ITPI20110132A1

ITPI20110132A1 - COMPOUNDS REPELLENT FOR AFIDI AND METHOD FOR REPRESENTING THE REPELLENT POWER OF CHEMICAL COMPOUNDS IN CONCERNED AFIDI

Info

Publication number: ITPI20110132A1
Application number: IT000132A
Authority: IT
Inventors: Donatella Battaglia; Biasio Filomena De; Patrizia Falabella; Paolo Pelosi; Huili Qiao; Lea Riviello; Yufeng Sun; Xinling Yang
Original assignee: Univ Pisa
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2013-05-31

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "COMPOSTI REPELLENTI PER GLI AFIDI E METODO PER PREVEDERE IL POTERE REPELLENTE DI COMPOSTI CHIMICI NEI RIGUARDI DEGLI AFIDI", Description of the industrial invention entitled: "REPELLENT COMPOUNDS FOR Aphids AND METHOD FOR PREDICTING THE REPELLENT POWER OF CHEMICAL COMPOUNDS WITH REGARD TO Aphids",

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Ambito dell'invenzione Scope of the invention

La presente invenzione si riferisce a composti chimici la cui presenza può essere avvertita dagli afidi, e che sono in grado di influenzare il comportamento di tali insetti provocandone l'allontanamento dal luogo in cui il composto viene avvertito, ovvero l'invenzione si riferisce a repellenti per gli afidi. The present invention refers to chemical compounds whose presence can be felt by aphids, and which are able to influence the behavior of these insects causing them to move away from the place where the compound is sensed, i.e. the invention refers to repellents for aphids.

L'invenzione si riferisce anche a un metodo per stabilire se un composto è un potenziale repellente nei confronti degli afidi. The invention also relates to a method for determining whether a compound is a potential aphid repellent.

Antecedenti dell'invenzione Background of the invention

Com'è noto, gli afidi sono parassiti fitofagi che provocano notevoli danni alle coltivazioni. Gli afidi si distinguono per un'elevata capacità riproduttiva, e sono inoltre in grado di sviluppare resistenza agli agenti chimici. Per questo motivo, non sempre gli insetticidi costituiscono un mezzo efficace per contrastare tali insetti . As is known, aphids are phytophagous parasites that cause considerable damage to crops. Aphids are distinguished by a high reproductive capacity, and are also able to develop resistance to chemical agents. For this reason, insecticides are not always an effective means of combating these insects.

Inoltre, gli afidi sono vettori di agenti patogeni, e questo accresce il danno che essi provocano alle piante. Furthermore, aphids are vectors of pathogens, and this increases the damage they cause to plants.

È quindi sentita la necessità di sostanze repellenti nei confronti degli afidi, ossia di sostanze che possono essere disperse in corrispondenza delle coltivazioni o comunque di piante da proteggere, che siano in grado di mantenere gli afidi a distanza dalle piante. The need is therefore felt for repellent substances against aphids, ie substances that can be dispersed in correspondence with crops or in any case of plants to be protected, which are able to keep aphids at a distance from plants.

In natura sono noti composti che possono essere percepiti dagli insetti, in particolare dagli afidi, e che sono in grado di influenzarne il comportamento, determinandone la fuga. In particolare, 1' (E)-β-Farnesene ((6E)-7,1l-dimetil-3-metilidenedodeca-l ,6,10-triene, CAS 18794-84-8) , In nature, compounds are known that can be perceived by insects, in particular by aphids, and that are able to influence their behavior, determining their escape. In particular, 1 '(E) -β-Farnesene ((6E) -7,1l-dimethyl-3-methylidenedodeca-1,6,10-triene, CAS 18794-84-8),

(E)-β-Farnesene, (E) -β-Farnesene,

viene sintetizzato e utilizzato dalla maggior parte delle specie di afidi come feromone di allarme, cioè viene impiegato per inviare un segnale di pericolo ad altri individui, percepibile anche da altri individui della stessa o di altre specie. In particolare, 1'(E)-β-Farnesene è usato come feromone di allarme dalla maggioranza delle specie di afidi, tra cui Acyrthosiphon pisum e Myzus persicae . Infatti, gli afidi sono provvisti di recettori per tale feromone, la cui attività è mediata da proteine leganti gli odori (OBP, odorant binding protein) con le quali 1'(E)-β-Farnesene è in grado di legarsi. Questa interazione determina modifiche coniormazionali nelle OBP, che vengono trasmesse ai recettori, provocando negli afidi una serie di eventi biochimici il cui effetto finale è l'allontanamento repentino degli insetti stessi. È nota anche la capacità di alcune piante, ad esempio di determinate specie di patate, di sintetizzare 1'(E)-β-Farnesene per respingere gli insetti. it is synthesized and used by most aphid species as an alarm pheromone, that is, it is used to send a danger signal to other individuals, which can also be perceived by other individuals of the same or other species. In particular, 1 '(E) -β-Farnesene is used as an alarm pheromone by most aphid species, including Acyrthosiphon pisum and Myzus persicae. In fact, aphids are equipped with receptors for this pheromone, whose activity is mediated by odorant binding proteins (OBP) with which 1 '(E) -β-Farnesene is able to bind. This interaction determines conormational changes in the OBPs, which are transmitted to the receptors, causing a series of biochemical events in the aphids whose final effect is the sudden removal of the insects themselves. The ability of some plants, for example certain potato species, to synthesize 1 '(E) -β-Farnesene to repel insects is also known.

Non è tuttavia possibile un uso sistematico dell'(E)—β— Farnesene per mantenere gli afidi a distanza di coltivazioni e piante da proteggere. Infatti, le vie di sintesi attualmente conosciute dell'(E)-β-Farnesene prevedono l'impiego di materie prime molto costose, e comprendono numerosi passaggi di difficile realizzazione. However, a systematic use of (E) —β— Farnesene is not possible to keep aphids at a distance from crops and plants to be protected. In fact, the currently known synthesis routes of (E) -β-Farnesene involve the use of very expensive raw materials, and include numerous difficult steps.

Per questo motivo, la sintesi industriale dell' (E)-β-Farnesene è molto costosa. In ogni caso, 1'(E)-β-Farnesene è chimicamente poco stabile, in particolare è facilmente ossidabile. Ciò dipende dalla presenza dei doppi legami terminali, che sono particolarmente reattivi con l'ossigeno dell'ambiente. Per questo motivo, dopo poche ore di esposizione dell' (E)-β-Farnesene all'atmosfera, la maggior parte del composto viene trasformata nei corrispondenti prodotti ossidati che non hanno significative capacità repellenti nei confronti degli afidi. Più in dettaglio, è stato dimostrato che il 77% dell'(E)-β-Farnesene scompare dopo 24 ore di esposizione in normali condizioni di temperatura e insolazione, e che dopo 48 ore rimangono solo tracce del composto. Inoltre, l'eccessiva volatilità di tale composto, in termini di tensione di vapore e diffusività in aria, contribuisce a limitarne il tempo di permanenza nell'ambiente in cui il composto viene diffuso. For this reason, the industrial synthesis of (E) -β-Farnesene is very expensive. In any case, 1 '(E) -β-Farnesene is chemically not very stable, in particular it is easily oxidizable. This depends on the presence of the terminal double bonds, which are particularly reactive with the oxygen of the environment. For this reason, after a few hours of exposure of (E) -β-Farnesene to the atmosphere, most of the compound is transformed into the corresponding oxidized products which do not have significant repellent properties towards aphids. More in detail, it has been shown that 77% of (E) -β-Farnesene disappears after 24 hours of exposure under normal conditions of temperature and insolation, and that after 48 hours only traces of the compound remain. Furthermore, the excessive volatility of this compound, in terms of vapor pressure and diffusivity in the air, helps to limit its residence time in the environment in which the compound is diffused.

Per usare 1' (E)-β-Farnesene contro gli afidi, sono state prodotte varianti transgeniche di alcune piante che sono in grado di sintetizzare tale composto, permettendo di mantenere gli afidi lontano dalle piante. Un uso generalizzato di tale tecnica è tuttavia di costosa e lunga realizzazione, e si scontra con note riserve e resistenze nei riguardi degli organismi transgenici. To use 1 '(E) -β-Farnesene against aphids, transgenic variants of some plants have been produced which are able to synthesize this compound, allowing to keep the aphids away from the plants. A generalized use of this technique is, however, costly and time-consuming to implement, and runs up against well-known reservations and resistances towards transgenic organisms.

