ITPI20100017A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF MINIATURIZED BIOSENSORS, AND BIOSENSORS OBTAINED WITH THIS METHOD - Google Patents
METHOD FOR THE PRODUCTION OF MINIATURIZED BIOSENSORS, AND BIOSENSORS OBTAINED WITH THIS METHOD Download PDFInfo
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Description
“METODO PER LA PRODUZIONE DI BIOSENSORI MINIATURIZZATI, E BIOSENSORI OTTENUTI CON TALE METODO†, â € œMETHOD FOR THE PRODUCTION OF MINIATURIZED BIOSENSORS, AND BIOSENSORS OBTAINED WITH THIS METHODâ €,
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Ambito dell’invenzione Scope of the invention
La presente invenzione si riferisce ad un metodo per produrre biosensori miniaturizzati, ed ai biosensori ottenuti mediante tale metodo. The present invention refers to a method for producing miniaturized biosensors, and to the biosensors obtained by means of this method.
Tali biosensori trovano la principale applicazione in campo biologico e biomedico, in particolare nella produzione di: These biosensors find their main application in the biological and biomedical fields, in particular in the production of:
 biochip capaci di rilevare la presenza di determinati analiti in campioni biologici; ï £ § biochips capable of detecting the presence of certain analytes in biological samples;
 supporti per la sintesi sequenziale di oligopeptidi o polipeptidi; - supports for the sequential synthesis of oligopeptides or polypeptides;
 dispositivi per studi di targeting proteico. ï £ § devices for protein targeting studies.
Cenni alla tecnica nota – Problema tecnico Notes on the known technique - Technical problem
Schematicamente, i biosensori comprendono: Schematically, biosensors include:
 un supporto atto ad essere portato in prossimità di un campione; ï £ § a support suitable to be brought near a sample;
 uno strato di un componente biologico adeso ad una superficie del supporto; tale componente biologico à ̈ in grado di interagire con eventuali analiti del campione legandosi ad esso/essi in maniera stabile, in particolare il componente biologico può essere formato da biomolecole come anticorpi o proteine, ma anche microorganismi o cellule; ï £ § a layer of a biological component adhered to a surface of the support; this biological component is able to interact with any analytes in the sample by binding to it / them in a stable manner, in particular the biological component can be formed by biomolecules such as antibodies or proteins, but also microorganisms or cells;
 un trasduttore che converte l’interazione tra il componente biologico e l’analita in un segnale fisico rilevabile; sono noti, in particolare trasduttori elettrochimici, elettroottici, acustici e meccanici. ï £ § a transducer that converts the interaction between the biological component and the analyte into a detectable physical signal; in particular electrochemical, electro-optical, acoustic and mechanical transducers are known.
Attualmente, per la produzione di biosensori si usano supporti in materiali inorganici, come oro, silicio, vetro, oppure supporti polimerici, come polistirene, siliconi, PTFE. Currently, supports made of inorganic materials, such as gold, silicon, glass, or polymeric supports, such as polystyrene, silicones, PTFE are used for the production of biosensors.
Alcuni noti metodi di produzione prevedono l’uso di supporti aventi caratteristiche superficiali idrofobe, e l’applicazione su tali supporti di biomolecole come proteine, in un processo di adsorbimento puramente fisico in cui si sfrutta l’affinità di porzioni delle biomolecole per siffatte superfici. Some known production methods involve the use of supports having hydrophobic surface characteristics, and the application on such supports of biomolecules such as proteins, in a purely physical adsorption process in which the affinity of portions of the biomolecules is exploited to such surfaces.
Tuttavia, le interazioni tra biomolecole e supporto sono poco stabili e non selettive: nel processo di adsorbimento, e durante l’uso del biosensore, si crea una competizione tra specie desiderate e specie indesiderate, e le biomolecole che si intende far adsorbire sul supporto possono esserne rimosse da altre specie, o da sostanze tensioattive. However, the interactions between biomolecules and support are not very stable and non-selective: in the adsorption process, and during the use of the biosensor, a competition is created between desired and unwanted species, and the biomolecules that are intended to be adsorbed on the support. they can be removed by other species, or by surfactant substances.
Le proteine, in particolare possono subire inattivazione e/o denaturazione nel processo di adsorbimento. Vi à ̈ infatti una relazione molto stretta tra il comportamento delle proteine e la loro struttura. Le proteine, impiegate come materiale di interazione biologica nei biosensori, possono esprimere al meglio la propria affinità per gli analiti se sono lasciate libere di assumere le conformazioni che loro competono naturalmente, in particolare, se hanno la possibilità di organizzarsi nelle strutture sopramolecolari terziarie e quaternarie. In particular, proteins can undergo inactivation and / or denaturation in the adsorption process. There is in fact a very close relationship between the behavior of proteins and their structure. Proteins, used as biological interaction material in biosensors, can best express their affinity for analytes if they are left free to assume the conformations that they naturally compete with, in particular, if they have the possibility of organizing themselves in the tertiary and quaternary supramolecular structures .
Altri metodi di realizzazione di sensori miniaturizzati per diagnostica prevedono l’impiego di supporti costituiti da membrane semipermeabili o matrici porose tipo sol-gel, in cui vengono intrappolate le biomolecole; i dispositivi diagnostici così ottenuti possono però interagire solo con analiti le cui dimensioni molecolari e le cui caratteristiche chimiche permettono la permeazione nei pori della membrana o della matrice porosa. Other methods of manufacturing miniaturized sensors for diagnostics involve the use of supports consisting of semipermeable membranes or sol-gel porous matrices, in which the biomolecules are trapped; the diagnostic devices thus obtained can, however, interact only with analytes whose molecular dimensions and chemical characteristics allow permeation into the pores of the membrane or porous matrix.
In altri metodi ancora, le biomolecole sono immobilizzate sul supporto mediante legami di tipo ionico o covalente. A tal fine, la superficie del supporto deve subire un laborioso trattamento preliminare di funzionalizzazione o di attivazione, ossia si devono creare gruppi funzionali a livello superficiale, che siano in grado di interagire con le biomolecole formando con esse tali legami ionici o covalenti. In still other methods, the biomolecules are immobilized on the support by means of ionic or covalent bonds. To this end, the surface of the support must undergo a laborious preliminary functionalization or activation treatment, i.e. functional groups must be created at the surface level, which are able to interact with the biomolecules, forming with them such ionic or covalent bonds.
In particolare, nel caso dei supporti inorganici, la superficie viene generalmente attivata predisponendo monostrati autoassemblanti funzionalizzati. Ad esempio, W00125780 riporta un metodo per la produzione di sensori per uso ambientale tramite deposizione di strati di particelle polimeriche su un supporto collegato a due elettrodi o su un sensore acustico. Le particelle possono essere costituite da polimeri non reattivi o reattivi grazie alla presenza di gruppi carbossilici, ossidrilici, amminici, enzimi, proteine, coloranti, ed altro. In particular, in the case of inorganic supports, the surface is generally activated by preparing functionalized self-assembling monolayers. For example, W00125780 reports a method for manufacturing sensors for environmental use by depositing layers of polymeric particles on a support connected to two electrodes or on an acoustic sensor. The particles can be made up of non-reactive or reactive polymers thanks to the presence of carboxylic, hydroxyl, amino groups, enzymes, proteins, dyes, and more.
Nel caso di supporti polimerici, l’attivazione della superficie del supporto può essere ottenuta mediante funzionalizzazione, ricorrendo a trattamenti con plasma, scarica corona o luce ultravioletta. Ad esempio, in W02007104107 viene riportato un metodo per attivare tramite trattamento con plasma materiali polimerici inerti, in modo da rendere possibile l'immobilizzazione di biomolecole sulla superficie. Il materiale polimerico deve essere costituito da uno strato superficiale idrofilo e da una regione reticolata sottostante. In the case of polymeric supports, the activation of the surface of the support can be obtained by functionalization, using treatments with plasma, corona discharge or ultraviolet light. For example, in WO2007104107 a method is reported for activating by plasma treatment inert polymeric materials, so as to make it possible to immobilize biomolecules on the surface. The polymeric material must consist of a hydrophilic surface layer and an underlying cross-linked region.
Tali procedimenti comportano tuttavia costi e tempi di realizzazione non trascurabili, con costi di produzione dei biosensori non sempre accettabili. Inoltre, l’immobilizzazione delle biomolecole viene realizzata in modo tale che le biomolecole, in particolare le proteine, assumano configurazioni diverse da quelle che avrebbero allo stato libero, per il fatto di essere vincolate chimicamente alla superficie del substrato e, al tempo stesso, di subire anche interazioni di tipo fisico con la superficie stessa, di tipo elettrostatico, per effetto della presenza di gruppi polari nelle molecole del supporto, e per effetto della presenza di porzioni idrofile ed idrofobe di tali molecole. I biosensori ottenuti, quindi, non sono in grado di esprimere sempre prestazioni soddisfacenti. However, these processes involve not negligible costs and production times, with production costs of the biosensors not always acceptable. Furthermore, the immobilization of the biomolecules is carried out in such a way that the biomolecules, in particular proteins, assume different configurations from those they would have in the free state, due to the fact that they are chemically bound to the surface of the substrate and, at the same time, to also undergo interactions of a physical type with the surface itself, of an electrostatic type, due to the presence of polar groups in the molecules of the support, and due to the presence of hydrophilic and hydrophobic portions of such molecules. The biosensors obtained, therefore, are not able to always express satisfactory performances.
In W02007044669 viene descritto un metodo per produrre composizioni per applicazioni di ingegneria tissutale, rilascio di principi attivi, applicazioni diagnostiche ed altro, comprendenti una matrice o un impianto biocompatibile e uno o più gruppi funzionali atti a complessare una o più molecole bioattive fissate alla matrice o all’impianto, in cui la concentrazione del gruppo funzionale della matrice può essere controllato indipendentemente dalla resistenza meccanica della matrice. Il metodo prevede di fissare a tale matrice o impianto uno o più di tali gruppi funzionali adatti a complessare molecole terapeutiche, profilattiche o bioattive, in cui i gruppi funzionali comprendono uno o più gruppi funzionali reattivi. WO2007044669 describes a method for producing compositions for tissue engineering applications, release of active ingredients, diagnostic applications and more, comprising a biocompatible matrix or implant and one or more functional groups suitable for complexing one or more bioactive molecules fixed to the matrix or to the plant, in which the concentration of the functional group of the matrix can be controlled independently of the mechanical strength of the matrix. The method provides for fixing to said matrix or implant one or more of these functional groups suitable for complexing therapeutic, prophylactic or bioactive molecules, in which the functional groups comprise one or more reactive functional groups.
WO0034781 si riferisce ad un metodo e ad un sistema di basso costo per rivelare analiti presenti in un campione, come batteri, lieviti, funghi, anticorpi, antigeni, allergeni, enzimi, ormoni, polisaccaridi, proteine, ed altri, mediante elementi in grado di amplificare la diffrazione ottica. Il sistema comprende un dispositivo biosensibile su cui vengono collegati fisicamente mediante microcontact printing ricettori specifici per gli analiti, secondo una distribuzione predeterminata. I supporti possono comprendere materiali polimerici, in generale privi di gruppi funzionali reattivi. Tali materiali, ad esempio microparticelle di polistirene, vengono legate all’analita prima del contatto con il sensore. Questa procedura può comportare il rischio di compromettere la funzionalità biologica del sistema. WO0034781 refers to a low cost method and system for detecting analytes present in a sample, such as bacteria, yeast, fungi, antibodies, antigens, allergens, enzymes, hormones, polysaccharides, proteins, and others, by means of elements capable of amplify the optical diffraction. The system includes a biosensitive device on which specific receptors for the analytes are physically connected by microcontact printing, according to a predetermined distribution. The supports can comprise polymeric materials, generally free of reactive functional groups. These materials, for example polystyrene microparticles, are bonded to the analyte before contact with the sensor. This procedure may involve the risk of compromising the biological functionality of the system.
WO9207006 riporta un metodo per rivestire una superficie solida con uno strato polimerico idrofilo non ionico, legato in modo covalente a un biopolimero, per immobilizzare biomolecole; tale metodo prevede di legare un polimero cationico alle catene idrofile e quindi la biomolecola alle catene idrofile prima della deposizione dello strato polimerico sulla superficie solida, che deve necessariamente esporre cariche negative in superficie. Il metodo comporta notevoli limitazioni nella scelta del tipo di substrato e del mezzo di reazione; in particolare esso richiede di produrre un rivestimento specifico per ogni biomolecola da utilizzare. WO9207006 reports a method for coating a solid surface with a nonionic hydrophilic polymer layer, covalently bonded to a biopolymer, to immobilize biomolecules; this method involves binding a cationic polymer to the hydrophilic chains and therefore the biomolecule to the hydrophilic chains before depositing the polymeric layer on the solid surface, which must necessarily expose negative charges on the surface. The method involves considerable limitations in the choice of the type of substrate and of the reaction medium; in particular it requires to produce a specific coating for each biomolecule to be used.
