere di utilizzare come biomediatore organismi fotosintetici che richiedono particolari lunghezze d’onda.

e) un computer di controllo ed elaboratore dei dati. I parametri chiave della fluorescenza Fo, Fm, Fv ed il rapporto Fv/Fm, l’area sovrastante la curva di fluorescenza A (vedi Tabella 1), il tempo Tm per raggiungere la fluorescenza massima sono calcolati automaticamente ed appaiono sul monitor a cristalli liquidi. La concentrazione dell’erbicida è proporzionale all’area sovrastante la curva di fluorescenza (Tabella 1A-B); la inibizione di tale area dipende strettamente dai tempi di lavaggio per cui è possibile determinare la concentrazione erbicida anche utilizzando il tempo di lavaggio necessario per ottenere una inibizione pressoché completa dell’area (vedi Tabella 1C). Il segnale di fluorescenza ricevuto dal sensore è trattato nella camera di controllo usando sistemi di trasduzione del segnale e convertitori analogicodigitali. Il sistema è computerizzato con un microprocessore molto sofisticato in grado di analizzare i dati del segnale di fluorescenza. Il sistema elettronico è quindi assemblato in un portatile per facilitare al massimo gli spostamenti in situ e per consentirne l’uso da parte di personale non specializzato. Il Bioherbi è inoltre provvisto di un caricatore di batterie a lunga durata, con protezione interna dei dati in caso di batterie scariche.

f) il sistema è munito di temporizzatore per le misure in automatico della fluorescenza in stopped-flow. Il temporizzatore (0 - 60 min) abilita in contemporanea sia il sistema per bloccare il flusso e permettere la lettura della fluorescenza in stopped-flow che un ritardatore (0 - 60 sec) che, successivamente alla condizione di stopped-flow, abilita l’attuatore di impulso di fluorescenza

Vantaggi in paragone con ie altre tecniche ed altri biosensori

Correntemente tre tecniche sono impiegate per rivelare gli erbicidi: tecniche in HPLC, in GC-MS ed ELISA. Le tecniche in HPLC ed in GC-MS rappresentano metodi di routine affidabili ma che hanno lo svantaggio di richiedere equipaggiamenti costosi, quantità notevoli sia di matrice da analizzare che di solventi organici, a loro volta potenzialmente nocivi per l' ambiente,. Inoltre è necessario trattare e preconcentrare la matrice prima dell’analisi, limitando di fatto il numero di analisi giornaliere (Chimica analitica strumentale, Eds Skoog and Leary, Saunders College Publishing, Orlando, ISBN 88 7959 0669). Un metodo immunologico recentemente sviluppato (ELISA) ha elevata sensibilità (2 x 10<-10 >M per diuron; 1 x 10<10 >M per atrazina) ma coinvolge preparazione di anticorpi monoclonali costosi che a loro volta devono essere preparati con uso di prodotti chimici potenzialmente dannosi e sacrificio di animali da laboratorio. Inoltre gli anticerpi monoclonali sono specifici per un composto singolo e non per classi, come più largamente richiesto (P Schneider, MH Goodrow, SJ Gee, BDHammock, 1994, J Agricultural Food Chemistry, 42, 413-422)

Rispetto ai sistemi a biosensori precedentemente realizzati (per una review sull’argomento vedi JL Marty, D Garcia, R Rouillon, Trends in Analytical Chemistry, 14, 329-332) la strumentazione oggetto di questa invenzione ha molteplici vantaggi ed originalità:

- richiede una quantità minima di organismo fotosintetico (pochi microgrammi in termini di contenuto di clorofilla);

- permette di distinguere le sotto classi di erbicidi;

- utilizza un biomediatore immobilizzato e stabile nel tempo;

- è rigenerabile dopo ogni misura per due giorni;

- unisce più qualità: alta sensibilità, specificità e facilità d’uso;

- non necessita di personale tecnico altamente specializzato;

- richiede scarsa manutenzione rispetto p.e. al sistema di trasduzione elettrodo di Clark (M Koblizek, J Masojidek, J Komenda, T Kucera, R Pilloton, A Mattoo, MT Giardi, 1998, Biotechnology and Bioengineering, 60, 664-669), ed a parità di sensibilità, non richiede lunghi tempi di messa a regime del sistema;

- la presente invenzione è sicuramente più maneggevole essendo un portatile di solo 6 Kg contro i 30 Kg del sistema precedentemente realizzato (M Koblizek, J Masojidek, J Komenda, T Kucera, R Pilloton, A Mattoo, MT Giardi, 1998, Biotechnology and Bioengineering, 60, 664-669);

