ITPG20110019A1

ITPG20110019A1 - Bioreattore per la produzione di microrganismi e relativo metodo

Info

Publication number: ITPG20110019A1
Application number: IT000019A
Authority: IT
Inventors: Davide Di Giuseppe Stefanori
Original assignee: Davide Di Giuseppe Stefanori
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2013-03-07

Description

1.3 DESCRIZIONE

La presente invenzione concerne un bioreattore per la produzione di microrganismi e relativo metodo.

In particolare, il presente bioreattore è particolarmente adatto all’ ottenimento di biomasse da microrganismi, specialmente aerobici, ma non limitatamente, da cui ottenere produzioni di lipidi ad alte concentrazioni di omega-3, acidi grassi insaturi (PUF A), adatti al consumo umano ed animale come additivi alimentari o per uso nutraceutico e farmaceutico. Inoltre, tale bioreattore è anche impiegabile per la coltura di cellule mammifere che producono proteine e prodotti ricombinanti ad elevata qualità su larga scala, oltre che per il controllo e la produzione su larga scala di cellule staminali o anche su scale ridotte per migliorare la produzione in ambiente di laboratorio. Ancora, tale bioreattore è utilizzabile efficientemente per la produzione di biodiesel o biocarburanti usando alghe aerobiche ed eterotrofe che utilizzano come fonte primaria il carbonio. Detto bioreattore è anche impiegabile per la coltura di microrganismi fotosintetici.

In particolare, va precisato che, in alcune forme, i PUFA hanno una lunghezza della catena di almeno diciotto atomi di carbonio. Tali acidi grassi poiinsaturi sono qui denominati acidi grassi poiinsaturi a catena lunga o LC PUFA. I PUFA sono costituiti da Omega-3 nello specifico da acido docosaesaenoico C22: 6 n-3 (DHA), acido docosapentaenoico C22: 5 n-3 (DPA (n-3)), omega-6 acido docosapentaenoico C22: 5 n-6 (DPA (n-6)), acido arachidonico C20: 4 n-6 (ARA), C20 acido eicosapentaenoico 5 n-3 (EPA), acido stearidonico (SDA), acido linolenico (LLA), acido alfa linolenico (ALA), acido gamma-linolenico (GLA), acido linolenico coniugato (CLA). acido eicosatetraenoico (C20: 4-n 3), omo-alfa e gamma-linolenico (C20: 3 n-6 e n-3 20:03), acido adrenico (C22: 4 n-6), acido octacosaoctaenoìco (C28: 8), o loro miscele. I PUFA possono essere presenti anche in una qualsiasi delle forme più comuni si trovano infatti in lipidi naturali compreso ma non limitato a trigliceridi, digliceridi fosfolipidi, acidi grassi liberi, o in forme derivate naturali o sintetiche di questi acidi grassi, come utilizzato nel presente invenzione, può riferirsi sia ad una composizione che comprende i trigliceridi che hanno un solo tipo di derivato di PUFA come DHA o di una composizione formata da trigliceridi con una miscela di più un tipo di derivati di PUFA come DHA, EPA e ARA.