L'applicazione US20050158850 descrive biosensori, ed un metodo per la loro produzione, comprendenti uno strato metallico rivestito da un polimero idrofobo sulla cui superficie viene depositato un legante su cui possono essere successivamente immobilizzate biomolecole, secondo una distribuzione predeterminata. In particolare, i gruppi funzionali presenti sul polimero idrofobo ed i gruppi Y vengono attivati in sequenza con carbodimmide e divinilsolfoni. La superficie di poli(metil metacrilato) può essere idrolizzata con NaOH per formare gruppi carbossilici sulla superficie. Secondo tale documento, le biomolecole vengono legate attraverso un processo comprendente ben quattro stadi dopo l'idrolisi, con notevoli complicazioni e difficoltà di trasposizione su scala industriale. Inoltre, il metodo à ̈ adatto solo nel caso di supporti comprendenti un substrato che espone una superficie metallica. The application US20050158850 describes biosensors, and a method for their production, comprising a metal layer coated with a hydrophobic polymer on whose surface a binder is deposited on which biomolecules can be subsequently immobilized, according to a predetermined distribution. In particular, the functional groups present on the hydrophobic polymer and the Y groups are activated in sequence with carbodimide and divinylsulfones. The poly (methyl methacrylate) surface can be hydrolyzed with NaOH to form carboxyl groups on the surface. According to this document, the biomolecules are linked through a process comprising four stages after hydrolysis, with considerable complications and difficulties of transposition on an industrial scale. Furthermore, the method is only suitable for substrates comprising a substrate that exposes a metal surface.
L'applicazione US20050042363 riporta l'uso di film polimerici macroporosi derivanti da monomeri metacrilici (glicidil metacrilato, idrossietil metacrilato, PEG metacrilato, PEG dimetacrilato, ed altri) per la produzione su supporti di vetro e l'impiego di tali film per l'immobilizzazione di biomolecole. Per il legame delle biomolecole non vengono utilizzati gruppi funzionali ottenuti aggiungendo alla miscela di polimerizzazione ulteriori reagenti rispetto a quelli sopra indicati. La presenza di porosità nel film polimerico pone limitazioni riguardo alle dimensioni della biomolecola e dell’analita, e inoltre comporta difficoltà di applicazione delle comuni tecniche di controllo della qualità della superficie. The application US20050042363 reports the use of macroporous polymeric films deriving from methacrylic monomers (glycidyl methacrylate, hydroxyethyl methacrylate, PEG methacrylate, PEG dimethacrylate, and others) for the production on glass supports and the use of these films for immobilization of biomolecules. For the binding of the biomolecules functional groups are not used, obtained by adding to the polymerization mixture further reagents than those indicated above. The presence of porosity in the polymer film places limitations on the size of the biomolecule and the analyte, and also involves difficulties in applying the common techniques for controlling the quality of the surface.
Sintesi dell'invenzione Summary of the invention
È quindi uno scopo della presente invenzione fornire un metodo per produrre biosensori miniaturizzati per rilevare la presenza di determinati componenti in campioni biologici, in particolare per produrre biosensori adatti per realizzare dispositivi diagnostici, che consenta di applicare un materiale di interazione biologica su un supporto in modo stabile. It is therefore an object of the present invention to provide a method for producing miniaturized biosensors to detect the presence of certain components in biological samples, in particular to produce biosensors suitable for making diagnostic devices, which allows to apply a biological interaction material on a support in a manner stable.
È uno scopo particolare della presente invenzione fornire siffatti biosensori in cui il materiale di interazione biologica non possa essere facilmente asportato dal supporto quando esposto al campione biologico, in particolare ad un mezzo acquoso e/o fluente. It is a particular object of the present invention to provide such biosensors in which the biological interaction material cannot be easily removed from the support when exposed to the biological sample, in particular to an aqueous and / or flowing medium.
È inoltre uno scopo della presente invenzione fornire un siffatto metodo, che consenta di applicare il materiale di interazione biologica sul supporto in modo riproducibile, in cui sia quindi possibile predeterminare la distribuzione delle molecole del materiale di interazione biologica, e dei rispettivi gruppi funzionali, sulla superficie del supporto. It is also an object of the present invention to provide such a method, which allows to apply the biological interaction material on the support in a reproducible way, in which it is therefore possible to predetermine the distribution of the molecules of the biological interaction material, and of the respective functional groups, on the support surface.
È poi uno scopo dell’invenzione fornire un siffatto metodo in cui le biomolecole, in particolare proteine, siano legate stabilmente al supporto, senza modificarne significativamente l'attività biologica, ossia senza che le biomolecole subiscano apprezzabile denaturazione e/o inattivazione per effetto dell’applicazione sulla superficie del supporto. It is also an aim of the invention to provide such a method in which the biomolecules, in particular proteins, are stably bound to the support, without significantly modifying their biological activity, i.e. without the biomolecules undergoing appreciable denaturation and / or inactivation due to the effect of € ™ application on the surface of the support.
È un altro scopo dell’invenzione fornire tali dispositivi miniaturizzati, in cui si utilizzino proteine quali materiali di interazione con il campione biologico, che garantisca prestazioni migliori rispetto ai dispositivi di tecnica nota. It is another object of the invention to provide such miniaturized devices, in which proteins are used as materials for interaction with the biological sample, which guarantee better performance than devices of the known art.
È inoltre uno scopo della presente invenzione fornire un metodo per produrre siffatti biosensori in modo più semplice ed economico rispetto ai metodi noti. It is also an object of the present invention to provide a method for producing such biosensors in a simpler and more economical way than known methods.
È altresì uno scopo dell’invenzione fornire tali dispositivi diagnostici miniaturizzati che abbiano un costo inferiore rispetto ai dispositivi noti. It is also an object of the invention to provide such miniaturized diagnostic devices which have a lower cost than known devices.
È un altro scopo particolare della presente invenzione fornire un siffatto metodo in cui la superficie del supporto possa essere realizzata in modo semplice ed economico, in particolare, mediante deposizione di una soluzione di un materiale polimerico. It is another particular object of the present invention to provide such a method in which the surface of the support can be made in a simple and economical way, in particular, by depositing a solution of a polymeric material.
È un ulteriore scopo della presente invenzione fornire biosensori che non comportino limitazioni di rilievo alle dimensioni molecolari ed alle caratteristiche chimiche degli analiti. It is a further object of the present invention to provide biosensors which do not involve significant limitations to the molecular dimensions and chemical characteristics of the analytes.
Questi ed altri scopi sono raggiunti da un metodo per produrre biosensori atti ad interagire con un campione biologico o con un suo componente, ciascun biosensore comprendendo: These and other purposes are achieved by a method for producing biosensors capable of interacting with a biological sample or with one of its components, each biosensor comprising:
 un supporto avente una superficie comprendente un materiale polimerico;  un materiale di interazione biologica, il materiale di interazione biologica essendo applicabile al supporto per formare uno strato di interazione biologica atto a creare un’interazione con il campione o con un suo componente quando il biosensore à ̈ posto in una prossimità del campione, A support having a surface comprising a polymeric material; ï £ § a biological interaction material, the biological interaction material being applicable to the support to form a biological interaction layer capable of creating an interaction with the sample or with one of its components when the biosensor is placed in a proximity of the sample,
il metodo comprendendo le fasi di: the method including the steps of:
 predisposizione del supporto; ï £ § preparation of the support;
 applicazione del materiale di interazione biologica sulla superficie del supporto; ï £ § application of the biological interaction material on the surface of the support;
in cui la fase di applicazione del materiale di interazione biologica sulla superficie del supporto comprende una creazione di un legame chimico tra un gruppo funzionale del materiale di interazione biologica ed un gruppo funzionale del materiale polimerico del supporto, e wherein the step of applying the biological interaction material to the surface of the support comprises a creation of a chemical bond between a functional group of the biological interaction material and a functional group of the polymeric material of the support, and
 regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto, in modo che l’interazione creata tra il campione biologico o il componente e lo strato di interazione biologica applicato sulla superficie del supporto abbia intensità sostanzialmente eguale ad una interazione tra il campione o il componente e lo strato di interazione biologica libero, ossia non vincolato al supporto. ï £ § regulation of hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support, so that the interaction created between the biological sample or component and the biological interaction layer applied on the surface of the support has an intensity substantially equal to an interaction between the sample or the component and the biological interaction layer free, i.e. not bound to the support.
Il legame chimico tra il gruppo funzionale del materiale molecolare dello strato di interazione biologica ed il gruppo funzionale del materiale polimerico della superficie del supporto può essere di tipo covalente o ionico. The chemical bond between the functional group of the molecular material of the biological interaction layer and the functional group of the polymeric material of the surface of the support can be of the covalent or ionic type.
In particolare, lo strato di interazione biologica comprende un materiale molecolare di origine biologica, formato cioà ̈ da biomolecole. In particular, the biological interaction layer comprises a molecular material of biological origin, that is, formed by biomolecules.
Vantaggiosamente, le biomolecole sono proteine. Secondo un altro aspetto, il materiale molecolare può comprendere molecole formate da unità monomeriche legate da legami peptidici. Advantageously, the biomolecules are proteins. According to another aspect, the molecular material can comprise molecules formed by monomer units linked by peptide bonds.
In particolare, le proteine sono scelte tra anticorpi, frammenti di anticorpo, antigeni, parti di antigene, enzimi, glicoproteine, una combinazione di tali proteine. In particular, proteins are chosen from antibodies, antibody fragments, antigens, parts of antigen, enzymes, glycoproteins, a combination of such proteins.
In alternativa, il materiale di origine biologica può essere un acido nucleico, ad esempio DNA, o un suo frammento. Alternatively, the material of biological origin can be a nucleic acid, such as DNA, or a fragment thereof.
Il materiale polimerico della superficie del supporto può essere un materiale polimerico di origine naturale, in particolare può comprendere polisaccaridi. The polymeric material of the surface of the support can be a polymeric material of natural origin, in particular it can include polysaccharides.
L’idrofilia della superficie del supporto può essere determinata studiando il comportamento dell’acqua quando questa venga posta in contatto con tale superficie. In altre parole, à ̈ possibile classificare la superficie secondo una scala di idrofilia/idrofobia basata sul valore che assume statisticamente l’angolo formato da una goccia d’acqua in condizioni statiche con la superficie, come meglio descritto più in dettaglio nel seguito. The hydrophilicity of the surface of the support can be determined by studying the behavior of water when it is placed in contact with this surface. In other words, it is possible to classify the surface according to a scale of hydrophilicity / hydrophobia based on the value that statistically assumes the angle formed by a drop of water in static conditions with the surface, as better described in more detail below. .
In particolare, il materiale polimerico del supporto à ̈ un polimero di sintesi, e la fase di regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto prevede una fase di polimerizzazione, secondo un rapporto molare predeterminato, di una pluralità di monomeri aventi rispettive idrofilie in modo da ottenere un polimero avente una idrofilia prefissata, dipendente da tale rapporto molare. In particular, the polymeric material of the support is a synthetic polymer, and the step of regulating the hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support provides a polymerization step, according to a predetermined molar ratio, of a plurality of monomers having respective hydrophilic to obtain a polymer having a predetermined hydrophilicity, dependent on this molar ratio.
In particolare, il polimero di sintesi può comprendere unità di tipo stirenico. In particular, the synthetic polymer can comprise units of the styrenic type.
Preferibilmente, le unità di tipo stirenico sono derivate dal clorometilstirene (CMS). Ciascun gruppo clorometilenico fornisce un sito reattivo, o un suo precursore, atto a legare chimicamente una biomolecola, in particolare una proteina, con il polimero, creando un vincolo stabile tra lo strato di interazione biologica e la superficie del supporto, mediante una reazione in cui il cloruro alchilico subisce un processo di sostituzione da parte di un gruppo nucleofilo. Preferably, the styrene-type units are derived from chloromethylstyrene (CMS). Each chloromethylene group provides a reactive site, or a precursor thereof, capable of chemically binding a biomolecule, in particular a protein, with the polymer, creating a stable bond between the biological interaction layer and the surface of the support, by means of a reaction in which alkyl chloride undergoes a substitution process by a nucleophilic group.