Vi è quindi necessità di disporre di composti repellenti nei confronti degli afidi, atti ad essere diffusi nell'ambiente senza danni per le specie viventi, che siano ottenibili industrialmente in modo semplice ed economico. È altresì necessario disporre di composti repellenti nei confronti degli afidi che abbiano una stabilità chimica, in particolare una stabilità all'ossidazione, superiore a quella di composti noti per essere repellenti verso gli afidi, come 1'(E)-β-Farnesene. There is therefore a need to have repellent compounds against aphids, capable of being spread in the environment without damage to living species, which can be industrially obtained in a simple and economical way. It is also necessary to have repellent compounds against aphids that have a chemical stability, in particular a stability to oxidation, higher than that of compounds known to be repellent towards aphids, such as 1 '(E) -β-Farnesene.

Per stabilire l'effettivo potere repellente nei confronti degli insetti, in particolare degli afidi, sono disponibili vari saggi di comportamento, come quello descritto più avanti nella presente domanda. Tali saggi di comportamento hanno lo svantaggio di dover essere eseguiti su grandi numeri di insetti, allo scopo di valutare l'effettivo potere repellente di una certa sostanza, pertanto comportano molto dispendio di tempo. Vi è quindi la necessità di disporre di un metodo rapido e semplice per predire il carattere repellente di composti chimici nei confronti degli afidi, in modo da limitare il numero di sostanze da sottoporre a saggi di comportamento con afidi vivi . To establish the effective repellent power against insects, in particular aphids, various behavioral assays are available, such as the one described later in the present application. Such behavioral tests have the disadvantage of having to be performed on large numbers of insects, in order to evaluate the effective repellent power of a certain substance, therefore they involve a lot of time. There is therefore a need to have a quick and simple method to predict the repellent character of chemical compounds against aphids, in order to limit the number of substances to be subjected to behavioral tests with live aphids.

Sintesi dell'invenzione Summary of the invention

È quindi scopo della presente invenzione fornire un prodotto repellente nei confronti degli afidi che possa essere sintetizzato industrialmente a partire da materie prime di facile reperibilità e di basso costo. It is therefore an object of the present invention to provide a repellent product against aphids which can be industrially synthesized starting from raw materials that are easy to find and of low cost.

È altresì uno scopo dell'invenzione fornire un siffatto prodotto che possa essere sintetizzato industrialmente con un procedimento più semplice e meno costoso rispetto alla sintesi industriale di composti repellenti noti, come 1' (E)-β-Farnesene . It is also an object of the invention to provide such a product which can be industrially synthesized with a simpler and less expensive process than the industrial synthesis of known repellent compounds, such as 1 '(E) -β-Farnesene.

È inoltre uno scopo dell'invenzione fornire un siffatto prodotto che abbia una resistenza chimica maggiore rispetto a tali composti repellenti noti, come 1'(E)-β-Farnesene, in particolare un prodotto che sia più resistente all'ossidazione ad opera dell'ossigeno atmosferico. It is also an object of the invention to provide such a product which has a higher chemical resistance than such known repellent compounds, such as 1 '(E) -β-Farnesene, in particular a product which is more resistant to oxidation by the atmospheric oxygen.

È anche uno scopo dell'invenzione fornire un siffatto prodotto che abbia una volatilità inferiore rispetto a tali composti repellenti noti, in particolare rispetto all' (E)-β-Farnesene, pur avendo una volatilità sufficiente per l'impiego quale repellente per insetti. It is also an object of the invention to provide such a product which has a lower volatility than such known repellent compounds, in particular with respect to (E) -β-Farnesene, while having sufficient volatility for use as an insect repellent.

È un altro scopo dell'invenzione fornire un siffatto prodotto che non sia dannoso per la salute delle altre specie potenzialmente esposte, in particolare che non sia dannoso per i mammiferi e che non riduca la popolazione di altri insetti predatori di afidi, come accade con gli insetticidi. It is another object of the invention to provide such a product which is not harmful to the health of other potentially exposed species, in particular which is not harmful to mammals and which does not reduce the population of other aphid predatory insects, as occurs with insecticides.

È pure uno scopo della presente invenzione fornire un metodo per stabilire con accettabile approssimazione il carattere repellente nei confronti degli afidi di una determinata sostanza, in modo da limitare il numero di composti chimici da sottoporre a test di comportamento per confermarne l'effettivo carattere repellente. It is also an object of the present invention to provide a method for establishing with an acceptable approximation the repellent character of a given substance against aphids, so as to limit the number of chemical compounds to be subjected to behavior tests to confirm their effective repellent character.

Questi ed altri scopi sono raggiunti da un composto repellente per afidi, consistente in un composto volatile, la cui caratteristica principale è di essere tra configurato in modo che, portato a contatto con proteine del tipo leganti gli odori o OBP (odour binding protein) del gruppo OBPl; OBP3; OBP6; OBP7; OBP8; OBPIO, detto composto volatile lega con proteine di tale gruppo consistenti in OBP3 o in OBP7, e non lega con proteine del gruppo consistenti in OBPl, OBP6, OBP8, OBPIO. These and other purposes are achieved by a repellent compound for aphids, consisting of a volatile compound, the main characteristic of which is to be configured in such a way that, brought into contact with odor binding proteins or OBP (odor binding protein) of the OBP1 group; OBP3; OBP6; OBP7; OBP8; OBPIO, said volatile compound binds with proteins of this group consisting of OBP3 or OBP7, and does not bind with proteins of the group consisting of OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO.

Con l'espressione "lega con proteine", si intende che il composto formano con le proteine un complesso stabile, attraverso interazioni molecolari di tipo non covalente, ossia attraverso interazioni come ponti a idrogeno, interazioni ioniche, forze di Van der Waals e interazioni idrofobiche. La stabilità del composto può essere indicata dal valore di una costante di dissociazione, determinabile attraverso misure di concentrazione eseguite in modo convenzionale, ad esempio ricorrendo a saggi in fluorescenza o saggi radioattivi. Convenzionalmente, in questa invenzione si assume che una proteina leghi un composto ossia un ligando quando la costante di dissociazione del complesso ha un valore inferiore a 1CT<5>. Gli inventori si sono infatti resi conto che esiste una correlazione molto stretta tra il potere repellente verso gli afidi dei composti sopra indicati, e la capacità di tali composti di legare in modo specifico la proteina OBP3 e/o la proteina OBP7. Il gruppo di proteine comprendente OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8 e OBPIO è infatti rappresentativo dell'intero corredo di OBP degli afidi, per i quali sono conosciuti in tutto 15 geni codificanti questo tipo di proteine. The expression "binds with proteins" means that the compound forms a stable complex with proteins, through non-covalent molecular interactions, that is, through interactions such as hydrogen bridges, ionic interactions, Van der Waals forces and hydrophobic interactions . The stability of the compound can be indicated by the value of a dissociation constant, which can be determined through concentration measurements carried out in a conventional way, for example by using fluorescence or radioactive assays. Conventionally, in this invention it is assumed that a protein binds a compound or a ligand when the dissociation constant of the complex has a value less than 1CT <5>. The inventors have in fact realized that there is a very close correlation between the aphid repellent power of the above compounds, and the ability of these compounds to specifically bind the OBP3 protein and / or the OBP7 protein. The group of proteins comprising OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8 and OBPIO is in fact representative of the entire OBP set of aphids, for which a total of 15 genes coding for this type of protein are known.