I microrganismi utilizzabili dal presente bioreattore da cui è possibile estrarre olio biologico del tipo PUFA, possono essere Alghe Batteri Funghi Protozoi. Tutti questi organismi per essere utilizzati nel presente ritrovato devono usare come nutriente principale il carbonio organico e riprodursi per via eterotrofa. Quindi il sistema può essere utilizzato per tutti quei microrganismi che si adattano a crescere per via eterotrofica in assenza di luce e in presenza di carbonio organico. Ad esempio, questi microrganismi possono essere utilizzati in un terreno di fermentazio microrganismi possono essere: i microrganismi del regno Stramenopiles come le alghe verdi, diatomee, dinoflagellati ( microrganismi quali dell’ ordine delle Dinophyceae compresi i membri del genere Crypthecodinium come, ad esempio, Crypthecodinium cohnii), lieviti (ad esempio un membro dei generi Yarrowia (come lipolytica Yanowia), Cryptococcus (come Cryptococcus albidus), Trichosporon, Candida, Lipomyces, Rhodosporidium e Rhodotorula), e funghi dei generi Mucor e Mortierella, compreso ma non limitato a Mortierella alpina e setta Mortierella. schmuckeri. I membri del gruppo Stramenopiles microbica includono microrganismi microalghe e alghe-like, compresi i seguenti gruppi di microrganismi: Hamatores, Proteromonads, opalini, Develpayella, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, oomiceti, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola , Aureococcus, Parmales, Diatomee, Xanthophytes, Phaeophytes (alghe brune), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (compresi Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales e Chromulinales. Il Thraustochytrids comprendono i generi Schizochytrium (specie comprendono aggregatimi, limacinum, mangrovei, minutum, octosporum), Thraustochytrium (specie comprendono arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kixmei, motivum, multinidimentale, pachydeimum, proliferum, roseum, striato), Ulkenia (specie includono amoeboidea, kerguelensis, Minuta, profunda, irradiano, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Aplanochytrium (specie comprendono haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), J aponochytrium (specie comprendono marinum), Althomia (specie comprendono crouchii), e Elina (specie comprendono marisalba, sinorifica). 11 Labrinthulids comprendono i generi Labyrinthula (specie comprendono algeriensis, coenocystis, chattonii, Macrocystis, Atlantica Macrocystis, Macrocystis Macrocystis, marina, Minuta, roseo ffènsis, valkanovii, vitellina, Pacifica vitellina, vitellina vitellina, Zopfi), Labyrinthomyxa (specie comprendono Marina), Labyrinthuloides (specie comprendono haliotidis, yorkensis), Diplophrys (specie comprendono archeri), Pyrrhosorus (specie comprendono marìnus), Sorodiplophrys (specie comprendono stercorea), Chlamydomyxa (specie labyrinthuloides comprendono, Montana). Per i micorganismi Pyrrhosorus (specie comprendono marinus) e Sorodiplophrys (specie comprendono stercorea) non c'è consenso generale attuale sul posizionamento esatto tassonomica di questi generi. Per la produzione dei PUFA la presente invenzione intende utilizzare, principalmente, ma non elusivamente, i seguenti microrganismi dell’ordine: Thraustochytrids, come Schizochytrium e Thraustochytrium, che sono microrganismi eterotrofi acquatici che si trovano comunemente in ambiente marino e negli estuari (Barr, 1992). La capacità del genere Thraustochytrids è quella di accumulare grandi quantità di acidi grassi poiinsaturi (PUFA), in particolare omega-3 acidi grassi tra cui docosaesaenoico acido (C22: 6, DHA), (Lewis et al, 1999;. Huang et al, 2001) I PUFA sono importanti nelle patologie prevenire e trattare come malattia coronarica, ictus, le malattie reumatoide e Γ artrite (Kinsella, 1987), fornisce una protezione contro l'asma, la dislessia, la depressione e alcuni forme di cancro (Simopoulos, 1989; Takahata et al., 1998). Il DHA è un acido grasso essenziale per lo sviluppo neuronaie (Yongmanitchai e Ward, 1989). La domanda di questi acidi grassi come una dieta supplemento è aumentata e l'offerta maggiore è attualmente derivato da olio di pesce. Ma la diminuzione dei pesci scorte e la domanda crescente ha creato un bisogno di ricavare acidi grassi poiinsaturi da una fonte vegetale come quella delle alghe marine.

Nel presente ritrovato, per ottenere gli acidi grassi del tipo Omega-3, potrà essere utilizzata una coltura eterotrofa, la quale ha una capacità di crescita sostenuta e una divisione cellulare che avviene al buio in cui l’energia ottenuta dalla cellula è ceduta dal carbonio e dal metabolismo del substrato organico. Le condizioni eterotrofiche sono quelle condizioni che permettono la crescita di organismi al buio. Ad esempio, possiamo citare alghe quali la Chlorella, Spongiocuccum e Prototheca per la produzione di proteineeterotrofiche e dei pigmenti. Ancora, possiamo citare le alghe del genere dei dinoflagellati, (Harrington e Holtz, 1968; Tomabene e altri 1974), adatte alla produzione di omega-3 acidi ed grassi insaturi.