In particolare, il polimero di sintesi à ̈ un polimero del CMS e dello stirene: In particular, the synthetic polymer is a polymer of CMS and styrene:
Clorometilstirene Stirene Chloromethylstyrene Styrene
La fase di regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto prevede allora una fase di polimerizzazione di CMS con stirene, in cui CMS e stirene hanno un rapporto molare predeterminato. La polimerizzazione con lo stirene permette di modulare la concentrazione dei siti reattivi forniti dai gruppi clorometilenici e quindi permette di modulare l’idrofilia della superficie del substrato in funzione della o delle biomolecole previste per formare lo strato di interazione biologica, senza modificare sensibilmente le proprietà meccaniche della superficie del substrato e senza rendere il polimero solubile nei mezzi acquosi. Inoltre, il CMS e lo stirene sono monomeri di facile reperibilità e di basso costo, che agevolano la preparazione di biosensori in modo economico. The step of regulating the hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support then provides a step of polymerization of CMS with styrene, in which CMS and styrene have a predetermined molar ratio. Polymerization with styrene allows to modulate the concentration of reactive sites supplied by chloromethylene groups and therefore allows to modulate the hydrophilicity of the substrate surface as a function of the biomolecule (s) expected to form the biological interaction layer, without significantly changing the properties of the substrate surface and without making the polymer soluble in aqueous media. Furthermore, CMS and styrene are easily available and low cost monomers, which facilitate the preparation of biosensors in an economical way.
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Polimero CMS-Stirene CMS-Styrene polymer
Preferibilmente, il polimero del CMS e dello stirene ha un contenuto di unità derivate dal CMS compreso tra 0 e 15% mol, in particolare tale contenuto varia da 0,1 a 10%. Tale intervallo di concentrazione di unità derivate dal CMS contiene valori di concentrazione cui corrispondono densità di siti reattivi e valori di idrofilia adatti per legare stabilmente molte biomolecole utili per formare lo strato di interazione biologica, in particolare per legare stabilmente la maggior parte delle proteine, al tempo stesso senza che le biomolecole perdano la loro conformazione naturale, e, quindi le loro proprietà utili. Preferably, the CMS and styrene polymer has a content of units derived from CMS ranging from 0 to 15% mol, in particular this content ranges from 0.1 to 10%. This concentration range of units derived from CMS contains concentration values which correspond to densities of reactive sites and hydrophilic values suitable for stably binding many biomolecules useful for forming the biological interaction layer, in particular for stably binding most of the proteins, to the at the same time without the biomolecules losing their natural conformation, and therefore their useful properties.
In alternativa, il polimero di sintesi comprende unità di tipo (met)acrilico, preferibilmente unità derivanti da un estere metacrilico, ossia da un metacrilato. I legami di tipo estere nella catena laterale del polimero possono infatti essere facilmente idrolizzati in gruppi carbossilici, i quali sono in grado di legarsi direttamente con gruppi funzionali di biomolecole, tipicamente con i gruppi funzionali amminici presenti nelle catene laterali dei residui amminoacidici, o di subire un ulteriore processo di attivazione come indicato nel seguito. Alternatively, the synthetic polymer comprises units of the (meth) acrylic type, preferably units deriving from a methacrylic ester, ie from a methacrylate. The ester type bonds in the side chain of the polymer can in fact be easily hydrolyzed into carboxylic groups, which are able to bind directly with functional groups of biomolecules, typically with the amino functional groups present in the side chains of amino acid residues, or to undergo a further activation process as indicated below.
L’unità di tipo metacrilico può essere un’unità derivata dal glicidil metacrilato (GMA). In particolare, il polimero à ̈ un polimero del GMA e di un monomero scelto tra idrossietil metacrilato (HEMA) e metil metacrilato (MMA), o preferibilmente una combinazione di HEMA e MMA: The methacrylic type unit can be a unit derived from glycidyl methacrylate (GMA). In particular, the polymer is a polymer of GMA and a monomer selected from hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and methyl methacrylate (MMA), or preferably a combination of HEMA and MMA:
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GMA HEMA MMA GMA HEMA MMA
La fase di regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto prevede allora una fase di polimerizzazione di GMA con HEMA e/o MMA, in cui GMA e HEMA e/o MMA hanno un rapporto molare predeterminato. The step of regulating the hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support then provides a step of polymerization of GMA with HEMA and / or MMA, in which GMA and HEMA and / or MMA have a predetermined molar ratio.
Polimero GMA-HEMA-MMA GMA-HEMA-MMA polymer
I gruppi laterali epossidici forniti dalle unità GMA, sono di per sé in grado di reagire con i gruppi nucleofili delle proteine; inoltre, essi possono facilmente subire una scissione tanto in ambiente acido che in ambiente basico o neutro, formando catene laterali idrofile, tali da attenuare le interazioni di tipo puramente fisico tra biomolecole e polimero. In tal modo, le uniche interazioni tra le biomolecole e la superficie del supporto sono definite dai siti reattivi, secondo una opportuna densità o distribuzione superficiale, e si hanno limitati fenomeni di denaturazione delle proteine; inoltre, la distribuzione superficiale dei siti reattivi, dipendendo dalla concentrazione di particolari unità monomeriche, à ̈ riproducibile con una relativa facilità , cosa che rende riproducibili le caratteristiche dello strato di interazione biologica e la produzione di serie dei biosensori secondo l’invenzione. L’HEMA ha anch’esso lo scopo di fornire unità idrofile, ma anche di contribuire alla processabilità del polimero, in particolare nel caso in cui esso debba essere disposto sulla superficie di un substrato eterogeneo, ad esempio di vetro. Il MMA ha lo scopo di controllare le interazioni del polimero sia con solventi organici che con mezzi acquosi, funge quindi da regolatore di solubilità . La solubilità nei solventi organici à ̈ una caratteristica utile per ragioni di processo, consentendo di depositare il polimero da soluzione, mentre la solubilità nei mezzi acquosi à ̈ da evitare in quanto molti campioni biologici contengono mezzi acquosi. The epoxy side groups provided by the GMA units are themselves capable of reacting with the nucleophilic groups of proteins; moreover, they can easily undergo a cleavage both in an acidic environment and in a basic or neutral environment, forming hydrophilic side chains, such as to attenuate the purely physical interactions between biomolecules and polymer. In this way, the only interactions between the biomolecules and the surface of the support are defined by the reactive sites, according to an appropriate density or surface distribution, and there are limited phenomena of denaturation of the proteins; moreover, the surface distribution of the reactive sites, depending on the concentration of particular monomer units, is reproducible with relative ease, which makes the characteristics of the biological interaction layer and the series production of the biosensors according to the invention reproducible. HEMA also has the purpose of providing hydrophilic units, but also of contributing to the processability of the polymer, in particular in the case in which it must be placed on the surface of a heterogeneous substrate, for example glass. The MMA has the purpose of controlling the interactions of the polymer both with organic solvents and with aqueous media, therefore it acts as a solubility regulator. Solubility in organic solvents is a useful feature for process reasons, allowing the polymer to be deposited as a solution, while solubility in aqueous media is to be avoided as many biological samples contain aqueous media.
In alternativa, ma non esclusivamente, l’unità di tipo metacrilico può essere un’unità derivata da un polietilenglicol metacrilato (PEGMA), comprendente una catena laterale derivata da un polietilenglicole (PEG) avente un peso molecolare predeterminato: Alternatively, but not exclusively, the methacrylic type unit can be a unit derived from a polyethylene glycol methacrylate (PEGMA), comprising a side chain derived from a polyethylene glycol (PEG) having a predetermined molecular weight:
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Polietilenglicol metacrilato (PEGMA) Polyethylene glycol methacrylate (PEGMA)
Come nel caso dei gruppi epossidici del GMA, le catene laterali derivate dal PEG, fortemente idrofile, sono in grado di respingere biomolecole, ad esempio proteine, minimizzando i fenomeni di adsorbimento puramente fisico. I gruppi ossidrilici terminali del PEG forniscono siti reattivi per legare le biomolecole, previo trattamento di attivazione, come descritto nel seguito. As in the case of the epoxy groups of GMA, the side chains derived from the PEG, strongly hydrophilic, are able to reject biomolecules, for example proteins, minimizing the phenomena of purely physical adsorption. The terminal hydroxyl groups of the PEG provide reactive sites for binding the biomolecules, upon activation treatment, as described below.
In particolare, il polimero comprende inoltre unità monomeriche derivate da un monometossipolietilenglicol metacrilato (MPEGMA), ossia di un etere metilico del PEGMA, avente un peso molecolare predeterminato. La scelta della concentrazione di unità monomeriche derivanti da MPEGMA e PEGMA nel polimero permette di assegnare la quantità di gruppi ossidrilici, che costituiscono i siti reattivi del polimero della superficie del supporto; una scelta opportuna della percentuale di unità MPEGMA e PEGMA permette quindi di regolare l’idrofilia del polimero e, quindi, le proprietà che ne dipendono, come la solubilità nei mezzi acquosi e la reattività nei confronti delle biomolecole, nei termini visti per le altre classi di polimeri di sintesi sopra descritte. In particular, the polymer further comprises monomer units derived from a monomethoxy polyethylene glycol methacrylate (MPEGMA), ie a methyl ether of PEGMA, having a predetermined molecular weight. The choice of the concentration of monomer units deriving from MPEGMA and PEGMA in the polymer allows to assign the quantity of hydroxyl groups, which constitute the reactive sites of the polymer of the surface of the support; an appropriate choice of the percentage of MPEGMA and PEGMA units therefore allows to regulate the hydrophilicity of the polymer and, therefore, the properties that depend on it, such as the solubility in aqueous media and the reactivity towards biomolecules, in the terms seen for the others classes of synthetic polymers described above.
Monometossipolietilenglicol metacrilato (MPEGMA) Monomethoxy polyethylene glycol methacrylate (MPEGMA)
In particolare, il polimero comprendente unità derivanti dal PEGMA e dal MPEGMA comprende inoltre un alchil (met)acrilato (AlMA) idrofobo, in particolare un monomero scelto tra MMA e un butil metacrilato (BuMA), in particolare n-butil metacrilato (n-BuMA), o una combinazione di MMA e di un BuMA; In particular, the polymer comprising units deriving from PEGMA and MPEGMA also comprises a hydrophobic alkyl (meth) acrylate (AlMA), in particular a monomer selected from MMA and a butyl methacrylate (BuMA), in particular n-butyl methacrylate (n- BuMA), or a combination of MMA and a BuMA;
n-butil metacrilato (n-BuMA) n-butyl methacrylate (n-BuMA)
la fase di regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto, e delle altre caratteristiche, prevede allora una fase di polimerizzazione di PEGMA e di almeno un tale ulteriore monomero di tipo metacrilico, in particolare MMA e/o n-BuMA, in cui il PEGMA e l’ulteriore/gli ulteriori monomeri di tipo metacrilico hanno un rapporto molare predeterminato. Infatti, l’introduzione dell’AlMA nella formulazione consente di ottenere prodotti insolubili nei mezzi acquosi, in modo che il biosensore ottenuto possa entrare in contatto con un ambiente biologico senza perdere le proprie caratteristiche, ossia senza essere disperso o lavato via dal mezzo biologico. Il n-BuMA fornisce una catena laterale meno idrofila del MMA, quindi funge anch’esso da regolatore di idrofilia. the step of regulating hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support, and of the other characteristics, then provides a step of polymerization of PEGMA and of at least one such further monomer of the methacrylic type, in particular MMA and / or n-BuMA, in which the PEGMA and the further monomers of the methacrylic type have a predetermined molar ratio. In fact, the introduction of AlMA in the formulation allows to obtain insoluble products in aqueous media, so that the obtained biosensor can come into contact with a biological environment without losing its characteristics, i.e. without being dispersed or washed away from the medium. biological. N-BuMA provides a less hydrophilic side chain than MMA, so it also acts as a regulator of hydrophilicity.
Preferibilmente, il polimero del PEGMA ha un contenuto di unità derivate dal PEGMA compreso tra 2 e 10% mol. ll polimero ha inoltre preferibilmente un contenuto di unità derivate da un AlMA compreso tra il 30% ed l’80%. Con tali concentrazioni di rispettive unità monomeriche si ottengono valori di idrofilia e densità di siti reattivi adatti per legare stabilmente e senza pregiudicare le caratteristiche di molte biomolecole, in particolare la maggior parte delle proteine, come spiegato in precedenza Preferably, the PEGMA polymer has a content of units derived from PEGMA comprised between 2 and 10% mol. Furthermore, the polymer preferably has a content of units derived from an AlMA between 30% and 80%. With these concentrations of respective monomer units, hydrophilicity and density of reactive sites are obtained, suitable for binding stably and without compromising the characteristics of many biomolecules, in particular most of the proteins, as explained above.
