ITPV20100009A1

ITPV20100009A1 - MULTIPARAMETRIC DETECTION IN SUSPENSION FOR NUCLEOTID SEQUENCES

Info

Publication number: ITPV20100009A1
Application number: IT000009A
Authority: IT
Inventors: Luca Lova
Original assignee: Luca Lova
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-01-16

Description

DESCRIZIONE STORICO TECNOLOGICA E STATO DELL'ARTE TECHNOLOGICAL HISTORICAL DESCRIPTION AND STATE OF THE ART

Numerose applicazioni in biologia molecolare si occupano da molti anni della rilevazione di specifiche sequenze di DNA e RNA. L'analisi del DNA si è affermata come metodo d'indagine sia in campo clinico sia nella diagnostica di un numero sempre maggiore di malattie genetiche. Un settore ancora più promettente per le applicazioni attese in medicina è quello della diagnostica molecolare genetica con l'individuazione dei così detti "SNPs", singole mutazioni polimorfiche in geni coinvolti nel possibile sviluppo delle patologie comuni, le quali solitamente vedono il coinvolgimento di molti geni. L'identificazione di specifiche sequenze di DNA si realizza dagli anni novanta attraverso la reazione a catena della polimerasi o PCR. Numerous applications in molecular biology have been dealing with the detection of specific DNA and RNA sequences for many years. DNA analysis has established itself as a method of investigation both in the clinical field and in the diagnosis of an increasing number of genetic diseases. An even more promising sector for the expected applications in medicine is that of genetic molecular diagnostics with the identification of the so-called "SNPs", single polymorphic mutations in genes involved in the possible development of common diseases, which usually involve many genes . The identification of specific DNA sequences has been carried out since the 1990s through the polymerase chain reaction or PCR.

Nell'ultimo ventennio questa tecnologia ha portato allo sviluppo della PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), questo è un metodo d'amplificazione e quantificazione del DNA. In the last twenty years this technology has led to the development of real-time PCR, also called quantitative PCR or quantitative real-time PCR (rtq-PCR), this is a method of amplification and quantification of DNA.

I metodi comuni di quantificazione annessi alla RT-PCR includono l'uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio-filamento (ds) e gli oligonucleotidi modificati del DNA (denominati sonde) fluorescenti una volta ibridati al frammento di DNA. La valutazione quantitativa dell'acido nucleico è affidata alla rilevazione e alla conseguente quantificazione di un "reporter" fluorescente, il cui segnale cresce in maniera proporzionale alla quantità di prodotto di PCR che si forma durante la reazione. Per sviluppare un'analisi quantitativa in PCR, sono richiesti diversi passaggi. Questi includono: la produzione di filamenti stampo puliti, la progettazione di primers e l'ottimizzazione degli stati di reazione. Common quantification methods related to RT-PCR include the use of fluorescent stains that intercalate with double-stranded (ds) DNA and modified fluorescent DNA oligonucleotides (called probes) once hybridized to the DNA fragment. The quantitative evaluation of the nucleic acid is entrusted to the detection and consequent quantification of a fluorescent "reporter", whose signal grows in proportion to the amount of PCR product formed during the reaction. To develop a quantitative PCR assay, several steps are required. These include: the production of clean mold filaments, the design of primers and the optimization of reaction states.

L'utilizzo di sonde rivelatrici di fluorescenza è il più accurato e il più affidabile dei metodi oggi in uso, ma anche il più costoso. Il limite della re al time PCR è quello di offrire alti livelli di sensibilità ma non la possibilità di produrre risultati multipli. Particolare attenzione va fatta per la rilevazione di sequenze di RNA. L' espressione comparativa dell'RNA è considerata da tempo un indice molecolare per numerose patologie nell'uomo. Per tale applicazione la PCR real-time è combinata con la PCR Retro Trascrizionale (RT-PCR) per quantificare i livelli d'espressione di specifici RNA: la retro-trascrizione (o trascrizione inversa) produce del DNA complementare a singolo filamento detto cDNA (complementary DNA) mantenendo inalterati i rapporti relativi di concentrazione delle diverse The use of fluorescence detector probes is the most accurate and most reliable of the methods in use today, but also the most expensive. The king's limit to time PCR is to offer high levels of sensitivity but not the ability to produce multiple results. Particular attention should be paid to the detection of RNA sequences. Comparative expression of RNA has long been considered a molecular index for numerous human pathologies. For this application, real-time PCR is combined with Retro Transcriptional PCR (RT-PCR) to quantify the expression levels of specific RNA: retro-transcription (or reverse transcription) produces complementary single-stranded DNA called cDNA ( complementary DNA) while maintaining the relative concentration ratios of the different ones

Una tecnica sviluppata negli anni '90 permette l'analisi dell'espressione genica monitorando in un solo processo gli RNA prodotti da migliaia di geni. Questa tecnologia è detta Microarray e ha fin ora permesso l'identificazione di profili d'espressione genica. Un microarray è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array. Tali array sono usati per esaminare parallelamente il profilo d'espressione di differenti geni nel medesimo saggio 0 per identificare la presenza di uno o più geni in una selezione variabilmente assortita (spesso anche su tutto il patrimonio genetico di un individuo umano). A technique developed in the 1990s allows the analysis of gene expression by monitoring the RNAs produced by thousands of genes in a single process. This technology is called Microarray and has so far allowed the identification of gene expression profiles. A microarray consists of a collection of microscopic DNA probes attached to a solid surface such as glass, plastic, or silicon chips forming an array. Such arrays are used to simultaneously examine the expression profile of different genes in the same assay or to identify the presence of one or more genes in a variably assorted selection (often even across the entire genetic heritage of a human individual).