In altre parole, come sarà mostrato nel seguito, gli inventori hanno verificato che sostanzialmente quasi tutti i composti, tra quelli studiati, che: In other words, as will be shown below, the inventors have verified that substantially almost all the compounds, among those studied, which:

- legano almeno una delle due proteine leganti gli odori OBP3 e OBP7; - they bind at least one of the two odor-binding proteins OBP3 and OBP7;

- non legano nessuna delle altre proteine di un gruppo rappresentativo di proteine leganti gli odori, formato da OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO, - they do not bind any of the other proteins of a representative group of odor-binding proteins, formed by OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO,

hanno anche potere repellente verso gli afidi, e viceversa. Tale comportamento selettivo nei confronti delle proteine leganti gli odori è il medesimo comportamento che ha 1'(E)-β-Farnesene. Pertanto, i composti repellenti sono percepiti allo stesso modo in cui viene percepito 1'(E)-β-Farnesene, e provocano gli stessi eventi biochimici che determinano l'allontanamento degli afidi dal luogo in cui il composto viene percepito. they also have repellent power towards aphids, and vice versa. This selective behavior towards odor binding proteins is the same behavior that 1 '(E) -β-Farnesene has. Therefore, repellent compounds are perceived in the same way that 1 '(E) -β-Farnesene is perceived, and cause the same biochemical events that cause the aphids to move away from the place where the compound is perceived.

Il composto può essere scelto tra i composti di formula generale: The compound can be chosen from the compounds of general formula:

Ri-X, [1] in cui Ri-X, [1] where

- Ri è un gruppo di atomi comprendente: - Ri is a group of atoms comprising:

- una catena alifatica lineare (CnHm)avente un numero di atomi di carbonio compreso tra 8 e 12; - almeno un gruppo metilico -CH3legato ad un atomo non terminale della catena alifatica; - a linear aliphatic chain (CnHm) having a number of carbon atoms comprised between 8 and 12; - at least one -CH3 methyl group attached to a non-terminal atom of the aliphatic chain;

- X è un gruppo di atomi scelto tra: - X is a group of atoms chosen from:

- un gruppo fenile opzionalmente sostituito; - an optionally substituted phenyl group;

- un gruppo ossidrile. - a hydroxyl group.

Il composto può essere scelto anche tra i composti di formula generale: The compound can also be chosen from the compounds of the general formula:

R2-0-C0-R3, [2] R2-0-C0-R3, [2]

in cui in which

- R2e R3sono, ciascuno indipendentemente dall'altro, gruppi di atomi comprendenti: - R2 and R3 are, each independently of the other, groups of atoms comprising:

- una catena alifatica lineare (CnHm) avente un numero di atomi di carbonio n non superiore a 8; - almeno un gruppo metilico -CH3legato ad un atomo non terminale della catena alifatica. - a linear aliphatic chain (CnHm) having a number of carbon atoms n not exceeding 8; - at least one -CH3 methyl group attached to a non-terminal atom of the aliphatic chain.

Tali composti si distinguono per l'elevata stabilità conferita dal gruppo estere, e per una notevole facilità di sintesi. These compounds are distinguished by the high stability conferred by the ester group, and by a remarkable ease of synthesis.

A differenza di composti naturali come 1'(Ε)-β-Farnesene, i composti sopra indicati possono essere usati su scala industriale per difendere coltivazioni e piante in genere dagli afidi. Infatti, è possibile sintetizzare industrialmente composti secondo la [1] o la [2] a partire da materie prime di facile disponibilità e di basso costo, e/o attraverso un numero limitato di reazioni e di operazioni di purificazione, in particolare attraverso uno solo o due passaggi reattivi. Inoltre, tali composti possiedono una migliore stabilità all'ossigeno atmosferico e una volatilità inferiore rispetto all'(E)-β-Farnesene . In questo modo, concentrazioni efficaci di tali composti possono rimanere nei luoghi di diffusione per tempi abbastanza lunghi da mantenere gli afidi lontani dalle coltivazioni in modo efficace. Verosimilmente i composti secondo l'invenzione sono compatibili con l'ambiente e con la salute degli altri esseri viventi, in particolare dei mammiferi. Prodotti analoghi ai composti secondo l'invenzione, ad esempio il propionato di geranile o l'acetato di geranile trovano impiego come additivi alimentari. Unlike natural compounds such as 1 '(Ε) -β-Farnesene, the compounds indicated above can be used on an industrial scale to defend crops and plants in general from aphids. In fact, it is possible to industrially synthesize compounds according to [1] or [2] starting from easily available and low cost raw materials, and / or through a limited number of reactions and purification operations, in particular through only one or two responsive steps. Furthermore, these compounds possess better stability to atmospheric oxygen and lower volatility than (E) -β-Farnesene. In this way, effective concentrations of these compounds can remain in places of spread for long enough to keep the aphids away from crops effectively. It is likely that the compounds according to the invention are compatible with the environment and with the health of other living beings, in particular of mammals. Products similar to the compounds according to the invention, for example geranyl propionate or geranyl acetate, are used as food additives.

I composti secondo l'invenzione possono sostituire gli insetticidi nella lotta contro gli afidi, costituendo un'alternativa vantaggiosa dal punto di vista ambientale, e più efficace in ragione della notevole capacità di adattamento degli afidi agli insetticidi. The compounds according to the invention can replace insecticides in the fight against aphids, constituting an advantageous alternative from the environmental point of view, and more effective due to the remarkable ability of aphids to adapt to insecticides.

In particolare, nei composti di formula [1], Ri è un gruppo di atomi comprendente una pluralità di gruppi metilici -CH3legati a rispettivi atomi di carbonio della catena alifatica, cui sono legati detti gruppi metilici. Preferibilmente, tra i rispettivi atomi di carbonio è presente una porzione della catena alifatica comprendente tre atomi di carbonio. In particular, in the compounds of formula [1], R1 is a group of atoms comprising a plurality of methyl groups -CH3 linked to respective carbon atoms of the aliphatic chain, to which said methyl groups are linked. Preferably, a portion of the aliphatic chain comprising three carbon atoms is present between the respective carbon atoms.

La catena alifatica del gruppo R può essere una catena alifatica insatura. In altre parole, essa può comprendere almeno un doppio legame tra due propri atomi di carbonio non terminali. Preferibilmente, almeno uno degli atomi di carbonio insaturi è legato al gruppo metilico. The aliphatic chain of the R group can be an unsaturated aliphatic chain. In other words, it can comprise at least one double bond between two of its own non-terminal carbon atoms. Preferably, at least one of the unsaturated carbon atoms is bonded to the methyl group.

Nel seguito, gli atomi di carbonio si intendono numerati in modo crescente a partire da un atomo di carbonio legato al gruppo di atomi indicato con X nella [1], e l'atomo di carbonio legato al gruppo di atomi X definisce la posizione 1 della catena alifatica. In the following, the carbon atoms are intended to be numbered in increasing order starting from a carbon atom bonded to the group of atoms indicated by X in [1], and the carbon atom bonded to the group of atoms X defines position 1 of the aliphatic chain.

In particolare, il numero di atomi di carbonio n è uguale a 9 e la catena alifatica è una catena alifatica 4,8-dimetil sostituita. Ad esempio, la catena alifatica comprende un doppio legame tra atomi di carbonio in posizione 3 e 4. In particular, the number of carbon atoms n is equal to 9 and the aliphatic chain is a substituted 4,8-dimethyl aliphatic chain. For example, the aliphatic chain comprises a double bond between carbon atoms in position 3 and 4.

Il gruppo di atomi X può essere un fenile. In particolare il composto è l-Fenil-4, 8-dimetil-l, 3,7-nonatriene : The group of atoms X can be a phenyl. In particular, the compound is 1-Phenyl-4, 8-dimethyl-1, 3,7-nonatriene:

Questo composto si distingue per l'elevata stabilità conferita dall'anello aromatico che si trova nella medesima posizione al posto dei doppi legami terminali del (Ε)-β-Farnesene, e per una notevole facilità di sintesi. This compound is distinguished by the high stability conferred by the aromatic ring which is in the same position in place of the terminal double bonds of (Ε) -β-Farnesene, and by a remarkable ease of synthesis.