Vantaggiosamente, la fase di regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto prevede una fase di introduzione di gruppi spaziatori idrofili, tali gruppi spaziatori essendo gruppi laterali o terminali rispetto alla catena principale del polimero della superficie del supporto, in particolare gruppi spaziatori comprendenti unità glicoliche o poliglicoliche, ossia unità derivanti dal PEG; pertanto, nel caso delle unità derivate dal PEGMA il gruppo laterale funge inoltre da spaziatore, in misura dipendente alla lunghezza della catena del PEG, ossia del peso molecolare del PEG da cui deriva il PEGMA. Tali effetti possono essere regolati scegliendo opportunamente tale peso molecolare, in particolare la fase di regolazione dell’idrofilia della superficie del supporto comprende allora una fase di scelta di tale peso molecolare. In sintesi, l'uso di comonomeri e/o di spaziatori in grado di ridurre la concentrazione dei siti reattivi, modificare le caratteristiche superficiali del substrato e di allontanare le biomolecole dalla superficie permette di ovviare agli inconvenienti legati ad un numero troppo elevato di gruppi reattivi e/o una superficie molto idrofoba che possono provocare l'inattivazione irreversibile delle biomolecole. Advantageously, the step of regulating the hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support provides for a step of introducing hydrophilic spacer groups, such spacer groups being lateral or terminal groups with respect to the main chain of the polymer of the surface of the support, in particular spacer groups comprising glycol units. o polyglycolic, ie units deriving from the PEG; therefore, in the case of units derived from PEGMA, the lateral group also acts as a spacer, depending on the length of the PEG chain, ie the molecular weight of the PEG from which the PEGMA derives. These effects can be regulated by suitably choosing this molecular weight, in particular the step of regulating the hydrophilicity of the surface of the support then comprises a step of choosing this molecular weight. In summary, the use of comonomers and / or spacers capable of reducing the concentration of reactive sites, modifying the surface characteristics of the substrate and removing the biomolecules from the surface allows to overcome the drawbacks associated with too high a number of reactive groups. and / or a very hydrophobic surface which can cause irreversible inactivation of biomolecules.
Il polimero che forma parte della superficie del supporto può essere anche un polimero di ampia disponibilità commerciale o naturale, scelto tra:  un poliestere, in particolare polietilentereftalato (PET); The polymer that forms part of the surface of the support can also be a widely available commercial or natural polymer, chosen from: ï £ § a polyester, in particular polyethylene terephthalate (PET);
 una poliammide, in particolare nylon; ï £ § a polyamide, in particular nylon;
 un poliuretano; ï £ § a polyurethane;
 un poli(met)acrilato, in particolare polimetil metacrilato (PMMA); - a poly (meth) acrylate, in particular polymethyl methacrylate (PMMA);
 una poliolefina; ï £ § a polyolefin;
 un copolimero vinilico, in particolare un copolimero etilene-acido acrilico, o un copolimero etilene-vinilalcol, o un copolimero etilene-anidride maleica  polivinilcloruro (PVC); • a vinyl copolymer, in particular an ethylene-acrylic acid copolymer, or an ethylene-vinyl alcohol copolymer, or an ethylene-maleic anhydride copolymer;
 un polisaccaride, in particolare cellulosa; ï £ § a polysaccharide, in particular cellulose;
 un silicone; ï £ § a silicone;
 una combinazione di tali polimeri. ï £ § a combination of such polymers.
I polimeri di sintesi precedentemente descritti, come pure i polimeri commerciali sopra indicati sono materiali di basso costo, dotati nativamente di funzionalità reattive ed ulteriormente attivabili ricorrendo a semplici trattamenti chimici superficiali o processi in massa, che sono facilmente attuabili su scala industriale. Il metodo secondo l’invenzione consente quindi di ottenere biosensori con un impegno di risorse economiche inferiore a quello richiesto dai metodi della tecnica nota. The synthesis polymers described above, as well as the commercial polymers indicated above are low cost materials, natively endowed with reactive functionality and further activated by resorting to simple surface chemical treatments or bulk processes, which are easily implemented on an industrial scale. The method according to the invention therefore allows to obtain biosensors with a commitment of economic resources lower than that required by the methods of the known art.
Gruppi reattivi capaci di interagire con biomolecole possono quindi essere già presenti nelle catene laterali o essere introdotti mediante opportune procedure di sintesi nelle catene laterali, ma anche in catena principale o nei gruppi terminali. L'introduzione dei gruppi reattivi può essere effettuata sia mediante modifica in massa di materiali polimerici preformati che per attivazione superficiale successivamente alla loro preparazione in forme idonee all'impiego come substrati. Reactive groups capable of interacting with biomolecules can therefore already be present in the side chains or be introduced by means of suitable synthesis procedures in the side chains, but also in the main chain or in the terminal groups. The introduction of the reactive groups can be carried out either by mass modification of preformed polymeric materials or by surface activation after their preparation in forms suitable for use as substrates.
In una forma realizzativa del metodo, la fase di predisposizione del supporto prevede una fase di deposizione del materiale polimerico su una base, in modo da formare la superficie del supporto utilizzando tecniche di deposizione di tipo noto come solution casting, spin coating, dip coating o spray coating; nel primo caso la base può comprendere un materiale rigido come vetro, silicio o un materiale plastico o cellulosico, su cui à ̈ applicato detto materiale polimerico. In one embodiment of the method, the support preparation step involves a step of depositing the polymeric material on a base, so as to form the surface of the support using known deposition techniques such as solution casting, spin coating, dip coating or spray coating; in the first case the base can comprise a rigid material such as glass, silicon or a plastic or cellulosic material, on which said polymeric material is applied.
In un’altra forma realizzativa, la detta fase di predisposizione del supporto prevede procurare un supporto avente una superficie costituita da detto materiale polimerico, in particolare un supporto integrale realizzato in detto materiale polimerico, ad esempio nella forma di un film di detto materiale polimerico. In another embodiment, said support preparation step provides for providing a support having a surface consisting of said polymeric material, in particular an integral support made of said polymeric material, for example in the form of a film of said polymeric material .
Il materiale polimerico della superficie del supporto può quindi essere uno strato superficiale deposto su un substrato di altro materiale, oppure può costituire il supporto stesso. I materiali polimerici impiegati nel metodo secondo l’invenzione possono essere usati direttamente come supporti, sia rigidi che flessibili, o come rivestimento superficiale di supporti convenzionali, quali ad esempio vetro o silicio. The polymeric material of the surface of the support can therefore be a surface layer deposited on a substrate of another material, or it can constitute the support itself. The polymeric materials used in the method according to the invention can be used directly as supports, both rigid and flexible, or as a surface coating of conventional supports, such as for example glass or silicon.
La fase di regolazione di idrofilia/idrofobia può comprendere una fase di trasformazione chimica di una porzione di catena del materiale polimerico, in cui vengono creati o trasformati i gruppi funzionali del materiale polimerico del supporto. La fase di trasformazione chimica può fornire gruppi funzionali atti a combinarsi con i gruppi funzionali del materiale di interazione biologica, in particolare con i gruppi funzionali di aminoacidi. The step of regulating hydrophilicity / hydrophobia can comprise a step of chemical transformation of a portion of the chain of the polymeric material, in which the functional groups of the polymeric material of the support are created or transformed. The chemical transformation phase can provide functional groups able to combine with the functional groups of the biological interaction material, in particular with the functional groups of amino acids.
In particolare i gruppi funzionali del materiale polimerico sono scelti tra  alogeni; In particular, the functional groups of the polymeric material are selected from halogens;
 epossidi; ï £ § epoxides;
 ossidrili; ï £ § hydroxyls;
 ammidi; ï £ § amides;
 ammine; ï £ § amines;
 esteri; ï £ § foreign;
 carbossili; ï £ § carboxyls;
 carbonili; ï £ § bunkers;
 uretani ï £ § urethanes
 una combinazione di tali gruppi funzionali. ï £ § a combination of these functional groups.
Grazie alla presenza di gruppi reattivi superficiali quali quelli sopra indicati, o quelli introdotti mediante reazione chimica, la superficie del supporto à ̈ in grado di formare legami chimici di tipo ionico o covalente con biomolecole quali proteine, in particolare anticorpi, frammenti di anticorpo, antigeni, parti di antigene, enzimi, glicoproteine, ma anche polisaccaridi nonché oligopeptidi in genere ed acidi nucleici, ad esempio DNA, o relativi frammenti. Questa caratteristica garantisce la possibilità di biofunzionalizzare la superficie del supporto in modo duraturo e riproducibile. Thanks to the presence of surface reactive groups such as those indicated above, or those introduced by chemical reaction, the surface of the support is able to form ionic or covalent chemical bonds with biomolecules such as proteins, in particular antibodies, antibody fragments, antigens , parts of antigen, enzymes, glycoproteins, but also polysaccharides as well as oligopeptides in general and nucleic acids, for example DNA, or relative fragments. This feature guarantees the possibility of biofunctionalizing the surface of the support in a lasting and reproducible way.
in particolare, la fase di creazione o trasformazione di gruppi funzionali nel materiale polimerico à ̈ condotta sulla superficie del supporto. Ciò può verificarsi sia nel caso di supporti integrati nel materiale polimerico sia nel caso di supporti in cui il materiale polimerico viene depositato su un substrato di altro materiale formando la superficie del supporto. in particular, the phase of creation or transformation of functional groups in the polymeric material is carried out on the surface of the support. This can occur both in the case of supports integrated into the polymeric material and in the case of supports in which the polymeric material is deposited on a substrate of another material forming the surface of the support.
Vantaggiosamente, la fase di regolazione di idrofilia/idrofobia della superficie del supporto comprende una fase di attivazione dei gruppi funzionali nel materiale polimerico della superficie del supporto, mediante almeno una fase di reazione del materiale polimerico con un reagente avente almeno due gruppi funzionali atto a reagire con il materiale polimerico. Advantageously, the step of regulating hydrophilicity / hydrophobia of the surface of the support comprises a step of activating the functional groups in the polymeric material of the surface of the support, by means of at least one reaction step of the polymeric material with a reagent having at least two functional groups adapted to react with the polymer material.
In particolare, mediante tale reazione il reagente introduce nel materiale polimerico gruppi funzionali scelti tra: In particular, by means of this reaction the reagent introduces into the polymeric material functional groups selected from:
 gruppi amminici primari o secondari; ï £ § primary or secondary amino groups;
 gruppi aldeidici; ï £ § aldehyde groups;
 gruppi carbossilici. ï £ § carboxyl groups.
 gruppi epossidici ï £ § epoxy groups
 gruppi isocianato ï £ § isocyanate groups
Preferibilmente, la fase di attivazione dei gruppi funzionali del materiale polimerico à ̈ eseguita dopo la fase di deposizione del materiale polimerico sul supporto, ed il reagente può essere un reagente omobifunzionale, ossia formato da molecole ciascuna avente due gruppi funzionali dello stesso tipo, senza che si abbiano reazioni di reticolazione e/o di inattivazione del reagente. Infatti, poiché il polimero à ̈ già deposto a formare la superficie del substrato, la probabilità che ambedue i gruppi funzionali reagiscano con il materiale polimerico sono ridotte rispetto al caso della attivazione in massa. Preferably, the step of activating the functional groups of the polymeric material is performed after the deposition step of the polymeric material on the support, and the reagent can be a homobifunctional reagent, i.e. formed by molecules each having two functional groups of the same type, without cross-linking and / or inactivation reactions of the reagent occur. In fact, since the polymer is already deposited to form the surface of the substrate, the probability that both functional groups react with the polymeric material are reduced compared to the case of mass activation.