Il presente ritrovato può essere anche utilizzato per la produzione di cellule staminali sia umane che vegetali. La fabbricazione su larga scala di cellule staminali, consentirà anche la creazione di tessuti umani da utilizzare per valutare in provetta la tossicità di farmaci e composti diversi, eliminando così la sperimentazione sugli animali.

Il bioreattore secondo l’invenzione è adatto per la produzione di proteine ricombinanti terapeutiche in cellule batteriche.

Inoltre, il bioreattore secondo l’invenzione può permettere una produzione di proteine terapeutiche attraverso delle cellule ricombinanti di Escherichia coli secondo la tecnologia delle proteine di fusione ottenendo un prodotto finale idoneo per l’impiego clinico nell’uomo. Il portafoglio delle proteine ricombinanti terapeutiche espresse in sistemi batterici può comprendere; l’ormone della crescita umano o somatropina (h-GH) il fattore di crescita dei granulociti non glicosilato (G-CSF), ed il suo analogo metionil-G-CSF (Met-G-CSF o filgrastim) rinterferone-β non glicosilato (IFN-βlb) l’interferone-a-2b (IFN-a-2b).

Il presente ritrovato può essere applicato per la produzione di proteine ri combinanti terapeutiche in cellule di mammifero più precisamente per la produzione di glicoproteine in cellule di mammifero. Il portafoglio delle glicoproteine ricombinanti terapeutiche comprende l’eritropoietina e il βinterferone.

Ancora, il presente bioreattore può essere impiegato per la produzione di biocarburante da microalghe. Ad esempio, lo Schizochytrium è in grado di produrre alti livelli di bio

grassi totali. La biomassa di questo microrganismo può potenzialmente produrre biodiesel utilizzando diversi metodi di preparazione, come con solventi chimici e la seguente transestereficazione (metodo a due stadi). La biomassa essiccata utilizzata come materia prima per l’estrazione può portare al 57% di rendimento di biodiesel grezzo, con un estere metilico di acidi grassi, o meglio conosciuto con l’acronimo inglese FAME, del 66,37%.

E nota da tempo Γ esistenza di bioreattori per la produzione di tali microrganismi. Infatti, i processi della microbiologia industriale avvengono soprattutto airintemo di bioreattori, o anche conosciuti col nome di fermentatori, il cui sviluppo tecnologico ha consentito significativi progressi nell’ambito della microbiologia applicata. Il fermentatore più noto è un reattore formato da un tino in acciaio verticale. Tale tipologia di fermentatori nasce e si evolve a partire dagli analoghi impianti utilizzati in chimica, la cui applicazione industriale è precedente rispetto alla microbiologia.

Le caratteristiche tecnologiche dell’impianto e, in particolare, del fermentatore, dipendono dal metabolismo del microrganismo coinvolto, che a seconda della fisiologia può richiedere condizioni aerobiche o anaerobiche. Le dimensioni del fermentatore variano in funzione del processo e vanno da qualche decina di m<3>, ad esempio, per la produzione di alcuni biofarmaci, fino a raggiungere i 1000 m<3>, ad esempio, per la produzione di etanolo. Nella parte alta del fermentatore, o bioreattore, sono posizionate una serie di entrate ed uscite, controllate da elettrovalvole. Le entrate sono necessarie per l’inoculo, all’interno del bioreattore, della coltura liquida ed eventuali addizioni quali, ad esempio, nutriiiti, correttori di pH, agenti antischiuma e simili, mentre le uscite sono impiegate per l’aria esausta ed eventuali prelievi di coltura effettuati nel tempo per monitorare il processo.