Ad esempio, ciascuno dei rispettivi atomi di carbonio, cui sono legati i gruppi metilici, è un atomo di carbonio insaturo. Ad esempio, la catena alifatica comprende sequenze di non più di due atomi di carbonio saturi, cui si interpone almeno un carbonio insaturo. In particolare, la catena alifatica comprende una sequenza terpenica, ossia una sequenza di unità isopreniche. For example, each of the respective carbon atoms, to which the methyl groups are bonded, is an unsaturated carbon atom. For example, the aliphatic chain comprises sequences of no more than two saturated carbon atoms, to which at least one unsaturated carbon is interposed. In particular, the aliphatic chain comprises a terpene sequence, ie a sequence of isoprene units.

il gruppo di atomi X può essere un gruppo ossidrilico. In particolare, il numero n di atomi di carbonio della catena principale è 12. In altre parole il composto è 3,7, ll-trimetil-2, 6,10-dodecatrien-l-olo, noto anche come Farnesolo : the group of atoms X can be a hydroxyl group. In particular, the number n of carbon atoms of the main chain is 12. In other words the compound is 3,7, ll-trimethyl-2, 6,10-dodecatrien-1-ol, also known as Farnesol:

In particolare, nei composti di formula [2] R2è un gruppo di atomi comprendente una pluralità di gruppi metilici -CH3legati a rispettivi atomi di carbonio della catena alifatica. In particular, in the compounds of formula [2] R2 is a group of atoms comprising a plurality of methyl groups -CH3 linked to respective carbon atoms of the aliphatic chain.

Nel seguito, gli atomi di carbonio delle catene alchiliche dei gruppi R2e R3della formula [2] si intendono numerati in modo crescente a partire da un atomo di carbonio legato al gruppo estere -O-CO-, e l'atomo di carbonio legato al gruppo estere -O-CO- definisce la posizione della catena alifatica. In the following, the carbon atoms of the alkyl chains of the R2 and R3 groups of the formula [2] are intended to be numbered in increasing order starting from a carbon atom bonded to the ester group -O-CO-, and the carbon atom bonded to the group ester -O-CO- defines the position of the aliphatic chain.

Il gruppo metilico e/o i gruppi metilici sono preferibilmente legati ad un atomo di carbonio in posizione 3 e/o in posizione 7 della catena alchilica. In altre parole, la catena alifatica del gruppo R è preferibilmente una catena 3-metil alchilica, o una catena 7-metil ottilica, e/o una catena 3,7-dimetil ottilica. The methyl group and / or the methyl groups are preferably bonded to a carbon atom in position 3 and / or in position 7 of the alkyl chain. In other words, the aliphatic chain of the R group is preferably a 3-methyl alkyl chain, or a 7-methyl octyl chain, and / or a 3,7-dimethyl octyl chain.

Similmente, la catena alifatica del gruppo R è una catena 4-metil alchilica. Similarly, the aliphatic chain of the R group is a 4-methyl alkyl chain.

Il composto può comprendere un gruppo fenilico opzionalmente sostituito, legato ad un atomo in posizione ω della catena alifatica del gruppo R e/o del gruppo R3, ossia in posizione terminale della catena alifatica all'estremità opposta rispetto al gruppo -O-CO. The compound can comprise an optionally substituted phenyl group, bonded to an atom in the ω position of the aliphatic chain of the R group and / or of the R3 group, ie in the terminal position of the aliphatic chain at the opposite end with respect to the -O-CO group.

La catena alifatica del gruppo R può essere ad esempio una catena 3-metil butilica. In particolare il composto è un estere isopentilico di una catena alifatica recante un siffatto gruppo R2, ossia il composto è isopentil 4-fenil butirrato: The aliphatic chain of the R group can be, for example, a 3-methyl butyl chain. In particular, the compound is an isopentyl ester of an aliphatic chain bearing such an R2 group, i.e. the compound is isopentyl 4-phenyl butyrate:

I gruppi R ed R , indipendentemente l'uno dall'altro, possono essere gruppi alitatici insaturi. In altre parole, la catena alifatica del gruppo R e/o del gruppo R può comprendere almeno un doppio legame tra due atomi di carbonio insaturi non terminali della catena alifatica. The R and R groups, independently of each other, can be unsaturated alitatic groups. In other words, the aliphatic chain of the R group and / or the R group can comprise at least one double bond between two non-terminal unsaturated carbon atoms of the aliphatic chain.

Preferibilmente, almeno uno degli atomi di carbonio insaturi è legato al gruppo metilico. Preferably, at least one of the unsaturated carbon atoms is bonded to the methyl group.

In particolare la catena alifatica del gruppo R2è una catena alifatica 3,7-dimetil sostituita. In particular, the aliphatic chain of the R2 group is a 3,7-dimethyl substituted aliphatic chain.

In una forma realizzativa, il numero di atomi di carbonio n è uguale a 8, in particolare il composto è geranil acetato: In one embodiment, the number of carbon atoms n is equal to 8, in particular the compound is geranyl acetate:

oppure è il composto analogo insaturo di questo, ossia 3,7-dimetil ottil acetato: or it is the unsaturated analogous compound of this, namely 3,7-dimethyl octyl acetate:

La correlazione molto stretta tra il potere repellente verso gli afidi, e la capacità di legare in modo specifico almeno la proteina OBP3 e/o la proteina OBP7 fornisce un criterio per eseguire uno screening preliminare di composti destinati all'uso quale repellente per gli insetti. Pertanto, secondo un altro aspetto dell'invenzione, gli scopi sopra indicati sono raggiunti da un metodo per valutare il potere potenzialmente repellente di un composto, cioè di un ligando, nei riguardi di un afide, comprendente le fasi di: The very close correlation between aphid repellent power and the ability to specifically bind at least the OBP3 protein and / or the OBP7 protein provides a criterion for preliminary screening of compounds intended for use as insect repellent. Therefore, according to another aspect of the invention, the purposes indicated above are achieved by a method for evaluating the potentially repellent power of a compound, i.e. of a ligand, with respect to an aphid, comprising the steps of:

- predisporre una quantità predeterminata di ciascuna proteina del gruppo formato da proteine leganti gli odori OBP1 , OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBPIO; - preparing a predetermined quantity of each protein of the group formed by odor binding proteins OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBPIO;

- eseguire un saggio di legame del ligando con ciascuna delle proteine del gruppo, ossia: - perform a ligand binding assay with each of the proteins of the group, i.e .:

- portare il ligando a contatto con ciascuna delle proteine del gruppo; - bring the ligand into contact with each of the proteins of the group;

- verificare la formazione di rispettivi complessi del ligando con le proteine; - verify the formation of respective ligand complexes with proteins;

- determinare rispettivi valori di costante di dissociazione dei complessi; - determine respective values of dissociation constant of the complexes;

classificare il composto come classify the compound as

potenziale composto repellente nei confronti degli afidi se il ligando lega in modo specifico almeno una proteina del gruppo scelta tra 0BP3 e 0BP7, ossia se: potential compound repellent towards aphids if the ligand specifically binds at least one protein of the group chosen between 0BP3 and 0BP7, i.e. if:

- il ligando lega almeno una proteina legante gli odori scelta tra 0BP3 e 0BP7, ossia se almeno un valore di costante di dissociazione del complesso del ligando con una proteina scelta tra 0BP3 e 0BP7 è inferiore a un valore di soglia predeterminato, e - the ligand binds at least one odor-binding protein chosen between 0BP3 and 0BP7, i.e. if at least one dissociation constant value of the ligand complex with a protein chosen between 0BP3 and 0BP7 is less than a predetermined threshold value, and

- il ligando non lega nessun altra proteina legante gli odori scelta tra 0BP1, 0BP6, 0BP8, OBPIO, ossia se tutti i valori di costante di dissociazione di complessi del ligando con proteine del gruppo diverse da 0BP3 e da 0BP7 non sono inferiori al valore di soglia; composto non repellente nei confronti degli afidi se : - the ligand does not bind any other odor-binding protein chosen from 0BP1, 0BP6, 0BP8, OBPIO, i.e. if all the dissociation constant values of the ligand complexes with proteins of the group other than 0BP3 and 0BP7 are not lower than the value of theshold; non-repellent compound against aphids if:

- il ligando non lega almeno una proteina legante gli odori scelta tra 0BP3 e 0BP7, ossia se almeno un valore di costante di dissociazione del complesso del ligando con una proteina scelta tra 0BP3 e 0BP7 non è inferiore a un valore di soglia predeterminato, e/o - the ligand does not bind at least one odor-binding protein chosen between 0BP3 and 0BP7, i.e. if at least one dissociation constant value of the ligand complex with a protein chosen between 0BP3 and 0BP7 is not less than a predetermined threshold value, and / or

- il composto lega almeno un'altra proteina legante gli odori scelta tra 0BP1, 0BP6, 0BP8, OBPIO, ossia se almeno un valore di costante di dissociazione di un complesso del ligando con una proteina del gruppo diversa da 0BP3 e da 0BP7 è inferiore al valore di soglia. - the compound binds at least one other odor-binding protein chosen from 0BP1, 0BP6, 0BP8, OBPIO, i.e. if at least one dissociation constant value of a ligand complex with a protein of the group other than 0BP3 and 0BP7 is lower than threshold value.