In particolare, la fase di attivazione dei gruppi funzionali comprende una reazione di un’ammina avente almeno due gruppi funzionali amminici con un polimero provvisto di unità funzionali derivate da un composto scelto tra: In particular, the activation step of the functional groups comprises a reaction of an amine having at least two amino functional groups with a polymer provided with functional units derived from a compound selected from:
 un monomero comprendente un atomo di alogeno legato ad un carbonio alchilico, come cloruro di vinile e CMS, e/o ï £ § a monomer comprising a halogen atom bonded to an alkyl carbon, such as vinyl chloride and CMS, and / or
 un monomero comprendente un gruppo epossidico come GMA. La diammina può vantaggiosamente comprendere uno spaziatore molecolare, in particolare uno spaziatore avente caratteristiche idrofile. In questo modo, come già osservato, si ottengono gruppi amminici, disponibili per combinarsi con i gruppi carbossilici di biomolecole come proteine, opportunamente distanziati dalla superficie idrofoba del substrato, in modo da limitare i fenomeni di adsorbimento non covalente, e quindi evitare la denaturazione della biomolecola. Preferibilmente, tale spaziatore avente caratteristiche idrofile à ̈ derivato da un polietilenglicole. It is a monomer comprising an epoxy group such as GMA. The diamine can advantageously comprise a molecular spacer, in particular a spacer having hydrophilic characteristics. In this way, as already observed, amino groups are obtained, available to combine with the carboxylic groups of biomolecules such as proteins, suitably spaced from the hydrophobic surface of the substrate, so as to limit the phenomena of non-covalent adsorption, and therefore avoid the denaturation of the biomolecule. Preferably, this spacer having hydrophilic characteristics is derived from a polyethylene glycol.
La diammina à ̈ preferibilmente una α,ω-diammina contenente una porzione di catena molecolare lineare idrofila che funge da distanziatore molecolare, in particolare la porzione di catena à ̈ costituita da unità ossietileniche in sequenza, in un numero, per ciascuna molecola, compreso tra due (come nel caso del α,ω-diamminodietilenglicol) (diam-DEG) The diamine is preferably a Î ±, Ï ‰ -diamine containing a portion of a hydrophilic linear molecular chain which acts as a molecular spacer, in particular the portion of the chain consists of oxyethylene units in sequence, in a number, for each molecule, between two (as in the case of Î ±, Ï ‰ -diaminodiethylene glycol) (diam-DEG)
α,ω-diamminodietilenglicol (diam-DEG) Î ±, Ï ‰ -diaminodiethylene glycol (diam-DEG)
ed un numero tale che la diammina abbia un peso molecolare prossimo a 1500, ad esempio 36 o 37 unità ossietileniche, come nel caso del α,ω-di(3-amminopropil)polietilenglicol (diam-PEG). and a number such that the diamine has a molecular weight close to 1500, for example 36 or 37 oxyethylene units, as in the case of Î ±, Ï ‰ -di (3-aminopropyl) polyethylene glycol (diam-PEG).
α,ω-di(3-amminopropil)polietilenglicol (diam-PEG) Î ±, Ï ‰ -di (3-aminopropyl) polyethylene glycol (diam-PEG)
Attivazione di un gruppo funzionale di un’unità monomerica Activation of a functional group of a monomer unit
derivata dal GMA per reazione con diam(DEG) derived from GMA by reaction with diam (DEG)
Nel caso in cui si utilizzi una poliammina, questa può essere polietileneimmina (PEI). In questo caso, il marcato effetto in termini di aumento di idrofilia può essere spiegato considerando che tale composto possiede una notevole quantità di gruppi reattivi complementari con il polimero clorometilstirenico, tali da formare uno strato sostanzialmente uniforme di PEI, in modo che le caratteristiche finali del supporto dipendono marcatamente dalla PEI e non dal polimero CMS. In altri termini, la funzionalizzazione del CMS fornisce un metodo per esporre una superficie di PEI, caratterizzato da un grado di idrofilia idoneo a combinare biomolecole come proteine senza causarne la denaturazione. If a polyamine is used, it can be polyethyleneimine (PEI). In this case, the marked effect in terms of increased hydrophilicity can be explained by considering that this compound possesses a considerable amount of reactive groups complementary with the chloromethyl styrene polymer, such as to form a substantially uniform layer of PEI, so that the final characteristics of the support depend heavily on PEI and not on CMS polymer. In other words, CMS functionalization provides a method to expose a PEI surface, characterized by a degree of hydrophilicity suitable for combining biomolecules as proteins without causing denaturation.
Polietileneimmina (PEI)In alternativa, la fase di attivazione dei gruppi funzionali prevede una reazione di una dialdeide con un polimero comprendente gruppi amminici primari quali quelli ottenuti in precedenza mediante attivazione con poliammine. Polyethyleneimine (PEI) Alternatively, the activation step of the functional groups involves a reaction of a dialdehyde with a polymer comprising primary amino groups such as those previously obtained by activation with polyamines.
Preferibilmente, la dialdeide à ̈ l’aldeide glutarica. Tale trasformazione introduce sulla superficie del supporto gruppi funzionali immino-aldeidici adatti, ad esempio, a combinarsi con i gruppi amminici delle proteine. Preferably, the dialdehyde is the glutaric aldehyde. This transformation introduces on the surface of the support imino-aldehyde functional groups suitable, for example, to combine with the amino groups of proteins.
Aldeide glutarica Glutaric aldehyde
In alternativa, la fase di attivazione dei gruppi funzionali prevede una reazione di un derivato diisocianato con un polimero comprendente gruppi ossidrilici quali quelli contenenti unità derivate da PEGMA o HEMA oppure gruppi amminici quale quelli ottenuti in precedenza mediante attivazione con poliammine. Alternatively, the functional group activation step involves a reaction of a diisocyanate derivative with a polymer comprising hydroxyl groups such as those containing units derived from PEGMA or HEMA or amino groups such as those previously obtained by activation with polyamines.
In particolare, il derivato diisocianato à ̈ 2,4-diisocianatotoluene. Tale trasformazione introduce sulla superficie del supporto gruppi funzionali isocianato adatti, ad esempio, a combinarsi con i gruppi amminici delle proteine. In particular, the diisocyanate derivative is 2,4-diisocyanatotoluene. This transformation introduces on the surface of the support isocyanate functional groups suitable, for example, to combine with the amino groups of proteins.
O O O O
C C C C
N N N N
2,4-diisocianatotoluene 2,4-diisocyanatotoluene
In particolare, il derivato diisocianato à ̈ 2,4-diisocianatoesano. Tale trasformazione introduce sulla superficie del supporto gruppi funzionali isocianato adatti, ad esempio, a combinarsi con i gruppi amminici delle proteine. In particular, the diisocyanate derivative is 2,4-diisocyanatohexane. This transformation introduces on the surface of the support isocyanate functional groups suitable, for example, to combine with the amino groups of proteins.
O OR
C N C N
N C N C
O OR
2,4-diisocianatoesano 2,4-diisocyanatohexane
In particolare, il derivato diisocianato à ̈ PEG-diisocianato. Tale trasformazione introduce sulla superficie del supporto spaziatori idrofili di PEG e gruppi funzionali isocianato adatti, ad esempio, a combinarsi con i gruppi amminici delle proteine. In particular, the diisocyanate derivative is PEG-diisocyanate. This transformation introduces on the surface of the support hydrophilic PEG spacers and isocyanate functional groups suitable, for example, to combine with the amino groups of proteins.
O OR
C O N C O N
N n O C N n O C
OPEG-diisocianato OPEG-diisocyanate
In alternativa ancora, la fase di attivazione comprende una fase di trattamento con un composto comprendente un acido bicarbossilico o preferibilmente, con una sua corrispondente anidride. In particolare, tale anidride à ̈ l’anidride succinica. In tal modo vengono resi disponibili gruppi carbossilici per la successiva combinazione di gruppi funzionali delle biomolecole, in particolare con gruppi amminici come nel caso delle proteine. Tale composto comprendente un acido carbossilico in forma di anidride può anche essere un copolimero di anidride maleica e di un viniletere alchilico, in particolare di metilviniletere e/o isobutilviniletere. Alternatively still, the activation step comprises a treatment step with a compound comprising a dicarboxylic acid or preferably, with a corresponding anhydride thereof. In particular, this anhydride is succinic anhydride. In this way, carboxylic groups are made available for the subsequent combination of functional groups of the biomolecules, in particular with amino groups as in the case of proteins. This compound comprising a carboxylic acid in the form of anhydride can also be a copolymer of maleic anhydride and an alkyl vinyl ether, in particular of methylvinylether and / or isobutylvinylether.
In questo ultimo caso il copolimero può costituire sia lo strato superficiale deposto su di un substrato che il supporto stesso. In this last case the copolymer can constitute both the surface layer deposited on a substrate and the support itself.
a) b) a) b)
Copolimeri di anidride maleica: a) con metil vinil etere; b) con isobutil vinil etere Copolymers of maleic anhydride: a) with methyl vinyl ether; b) with isobutyl vinyl ether
Ad esempio, tali copolimeri sono in grado di combinarsi con i gruppi ossidrilici di polisaccaridi naturali o semisintetici quali ad esempio cellulosa e suoi derivati permettendo una efficace attivazione di tale polimero naturale impiegato come materiale della superficie del supporto nei confronti della successiva fase di applicazione del materiale di interazione biologica sulla superficie. For example, these copolymers are able to combine with the hydroxyl groups of natural or semisynthetic polysaccharides such as cellulose and its derivatives allowing an effective activation of this natural polymer used as material of the surface of the support towards the subsequent phase of application of the material. of biological interaction on the surface.
Preferibilmente la fase di attivazione con reagenti bicarbossilici prevede inoltre una successiva fase di trasformazione dei gruppi carbossilici introdotti nel polimero del supporto in gruppi esterei reattivi, cioà ̈ atti a subire una ammidazione in presenza di gruppi funzionali amminici del materiale di interazione biologica, in particolare di biomolecole, in particolare dei gruppi amminici delle proteine. Tale trasformazione può essere utilizzata per aumentare l’affinità dei gruppi carbossilici introdotti nel polimero della superficie del supporto nei confronti dei gruppi nucleofili, amminici, presenti sulla macromolecola. Essa può vantaggiosamente essere effettuata trattando il polimero contenente gruppi carbossilici con 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimmide (EDC) Preferably, the activation step with dicarboxylic reagents also provides for a subsequent transformation step of the carboxylic groups introduced into the polymer of the support into reactive ester groups, that is, capable of undergoing an amidation in the presence of amino functional groups of the biological interaction material, in particular of biomolecules, in particular of the amino groups of proteins. This transformation can be used to increase the affinity of the carboxyl groups introduced into the polymer of the surface of the support towards the nucleophilic, amine groups present on the macromolecule. It can advantageously be carried out by treating the polymer containing carboxylic groups with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC)
1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (EDC) 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
e, in un secondo passaggio, con N-idrossisuccinimmide (NHS) che forma con il gruppo funzionale fornito da EDC un gruppo estereo reattivo nel senso sopra indicato. and, in a second step, with N-hydroxysuccinimide (NHS) which forms with the functional group supplied by EDC a reactive ester group in the sense indicated above.
N-idrossisuccinimmide (NHS) N-hydroxysuccinimide (NHS)
Operando in due passaggi si agevola il controllo della reazione e si evita che il materiale di interazione biologica, in particolare la proteina, si trasformi interagendo direttamente con EDC. By operating in two steps, the control of the reaction is facilitated and the biological interaction material, in particular the protein, is prevented from transforming by interacting directly with EDC.
La fase di regolazione di idrofilia/idrofobia permette inoltre di ottimizzare le proprietà della superficie del supporto dal punto di vista della bagnabilità e dal punto di vista morfologico, in funzione delle tecniche di deposizione dello strato di interazione biologica utilizzate, in modo da formare biosensori di dimensioni micrometriche. The hydrophilic / hydrophobic regulation phase also allows to optimize the properties of the surface of the support from the point of view of wettability and from the morphological point of view, according to the deposition techniques of the biological interaction layer used, in order to form biosensors of micrometric dimensions.
Preferibilmente, la fase di applicazione del materiale di interazione biologica sulla superficie del supporto viene effettuata con una tecnica automatizzata, in particolare scelta tra stampa a getto d'inchiostro e micropipettatura. Tali tecniche di deposizione, il cui successo à ̈ reso possibile dalla scelta accurata delle proprietà superficiali del supporto, consentono di produrre facilmente dispositivi miniaturizzati capaci di rivelare simultaneamente un numero molto elevato di analiti. Preferably, the step of applying the biological interaction material on the surface of the support is carried out with an automated technique, in particular chosen between ink jet printing and micropipetting. These deposition techniques, the success of which is made possible by the careful choice of the surface properties of the support, make it possible to easily produce miniaturized devices capable of simultaneously detecting a very large number of analytes.
Secondo un altro aspetto dell’invenzione, gli scopi sopra indicati sono raggiunti da un biosensore ottenuto attraverso il metodo sopra descritto. According to another aspect of the invention, the objects indicated above are achieved by a biosensor obtained through the method described above.