La temperatura all’interno del fermentatore è mantenuta a livelli ottimali in relazione alle esigenze del microrganismo, mediante dispositivi interni o esterni. La coltura liquida all’interno del bioreattore, inoltre, è mantenuta in agitazione per rendere omogeneo l’ambiente, evitando la formazione di gradienti relativi non solo alla temperatura, ma anche alla biomassa cellulare, ai nutriiiti ed ai gas presenti nella coltura liquida stessa. I dispositivi di agitazione hanno diverso disegno in funzione delle caratteristiche del processo, in particolare della macromorfologia cellulare. Ciononostante, in generale, il dispositivo di agitazione è costituito da un albero motore a cui sono vincolate solidalmente le giranti e che si estende verticalmente lungo l’asse longitudinale del tino del bioreattore. Tra gli agitatori veloci, caratterizzati da un rapporto diametro agitatore/diametro reattore e impiegabili con microrganismi unicellulari (per es., lieviti e la maggior parte dei batteri), i più diffusi sono quelli a elica marina, a palette e a turbina, quale, ad esempio, del tipo Rushton. Tra gli agitatori lenti, caratterizzati da un rapporto diametro agitatore/diametro reattore e impiegabili con microrganismi miceliari (per es., muffe e alcuni batteri), i più diffusi sono quelli a gabbia, ad ancora e a vite senza fine.

Tuttavia tali bioreattori a tino non sono scevri di inconvenienti. Infatti, i dispositivi di agitazione, se impiegati ad elevate velocità, per ottenere così una maggiore produzione di microorganismi, provocano la formazione di schiuma sulla superficie della coltura, la rottura delle cellule a causa delle forze di taglio prodotte dalla girante, e la lisi cellulare con la fuoriuscita di prodotti extracellulari nel brodo di fermentazione, causando conseguentemente evidenti danni al metabolismo e alla crescita dei microrganismi presenti nella coltura liquida contenuta nel bioreattore, o fermentatore.

Parallelamente a tali tipi di bioreattori a tino sono stati sviluppati da tempo bioreattori del tipo ad induzione di onda, impiegati principalmente per i microrganismi fotosintetici. Ad esempio, la privativa WO99/01537, a nome INGRIDIENT TECHNOLOGY CORPORATION INTERNATIONAL, descrive un bioreattore di questo genere.

Tale tipo di bioreattore comprende un canale di reazione contenente una coltura liquida di detti microrganismi e mezzi per generare in detta coltura liquida onde armoniche di gravità che si propagano in direzione dell’ asse longitudinale di detto canale. Tali mezzi di generazione delle onde armoniche comprendono, in maniera nota, una pala che ruota in maniera alternata attorno ad una\ cerniera posta sul fondo del canale in modo tale da generare così onde armoniche di gravità nella stessa coltura liquida.

Va precisato che le succitate onde armoniche di gravità hanno dinamica simile alle onde presenti in mare aperto. In questo tipo di onde la gravità tende ad appiattire le creste dell’onda e ristabilire l’equilibrio. L’eccesso d’acqua che appare in cresta d’onda deve defluire dalle regioni delle gole adiacenti, perciò le singole particelle sono soggette ad un moto che è la combinazione del moto longitudinale, avanti ed indietro, e del moto trasversale, su e giù, dell’onda stessa. Le singole cellule fluttuanti in un’onda armonica di questo genere non subiscono nessuna traslazione media e si muovono lungo traiettorie circolari, o ellittiche, a seconda della frequenza dell’onda stessa. Quindi, una volta che un’onda si propaga lungo la direzione longitudinale del canale, la generica particella, o cellula, del microrganismo presente nella coltura liquida è soggetta ad un moto lungo traiettorie circolari, o ellittiche, senza però venire trascinato lungo l’asse longitudinale del canale e ritornando, dopo un certo periodo di tempo, nella stessa posizione di partenza.

Tali bioreattori noti ad induzione di onda, a differenza dei bioreattori a tino tradizionali, evitano la formazione di schiuma sulla superficie della coltura, la rottura delle cellule e la lisi cellulare con la fuoriuscita di prodotti extracellulari nel brodo di fermentazione, tuttavia non permettono di superare i livelli di produzione ottenibili mediante l’impiego dei bioreattori tradizionali a tino, soprattutto se impiegati anche per la produzione di microrganismi aerobi e/o eterotrofi.

Pertanto, scopo della presente invenzione è quello di realizzare un bioreattore del tipo ad induzione di onda, ed un relativo metodo, in grado di aumentare notevolmente i livelli di produzione dei microrganismi presenti nella coltura liquida contenuta in esso, sia quelli fotosintetici che quelli aerobici e/o eterotrofi, evitando, contemporaneamente, gli inconvenienti dei bioreattori a tino di arte nota più sopra descritti.