1 microarray di espressione sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, consiste cioè nel fissare le sonde di ibridazione su un supporto e nel marcare invece l'acido nucleico target. Per rilevare gli mRNA con questa tecnica, questi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cDNA, con l'uso di un enzima chiamato transcrittasi inversa e marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cDNA target, quest'ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato. The expression microarrays exploit a reverse hybridization technique, that is, it consists in fixing the hybridization probes on a support and instead marking the target nucleic acid. To detect mRNAs with this technique, they are first extracted from the cells, converted into cDNA, with the use of an enzyme called reverse transcriptase, and labeled with a fluorescent probe. When hybridization occurs between the probe on the matrix and the target cDNA, the target cDNA will remain bound to the probe and can be identified simply by detecting the location where it remained bound.

Altre applicazioni dei microarray sono l'analisi dei polimorfismi SNP, il confronto di popolazioni di RNA di cellule diverse e l'utilizzo per nuove metodologie di sequenziamento del DNA, non che per lo screening di sequenze senso e antisenso nella ricerca degli oligonucleotidi usati in campo farmaceutico. Other applications of microarrays are the analysis of SNP polymorphisms, the comparison of RNA populations of different cells and the use for new DNA sequencing methodologies, as well as for the screening of sense and antisense sequences in the search for oligonucleotides used in the field. pharmaceutical.

La misura dell'espressione genica mediante microarrays ha un notevole interesse sia nel campo della ricerca di base che nella diagnostica medica, in particolare di malattie a base genetica, dove l'espressione genetica di cellule sane viene comparata con quella di cellule affette dalla malattia in esame. Questa tecnologia ha di molto migliorato lo studio dei livelli d'espressione genica che erano tradizionalmente misurati con tecniche quali il Northern blot. Tuttavia questa tecnologia presenta alcuni limiti di sensibilità per la produzione di un alto numero di falsi positivi, inoltre i costi di questa tecnica sono molto elevati. Un ulteriore problema per l'applicazione nella routine diagnostica è la mancanza di standardizzazione statistica negli arrays che presenta un problema interoperativo di tipo bioinformatico, che non può far prescindere dallo scambio di dati ottenuti con tale tecnica. The measurement of gene expression using microarrays is of considerable interest both in the field of basic research and in medical diagnostics, in particular of genetic-based diseases, where the genetic expression of healthy cells is compared with that of cells affected by the disease in exam. This technology has greatly improved the study of gene expression levels that were traditionally measured with techniques such as Northern blot. However this technology has some sensitivity limits for the production of a high number of false positives, moreover the costs of this technique are very high. A further problem for the application in the diagnostic routine is the lack of statistical standardization in the arrays which presents an interoperative problem of a bioinformatics type, which cannot disregard the exchange of data obtained with this technique.

Il microarray è stato sviluppato anche in sospensione: questa è una tecnica che permette l'analisi simultanea di fino a 100 differenti biomolecole (proteine, peptidi o acidi nucleici) in un piccolo volume di campione biologico. Questo tecnologia si basa sull'utilizzo di microsfere di polistirene (del diametro di 5,6 pm) a cui viene legato per il rilevamento delle sequenze nucleotidiche una sonda specifica per la molecola di acido nucleico che si vuole quantificare. La sequenza bersaglio viene poi ibridata con una sonda fluorescente. Le microsfere sono coniugate a 2 fluorocromi in concentrazioni diverse, tali da identificare fino a 100 diverse regioni in un grafico bidimensionale grazie al software connesso alla strumentazione citometrica. Le microsfere sono aspirate da un ago e portate nella camere di lettura dove vengono fatte passare una ad una e colpite da 2 laser: uno riconosce la regione della microsfera andando ad eccitare i 2 fluorocromi che la determinano, e quindi identificando la relativa sequenza a lei legata, mentre l'altro laser quantifica perché eccita il fluorocromo legato alla sequenza nucleotidica. The microarray has also been developed in suspension: this is a technique that allows the simultaneous analysis of up to 100 different biomolecules (proteins, peptides or nucleic acids) in a small volume of biological sample. This technology is based on the use of polystyrene microspheres (with a diameter of 5.6 µm) to which a specific probe for the nucleic acid molecule to be quantified is linked for the detection of nucleotide sequences. The target sequence is then hybridized with a fluorescent probe. The microspheres are conjugated to 2 fluorochromes in different concentrations, such as to identify up to 100 different regions in a two-dimensional graph thanks to the software connected to the cytometric instrumentation. The microspheres are aspirated by a needle and taken to the reading chamber where they are passed one by one and hit by 2 lasers: one recognizes the region of the microsphere going to excite the 2 fluorochromes that determine it, and then identifying the relative sequence to it. bound, while the other laser quantifies because it excites the fluorochrome bound to the nucleotide sequence.