Breve descrizione dei disegni Brief description of the drawings
L’invenzione verrà di seguito illustrata con la descrizione che segue di sue forme realizzative e di esempi, fatta a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni annessi in cui: The invention will be illustrated below with the following description of its embodiments and examples, given by way of non-limiting example, with reference to the attached drawings in which:
 la figura 1 mostra schematicamente il comportamento di una goccia di un mezzo acquoso su una superficie idrofila e su una superficie idrofoba; Figure 1 schematically shows the behavior of a drop of an aqueous medium on a hydrophilic surface and on a hydrophobic surface;
 la figura 2 mostra schematicamente una tecnica di caratterizzazione dell’idrofilia/idrofobia di una superficie, sulla base del comportamento rappresentato in figura 1. Figure 2 schematically shows a technique for characterizing the hydrophilicity / hydrophobia of a surface, on the basis of the behavior represented in figure 1.
Descrizione di forme realizzative preferite Description of preferred embodiments
Con riferimento alle figure 1 e 2, viene descritta una tecnica che permette di dare una valutazione quantitativa del carattere idrofilo/idrofobo di una superficie di un supporto di un biosensore secondo l’invenzione. Come mostrato nella figura 1, il carattere idrofilo o idrofobo della superficie 1 del supporto 2 può essere valutato dalla forma che assume una goccia di acqua 3 disposta sulla superficie 1, più precisamente da una misura di angolo di contatto statico Î ̧ formato tra l’interfaccia goccia-aria e l’interfaccia superficiegoccia. Tanto maggiore à ̈ l’angolo Î ̧, tanto minore à ̈ l’idrofilia della superficie 1 del supporto 2. La misura dell’angolo di contatto Î ̧ può essere condotta con l’attrezzatura schematicamente mostrata in figura 2, comprendente una siringa 4 connessa ad una pompa dosatrice, non mostrata, in grado di depositare una pluralità di gocce 3, una sorgente di luce 5 ed una telecamera 6 associata ad un goniometro per la misura di Î ̧, non rappresentato, un computer 7 comprendente mezzi a programma per determinare il profilo ed i rispettivi angoli di contatto delle gocce 3 estraendo un valore medio di Î ̧, per tenere conto dei fattori ambientali che influenzano l’angolo di contatto statico. With reference to Figures 1 and 2, a technique is described which allows to give a quantitative evaluation of the hydrophilic / hydrophobic character of a surface of a support of a biosensor according to the invention. As shown in Figure 1, the hydrophilic or hydrophobic character of the surface 1 of the support 2 can be evaluated by the shape assumed by a drop of water 3 placed on the surface 1, more precisely by a measurement of the static contact angle Î ̧ formed between the Drop-air interface and the surface-drop interface. The greater the angle Î ̧, the less is the hydrophilicity of the surface 1 of the support 2. The measurement of the contact angle Î ̧ can be carried out with the equipment schematically shown in figure 2, comprising a syringe 4 connected to a metering pump, not shown, capable of depositing a plurality of drops 3, a light source 5 and a camera 6 associated with a goniometer for measuring Î ̧, not shown, a computer 7 comprising program means for determining the profile and the respective contact angles of the drops 3 by extracting an average value of Î ̧, to take into account the environmental factors that influence the static contact angle.
Secondo un aspetto dell’invenzione, la fase di regolazione dell’idrofilia/idrofobia della superficie di un supporto di un biosensore prevede una fase di polimerizzazione di monomeri atti a conferire rispettivi contributi all’idrofilia del polimero, che dipende dal rapporto molare tra i monomeri. L’effetto della polimerizzazione à ̈ mostrato nelle tabelle 1-3 per tre classi di polimeri di sintesi, nell’ordine polimeri CMS-stirene, polimeri contenenti GMA e almeno un monomero scelto tra HEMA e MMA, e polimeri contenenti PEGMA, MPEGMA ed un alchilmetacrilato, in questo caso n-BuMA. Le tabelle mostrano i valori dell’angolo di contatto statico Î ̧ (figura 1) misurato con il metodo sopra indicato (figura 2), con riferimento ad un film polimerico ottenuto medinate spin coating. According to one aspect of the invention, the step of regulating the hydrophilicity / hydrophobia of the surface of a support of a biosensor involves a polymerization step of monomers capable of conferring respective contributions to the hydrophilicity of the polymer, which depends on the molar ratio among the monomers. The polymerization effect is shown in tables 1-3 for three classes of synthetic polymers, in order CMS-styrene polymers, polymers containing GMA and at least one monomer chosen from HEMA and MMA, and polymers containing PEGMA, MPEGMA and an alkyl methacrylate, in this case n-BuMA. The tables show the values of the static contact angle Î ̧ (figure 1) measured with the method indicated above (figure 2), with reference to a polymeric film obtained by spin coating.
Come mostra la tabella 1, nel caso di copolimeri a base di CMS e stirene, all’aumentare del rapporto in moli CMS/stirene aumenta l’idrofilia del polimero, l’angolo Î ̧ passando con sostanziale regolarità tra il valore del polistirene (ca 98°) al valore che compete al policlorometilstirene, prossimo a 86°. Tale andamento dipende dalla maggiore polarità e, quindi, dalla maggiore idrofilia delle unità derivanti dal CMS rispetto alle unità derivate dallo stirene. As shown in table 1, in the case of copolymers based on CMS and styrene, as the ratio in moles CMS / styrene increases, the hydrophilicity of the polymer increases, the angle Î ̧ passing with substantial regularity between the value of polystyrene (about 98 °) to the value that belongs to polychloromethylstyrene, close to 86 °. This trend depends on the greater polarity and, therefore, on the greater hydrophilicity of the units deriving from CMS compared to the units deriving from styrene.
Tabella 1 Table 1
Valori dell’angolo di contatto statico misurato su film Static contact angle values measured on film
da copolimero CMS-stirene from CMS-styrene copolymer
Polimero CMS/Stirene moli Angolo di contatto statico CMS polymer / Styrene moles Static contact angle
PS 0/100 98° PS 0/100 98 °
S1 1/99 96,2°±0,6 S1 1/99 96.2 ° ± 0.6
S2 2/98 93,4°±1,5 S2 2/98 93.4 ° ± 1.5
S4 4/96 90,4°±0,9 S4 4/96 90.4 ° ± 0.9
S7 7/93 92,7°±0,3 S7 7/93 92.7 ° ± 0.3
S10 10/90 88,0°±0,9 S10 10/90 88.0 ° ± 0.9
PCMS 100/0 85,9°±1,0 PCMS 100/0 85.9 ° ± 1.0
In tabella 2 sono riportati valori dell’angolo statico angoli misurati su film da terpolimero GMA/HEMA/MMA (G1) e da copolimero GMA/MMA (G2). Tali polimeri espongono valori dell’angolo statico inferiori a quelli dei polimeri CMS-stirene per il carattere maggiormente idrofilo dei monomeri impiegati. Table 2 shows the values of the static angle angles measured on films from terpolymer GMA / HEMA / MMA (G1) and from copolymer GMA / MMA (G2). These polymers exhibit static angle values lower than those of CMS-styrene polymers due to the more hydrophilic character of the monomers used.
Tabella 2 Table 2
Valori dell’angolo di contatto statico misurato su film da terpolimero GMA/HEMA/MMA e copolimero GMA/MMA Static contact angle values measured on film from GMA / HEMA / MMA terpolymer and GMA / MMA copolymer
Polimero GMA moli HEMA moli MMA moli Angolo di contatto statico Polymer GMA moles HEMA moles MMA moles Static contact angle
G1 10 40 50 66,1°±1,5 G1 10 40 50 66.1 ° ± 1.5
G2 10 0 90 72,2°±0,5 G2 10 0 90 72.2 ° ± 0.5
In tabella 3 sono riportati valori dell’angolo di contatto statico misurati su film da terpolimero PEGMA/MPEGMA/BuMA. L’angolo statico aumenta all’aumentare del contenuto in unità derivanti da n-BuMA. La presenza di frazioni crescenti di PEGMA e MPEGMA aumenta sensibilmente l’idrofilia, riducendo l’angolo Î ̧, che per l’omopolimero del n-BuMA à ̈ circa 85°. Table 3 shows the static contact angle values measured on PEGMA / MPEGMA / BuMA terpolymer film. The static angle increases as the content in units deriving from n-BuMA increases. The presence of increasing fractions of PEGMA and MPEGMA significantly increases hydrophilicity, reducing the angle Î ̧, which for the n-BuMA homopolymer is about 85 °.
Tabella 3 Table 3
Valori dell’angolo di contatto statico misurato su film Static contact angle values measured on film
da terpolimero PEGMA/MPEGMA/BuMA from PEGMA / MPEGMA / BuMA terpolymer
Polimero PEGMA/MPEGMA/BuMA Angolo di contatto statico PEGMA / MPEGMA / BuMA polymer Static contact angle
P4 8/32/60 64,7°±1,7 P4 8/32/60 64.7 ° ± 1.7
P5 6/22/72 72,8°±1,6 P5 6/22/72 72.8 ° ± 1.6
P6 5/14/81 73,1°±0,8 P6 5/14/81 73.1 ° ± 0.8
La sintesi dei polimeri di cui alle tabelle 1, 2 e 3 Ã ̈ stata condotta secondo procedure ben note ad un tecnico del ramo. The synthesis of the polymers referred to in Tables 1, 2 and 3 was carried out according to procedures well known to a person skilled in the art.
Secondo un altro aspetto dell’invenzione, la regolazione di idrofilia avviene attraverso una fase di introduzione di gruppi spaziatori idrofili come catene laterali del polimero che forma la superficie del supporto. Un esempio di tale introduzione à ̈ dato dall’impiego nella miscela di reazione che porta al polimero, di monomeri provvisti di tali gruppi spaziatori. Nel caso dei polimeri del PEGMA e del MPEGMA, sopra ricordati, tali gruppi spaziatori idrofili sono costituiti da sequenze ossietileniche. In altri casi, come verrà mostrato nel seguito, l’introduzione di tali gruppi spaziatori avviene contestualmente alla creazione, in seno al polimero della superficie del supporto, di gruppi funzionali atti a combinarsi con gruppi reattivi delle biomolecole, o alla modifica ossia all’attivazione di gruppi funzionali preesistenti in seno al polimero. According to another aspect of the invention, the regulation of hydrophilicity occurs through a step of introducing hydrophilic spacer groups as side chains of the polymer that forms the surface of the support. An example of this introduction is given by the use in the reaction mixture that leads to the polymer, of monomers provided with such spacer groups. In the case of the polymers of PEGMA and MPEGMA, mentioned above, these hydrophilic spacer groups consist of oxyethylene sequences. In other cases, as will be shown below, the introduction of such spacer groups occurs at the same time as the creation, within the polymer of the surface of the support, of functional groups suitable for combining with reactive groups of the biomolecules, or for the modification, i.e. ™ activation of pre-existing functional groups within the polymer.
Secondo un altro aspetto ancora dell’invenzione, la fase di regolazione dell’idrofilia prevede la creazione o la trasformazione di gruppi funzionali nel polimero che forma la superficie del supporto, atti a combinarsi con biomolecole, in particolare con proteine. According to yet another aspect of the invention, the hydrophilic regulation step involves the creation or transformation of functional groups in the polymer that forms the surface of the support, suitable for combining with biomolecules, in particular with proteins.
Ad esempio, un polimero naturalmente idrofilo come la cellulosa può essere fornito di gruppi carbossilici in grado di combinarsi con biomolecole come proteine mediante trattamento a 60°C per circa 3 ore di fogli di cellulosa con soluzioni di copolimeri alternati dell’anidride maleica (AM) con metil vinil etere (MeVAM) oppure con isobutil vinil etere (BuVAM) in tetraidrofurano, e successivo raffreddamento e lavaggio con lo stesso solvente. I fogli così ottenuti, al contrario di quelli di partenza, sono sostanzialmente repellenti nei confronti dell’acqua. La cellulosa così funzionalizzata espone gruppi carbossilici ed anelli non reagiti derivanti dall’AM. Tali anelli costituiscono una funzionalità atta a combinarsi mediante legame ionico con i gruppi amminici delle proteine; i gruppi carbossilici sono invece suscettibili di ulteriore modifica, o attivazione, mediante trattamento in due stadi con EDC/NHS, per formare gruppi esterei reattivi, secondo procedimenti noti ad un tecnico del ramo. For example, a naturally hydrophilic polymer such as cellulose can be provided with carboxylic groups capable of combining with biomolecules such as proteins by treating cellulose sheets at 60 ° C for about 3 hours with alternating copolymer solutions of maleic anhydride (AM ) with methyl vinyl ether (MeVAM) or with isobutyl vinyl ether (BuVAM) in tetrahydrofuran, and subsequent cooling and washing with the same solvent. The sheets thus obtained, unlike the original ones, are essentially water repellent. The cellulose thus functionalized exposes carboxylic groups and unreacted rings deriving from AM. These rings constitute a function suitable for combining by ionic bond with the amino groups of proteins; the carboxylic groups, on the other hand, are susceptible of further modification, or activation, by means of two-stage treatment with EDC / NHS, to form reactive ester groups, according to processes known to a person skilled in the art.