Ulteriormente, scopo della presente invenzione è quello di realizzare quanto detto sopra in maniera semplice e senza apportare eccessive modiche ai bioreattori ad induzione di onda di arte nota.

Questi ed altri scopi sono raggiunti mediante un bioreattore per la produzione di microrganismi, comprendente un canale di reazione contenente una coltura liquida di detti microrganismi, mezzi per generare in detta coltura liquida onde armoniche di gravità in direzione dell’asse longitudinale di detto canale, caratterizzato dal fatto di comprendere mezzi per la diffusone di un gas in forma di bolle all’intemo di detta coltura liquida contenuta in detto canale di reazione. Si osservi che detto gas, a seconda del microrganismo impiegato nella coltura, può scelto tra aria o ossigeno, nel caso di microrganismi aerobici, vale a dire microrganismi il cui metabolismo si basa sull’ossigeno, oppure una miscela di aria ed anidride carbonica nel caso di microrganismi fotosintetici, vale a dire microrganismi in cui l’anidride carbonica è molto importante per il proprio metabolismo.

In pratica, combinando la diffusione del gas in forma di bolle all’interno della coltura con la generazione di onde armoniche di gravità, a frequenze differenti, con il conseguente instaurasi di moti circolari, o ellittici, dei microrganismi all’interno della coltura liquida, si ottiene un aumento del tempo di passaggio delle dette bolle di gas diffuso all’ interno della coltura poiché queste ultime rimangono imprigionate nei succitati moti circolari, o ellittici, di detti microrganismi, con conseguente migliore trasferimento di ossigeno, o anidride carbonica, alla cellula, a seconda del tipo di microrganismo scelto per la coltura. Ciò permette di diminuire i tempi di crescita colturale e di aumentare così, in maniera rilevante, il livello di produttività di tedi microrganismi in detto bioreattore. La Richiedente ha, infatti, sperimentato che il moto circolare, o ellittico, dei microrganismi, generato dall’onda armonica di gravità indotta all’intemo della coltura, permette di imprigionare per un determinato periodo le dette bolle di gas diffuse all’interno del moto circolare vettoriale, o ellittico, dei microrganismi, creando una superficie di contatto molto prolungato tra l’ossigeno, o l’anidride carbonica, disciolto/a, presente nella bolla del gas, e racchiuso nel campo di azione del moto circolare, o ellittico, dei microrganismi presenti nella coltura. Tale fenomeno induce una più elevata velocità di trasferimento dell’ossigeno alle cellule e questo permette alle stesse cellule di metabolizzare più velocemente la principale fonte di carbonio come, ad esempio, il glucosio. Tutto ciò favorisce un incremento del metabolismo dei microrganismi ed una crescita cellulare in tempi più brevi rispetto a quanto consentito fino ad oggi. Tale fenomeno, inoltre, porta ad un aumento notevole dello scambio tra i gradienti chimici e, quindi, permette di avere un incremento del metabolismo dei microrganismi ed una crescita cellulare in tempi più brevi rispetto a quanto conosciuto e noto fino ad oggi.

Più in particolare, detti mezzi di diffusione sono disposti, almeno in parte, e si estendono su almeno parte del fondo di detto canale di reazione per la diffusione di detto gas in forma di bolle in direzione della superficie della detta coltura liquida. Ciò, vantaggiosamente, permette di aumentare ancora di più il tempo di passaggio del detto gas all’interno della coltura liquida.

Inoltre, preferibilmente, tali bolle di gas sono micro bolle di diametro compreso tra 0,5 e 1,5 mm La nube gassosa di micro bolle, diffusa airintemo della coltura, crea una superficie di contatto molto prolungata tra l’ossigeno, o Fanidride carbonica, disciolto/a e racchiuso/a nel campo d azione del moto circolare, o ellittico, di tutte le cellule presenti nella coltura, aumentando l solubilità dell’ossigeno o dell’anidride carbonica nella coltura liquida. È noto, infatti, che a parità d gas erogato, minore dimensione delle bolle significa maggiore superficie di contatto e quind maggiore quantità di gas disciolto nell’unità di tempo. Inoltre, minore dimensione delle boll significa anche una minore velocità di risalita delle stesse e, quindi, un maggiore tempo di contatto gas/fluido. Se a ciò si aggiunge che le micro bolle vengono rallentate nella loro risalita poich vengono intrappolate all’ interno dei moti circolari, o ellittici, dei microrganismi risulta del tutto evidente che il bioreattore secondo l’invenzione è in grado di realizzare un notevole aumento di produzione dei microrganismi presenti nella coltura liquida a parità di tempo rispetto ai bioreattori di arte nota.