I campi d'applicazione comprendono la selezione delle malattie genetiche ereditarie, la profilazione dell'espressione genica, nell'identificazione dei "Single Nucleotide Polymorphism (SNP)", la tipizzazione dell'HLA DNA e la rilevazione microbica. Fields of application include the selection of inherited genetic diseases, gene expression profiling, identification of "Single Nucleotide Polymorphism (SNP)", HLA DNA typing and microbial detection.

INNOVAZIONE E VANTAGGIO TECNOLOGICO DELL'INVENZIONE INNOVATION AND TECHNOLOGICAL ADVANTAGE OF THE INVENTION

1) L'invenzione permette, in concomitanza con alcuni metodi di amplificazione e/o isolamento delle sequenze genomiche descritti in letteratura, di realizzare per alcune applicazioni la rilevazione delle sequenze nucleotidiche senza l'utilizzo della strumentazione per la PCR, rendendo tali applicazioni appetibili in centri diagnostici dove il laboratorio di biologia molecolare non è presente. Tra queste la rilevazione d'infezioni batteriche e virali, e la rilevazione di acidi nucleici di fusione come BCR-ABL e PML RARa che sono un indicatore diagnostico molto utilizzato poiché portano alla formazione di proteine di fusione e il conseguente insorgere di patologie oncoematologiche. 1) The invention allows, in conjunction with some amplification and / or isolation methods of the genomic sequences described in the literature, to realize for some applications the detection of nucleotide sequences without the use of PCR instrumentation, making these applications attractive in diagnostic centers where the molecular biology laboratory is not present. These include the detection of bacterial and viral infections, and the detection of fusion nucleic acids such as BCR-ABL and PML RARa which are a widely used diagnostic indicator as they lead to the formation of fusion proteins and the consequent onset of oncohematological pathologies.

2) Il processo d'ibridazione che l'invenzione realizza in assenza dell'ingombro sterico della microparticella con l'approccio descritto nelle rivendicazioni dell'invenzione al punto 1-a permette di ottimizzare i tempi e l'efficienza della reazione d'ibridazione rispetto allo stato dell'arte. 2) The hybridization process that the invention carries out in the absence of the steric hindrance of the microparticle with the approach described in the claims of the invention at point 1-a allows to optimize the times and efficiency of the hybridization reaction with respect to state of the art.

3) Con l'approccio descritto nelle rivendicazioni dell'invenzione al punto 1-a: la procedura d'ibridazione da parte della sonda fluorocromo coniugata e della sonda biotina coniugata può avvenire in contemporanea riducendo i tempi e le condizioni di trattamento della metodica allo stato dell'arte. 3) With the approach described in the claims of the invention at point 1-a: the hybridization procedure by the conjugated fluorochrome probe and the conjugated biotin probe can take place simultaneously, reducing the treatment times and conditions of the method. of art.

4) La reazione streptavidina-biotina descritta nelle rivendicazioni dell'invenzione nel punto 2-a è una delle interazioni più efficienti nei sistemi biologici e qui ottimizza l'interazione tra la microparticella e il complesso costituito dalla sequenza bersaglio -sonda biotinilata - sonda fluorocromo coniugata. 4) The streptavidin-biotin reaction described in the claims of the invention in point 2-a is one of the most efficient interactions in biological systems and here it optimizes the interaction between the microparticle and the complex constituted by the target sequence - biotinylated probe - conjugated fluorochrome probe .

5) La preincubazione della sonde d'ibridazione biotinilate con le microparticelie streptavidinate descritta nelle rivendicazioni dell'invenzione al punto 3-a permette una versatilità di combinazioni tra le sequenze da rilevare e le microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza, gestibile dall'operatore. 5) The pre-incubation of the biotinylated hybridization probes with the streptavidinated microparticles described in the claims of the invention at point 3-a allows a versatility of combinations between the sequences to be detected and the microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics, manageable by the operator.