Nel caso dei poliesteri come PET o PBT, gruppi carbossilici possono essere creati mediante idrolisi controllata, ossia parziale dei legami estere in presenza di comuni acidi inorganici come acido solforico o anche acido cloridrico, per poche ore ed a temperature e concentrazioni moderate, secondo procedimenti ben noti ad un tecnico del ramo. Anche questi gruppi possono essere successivamente attivati per reazione con carbodiimmidi e NHS come descritto sopra. In tabella 4 sono riportati i risultati ottenuti in termini di angolo di contatto statico, mentre in Tabella 4a sono riportati i valori di intensità luminosa corrispondente all’attività residua degli anticorpi depositati.. In the case of polyesters such as PET or PBT, carboxylic groups can be created by controlled hydrolysis, i.e. partial hydrolysis of the ester bonds in the presence of common inorganic acids such as sulfuric acid or even hydrochloric acid, for a few hours and at moderate temperatures and concentrations, according to well-defined processes. known to a person skilled in the art. These groups too can be subsequently activated by reaction with carbodiimides and NHS as described above. Table 4 shows the results obtained in terms of static contact angle, while Table 4a shows the luminous intensity values corresponding to the residual activity of the deposited antibodies.
Tabella 4 Table 4
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di PET trattato con soluzioni di acidi inorganici Static contact angle and activity values measured on PET film treated with inorganic acid solutions
Campione Acido Tempo di Angolo di Attività inorganico trattamento contatto (0-255) statico Sample Acid Time of Activity Angle inorganic treatment contact (0-255) static
PET - - 80,2°±0,9 84 ± 25 PET HCl 3,65 M 1 h 79,7°±1,6 81 ± 14 PET HCl 3,65 M 3 h 76,9°±2,5 n.d. PET H2SO43,22 M 1 h 68,3°±0,7 n.d. PET 1) H2SO43,3 M 1h n.d. 255 PET - - 80.2 ° ± 0.9 84 ± 25 PET HCl 3.65 M 1 h 79.7 ° ± 1.6 81 ± 14 PET HCl 3.65 M 3 h 76.9 ° ± 2.5 n.d. PET H2SO43.22 M 1 h 68.3 ° ± 0.7 n.d. PET 1) H2SO43.3 M 1h n.d. 255
2) CDI/NHS 2) CDI / NHS
PET biorientato - - 75,8°±2,1 87 ± 16 PET biorientato H2SO43,22 M 1 h 68,1°±1,8 255 PET biorientato 1) H2SO43,3 M 1h n.d. 255 Bioriented PET - - 75.8 ° ± 2.1 87 ± 16 Bioriented PET H2SO43.22 M 1 h 68.1 ° ± 1.8 255 Bioriented PET 1) H2SO43.3 M 1h n.d. 255
2) CDI/NHS 2) CDI / NHS
Nel caso di polimeri metacrilici come PMMA, gruppi carbossilici possono essere creati mediante idrolisi controllata dei gruppi estere metilici laterali in ambiente alcalino, tipicamente in una soluzione di idrossido di sodio, secondo procedimenti ben noti ad un tecnico del ramo, per almeno 16-24 ore. Tali gruppi possono essere successivamente attivati per reazione con carbodiimmidi e NHS come descritto sopra. In tabella 5 sono riportati i risultati ottenuti in termini di angolo di contatto statico. In the case of methacrylic polymers such as PMMA, carboxylic groups can be created by controlled hydrolysis of the lateral methyl ester groups in an alkaline medium, typically in a sodium hydroxide solution, according to procedures well known to a person skilled in the art, for at least 16-24 hours. . Such groups can be subsequently activated by reaction with carbodiimides and NHS as described above. Table 5 shows the results obtained in terms of static contact angle.
Tabella 5 Table 5
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di PMMA trattati con soluzioni di idrossido di sodio Static contact angle and activity values measured on PMMA film treated with sodium hydroxide solutions
Tempo di trattamento Angolo di contatto statico Attività (0-255) Treatment time Static contact angle Activity (0-255)
- 75,3°±1,1 107 ± 9 - 75.3 ° ± 1.1 107 ± 9
8 h 75,5°±1,2 n.d. 8 h 75.5 ° ± 1.2 n.a.
16 h 72,8°±2,7 n.d. 16 h 72.8 ° ± 2.7 n.d.
24 h 70,4°±2,1 89 ± 21 24 h 70.4 ° ± 2.1 89 ± 21
24 h<a)>n.d. 132 ± 35 24 h <a)> n.d. 132 ± 35
a) Dopo ulteriore trattamento con EDC/NHS a) After further treatment with EDC / NHS
I polimeri del CMS sono dotati di un gruppo clorometilico di per sé adatto a combinarsi con biomolecole come proteine, vincolandole al supporto in modo stabile. È altresì vantaggioso modificare tale gruppo clorometilenico mediante reazioni con reagenti polifunzionali o bifunzionali in grado di fornire ulteriori gruppi funzionali, in particolare amminici, aldeidici o carbossilici, adatti a combinarsi con le biomolecole. Per regolare l’idrofilia, sono preferibili reagenti bifunzionali in grado di provvedere anche dei gruppi spaziatori, ad esempio una α,ω-diammina con una porzione di catena molecolare lineare idrofila di lunghezza predeterminata, in modo che le biomolecole vengano vincolate ad una distanza tale da sostanzialmente escludere altre forme di interazione con la superficie del substrato, lasciando la biomolecola sostanzialmente libera di arrangiarsi in una conformazione più vicina possibile a quella naturale, esprimendo così al meglio la propria attività come elemento sensibile nei confronti degli analiti. In tabella 6 vengono riportati gli angoli di contatto statici riferiti a polimeri del CMS trattati per 48 ore con un eccesso 100:1 di diamDEG sulle unità CMS, in soluzione di etanolo a temperatura ambiente. The CMS polymers are endowed with a chloromethyl group suitable for combining with biomolecules such as proteins, binding them to the support in a stable way. It is also advantageous to modify this chloromethylene group by means of reactions with polyfunctional or bifunctional reagents capable of providing further functional groups, in particular amino, aldehyde or carboxylic groups, suitable for combining with the biomolecules. To regulate hydrophilicity, bifunctional reagents capable of providing also spacer groups are preferable, for example an Î ±, Ï ‰ -diamine with a portion of hydrophilic linear molecular chain of predetermined length, so that the biomolecules are bound to a distance such as to substantially exclude other forms of interaction with the substrate surface, leaving the biomolecule substantially free to arrange itself in a conformation as close as possible to the natural one, thus best expressing its activity as a sensitive element towards the analytes. Table 6 shows the static contact angles referred to CMS polymers treated for 48 hours with a 100: 1 excess of diamDEG on the CMS units, in an ethanol solution at room temperature.
Tabella 6 Table 6
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di copolimero CMS-stirene prima e dopo trattamento con diamDEG. Static contact angle and activity values measured on CMS-styrene copolymer film before and after treatment with diamDEG.
copolimero Angolo di contatto statico Attività (0-255) copolymer Static contact angle Activity (0-255)
(v. tab.1)<Prima del>Dopo il Prima del Dopo iltrattamentotrattamento trattamento trattamento (see table 1) <Before> After Before After treatment treatment treatment treatment
S1 96,2°±0,6 89,0°±1,3 101.7 ± 4.9 118.8 ± 10.3 S1 96.2 ° ± 0.6 89.0 ° ± 1.3 101.7 ± 4.9 118.8 ± 10.3
S2 93,4°±1,5 85,4°±3,3 130.5 ± 6.7 170.3 ± 18.5 S2 93.4 ° ± 1.5 85.4 ° ± 3.3 130.5 ± 6.7 170.3 ± 18.5
S4 90,4°±0,9 86,8°±0,9 120.8 ± 8.6 118.0 ± 10.1 S4 90.4 ° ± 0.9 86.8 ° ± 0.9 120.8 ± 8.6 118.0 ± 10.1
S7 92,7°±0,3 85,5°±1,6 106.2 ± 4.8 140.0 ± 12.6 S7 92.7 ° ± 0.3 85.5 ° ± 1.6 106.2 ± 4.8 140.0 ± 12.6
S10 88,0°±0,9 80,4°±4,9 117.8 ± 7.9 119.2 ± 7.5 S10 88.0 ° ± 0.9 80.4 ° ± 4.9 117.8 ± 7.9 119.2 ± 7.5
PCMS 85,9°±1,0 78,3°±1,0 139.7 ± 7.2 163.8 ± 7.7 PCMS 85.9 ° ± 1.0 78.3 ° ± 1.0 139.7 ± 7.2 163.8 ± 7.7
Come mostra la tabella 7, riduzioni ancora più sensibili dell’angolo di contatto statico, e quindi incrementi più marcati dell’idrofilia sono ottenuti trattando gli stessi copolimeri con diamPEG, ossia aumentando la lunghezza della catena idrofila spaziatrice del reagente utilizzato, ferme restando tutte le altre condizioni operative. Il decremento dell’angolo di contatto statico à ̈ in tutti i casi di almeno il 15%. As table 7 shows, even more sensitive reductions in the static contact angle, and therefore more marked increases in hydrophilicity, are obtained by treating the same copolymers with diamPEG, i.e. by increasing the length of the hydrophilic spacer chain of the reagent used, without prejudice to all other operating conditions. The decrease in the static contact angle is in all cases at least 15%.
Tabella 7 Table 7
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di copolimero CMS-stirene prima e dopo trattamento con diamPEG. Static contact angle and activity values measured on CMS-styrene copolymer film before and after treatment with diamPEG.
polimero Angolo di contatto statico Attività (0-255) (v. tab. 1) Prima del trattamento Dopo il trattamento Dopo il trattamento polymer Static contact angle Activity (0-255) (see table 1) Before treatment After treatment After treatment
S1 96,2°±0,6 68,1°±3,1 126.1 ± 4.3 S1 96.2 ° ± 0.6 68.1 ° ± 3.1 126.1 ± 4.3
S2 93,4°±1,5 n.d. 130.6 ± 12.6 S2 93.4 ° ± 1.5 n.a. 130.6 ± 12.6
S4 90,4°±0,9 65,7°±1,9 121.0 ± 2.8 S4 90.4 ° ± 0.9 65.7 ° ± 1.9 121.0 ± 2.8
S7 92,7°±0,3 66,6°±0,9 114.4 ± 10.6 S7 92.7 ° ± 0.3 66.6 ° ± 0.9 114.4 ± 10.6
S10 88,0°±0,9 65,2°±1,3 123.4 ± 9.6 S10 88.0 ° ± 0.9 65.2 ° ± 1.3 123.4 ± 9.6
PCMS 85,9°±1,0 49,7°±1,1 147.4 ± 7.1 PCMS 85.9 ° ± 1.0 49.7 ° ± 1.1 147.4 ± 7.1
In tabella 8 sono riportati i valori dell’angolo di contatto statico ancora di polimeri contenenti unità derivate dal CMS dopo 5 ore di trattamento a 55°C con una soluzione acquosa di PEI allo 0,05%, ossia con un eccesso 6:1 rispetto alle unità CMS. Un solo polimero viene riportato in quanto l’angolo risulta sostanzialmente indipendente dalla proporzione di unità CMS, e molto simile all’angolo che compete all’omopolimero PCMS, probabilmente perché si forma uno strato di uniforme di PEI che nasconde la superficie del polimero. Table 8 shows the static contact angle values still of polymers containing units derived from CMS after 5 hours of treatment at 55 ° C with an aqueous solution of PEI at 0.05%, i.e. with an excess of 6: 1 compared to CMS units. Only one polymer is reported as the angle is substantially independent of the proportion of CMS units, and very similar to the angle that competes with the PCMS homopolymer, probably because a uniform layer of PEI is formed which hides the surface of the polymer.