- il composto non lega nessuna delle 6 proteine ossia se i valori delle costanti di dissociazione sono superiori ad un valore di soglia predeterminato. - the compound does not bind any of the 6 proteins, ie if the values of the dissociation constants are higher than a predetermined threshold value.

In particolare, il valore di soglia predeterminato è 1CT<5>M. In particular, the predetermined threshold value is 1CT <5> M.

Tale tecnica consente di limitare il numero di composti da sottoporre a prove di comportamento per verificare direttamente il loro effettivo potere repellente nei riguardi degli afidi, con notevole economia di tempo e di risorse. This technique allows to limit the number of compounds to be subjected to behavior tests to directly verify their effective repellent power towards aphids, with a considerable saving of time and resources.

Pertanto, rientra nell'ambito dell'invenzione anche un dispositivo o kit per valutare il potere potenzialmente repellente di un composto nei riguardi di un afide, il quale dispositivo comprende una quantità predeterminata di ciascuna proteina del gruppo formato da OBP1, OBP3, OBP6, OBP7 , OBP8, OBPIO. Therefore, a device or kit for evaluating the potentially repellent power of a compound towards an aphid also falls within the scope of the invention, which device comprises a predetermined quantity of each protein of the group formed by OBP1, OBP3, OBP6, OBP7 , OBP8, OBPIO.

In particolare, il dispositivo comprende mezzi per eseguire un saggio di legame tra tale composto e ciascuna proteina del gruppo sopra definito. Il saggio di legame può essere di qualsiasi tipo noto nella tecnica, idoneo per rilevare un complesso proteina/ligando di basso peso molecolare, ad esempio un saggio in fluorescenza, un saggio radioattivo, un saggio utilizzante la tecnica del Surface Plasmon Resonance (Biacore®) o altri saggi utilizzandi metodi di precipitazione o di dialisi all'equilibrio. In particular, the device comprises means for carrying out a binding assay between said compound and each protein of the group defined above. The binding assay can be of any type known in the art, suitable for detecting a low molecular weight protein / ligand complex, for example a fluorescence assay, a radioactive assay, an assay using the Surface Plasmon Resonance (Biacore®) technique. or other assays using precipitation or equilibrium dialysis methods.

Descrizione di esempi e forme realizzative preferite. Description of examples and preferred embodiments.

L'invenzione verrà di seguito illustrata con la descrizione che segue di suoi esempi e forme realizzative, fatta a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento alla Figura 1, che è un diagramma che mostra i risultati di test di comportamento di due specie di afidi nei confronti di un pluralità di composti chimici, e alle tabelle 1 e 2 richiamate nel seguito. The invention will be illustrated below with the following description of its examples and embodiments, given by way of non-limiting example, with reference to Figure 1, which is a diagram showing the results of behavior tests of two species of aphids with respect to a plurality of chemical compounds, and to tables 1 and 2 referred to below.

Nel seguito vengono descritte le prove sperimentali che hanno permesso di stabilire il potere repellente nei riguardi degli afidi di alcuni composti e di alcune classi di composti. Vengono anche descritti i test che hanno permesso di stabilire un criterio per predire tale attività repellente in un determinato composto chimico. The experimental tests that have made it possible to establish the repellent power of some compounds and some classes of compounds towards aphids are described below. It also describes the tests that have allowed to establish a criterion for predicting such repellent activity in a given chemical compound.

Le attività sperimentali si sono articolate in: The experimental activities were divided into:

- predisposizione di determinate quantità e campioni di alcuni composti chimici; - preparation of certain quantities and samples of some chemical compounds;

- scelta di classi e di popolazioni significative di afidi da impiegare per le prove; - choice of classes and significant populations of aphids to be used for the tests;

- esecuzione di prove di comportamento degli afidi, per stabilire/verif icare l'effettivo potere repellente verso gli afidi di ciascuno di tali composti; - execution of aphid behavior tests, to establish / verify the effective repellent power of each of these compounds against aphids;

- definizione di classi di reagenti, in specie di proteine OBP; - definition of classes of reactants, especially of OBP proteins;

- preparazione delle proteine OBP; - preparation of OBP proteins;

- esecuzione di prove di legame con proteine leganti gli odori degli afidi; - carrying out binding tests with aphid odor binding proteins;

- confronto fra le affinità di legame misurate con composti chimici potenziali repellenti le 6 proteine OBP ed i risultati delle prove di comportamento effettuate sugli afidi con gli stessi composti chimici. - comparison between the binding affinities measured with potential chemical compounds repelling the 6 OBP proteins and the results of the behavior tests carried out on aphids with the same chemical compounds.

Composti (ligandi) utilizzati Compounds (ligands) used

Sono state predisposte opportune quantità di 30 composti . Suitable quantities of 30 compounds were prepared.

Un primo gruppo comprendeva gli otto composti di seguito riportati: A first group comprised the following eight compounds:

(E)-β-Farnesene (E) -β-Farnesene

l-Fenil-4 ,8-dimetil-l ,3,7-nonatriene 1-Phenyl-4, 8-dimethyl-1, 3,7-nonatriene

Isopentll 4-fenllbutlrrato Isopentll 4-phenylbuthrate

3,7-Dimetil ottil acetato 3,7-Dimethyl octyl acetate

n-Butil benzoato n-Butyl benzoate

n-Esil benzoato n-Hexyl benzoate

Tale gruppo contiene 1'(E)-β-Farnesene assieme a suoi analoghi strutturali, composti [II], [III], [VI], [VII], [V], ed altri composti di struttura leggermente diversa. I composti [III] e [V] sono stati acquisiti da Sigma-Aldrich, mentre 1'(E)-β-Farnesene proveniva da Bedoukian Research, Danbury, CVT, USA. Tutti gli altri composti sono stati preparati con tecniche di laboratorio convenzionali. This group contains 1 '(E) -β-Farnesene together with its structural analogues, compounds [II], [III], [VI], [VII], [V], and other compounds of slightly different structure. Compounds [III] and [V] were acquired from Sigma-Aldrich, while 1 '(E) -β-Farnesene came from Bedoukian Research, Danbury, CVT, USA. All other compounds were prepared with conventional laboratory techniques.

Un secondo gruppo di composti è riportato in tabella l.Tali composti hanno formula generale A second group of compounds is reported in Table 1. These compounds have a general formula

in cui R' è un gruppo diazolile sostituito: where R 'is a substituted diazolyl group:

dove where is it

- Ri* è terz-bufile; - Ri * is tert-bufile;

- R2* è scelto tra metile, etile, n-propile, i-butile, fenile ; - R2 * is selected from methyl, ethyl, n-propyl, i-butyl, phenyl;

- R3* è scelto tra idrogeno e alogeno, in particolare cloro . - R3 * is selected from hydrogen and halogen, in particular chlorine.

e R" è un idrogeno o un metile. and R "is a hydrogen or a methyl.

- TABELLA 1 - - TABLE 1 -

Si tratta di un gruppo di composti sintetici ciascuno dei quali contiene un residuo aromatico provvisto di attività insetticida, legato ad un gruppo geranile che imita la struttura dell' (E)-β-Farnesene . Tali composti sono stati ottenuti come descritto in Sun, Y., Quiao, H, Ling, Y., Yang, S, Rui, C., Pelosi, P. e Yang X New analogues of (E)-β-Farnesene with inseticidal activity and binding affinity to aphid odorant-binding proteins, J.Agric.Food Chem. 5_9, 2456-2461. It is a group of synthetic compounds each of which contains an aromatic residue with insecticidal activity, linked to a geranyl group that mimics the structure of (E) -β-Farnesene. These compounds were obtained as described in Sun, Y., Quiao, H, Ling, Y., Yang, S, Rui, C., Pelosi, P. and Yang X New analogues of (E) -β-Farnesene with inseticidal activity and binding affinity to aphid odorant-binding proteins, J.Agric.Food Chem. 5_9, 2456-2461.