6) L'utilizzo di sonde fluorocromo marcate di due o più differenti colori, per la rilevazione di più sequenze bersaglio su di un'unica tipologia di microparticella descritto nelle rivendicazioni dell'invenzione nei punti 2-a, 2-b, 2-c, permette un approccio innovativo di sistema offrendo un rapporto quantitativo tra l'espressione delle differenti sequenze nucleotidiche bersaglio sulla stessa microparticella. Tale condizione prevede l'impiego di quattro o più fluorocromi e coinvolge l'impiego di un citofluorimetro con l'opzione multicolor. L'invenzione permette quindi di realizzare il rilevamento degli acidi nucleici in citometria a flusso sfruttando l'intera potenzialità della strumentazione citofluorimetrica di ultima generazione. 6) The use of fluorochrome probes marked with two or more different colors, for the detection of several target sequences on a single type of microparticle described in the claims of the invention in points 2-a, 2-b, 2-c , allows an innovative system approach by offering a quantitative relationship between the expression of the different target nucleotide sequences on the same microparticle. This condition involves the use of four or more fluorochromes and involves the use of a flow cytometer with the multicolor option. The invention therefore allows to carry out the detection of nucleic acids in flow cytometry by exploiting the full potential of the latest generation flow cytometric instrumentation.

7) L'invenzione permette di realizzare contemporaneamente la rilevazione multiparametrica descritta nelle rivendicazioni dell'invenzione al punto 2 e l'analisi di sequenze multiple su sistema di microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza descritta nelle rivendicazioni dell'invenzione al punto 3, tale condizione permette di amplificare il numero di sequenze rilevabili in un unico test rispetto la tecnologia esistente. 7) The invention makes it possible to simultaneously carry out the multiparametric detection described in the claims of the invention at point 2 and the analysis of multiple sequences on a system of microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics described in the claims of the invention at point 3, this condition allows to amplify the number of detectable sequences in a single test with respect to existing technology.

DESCRIZIONE TECNICA DELL'INVENZIONE TECHNICAL DESCRIPTION OF THE INVENTION

Il metodo proposto nell'invenzione è un sistema in grado realizzare un focus microarray in sospensione per sequenze nucleotidiche rilevabile mediante citometria a flusso secondo l'analisi multiparametrica. Il sistema di ibridazione è univoco per frammento di acido nucleico e sarà costituito da due differenti oligonucleotidi. La metodica prevede che la sequenza bersaglio è contemporaneamente ibridata da una sequenza costituita da una sonda biotinilata e da una seconda sequenza costituita da una sonda fluorocromo coniugata. Il passaggio successivo consiste nell'incubazione del complesso costituito dalla sequenza bersaglio ibridata dalla sonda fluorocromo coniugata e dalla sonda biotinilata con microparticelle streptavidina coniugate. L'interazione tra la molecola di biotina e la streptavidina coniugata alla microparticella permette di legare la stessa al complesso sequenza bersaglio - sonda fluorocromo coniugata - sonda biotinilata. La miscela dei complessi così costituiti è poi analizzata al citofluorimetro per misurarne i livelli di fluorescenza e la relativa presenza della sequenza bersaglio. The method proposed in the invention is a system capable of realizing a focus microarray in suspension for nucleotide sequences detectable by flow cytometry according to multiparametric analysis. The hybridization system is unique per nucleic acid fragment and will consist of two different oligonucleotides. The method provides that the target sequence is simultaneously hybridized by a sequence consisting of a biotinylated probe and a second sequence consisting of a conjugated fluorochrome probe. The next step consists in incubating the complex consisting of the hybridized target sequence from the conjugated fluorochrome probe and the biotinylated probe with conjugated streptavidin microparticles. The interaction between the biotin molecule and the streptavidin conjugated to the microparticle allows it to bind to the complex target sequence - conjugated fluorochrome probe - biotinylated probe. The mixture of the complexes thus constituted is then analyzed on a flow cytometer to measure the fluorescence levels and the relative presence of the target sequence.

Come caratteristica d'innovazione l'invenzione prevede un rilevamento delle sequenze nucleotidiche in analisi multiparametrica dove una miscela di più geni o di diverse specie mutazionali dello stesso gene sono incubate con una miscela di sonde biotinilate e sonde fluorocromo coniugate, tale per cui ogni combinazione di sonda biotinilata abbinata ad una sonda fluorocromo coniugata è complementare per il rilevamento di un'unica e specifica sequenza bersaglio presente nella miscela iniziale. L'incubazione della miscela contenente i complessi d'ibridazione con le microparticelle streptavidina coniugate permette la rilevazione multiparametrica di più sequenze su un'unica tipologia di microparticella in citofluorimetria. As an innovative feature, the invention provides for a detection of nucleotide sequences in multiparametric analysis where a mixture of several genes or of different mutational species of the same gene are incubated with a mixture of biotinylated probes and conjugated fluorochrome probes, such that each combination of biotinylated probe combined with a conjugated fluorochrome probe is complementary for the detection of a single and specific target sequence present in the initial mixture. The incubation of the mixture containing the hybridization complexes with the conjugated streptavidin microparticles allows the multiparametric detection of several sequences on a single type of microparticle in flow cytometry.