Tabella 8 Table 8
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di copolimero CMS-stirene prima e dopo trattamento con PEI. Static contact angle and activity values measured on CMS-styrene copolymer film before and after treatment with PEI.
polimero Angolo di contatto statico Attività (0-255) (v. tab.1) Prima del trattamento Dopo il trattamento Dopo il trattamento polymer Static contact angle Activity (0-255) (see table 1) Before treatment After treatment After treatment
S2 93,4°±1,5 64,6°±1,8 95.2 ± 5.1 S2 93.4 ° ± 1.5 64.6 ° ± 1.8 95.2 ± 5.1
PCMS 85,9°±1,0 62,8°±1,5 105.7 ± 10.5 PCMS 85.9 ° ± 1.0 62.8 ° ± 1.5 105.7 ± 10.5
In tabella 9 vengono invece riportati gli angoli di contatto statico riferiti a copolimeri del CMS, precedentemente trattati con diamDEG o con PEI, prima e dopo 72 ore di trattamento con una soluzione di aldeide glutarica in etanolo assoluto, a temperatura ambiente ed in lieve eccesso sui gruppi CMS. Table 9 shows the static contact angles referring to CMS copolymers, previously treated with diamDEG or PEI, before and after 72 hours of treatment with a solution of glutaric aldehyde in absolute ethanol, at room temperature and in slight excess on CMS groups.
Tabella 9 Table 9
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di copolimero CMS-stirene prima e dopo trattamento con aldeide glutarica. Static contact angle and activity values measured on CMS-styrene copolymer film before and after treatment with glutaric aldehyde.
Copolimero/ 1° trattam. Angolo di contatto statico Attività (0-255) (v. tab.1 e 6) Prima del Dopo il Dopo il trattamento trattamento trattamento Copolymer / 1st treatment Static contact angle Activities (0-255) (see tables 1 and 6) Before After After After treatment treatment treatment
S2 / diamDEG 85,4°±3,3 77.3°±3,4 153.1 ± 12.6 PCMS / diamDEG 78,3°±1,0 69,0°±0,5 132.7 ± 11.7 S2 / diamDEG 85.4 ° ± 3.3 77.3 ° ± 3.4 153.1 ± 12.6 PCMS / diamDEG 78.3 ° ± 1.0 69.0 ° ± 0.5 132.7 ± 11.7
La tabella 10 riporta l’angolo di contatto statico misurato su film di polimeri contenenti glicidil metacrilato, prima e dopo trattamento con diamDEG nelle stesse condizioni adottate per i polimeri del CMS. Table 10 reports the static contact angle measured on polymer films containing glycidyl methacrylate, before and after treatment with diamDEG under the same conditions adopted for CMS polymers.
Tabella 10 Table 10
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di polimeri comprendenti GMA prima e dopo trattamento con diamDEG. Static contact angle and activity values measured on polymer films including GMA before and after treatment with diamDEG.
polimero Angolo di contatto statico Attività (0-255) polymer Static contact angle Activity (0-255)
(v. tab. 2) Prima del Dopo il Prima del Dopo il trattamento trattamento trattamento trattamento (see table 2) Before After After Before After treatment treatment treatment treatment
G1 66,1°±1,5 55,0°±1,5 113.4±12.5 185.3±15.5 G1 66.1 ° ± 1.5 55.0 ° ± 1.5 113.4 ± 12.5 185.3 ± 15.5
G2 72,2°±0,5 59,4°±1,8 118.9±5.4 184.6±8.8 G2 72.2 ° ± 0.5 59.4 ° ± 1.8 118.9 ± 5.4 184.6 ± 8.8
I polimeri contenenti unità derivate dal GMA sono stati trattati anche con PEI, nelle stese condizioni dei polimeri del CMS, ottenendo i risultati di tabella 11. I valori dopo trattamento approssimano i circa 62° che competono al PEI, a conferma di quanto visto per l’altra classe di polimeri. The polymers containing units derived from GMA were also treated with PEI, under the same conditions as the CMS polymers, obtaining the results of table 11. The values after treatment approximate the approximately 62 ° that compete with PEI, confirming what has been seen for the € ™ other class of polymers.
Tabella 11 Table 11
Valori dell’angolo di contatto statico e di attività misurati su film di polimeri comprendenti GMA prima e dopo trattamento con PEI. Static contact angle and activity values measured on polymer films including GMA before and after treatment with PEI.
polimero Angolo di contatto statico Luminosità (a.u.) (v. tab.2) Prima del Dopo il Dopo il trattamento trattamento trattamento polymer Static contact angle Brightness (a.u.) (see table 2) Before After After After treatment treatment treatment
G1 66,1°±1,5 63,5°±1,0 142.0±5.7 G1 66.1 ° ± 1.5 63.5 ° ± 1.0 142.0 ± 5.7
G2 72,2°±0,5 61,4°±0,9 125.6±7.4 G2 72.2 ° ± 0.5 61.4 ° ± 0.9 125.6 ± 7.4
In tabella 12 sono riportati i valori dell’angolo di contatto statico ottenuto sottoponendo il PVC ad una fase di regolazione dell’idrofilia simile alla modifica o attivazione dei gruppi cloro dei polimeri del CMS, per immersione in una soluzione di diamDEG o PEI in etanolo a 50°C per 5 ore. Table 12 shows the values of the static contact angle obtained by subjecting the PVC to a hydrophilic regulation phase similar to the modification or activation of the chlorine groups of CMS polymers, by immersion in a solution of diamDEG or PEI in ethanol at 50 ° C for 5 hours.
I diversi polimeri ottenuti dopo trattamento con diamPEG o PEI sono stati trattati a temperatura ambiente con una soluzione di PEG-diisocianato. Questa modifica ha introdotto gruppi isocianato capaci di reagire con i gruppi amminici delle proteine. Non à ̈ stato tuttavia possibile misurare l’angolo di contatto dei prodotti ottenuti, in quanto i gruppi isocianato reagiscono spontaneamente con acqua sviluppando CO2gassosa. The various polymers obtained after treatment with diamPEG or PEI were treated at room temperature with a PEG-diisocyanate solution. This modification introduced isocyanate groups capable of reacting with the amino groups of the proteins. However, it was not possible to measure the contact angle of the products obtained, as the isocyanate groups react spontaneously with water, developing CO2 gas.
Tabella 12 Table 12
Valori di angolo di contatto statico e di attività misurati su film di polimero PVC Static contact angle and activity values measured on PVC polymer film
Attivazione Angolo di contatto statico Attività (0-255) Activation Static contact angle Activity (0-255)
- 82,4°±3,2 n.d diam-DEG 62,7°±2,3 154.7±10.5 diam-DEG – GD 76,4°±3,3 181.3±9.2 - 82.4 ° ± 3.2 n.d diam-DEG 62.7 ° ± 2.3 154.7 ± 10.5 diam-DEG â € “GD 76.4 ° ± 3.3 181.3 ± 9.2
PEI 54,6°±7,6 90.6±6.0 PEI 54.6 ° ± 7.6 90.6 ± 6.0
PEI – GD 68,2°±2,1 50.6±11.4 PEI - GD 68.2 ° ± 2.1 50.6 ± 11.4
La fase di deposizione del materiale polimerico per formare la superficie del supporto à ̈ vantaggiosamente svolta mediante una tecnica di spin coating ben nota ad un tecnico del ramo. La tecnica consiste nella preparazione di una soluzione di un polimero in un solvente come indicato in tabella 13, preferibilmente ad una concentrazione di polimero dello 0,2 % peso/volume. Tale soluzione viene filtrata attraverso un filtro in teflon da 2 µm, quindi depositata in dosi da 100 µl al centro di rispettivi substrati costituiti, nel caso specifico di laboratorio, da vetri per microscopio, posti in rotazione a 1000 RPM per 10 secondi, mantenendo poi i manufatti ottenuti in atmosfera secca fino al momento dell’uso. The step of depositing the polymeric material to form the surface of the support is advantageously carried out by means of a spin coating technique well known to a person skilled in the art. The technique consists in the preparation of a solution of a polymer in a solvent as indicated in table 13, preferably at a polymer concentration of 0.2% weight / volume. This solution is filtered through a 2 µm Teflon filter, then deposited in doses of 100 µl in the center of respective substrates consisting, in the specific case of the laboratory, of microscope glasses, rotated at 1000 RPM for 10 seconds, then maintaining the manufactured articles obtained in a dry atmosphere up to the moment of use.
La fase di applicazione dello strato di interazione biologica, in particolare proteine o anticorpi, può essere condotta mediante una tecnica di per sé nota di stampa a getto d’inchiostro, che permette di realizzare microarray di secondo pattern predeterminati The application phase of the biological interaction layer, in particular proteins or antibodies, can be carried out by means of a per se known ink jet printing technique, which allows the creation of microarrays of predetermined second patterns.
Tabella 13 Table 13
Solventi impiegati per la deposizione di film di polimeri mediante la tecnica di spin-coating Solvents used for the deposition of polymer films by means of the spin-coating technique
Polimero Solvente Stirene/CMS Miscela Cloroformio/Toluene GMA/HEMA/MMA Tetraidrofurano PEGMA/MPEGMA/n-BuMA Cloroformio Polymer Solvent Styrene / CMS Blend Chloroform / Toluene GMA / HEMA / MMA Tetrahydrofuran PEGMA / MPEGMA / n-BuMA Chloroform
In particolare, la fase di deposizione può essere svolta secondo una fase di casting o di dip-coating o spraying. In particular, the deposition phase can be carried out according to a casting or dip-coating or spraying phase.
In particolare, la fase di deposizione à ̈ svolta secondo una fase di rivestimento per rotazione, ossia di spin coating, in cui una dose di una soluzione del polimero in un solvente viene disposta sul supporto, e il supporto viene poi messo in rotazione, in modo che per effetto dell’evaporazione del solvente e della forza centrifuga creata dalla rotazione, sul supporto rimanga una pellicola del polimero che forma la superficie. In particular, the deposition phase is carried out according to a spin coating phase, in which a dose of a solution of the polymer in a solvent is placed on the support, and the support is then rotated, in so that due to the evaporation of the solvent and the centrifugal force created by the rotation, a film of the polymer that forms the surface remains on the support.
Per determinare la validità dei materiali prodotti, i campioni sono stati sottoposti a test di attività residua di un anticorpo depositato sulla superficie dei relativi biochip. I risultati di tali test sono riportati nelle tabelle dalla 4 alla 12 assieme al valori di angolo statico. To determine the validity of the materials produced, the samples were subjected to residual activity tests of an antibody deposited on the surface of the related biochips. The results of these tests are reported in tables from 4 to 12 together with the static angle values.
In tali test, l’anticorpo viene stampato sulla superficie polimerica, eventualmente trattata o attivata opportunamente, tramite stampa a getto d’inchiostro secondo un pattern predeterminato, con risoluzione 300x150 dpi. Il resto della superficie viene sottoposto a bloccaggio con una proteina inattiva nei confronti degli analiti d’interesse. In these tests, the antibody is printed on the polymeric surface, possibly treated or activated appropriately, by means of ink jet printing according to a predetermined pattern, with a resolution of 300x150 dpi. The rest of the surface is blocked with a protein inactive towards the analytes of interest.
Un campione biologico viene messo in contatto con la superficie in modo che l’analita in esso contenuto possa legarsi all’anticorpo depositato. Dopo opportuni tempi di incubazione, la superficie del biochip viene trattata con una soluzione atta a produrre una reazione chemoluminescente con il complesso anticorpo-analita. L’intensità della radiazione emessa, misurata su una scala 0-255 mediante una camera digitale CCD raffreddata, risulta essere proporzionale all’attività residua dell’anticorpo depositato. A biological sample is placed in contact with the surface so that the analyte it contains can bind to the deposited antibody. After suitable incubation times, the surface of the biochip is treated with a solution capable of producing a chemoluminescent reaction with the antibody-analyte complex. The intensity of the emitted radiation, measured on a 0-255 scale by a cooled CCD digital camera, is proportional to the residual activity of the deposited antibody.
La descrizione di cui sopra di forme realizzative specifiche à ̈ in grado di mostrare l'invenzione dal punto di vista concettuale in modo che altri, utilizzando la tecnica nota, potranno modificare e/o adattare in varie applicazioni tali forme realizzative specifiche senza ulteriori ricerche e senza allontanarsi dal concetto inventivo, e, quindi, si intende che tali adattamenti e modifiche saranno considerabili come equivalenti delle forme realizzative specifiche. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall’ambito dell’invenzione. Si intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e per questo non limitativo. The above description of specific embodiments is able to show the invention from a conceptual point of view so that others, using the known art, will be able to modify and / or adapt these specific embodiments in various applications without further research and without departing from the inventive concept, and, therefore, it is understood that such adaptations and modifications will be considered as equivalent to the specific embodiments. The means and materials for carrying out the various functions described may be of various nature without thereby departing from the scope of the invention. It is understood that the expressions or terminology used have a purely descriptive purpose and therefore not limitative.
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