Prove di comportamento Behavior tests

Sono state eseguite prove di comportamento per stabilire l'effettivo potere repellente verso gli afidi di alcuni composti rappresentativi. Behavior tests were performed to establish the effective repellent power of some representative compounds against aphids.

1. Afidi 1. Aphids

Per le prove di comportamento sono stati usati esemplari adulti privi di ali delle specie Acyrthosiphon pisum e Myzus persicae . Gli esemplari provenivano da colture realizzate in condizioni climatiche controllate. In particolare, gli esemplari di Acyrthosiphon pisum provenivano da una coltura iniziata nel 1985 a partire da afidi raccolti in campi di Medicago sativa (erba medica) presso Eboli (Italia), mentre gli esemplari di Myzus persicae provenivano da una coltura in serra dell'Istituto per la protezione delle piante dell'Accademia Cinese di Scienze Agrarie (Beijing, Cina). Adult wingless specimens of the species Acyrthosiphon pisum and Myzus persicae were used for the behavioral tests. The specimens came from crops grown in controlled climatic conditions. In particular, the specimens of Acyrthosiphon pisum came from a culture started in 1985 starting from aphids collected in fields of Medicago sativa (alfalfa) near Eboli (Italy), while the specimens of Myzus persicae came from a greenhouse culture of the Institute for plant protection of the Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing, China).

2. Olfattometro 2. Olfactometer

Per eseguire le prove di comportamento sono stati impiegati olfattometri a tubo ad Y in vetro di tipo convenzionale. Per le prove con Acyrthosiphon pisum,. Conventional glass Y-tube olfactometers were used to perform the behavior tests. For trials with Acyrthosiphon pisum ,.

1'olfattometro aveva diametro uniforme di 2,7 cm, il corpo principale aveva una lunghezza di 26,5 cm e i rami avevano una lunghezza di 16,5 cm. Per le prove con Myzus persicae, 1'olfattometro aveva diametro uniforme di 1,0 cm e il corpo principale e i rami avevano una lunghezza di 5,0 cm. The olfactometer had a uniform diameter of 2.7 cm, the main body had a length of 26.5 cm and the branches had a length of 16.5 cm. For Myzus persicae tests, the olfactometer had a uniform diameter of 1.0 cm and the main body and branches had a length of 5.0 cm.

All'interno del tubo a Y era disposto un filo di rame per facilitare lo spostamento degli afidi verso l'uno o verso l'altro ramo dell'olfattometro . Le estremità libere dei rami del tubo a Y erano collegate con rispettive camere contenenti delle sorgenti di odore, anch'esse in vetro. A copper wire was placed inside the Y-tube to facilitate the movement of the aphids towards one or the other branch of the olfactometer. The free ends of the Y-tube branches were connected with respective chambers containing odor sources, also made of glass.

3. Esecuzione delle prove 3. Execution of tests

Prima di ogni prova, 1' olfattometro era lavato con acqua e con una sostanza detergente. In ogni prova, in una delle due camere era disposto un campione formato da una soluzione in esano di uno dei composti da provare, alla concentrazione dello 0,5%. Nell'altra camera era disposto 1 microlitro di esano come controllo. Un flusso d'aria era stabilito tra ciascuna camera e il corpo principale attraverso il rispettivo ramo, con una portata di 0,5 litri/minuto, in modo da generare nell'olfattometro due flussi d'aria laminari ben distinti. L'olfattometro era mantenuto a 20-25°C. Per guidare gli afidi, veniva inoltre attivata una sorgente luminosa. Before each test, the olfactometer was washed with water and a detergent substance. In each test, a sample was placed in one of the two chambers consisting of a solution in hexane of one of the compounds to be tested, at a concentration of 0.5%. In the other chamber, 1 microliter of hexane was placed as a control. An air flow was established between each chamber and the main body through the respective branch, with a flow rate of 0.5 liters / minute, so as to generate two distinct laminar air flows in the olfactometer. The olfactometer was kept at 20-25 ° C. A light source was also activated to guide the aphids.

Gruppi di 20 afidi venivano introdotti nell'estremità libera del corpo principale, e lasciati liberi di camminare all'interno dell' olfattometro . Dopo 15 minuti, veniva registrato il numero di afidi gli afidi che si trovavano nel lato del controllo (C) e il numero di afidi che si trovavano nel lato del campione (T). Gli afidi che non si muovevano nel corpo principale venivano contati, ma venivano esclusi nell'analisi. Ogni test comprendeva quattro repliche delle azioni ora descritte. Groups of 20 aphids were introduced into the free end of the main body, and left free to walk inside the olfactometer. After 15 minutes, the number of aphids that were in the control side (C) and the number of aphids that were in the sample side (T) were recorded. Aphids that did not move in the main body were counted but excluded in the analysis. Each test included four replicas of the actions just described.

4. Calcolo del potere repellente 4. Calculation of repellent power

Il potere repellente di ciascun composto veniva stimato a partire dalla percentuale di afidi che sceglievano il ramo contenente il composto in esame rispetto al numero totali di afidi che avevano effettuato una scelta. Più in dettaglio, è definito un "indice di repellenza" : The repellent power of each compound was estimated starting from the percentage of aphids that chose the branch containing the compound in question compared to the total number of aphids that had made a choice. More specifically, a "repellency index" is defined:

R = (C-T)/ (C+T). R = (C-T) / (C + T).

Un valore R=1 indica quindi che tutti gli afidi sono stati ritrovati nel ramo del controllo, mentre R=0 indica che gli afidi si sono ripartiti equamente tra i due rami. Il potere repellente di ciascun composto è stato poi analizzato sulla base del numero tortale di afidi presenti in ciascun ramo dell' olfattometro mediante il test di verifica d'ipotesi χ . Tale test permette di verificare se vi è una differenza significativa tra il numero di afidi osservato in ciascun ramo e il numero atteso in base all' "ipotesi nulla" di una distribuzione degli afidi 50:50. A value R = 1 therefore indicates that all the aphids were found in the control branch, while R = 0 indicates that the aphids were equally divided between the two branches. The repellent power of each compound was then analyzed on the basis of the tortal number of aphids present in each branch of the olfactometer by means of the hypothesis test χ. This test allows to verify if there is a significant difference between the number of aphids observed in each branch and the number expected based on the "null hypothesis" of a 50:50 aphid distribution.

5. Risultati 5. Results

I risultati delle prove di comportamento sono riassunti in figura 1. Vengono riportati in un primo istogramma i valori del potere repellente R di ciascuno dei composti presi in considerazione nei riguardi di afidi della specie Acyrthosiphon pisum, e in un secondo istogramma i valori del potere repellente R nei riguardi di afidi Myzus persicae. Si possono considerare repellenti nei riguardi degli afidi delle rispettive specie i composti che hanno un potere repellente superiore a 0,5. The results of the behavior tests are summarized in figure 1. The values of the repellent power R of each of the compounds taken into consideration with regard to aphids of the species Acyrthosiphon pisum are reported in a first histogram, and in a second histogram the values of the repellent power R in regards to aphids Myzus persicae. Compounds that have a repellent power greater than 0.5 can be considered repellent towards aphids of the respective species.

Gli afidi Myzus persicae mostravano una risposta più forte rispetto agli afidi Acyrthosiphon pisum. Tuttavia, la risposta di comportamento degli esemplari delle due specie segue sostanzialmente il medesimo schema. Myzus persicae aphids showed a stronger response than Acyrthosiphon pisum aphids. However, the behavioral response of the specimens of the two species basically follows the same pattern.