Per analisi di sequenze multiple su sistema di microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza l'invenzione offre la possibilità di preincubare e combinare composizioni di sonde biotinilate con tipologie di microparticelle streptavidinate differenziabili per caratteristiche di fluorescenza, in modo di costituire dei complessi sonde biotinilate - microparticella. Il processo d'ibridazione è quindi realizzato mediante incubazione delle sequenze bersaglio con le sonde fluorocromo coniugate e complessi sonde biotinilate - microparticella. La miscela di prodotti costituita da ogni rispettiva composizione: sequenze bersaglio - sonde fluorocromo coniugate - sonde biotinilate - microparticella streptavidinata è poi analizzata al citofluorimetro per determinare la presenza delle sequenze bersaglio. Graziea tale approccio l'invenzione permette di realizzare contemporaneamente la rilevazione multiparametrica e l'analisi di sequenze multiple su sistema di microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza permettendo di amplificare il numero di sequenze rilevabili in un unico test rispetto la tecnologia esistente. For the analysis of multiple sequences on a system of microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics, the invention offers the possibility of preincubating and combining compositions of biotinylated probes with types of streptavidinated microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics, in order to form complex biotinylated - microparticle probes. The hybridization process is then carried out by incubating the target sequences with conjugated fluorochrome probes and biotinylated - microparticle complexes. The product mix consisting of each respective composition: target sequences - conjugated fluorochrome probes - biotinylated probes - streptavidinated microparticle is then analyzed on a flow cytometer to determine the presence of the target sequences. Thanks to this approach, the invention allows to simultaneously carry out the multiparametric detection and the analysis of multiple sequences on a system of microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics, allowing to amplify the number of detectable sequences in a single test with respect to the existing technology.

Le componenti utilizzate per l'applicazione dell' invenzione quali: la sonda biotinilata, la sonda fluorocromo coniugata e le microparticelle streptavidina coniugate; sono prodotte secondo le normali procedure industriali allo stato dell'arte. The components used for the application of the invention such as: the biotinylated probe, the conjugated fluorochrome probe and the conjugated streptavidin microparticles; they are produced according to normal state-of-the-art industrial procedures.

FASI PRELIMINARI PER L'ISOLAMENTO DEGLI ACIDI NUCLEICI PRELIMINARY PHASES FOR THE ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS

I passaggi di preparazione della miscela di sequenze nucleotidiche bersaglio sono descritti a titolo di completezza ma non sono da considerarsi parte integrante di questo brevetto d'invenzione. The steps for preparing the mixture of target nucleotide sequences are described for completeness but are not to be considered an integral part of this invention patent.

II processo prevede alcuni trattamenti preliminari del campione per produrre le sequenze bersaglio: The process involves some preliminary treatments of the sample to produce the target sequences:

La prima fase di lavorazione del campione biologico consiste nell'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici, tali procedure possono avvenire seguendo i normali protocolli presenti in letteratura. The first phase of processing the biological sample consists in the extraction and purification of the nucleic acids, these procedures can be carried out following the normal protocols found in the literature.

Dopo la procedura di estrazione del DNA o dell'RNA per diverse esigenze è necessario scegliere diverse strategie per isolare e/o amplificare gli acidi nucleici, anche queste procedure possono avvenire seguendo i normali protocolli presenti in letteratura. After the DNA or RNA extraction procedure for different needs it is necessary to choose different strategies to isolate and / or amplify the nucleic acids, also these procedures can be performed following the normal protocols present in the literature.

L'invenzione è finalizzata a realizzare la rilevazione degli acidi nucleici nel laboratorio di citometria a flusso ed è applicabile anche a sistemi che escludono l'utilizzo della PCR e quindi l'intervento del laboratorio di biologia molecolare a livello della diagnostica o della ricerca applicata in citofluorimetria. The invention is aimed at realizing the detection of nucleic acids in the flow cytometry laboratory and is also applicable to systems that exclude the use of PCR and therefore the intervention of the molecular biology laboratory at the level of diagnostics or research applied in flow cytometry.

APPLICAZIONI PREVISTE INTENDED APPLICATIONS

I vari protocolli per la rilevazione di acidi nucleici sono sviluppati in maniera individuale per far fronte alle diverse sensibilità del sistema. La concentrazione dei reagenti, i tempi d'incubazione e la composizione dei tamponi d'ibridazione dipenderanno da fattori quali la lunghezza degli oligonucleotidi, e il numero di molecole presenti sulla superficie delle microparticelle. The various protocols for the detection of nucleic acids are developed individually to cope with the different sensitivities of the system. The concentration of the reagents, the incubation times and the composition of the hybridization buffers will depend on factors such as the length of the oligonucleotides, and the number of molecules present on the surface of the microparticles.