Ancora, secondo la forma realizzativa qui descritta, detti mezzi per la diffusione del detto gas comprendono almeno una lastra in materiale poroso disposta su almeno parte della superficie di fondo di detto canale e mezzi per comprimere detto gas. Tali mezzi di compressione sono fluidicamente collegati a detta lastra in materiale poroso, in corrispondenza della sua superficie inferiore, per la diffusione di detto gas all’interno di detta coltura liquida attraverso detta almeno una lastra in materiale poroso.

Ulteriormente, secondo l’invenzione, e nel caso di microrganismi aerobici, detto bioreattore comprende mezzi per misurare la saturazione dell’ossigeno presente in detta coltura liquida ed almeno una unità di controllo per variare la frequenza delle dette onde armoniche generate da detti mezzi di generazione delle onde e/o la portata dell’aria, o di ossigeno, diffusa da detto diffusore all’interno di detta coltura liquida in funzione del valore di saturazione dell’ossigeno misurato da detti mezzi di misurazione della saturazione dell’ossigeno di detta coltura liquida.

In particolare, detta frequenza di dette onde armoniche generate è compresa tra 0,1 e 3 Hz. Scendendo più nel dettaglio, la frequenza di dette onde armoniche generate all’intemo di detta coltura liquida è compresa tra circa 1 e 3 Hz per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,1 ed 1 Hz per livelli misurati di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %.

Ulteriormente, nel caso sempre di microrganismi aerobici e di impiego di aria, la portata di aria insufflata all’intemo della coltura liquida è compresa tra circa 2 l/min a 0,02 l/min per litro di coltura liquida. Specificatamente, detta portata di aria è compresa tra circa 2 e 0,3 l/min per litro di coltura liquida per livelli di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,3 l/min e 0,02 l/min per litro di coltura liquida per livelli di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %. In pratica, l’unità di controllo è in grado di comandare e regolare, sulla base delle informazioni fomite dai detti mezzi di misurazione della saturazione dell’ ossigeno, i quali - come si vedrà più in basso - permettono di rilevare i differenti stadi di crescita dei microrganismi, sia la frequenza di lavoro dei mezzi di generazione dell’onda armonica generata nella coltura liquida sia la portata di aria diffusa mediante detti mezzi di diffusione.

Va, infatti, precisato che alfintemo del liquido colturale la crescita dei microrganismi segue sempre almeno due fasi principali. Una prima fase esponenziale in cui il tasso di crescita della popolazione è, pertanto, esponenziale, e rimane sempre positivo nel tempo e dipende dai nutrienti e dalla temperatura. In tale fase la saturazione dell’ossigeno diminuisce gradualmente fino a raggiungere il 5% circa di saturazione. Al contrario, durante la seconda fase di crescita dei microrganismi, detta anche fase lineare, il tasso di crescita della popolazione dei microrganismi è molto rallentato, o addirittura azzerato, e la concentrazione dei microrganismi, a questo punto elevata, tende a stabilizzarsi. Durante tale fase la saturazione di ossigeno è inferiore a circa il 5%. Pertanto, conoscendo il livello di saturazione dell’ossigeno presente all’intemo della coltura, ottenibile come detto mediante l’impiego di detti mezzi di misurazione della saturazione dell’ossigeno, è possibile capire in quale fase di crescita si trovino i microrganismi e, dunque, regolare di conseguenza sia la frequenza delle onde armoniche generate nella coltura sia la portata di aria insufflata dai detti mezzi di diffusione. In questo modo è possibile seguire al meglio la crescita dei microrganismi, seguendo il loro ciclo di crescita e, allo stesso tempo, ridurre sensibilmente anche i consumi energetici del bioreattore.