- l’invenzione è portatile e computerizzata;

- misura l’area sovrastante la curva di fluorescenza mentre in precedenti sistemi biosensori viene attuata una cinetica di innalzamento della fluorescenza nell’arco di secondi che richiede una apparecchiatura di misura più complessa ed accurata (D Merz, M Geyer, M Moss, DA Anche, 1996, Fresenius J Analitical Chemistry 354, 299-305)

Il trovato verrà meglio compreso seguendo la descrizione e la unita foto (Fig.3). E’ inteso che la foto non mostra che una esemplificazione data solo quale dimostrazione pratica del trovato, potendo detto trovato variare nelle forme a disposizione dipendendo dal tipo di immobilizzazione che si e’ fatta del biomediatore senza peraltro uscire dall’ambito del concetto che informa il trovato stesso. Sono possibili differenti assemblamenti del “Bioherbi” che possono prevedere l’uso in successione od in contemporanea di differenti biomediatori immobilizzati e sensibili alle diverse sottoclassi di erbicidi. Nel primo caso (vedi Fig. 4A) e solo dopo risposta positiva alla presenza di erbicidi (per esempio vedi Tabella 1D), il corpo contenete il biomediatore immobilizzato viene sostituito con altri corpi contenenti biomediatori immobilizzati specifici e resistenti alle differenti sottoclassi. Nel secondo caso più celle di misura, contenenti ognuna uno specifico biomediatore immobilizzato, sono posizionate in serie. La soluzione da analizzare contenente l’erbicida passa attraverso le varie celle, mentre il lettore di fluorescenza viene spostato da una cella alla successiva (Fig. 4B).

Nel terzo caso (Fig. 4C) caso più celle di misura, contenenti ognuna uno specifico biomediatore immobilizzato, sono posizionate in parallelo. La soluzione da analizzare contenente l’erbicida passa attraverso una valvola a più vie che alimenta singolarmente le celle di lettura e dopo risposta positiva al biomediatore “wild-type” sposta in automatico il flusso alla successiva cella per la identificazione delle sottoclassi.

I risultali ottenuti permettono di prevedere un utilizzo pratico di tale sistema biosensore basato sul PSII; infatti le tecnologie per la analisi ambientale che consentono la misurazione e nello stesso tempo non causino inquinamento sono meglio rispondenti a quanto richiesto da normative sempre più restrittive