APPLICAZIONE PER IL RILEVAMENTO DI INFEZIONI VIRALI E BATTERICHE APPLICATION FOR THE DETECTION OF VIRAL AND BACTERIAL INFECTIONS

La presenza di RNA virale o batterico in campioni complessi come da estrazione di sangue è un dato non sempre facile da valutare, poiché la percentuale di acido nucleico esogeno si presenta in una quantità minima, non sempre tecniche quali PCR e RT-PCR hanno un'efficienza tale da rivelare tali percentuali. La soluzione potrebbe essere un'amplificazione isotermica del RNA (NASBA), questa reazione avviene a temperatura costante (412C) e permette di amplificare in maniera selettiva RNA esogeno quali virus e batteri, applicazioni in questo senso sono già state ampiamente descritte per patogeni quali Influenza A, Footand-mouth disease virus e Coronavirus associati a severe acute respiratory syndrome (SARS). The presence of viral or bacterial RNA in complex samples such as blood extraction is not always easy to evaluate, since the percentage of exogenous nucleic acid occurs in a minimal amount, techniques such as PCR and RT-PCR do not always have a efficiency such as to reveal these percentages. The solution could be an isothermal amplification of RNA (NASBA), this reaction takes place at constant temperature (412C) and allows to selectively amplify exogenous RNA such as viruses and bacteria, applications in this sense have already been widely described for pathogens such as Influenza A, Footand-mouth disease virus and Coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS).

Il metodo descritto nell'invenzione associato all'amplificazione isotermica del DNA permette un rapido diagnostico che sostituisce la PCR seguita da elettroforesi e la RT-PCR. L'approccio multiparametrico descritto nell'invenzione offre la possibilità di discriminare i vari ceppi virali e/o batterici valutandone i rapporti quantitativi. La rilevazione su sistema di microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza permette di condurre indagini per differenti infezioni virali e batteriche in singolo test. The method described in the invention associated with the isothermal amplification of DNA allows for rapid diagnostics which replaces PCR followed by electrophoresis and RT-PCR. The multiparametric approach described in the invention offers the possibility of discriminating the various viral and / or bacterial strains by evaluating their quantitative ratios. The detection on a system of microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics allows to conduct investigations for different viral and bacterial infections in a single test.

APPLICAZIONE PER IL RILEVAMENTO DI ACIDI NUCLEICI DI FUSIONE APPLICATION FOR THE DETECTION OF MELTING NUCLEIC ACIDS

La presenza di mRNA codificanti per proteine di fusione come BCR-ABL e PML RARa sono un indicatore diagnostico molto utilizzato. Caratteristica di questi mRNA è la presenza contemporanea di mRNA ibrido proveniente da geni distinti "fusi" insieme da un evento di riarrangiamento cromosomico, traslocazioni, inserzioni o delezioni. Per rilevare la presenza di questi particolari acidi nucleici la tecnica più diffusa oggi è la PCR seguita da elettroforesi. The presence of mRNAs encoding fusion proteins such as BCR-ABL and PML RARa are a widely used diagnostic indicator. Characteristic of these mRNAs is the simultaneous presence of hybrid mRNA from distinct genes "fused" together by an event of chromosomal rearrangement, translocations, insertions or deletions. To detect the presence of these particular nucleic acids, the most common technique today is PCR followed by electrophoresis.

Per questa applicazione è necessario ottenere una quantità sufficiente di DNA (1-5 ug) e effettuare una frammentazione delio stesso per calore o sonicazione, successivamente si procede alla ibridazione del DNA secondo il metodo descritto nell'invenzione. La sonda biotinilata e la sonda fluorocromo coniugata saranno disegnate rispettivamente sui due differenti geni codificanti per la proteina di fusione. L'applicazione della rilevazione multiparametrica permette in questa applicazione di rilevare i differenti prodotti di riarrangiamento genico caratteristici delle patologie e i rapporti quantitativi tra questi. For this application it is necessary to obtain a sufficient quantity of DNA (1-5 ug) and carry out a fragmentation of the same by heat or sonication, subsequently the DNA hybridization is carried out according to the method described in the invention. The biotinylated probe and the conjugated fluorochrome probe will be drawn respectively on the two different genes coding for the fusion protein. The application of multiparametric detection allows in this application to detect the different products of gene rearrangement characteristic of the pathologies and the quantitative relationships between them.

RILEVAMENTO ESPRESSIONE GENICA GENE EXPRESSION DETECTION

La possibilità di discriminare la co-espressione per differenti trascritti in un unico test è uno dei punti di forza di tecniche quali il Microarray, il problema di questi ultimi è la necessità di possedere attrezzature dedicate quali scanner, stazioni d'ibridazione e, nel caso si voglia creare Microarray dedicati, costosi equipaggiamenti quali gli spotters (con personale preparato al loro utilizzo). Una tecnica in grado di eseguire un'analisi parallela d'espressione genica aiuterebbe un veloce sviluppo di test diagnostici anche in laboratori non equipaggiati per la creazione di microarray. The possibility of discriminating the co-expression for different transcripts in a single test is one of the strengths of techniques such as Microarray, the problem of the latter is the need to have dedicated equipment such as scanners, hybridization stations and, in the case you want to create dedicated Microarrays, expensive equipment such as spotters (with personnel trained for their use). A technique capable of performing parallel gene expression analysis would help rapid development of diagnostic tests even in laboratories not equipped for the creation of microarrays.