Saggi di legame Binding essays

È stata inoltre studiata la capacità dei 30 composti di legarsi con sei proteine leganti gli odori, rappresentative dell'intero corredo di OBP. Tali proteine sono OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBP10. Queste sono state prodotte, con alte rese, e successivamente purificate cromatograficamente, ricorrendo a tecniche convenzionali . The ability of the 30 compounds to bind with six odor-binding proteins, representative of the entire OBP set, was also investigated. Such proteins are OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBP10. These were produced, with high yields, and subsequently purified chromatographically, using conventional techniques.

Prove di legame Bond tests

1. Predisposizione delle proteine leganti gli odori (OBP) 1. Predisposition of odor binding proteins (OBPs)

Adatte quantità di proteine leganti gli odori del gruppo formato da OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBP10, sono state predisposte con una convenzionale tecnica di espressione batterica. Suitable quantities of odor-binding proteins of the group formed by OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBP10, have been prepared with a conventional bacterial expression technique.

2. Misure di fluorescenza 2. Fluorescence measurements

Su uno strumento Jasco FP-750 sono stati registrati spettri di emissione di fluorescenza a 25°C con una configurazione ad angolo retto, con una cuvette di quarzo del percorso ottico di 1 cm, e fessure di 5 nm sia per l'eccitazione che per l'emissione. La proteina è stata disciolta in 50 mM di buffer Tris-HCl, pH 7,4, mentre i ligandi sono stati aggiunti come soluzione in metanolo 1 mM . Fluorescence emission spectra at 25 ° C were recorded on a Jasco FP-750 instrument with a right angle configuration, with a 1 cm optical path quartz cuvette, and 5 nm slits for both excitation and the issue. The protein was dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, while the ligands were added as a solution in 1 mM methanol.

3. Saggi di legame mediante fluorescenza. 3. Binding assays by fluorescence.

Per misurare l'affinità del ligando fluorescente N-phenyl-l-naphthylamine (1-NPN) verso ciascuna proteina, una soluzione 2 μΜ della proteina in 50 mM di Tris-HCl, pH 7,4, è stata titolata con aliquote di ligando 1 mM in metanolo, fino ad una concentrazione finale di 2-16 μΜ. Il campione è stato eccitato a 337 nm e sono stati registrati spettri di emissione tra 380 e 450 nm. L'affinità per altri ligandi è stata misurata in saggi di legame competitivi, usando 1-NPN come reporter fluorescente ad una concentrazione 2 μΜ e a concentrazioni 2-16 μΜ per ciascun competitore. To measure the affinity of the N-phenyl-l-naphthylamine (1-NPN) fluorescent ligand towards each protein, a 2 μΜ solution of the protein in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, was titrated with aliquots of ligand 1 mM in methanol, up to a final concentration of 2-16 μΜ. The sample was excited at 337 nm and emission spectra between 380 and 450 nm were recorded. Affinity for other ligands was measured in competitive binding assays, using 1-NPN as a fluorescent reporter at 2 μΜ concentration and 2-16 μΜ concentrations for each competitor.

Per determinare le costanti di legame, i valori di intensità corrispondenti al massimo dell'emissione di fluorescenza sono stati riportati in funzione delle concentrazioni di ligando libero. Le curve sono state tracciate usando il software Prism, che ha permesso di calcolare le costanti di dissociazione e la stechiometrico di legame, assumendo che la proteina fosse attiva al 100%. Le costanti di dissociazione dei competitori sono state calcolate ai corrispondenti valori di IC50 usando l'equazione KD= [IC50]/1+[1-NPN]/Kl-NPN, in cui [1-NPN] rappresenta la concentrazione libera di 1-NPN e Kl-NPN rappresenta la costante di dissociazione del complesso Proteina/1-NPN . To determine the binding constants, the intensity values corresponding to the maximum of the fluorescence emission were reported as a function of the free ligand concentrations. The curves were plotted using the Prism software, which made it possible to calculate the dissociation constants and the stoichiometric binding, assuming that the protein was 100% active. The dissociation constants of the competitors were calculated to the corresponding values of IC50 using the equation KD = [IC50] / 1 + [1-NPN] / Kl-NPN, where [1-NPN] represents the free concentration of 1- NPN and Kl-NPN represents the dissociation constant of the Protein / 1-NPN complex.

4. Risultati 4. Results

La tabella 2 riporta i risultati dei saggi di legame, ossia riporta le costanti di dissociazione dei complessi dei trenta singoli composti considerati, I-XXX con le sei proteine leganti gli odori OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8 e OBP10. Sono riportati i valori delle costanti di dissociazione in unità micro molari (μΜ). L'assenza del dato indica una costante di dissociazione troppo elevata per essere calcolata, quindi una bassa affinità di legame verso la proteina. Table 2 reports the results of the binding assays, i.e. it reports the dissociation constants of the complexes of the thirty individual compounds considered, I-XXX with the six odor-binding proteins OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8 and OBP10. The values of the dissociation constants are reported in micro molar units (μΜ). The absence of the data indicates a dissociation constant that is too high to be calculated, therefore a low binding affinity towards the protein.

Ciascuna OBP mostrava uno spettro di legame differente, con una larga specificità verso un certo numero di composti. Considerando la selettività di ciascun composto, si osserva che alcuni composti, tra cui (Ε)-β-Farnesene, e molecole strutturalmente simili all'(E)-β-Farnesene, legano solo OBP3 e/o OBP7, mentre altri mostrano un'affinità misurabile con altre OBP, oppure non legano nessuna delle proteine considerate. Each OBP exhibited a different binding spectrum, with a broad specificity towards a number of compounds. Considering the selectivity of each compound, it is observed that some compounds, including (Ε) -β-Farnesene, and molecules structurally similar to (E) -β-Farnesene, bind only OBP3 and / or OBP7, while others show a measurable affinity with other OBPs, or they do not bind any of the proteins considered.

- TABELLA 2 - - TABLE 2 -

Anche se quale saggio di legame è stato descritto soltanto un saggio in fluorescenza, resta inteso che è possibile ricorrere a un altro saggio di tipo noto, ad esempio un saggio radioattivo, un saggio basato sulla tecnica del "Surface Plasmon Resonance" (Biacore®) che sfrutta la variazione dell'indice di rifrazione della superficie di un prisma in presenza o meno di un complesso ligando/proteina, o altri protocolli noti in letteratura. Even if only one fluorescence assay has been described as the binding assay, it is understood that it is possible to use another assay of a known type, for example a radioactive assay, an assay based on the technique of "Surface Plasmon Resonance" (Biacore®) which exploits the variation of the refractive index of the surface of a prism in the presence or absence of a ligand / protein complex, or other protocols known in literature.

Correlazione tra potere repellente verso gli afidi e capacità di legare le proteine leganti gli odori 0BP3, 0BP7. Correlation between aphid repellent power and ability to bind odor binding proteins 0BP3, 0BP7.

I risultati delle prove di comportamento e delle prove di legame hanno permesso di validare la correlazione tra potere repellente e capacità di legare in modo esclusivo le due proteine leganti gli odori OBP3 e OBP7 rispetto alle altre proteine leganti gli odori prese in considerazione, come sarà descritto nel seguito. The results of the behavior tests and the binding tests allowed to validate the correlation between repellent power and the ability to exclusively bind the two odor binding proteins OBP3 and OBP7 compared to the other odor binding proteins considered, as will be described. in the sequel.

Con riferimento ancora alla figura 1, sono riportate in nero le barre degli istogrammi dei composti che, alla luce dei saggi di legame, legano in modo specifico le proteine OBP3 e/o OBP7, ovvero dei composti che legano la proteina OBP3 e/o la proteina OBP7 e non legano alcuna delle altre proteine del gruppo, cioè OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO. Sono invece riportate in nero le barre degli istogrammi dei composti che non legano almeno una delle proteine OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO e/o che non legano le proteine OBP3 e/o OBP7. With reference again to Figure 1, the bars of the histograms of the compounds that, in the light of the binding assays, specifically bind the OBP3 and / or OBP7 proteins, or of the compounds that bind the OBP3 protein and / or the OBP7 protein and do not bind any of the other group proteins, i.e. OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO. On the other hand, the bars of the histograms of the compounds that do not bind at least one of the proteins OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO and / or that do not bind the proteins OBP3 and / or OBP7 are shown in black.