Claims

Rivendicazioni 1. Dispositivo biosensore con cella a flusso collegato ad un sensore di fluorescenza per la rilevazione della presenza di erbicidi, tramite la misura della variazione della attività di fluorescenza.
2. Dispositivo biosensore con cella di lettura contenente un biomediatore opportunamente immobilizzato per determinare la presenza e concentrazione di erbicidi.
3. Metodo di stabilizzazione di estratti di organismi fotosintetici per trattamento ad alta temperatura 4. Metodo di stabilizzazione di estratti di organismi fotosintetici per cross-linking con soluzione di CdCl2 o analoghi sali di metalli pesanti (Zn<2+>, etc.). 5. Metodo di stabilizzazione di estratti di organismi fotosintetici per combinazione delle rivendicazioni 3 e 4. 6. Metodo di stabilizzazione di estratti di organismi fotosintetici per adsorbimento su setto poroso di matrice vetrosa. 7. Metodo di stabilizzazione di estratti di organismi fotosintetici per combinazione delle rivendicazioni 3, 4 e 6. 8. Uso di mutanti di organismi fotosintetici nella rivendicazione 3. 9. Uso di mutanti di organismi fotosintetici nella rivendicazione 4. 10. Uso di mutanti di organismi foto sintetici nella rivendicazione 5. 11. Uso di mutanti di organismi fotosintetici nella rivendicazione 6. 12. Uso di mutanti di organismi fotosintetici nella rivendicazione 7. 13. Procedimento per la rilevazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, articolato nell’insieme delle seguenti fasi: - realizzazione di un biomediatore a partire da estratti di qualsivoglia organismo fotosintetico. - immobilizzazione del biomediatore (secondo le rivendicazione da 3 a 7) su di un blocco intercambiabile ed a tenuta dotato di setto poroso; - inserimento del blocco intercambiabile nella cella a flusso costituita da materiale plastico opaco; - collegamento della cella a flusso con un sensore di fluorescenza a LED; - collegamento della cella a flusso ad una pompa peristaltica che attua il movimento 1) del campione contenente l’erbicida e 2) del tampone di lavaggio e rigenerazione del biomediatore; - collegamento della pompa peristaltica ad un attuatore temporizzatore per la lettura della fluorescenza in stopped-flow; - collegamento della pompa peristaltica ai contenitori della soluzione da analizzare e della soluzione tampone di lavaggio e rigenerazione del biomediatore ed alla corrispondente valvola manuale od automatica per la alimentazione separata delle soluzioni; - collegamento del sensore di fluorescenza a LED ad un analizzatore - misuratore di fluorescenza tramite un fibra ottica; - invio del segnale luminoso tramite sensore di fluorescenza sul biomediatore; - collegamento del sensore di fluorescenza ad un attuatore per dare l’impulso luminoso a tempo e collegamento di questo attuatore ad un ritardatore guidato dal temporizzatore del sistema a stopped-flow, per dare l’impulso luminoso dopo un tempo ottimale dall’ inizio del blocco di flusso; - lettura con metodi elettronici del valore di fluorescenza; - analisi dei dati di fluorescenza con sistema computerizzato; - lavaggio, tramite pompa peristaltica, del biomediatore e sua rigenerazione con adatta soluzione tampone dopo la lettura di fluorescenza. 14. Procedimento per la rilevazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, articolato nell'insieme delle fasi come nella rivendicazione 13, ma utilizzando mutanti di organismi fotosintetici. 15. Procedimento per la rilevazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, articolato nell'insieme delle fasi come nella rivendicazione 13, ma utilizzando cellule intatte di organismi fotosintetici. 16. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi un sensore con emissione di luce non a LED. 17. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi un sistema a depressione per la movimentazione dei liquidi. 18. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi una pompa proporzionale a pistone biocompatibile. 19. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi un sistema di interruzione del flusso non elettronico. 20. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi un sistema di rilevazione ed analisi dei dati non elettronico. 21. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi un sistema di fluorescenza a lunghezza d’onda di eccitazione modificabile. 22. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi una cella di lettura con il blocco, contenente il biomediatore, intercambiabile. 23. Procedimento per la rivelazione della presenza di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto secondo le rivendicazioni 13, 14 o 15, che utilizzi una cella di lettura contenente in contemporanea diversi biomediatori immobilizzati posizionati su di un blocco rotante, a tenuta idraulica, sotto un sensore di fluorescenza. 24. Procedimento impostato come nella rivendicazione 23 ma con il sensore di fluorescenza posizionato su di un blocco rotante a tenuta. 25. Procedimento impostato come nelle rivendicazione 23 e 24 ma utilizzante una valvola a più vie per lo smistamento manuale od automatico dei flussi di soluzione di erbicida o di soluzione tampone di lavaggio e rigenerazione. 26. Procedimento per la rivelazione di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto per combinazione delle rivendicazioni 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 27. Procedimento per la rivelazione di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto per combinazione delle rivendicazioni 23, 24, 26. 28. Procedimento per la rivelazione di erbicidi, tramite sistema biosensoriale, condotto per combinazione delle rivendicazioni 25 e 27. 29. Inserimento di sistema automatico per fissare tempi di flusso dell’erbicida e tempi di Lavaggio 30. Estensione del sistema biosensore per l' analisi degli erbicidi nel suolo tramite applicazione di uno step di estrazione dell’erbicida. Tabella 1. Risposta del biosensore agli erbicidi in funzione del biomediatore e dei tempi di contatto A

Biomediatore tilacoidi di Vida faba immobilizzati su filtro poroso (G3) estratti con tampone contenente BSA 0.4%. Tempo di contatto 20min in flusso di soluzione contenente erbicida. I valori riportati sono una media di almeno 3 misure (SE circa 15%). Il valore % di inibizione è stato ricavato dal rapporto tra la differenza delle aree del controllo e in presenza di erbicida e l’area ottenuta per il controllo riportato in percento. B

Biomediatore tilacoidi di S pinacia oleracea. Tempo di contatto 15 min in flusso di soluzione contenente erbicida. c

Biomediatore tilacoidi di Spinacea oleracea. Misure effettuate in tempi successivi di flusso di erbicida. Le misure sono una media di almeno tre analisi, ES circa 10%. D % Inibizione dell’area

Biomediatore tilacoidi di Amaranthus retroflexus, concentrazione erbicida IO<-6 >M, tempo di flusso 20 min. Le misure sono una media di almeno tre analisi, ES circa 16%.