La presenza della molecola di mRNA è evidenziata dalla doppia ibridazione e associata poi alla microparticella come descritta nell'invenzione. La rilevazione multiparametrica descritta nell'invenzione permette di evidenziare particolari splicing alternativi di interesse. La possibilità di utilizzare sonde marcate con differenti fluorocromi permette inoltre un'analisi quantitativa dell'espressione rispettivamente tra campioni e controlli. In questo caso la tecnica suggerita per il trattamento degli acidi nucleici è un'amplificazione lineare di tutto il corredo di RNA messaggero. The presence of the mRNA molecule is evidenced by the double hybridization and then associated with the microparticle as described in the invention. The multiparametric detection described in the invention allows to highlight particular alternative splicings of interest. The possibility of using probes labeled with different fluorochromes also allows a quantitative analysis of the expression between samples and controls, respectively. In this case the suggested technique for the treatment of nucleic acids is a linear amplification of the whole messenger RNA kit.

L'utilizzo di sonde fluorocromo marcate di differenti colori per la rilevazione degli splicing alternativi permette un approccio innovativo offrendo un rapporto quantitativo tra i differenti prodotti di splicing sulla stessa biglia, tale condizione prevede l'impiego di quattro o più fluorocromi e coinvolge l'impiego di un citofluorimetro con l'opzione multicolor. Quest'applicazione in rilevazione multiparametrica associatà al rilevamento su sistema di microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza, come descritto nell'invenzione, aumenta il numero di prodotti d'espressione rilevabili in un unico test. The use of fluorochrome probes marked with different colors for the detection of alternative splicing allows an innovative approach by offering a quantitative relationship between the different splicing products on the same ball, this condition involves the use of four or more fluorochromes and involves the use of a flow cytometer with the multicolor option. This application in multiparametric detection combined with the detection on a system of microparticles differentiable by fluorescence characteristics, as described in the invention, increases the number of expression products detectable in a single test.

RILEVAMENTO SNPS SNPS DETECTION

Un polimorfismo a singolo nucleotide (spesso definito in inglese Single Nucleotide Polymorphism o SNP) è una variazione a livello di una sequenza di acidi nucleici che si presenta tra individui della stessa specie, caratterizzata da una differenza a carico anche di un unico nucleotide. Lo studio degli SNPs è molto utile poiché variazioni anche di singoli nucleotidi possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta a patogeni, agenti chimici, farmaci. Per tale motivo gli SNPs hanno una grande importanza nello sviluppo di nuovi farmaci e nella diagnostica, in quanto consentono di conoscere l'effetto che può avere un farmaco su un individuo ancor prima della somministrazione, attraverso una selezione degli SNPs presenti nel gene responsabile della metabolizzazione del farmaco stesso; su questo principio si basa la farmacogenomica. Poiché gli SNPs sono perlopiù ereditati di generazione in generazione, essi sono utilizzati in alcuni studi genetici. Interessante inoltre è l'associazione tra alcuni particolari modelli di SNPs con patologie complesse quali obesità e infertilità. L'approccio proposto nell'invenzione permette non tanto di eludere il problema dell'amplificazione in PCR quanto di poter rivelare contemporaneamente la presenza di differenti SNP senza utilizzare ancora una volta la tecnologia Microarray. La sonda biotinilata in questo caso riconosce la zona limitrofa al polimorfismo, mentre la sonda fluorocromo coniugata ha il ruolo di differenziare l'allele presente nel genoma. Grazie all'innovazione introdotta dall'invenzione: per ogni sequenza si ha la possibilità di legare sonde coniugate con fluorocromi differenti (Es. polimorfismo ancestrale e variante), permettendo di analizzare in maniera quantitativamente confrontabile una famiglia di SNPs selezionati sulla stessa tipologia di microparticeila. Questa applicazione multiparametrica associatà al rilevamento su sistema di microparticelle differenziabili per caratteristiche di fluorescenza, come descritto nell'invenzione, aumenta il numero di SNPs rilevabili in un unico test. A single nucleotide polymorphism (often defined in English Single Nucleotide Polymorphism or SNP) is a variation at the level of a nucleic acid sequence that occurs between individuals of the same species, characterized by a difference in even a single nucleotide. The study of SNPs is very useful since variations of even single nucleotides can influence the development of pathologies or the response to pathogens, chemicals, drugs. For this reason, SNPs have a great importance in the development of new drugs and in diagnostics, as they allow to know the effect that a drug can have on an individual even before administration, through a selection of the SNPs present in the gene responsible for metabolization. the drug itself; pharmacogenomics is based on this principle. Since SNPs are mostly inherited from generation to generation, they are used in some genetic studies. Also interesting is the association between some particular models of SNPs with complex pathologies such as obesity and infertility. The approach proposed in the invention allows not so much to circumvent the problem of amplification in PCR as to be able to simultaneously detect the presence of different SNPs without once again using the Microarray technology. In this case, the biotinylated probe recognizes the area adjacent to the polymorphism, while the conjugated fluorochrome probe has the role of differentiating the allele present in the genome. Thanks to the innovation introduced by the invention: for each sequence it is possible to link conjugated probes with different fluorochromes (e.g. ancestral and variant polymorphism), allowing to analyze in a quantitatively comparable way a family of SNPs selected on the same type of microparticle. This multiparametric application associated with the detection on a system of microparticles differentiable by fluorescence characteristics, as described in the invention, increases the number of SNPs detectable in a single test.