Dal diagramma di figura 1 si deduce che tutti i composti che legano in modo specifico le proteine OBP3 e/o OBP7 sono anche repellenti significativi per gli afidi Myzus persicae. La stessa regolarità si riscontra per gli afidi Acyrthosiphon pisum, con le eccezioni dei composti XII, XXI e XXIII. Tuttavia, in questi casi i valori calcolati di χ<2>, nell'ordine 3,7, 3,7, 3,39 erano molto prossimi al valore di accettabilità 3,84. From the diagram of figure 1 it can be deduced that all the compounds that specifically bind the OBP3 and / or OBP7 proteins are also significant repellents for Myzus persicae aphids. The same regularity is found for the aphids Acyrthosiphon pisum, with the exceptions of compounds XII, XXI and XXIII. However, in these cases the calculated values of χ <2>, in the order 3.7, 3.7, 3.39 were very close to the acceptability value 3.84.

Inversamente, tutti i composti che legano proteine leganti gli odori diverse da OBP3 e OBP7 non hanno potere repellente nei riguardi degli afidi, con l'eccezione di XIX nel caso degli afidi Myzus persicae e di IX e XV nel caso degli afidi Acyrthosiphon pisum. Conversely, all compounds that bind odor-binding proteins other than OBP3 and OBP7 have no repellent power towards aphids, with the exception of XIX in the case of the aphids Myzus persicae and of IX and XV in the case of the aphids Acyrthosiphon pisum.

In sintesi, i composti che legano in modo specifico le proteine leganti gli odori 0BP3 e 0BP7 hanno una probabilità molto più elevata di essere buoni repellenti per gli afidi rispetto ai composti che legano altre proteine OBP, o nessuna proteina OBP. In summary, compounds that specifically bind odor-binding proteins 0BP3 and 0BP7 are much more likely to be good aphid repellents than compounds that bind other OBP proteins, or no OBP proteins at all.

È quindi possibile stabilire, con una notevole confidenza, se un determinato composto chimico possa essere o no un repellente nei confronti degli afidi, sulla base di un relativamente semplice saggio di legame con un gruppo di proteine come quello sopra indicato. It is therefore possible to establish, with considerable confidence, whether a given chemical compound may or may not be a repellent against aphids, on the basis of a relatively simple binding assay with a group of proteins such as the one indicated above.

La descrizione di cui sopra di una forma realizzativa specifica è in grado di mostrare l'invenzione dal punto di vista concettuale in modo che altri, utilizzando la tecnica nota, potranno modificare e/o adattare in varie applicazioni tale forma realizzativa specifica senza ulteriori ricerche e senza allontanarsi dal concetto inventivo, e, quindi, si intende che tali adattamenti e modifiche saranno considerabili come equivalenti della forma realizzativa specifica. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione. Si intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e per questo non limitativo, The above description of a specific embodiment is able to show the invention from the conceptual point of view so that others, using the known technique, will be able to modify and / or adapt this specific embodiment in various applications without further research and without departing from the inventive concept, and, therefore, it is understood that such adaptations and modifications will be considered as equivalent to the specific embodiment. The means and materials for carrying out the various functions described may be of various nature without thereby departing from the scope of the invention. It is understood that the expressions or terminology used have a purely descriptive purpose and therefore not limitative,

Claims

CLAIMS 1. An aphid repellent compound, consisting of a volatile compound characterized in that it is configured so that when brought into contact with odor binding proteins (OBP) of the group comprising OBP1; OBP3; OBP6; OBP7; OBP8; OBPIO, said volatile compound binds with proteins of said group consisting of OBP3 or OBP7 and does not bind with proteins of said group consisting of OBP1, OBP6, OBP8, OBPIO.

2. A compound according to claim 1, selected from the compounds of general formula: Ri-X [1] m which - Ri is a group of atoms comprising: - a linear aliphatic chain having a number of carbon atoms comprised between 8 and 12; - at least one methyl group -CH3 attached to a non-terminal atom of said aliphatic chain; - X is a group of atoms chosen from: - an optionally substituted phenyl group; - a hydroxyl group for use as aphid repellent, in particular, said aliphatic chain comprises a double bond between two non-terminal unsaturated carbon atoms of said aliphatic chain.

3. A compound according to claim 2, wherein R1 is a group of atoms comprising a plurality of methyl groups -CH3 linked to respective carbon atoms of said aliphatic chain, in particular, a same portion of said aliphatic chain comprising three carbon atoms is bonded to both of said respective carbon atoms, to which said methyl groups are bonded.

4. A compound as per claim 3, wherein said number of carbon atoms n is equal to 9 and said aliphatic chain is a 4,8-dimethyl substituted aliphatic chain, said carbon atoms being numbered increasing starting from a carbon atom bonded to said group of atoms X, said carbon atom bonded to said group of atoms X defining position 1 of said aliphatic chain.

5. A compound according to claim 2, wherein said group of atoms X is a phenyl, in particular said compound is 1-Phenyl-4,8-dimethyl-1,1,7-nonatriene.

6. A compound according to claim 2, wherein said group X is a hydroxyl group, in particular, said number n of carbon atoms of said aliphatic chain is 12, ie said compound is 3,7,1l-trimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-ol, also called Farnesol.

7. A compound according to claim 1, selected from the compounds of general formula: R2-O-CO-R3 [2] m which R2 and R3 are, each independently of the other, groups of atoms comprising: - a linear aliphatic chain having a number of carbon atoms n not exceeding 8; at least one -CH3 methyl group attached to a non-terminal atom of said aliphatic chain, for use as aphid repellent.

8. A compound according to claim 7, wherein R 2 is a group of atoms comprising a plurality of methyl groups -CH3 attached to respective carbon atoms of said aliphatic chain.

9. A compound according to claim 7, wherein said aliphatic chain of said group R2 is selected from - a 3-methyl alkyl chain; - a 7-methyl octyl chain, in particular, said aliphatic chain of said R.2 group is a 3,7-dimethyl octyl chain, wherein said carbon atoms being numbered in increasing order starting from a carbon atom bonded to the ester group -O-CO-, said carbon atom bonded to said group of atoms -O-CO- being at position 1 of said chain aliphatic.

10. A compound as per claim 7, wherein said aliphatic chain of said R3 group is a 4-methyl alkyl chain.

11. A compound as per claim 7, comprising an optionally substituted phenyl group, said phenyl group being bonded to an atom in the ω position of said aliphatic chain of said R2 group and / or of said R3 group, i.e. in the terminal position of said aliphatic chain on the opposite side with respect to the -O-CO ester group, in particular said aliphatic chain of said group R2 is a 3-methyl butyl chain, in particular said compound is isopentyl 4-phenyl butyrate.

12. A compound as per claim 7, wherein said aliphatic chain of said R2 group and / or said R3 group comprises a double bond between two non-terminal unsaturated carbon atoms of said aliphatic chain, in particular at least one of said unsaturated carbon atoms is bonded to said methyl group.

13. A compound as per claim 9, wherein said number of carbon atoms n is equal to 8, in particular said compound is selected between 3,7-dimethyl octyl acetate and geranyl acetate

14. A method for establishing the repellent power of a compound against an aphid, comprising the steps of: - preparing a predetermined quantity of each protein of the group formed by odor binding proteins OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBPIO; - bringing said compound into contact with each of said proteins of said group; - verifying the formation of respective complexes of said compound with said proteins; - determining respective dissociation constant values of said complexes; - classify said compound as - potential repellent compound against aphids if: - at least one dissociation constant value of said complex of said compound with a protein selected from OBP3 and OBP7 is lower than a predetermined threshold value, and if - all the dissociation constant values of complexes of said compound with proteins of said group other than OBP3 and OBP7 are not lower than said threshold value; - non-repellent compound against aphids if: - at least one dissociation constant value of said complex of said compound with a protein selected from OBP3 and OBP7 is not less than a predetermined threshold value, and / or if - at least one dissociation constant value of a complex of said compound with a protein of said group other than OBP3 and OBP7 is lower than said threshold value, in which, in particular, said threshold value is 1CT <5> M.

15. A device for establishing the repellent power of a compound towards an aphid, said device comprising a predetermined quantity of each protein of the group formed by OBP1, OBP3, OBP6, OBP7, OBP8, OBPIO.