Claims

CLAIMS: 1) A nucleotide sequence hybridization and detection method consisting of the following steps: a) The method provides that the target nucleotide sequence is placed to form a mixture simultaneously with a probe consisting of a biotinylated sequence and a second probe consisting of a conjugated fluorochrome sequence in order to form a single hybridization complex. b) The next step consists in incubating the complex consisting of the hybridized target sequence from the conjugated fluorochrome probe and the biotinylated probe with conjugated streptavidin microparticles. The interaction between the biotin molecule and the streptavidin conjugated to the microparticle allows to bind the microparticle to the complex target sequence - conjugated fluorochrome probe - biotinylated probe. c) The suspension of microparticles conjugated with the complex consisting of the target sequence hybridized by the conjugated fluorochrome probe and the biotinylated probe with conjugated streptavidin microparticles is then analyzed on a flow cytometer to measure the fluorescence levels and the relative presence of the target sequences. d) The probe made up of a biotinylated sequence and the second probe made up of a conjugated fluorochrome sequence have the same length in base pairs to allow for a single hybridization step of the target sequence which will take place at a defined temperature and with a defined incubation time. e) The biotinylated probe and the conjugated fluorochrome probe may have a length between 6 and 600 base pairs.

2) A method for detecting multiple genes or different mutational species of the same gene in multiparametric analysis consisting of the following steps: a) For the detection of several genes or different mutational species of the same gene, the mixture of the different genetic sequences to be detected is mixed and incubated with a mixture of biotinylated probes and conjugated fluorochrome probes. b) Each combination of biotinylated probe and conjugated fluorochrome probe is complementary to hybridize a single and specific target sequence present in the mixture. c) The next step consists in incubating the mixture containing the complexes consisting of the hybridized target sequences from the conjugated fluorochrome sequences and the biotinylated probes with conjugated streptavidin microparticles. The biotin - streptavidin interaction allows to bind the microparticles to the target sequence complexes - conjugated fluorochrome probe - biotinylated probe. d) The mixture containing the complexes composed of the target sequences hybridized by the conjugated fluorochrome probes and by the biotinylated probes linked to the streptavidinated microparticles is then analyzed on the flow cytometer to measure the fluorescence levels and the relative presence of the target sequences. e) The fluorochromes used to conjugate the conjugated fluorochrome probes used in point 2-a have different emission spectra between them, to allow detection in multiparametric analysis. f) The use of fluorochrome probes marked with two or more different colors, for the detection of multiple target sequences on a single type of microparticle as described in point 2-a, offers a quantitative relationship between the presence of the different nucleotide sequences target on the same microparticle.

3) A method for the detection of several genes or of different mutational species of the same gene in multiparametric analysis on a system of microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics consisting of the following steps: a) For the analysis of multiple sequences, the method on a system of microparticles that can be differentiated by fluorescence characteristics proposed here offers the possibility of pre-incubating any type of streptavidinated microparticle with the probes constituted by the biotinylated sequences in order to form a complex of biotinylated probes - microparticle. b) The hybridization process is then carried out by incubating the target sequences with the biotinylated probe complexes - conjugated streptavidin microparticles and the conjugated fluorochrome probes to form target sequence complexes - conjugated fluorochrome probes - biotinylated probe - conjugated streptavidin microparticles. c) The complex target sequences - conjugated fluorochrome probes - biotinylated probes - conjugated streptavidin microparticle are then analyzed on the flow cytometer to determine the presence of the target sequences. d) The pre-incubation of the biotinylated hybridization probes with the streptavidinated microparticle described in point 3-a offers a versatility of combinations between the sequences to be detected and the microparticles manageable by the operator. e) The incubation step described in point 3-a defines how many target sequences are detected on each type of microparticle differentiable for the fluorescence characteristics used. Flow cytometric analysis thus allows to detect multiple microparticles distinguishable by fluorescence characteristics in a single mixture, for each of which the detection of multiple target sequences is attributed for which assignment the system has been set according to the description in point 3-a . 4) 11 sets of reagents for carrying out the multiparametric detection in suspension for nucleotide sequences is composed of: a) Reagent A) Suspension of microparticles covalently conjugated with streptavidin b) Reagent B) Solution containing: biotinylated oligonucleotides specific for the hybridization of a specific and complementary nucleic acid sequence. c) Reagent C) Solution containing: specific conjugated fluorochrome oligonucleotides for the hybridization of a specific and complementary nucleic acid sequence. d) Each of the elements described in points: 4-a, 4-b, 4-c, is present in several units to allow the detection of multiple target sequences in multiparametric analysis (described in claim 2) and / or on a microparticle system differentiable for fluorescence characteristics (described in claim 3).