Per quanto detto più sopra, durante la succitata prima fase di crescita esponenziale, è richiesta una maggiore diffusione di aria in forma di bolle, o micro bolle, con la creazione di una nube gassosa formata da bolle o micro bolle, la quale, entrando in contatto con l’area di influenza dei moti dei microrganismi, generati dall’onda armonica indotta, conduce ad un maggiore e più rapido trasferimento volumetrico e, quindi, ad una più alta solubilità dell’ossigeno nel liquido colturale. La frequenza dell’onda in questa prima fase esponenziale è compresa tra 1 e 3 Hz, con la formazione di moti circolari dei microrganismi, dove tali moti circolari occupano solo una parte della profondità della vasca di coltura. La Richiedente ha, infatti, sperimentato che ciò comporta una migliore efficienza di funzionamento del bioreattore poiché permette di avere più spazio per la diffusione di aria tra il fondo del canale di reazione e tale moto circolare dei microrganismi. Nella seconda fase di crescita dei microrganismi, quando viene registrata una riduzione della saturazione di ossigeno all’incirca inferiore al 5%, la frequenza delle onde generate è ridotta al di sotto di 1 Hz, con lo sviluppo di moti ellittici dei microrganismi. Ciò perché il moto ellittico si estende dalla cresta dell’onda fino a sfiorare il fondo del canale di reazione. In questa fase la crescita cellulare ha raggiunto il suo apice, quasi arrestandosi, e per tale ragione la pressione del gas diffuso, o erogato, viene ridotta. Al fine di ottenere Γ imprigionamento del gas erogato nel flusso rotazionale delle ampiezze d’onda generate non è, quindi, più necessario avere lo stesso spazio di fuga presente nella prima fase esponenziale, dove venivano riprodotte ampiezze del tipo circolari, ma è sufficiente anche un ridottissimo spazio di fuga.

Inoltre, il moto ellittico permette di ottenere una completa rotazionalità della sospensione delle cellule su tutto il volume colturale. In questo caso, per ottenere un omogeneo rimescolamento delle cellule in sospensione, non è necessario un effetto combinato del moto turbolento o, air-lift, delle bolle o micro bolle, con il flusso rotazionale circolare uniforme di tutte le cellule, come invece necessario nella succitata prima fase esponenziale, ma è sufficiente ottenere, con il modello di ampiezza del tipo ellittico, una uniforme rotazionalità di tutte le cellule in sospensione su tutto il volume colturale. In questa fase, dunque, la portata di aria diffusa nella coltura è ridotta poiché nella coltura liquida si vanno ad esaurire i nutrimenti del mezzo chimico e di conseguenza si avrà una diminuzione del metabolismo cellulare. In questa fase remissione della miscela gassosa è, dunque, ridotta a valori compresi tra 0,3 l/min e 0,02 l/min per litro di coltura liquida.

Ulteriormente, detto bioreattore comprende un elemento di copertura superiore per detto canale di reazione, in cui detto elemento di copertura superiore e detto canale sono impermeabili alla radiazione luminosa. Tale forma realizzativa è particolarmente vantaggiosa per lo sviluppo di microrganismi aerobici ed eterotrofi, in grado cioè di svilupparsi essenzialmente in presenza di ossigeno ed in assenza di luce.

Si osservi che i microrganismi che sono impiegabili nel bioreattore aggetto della presente invenzioni sono principalmente, ma non limitatamente, scelti tra microrganismi aerobici e/o eterotrofi e sono del tipo diatomee, dinoflagellati del genere Crypthecodinium cohnii, lieviti del genere Yarrowia, funghi del genere Mucor e Mortierella, membri del gruppo Streamenopiles microbica le quali includono microalghe eterotrofe e i Thraustochytris che comprendono i generi Schizochytrium, la quale specie può comprendere aggregatimi, limacinum, mangrovie, minutum,octosponim, i Traustochytrium la quale specie può comprendere arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale ,pachydermum, proliferum, roseum, striato, i generi Ulkenia, la quale specie può comprendere amoeboidea, kerguelensis, minuta, profùnda, irradiano, sailens sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis, i generi; Aplanochytrium, Japonochytrium, Labrinthulids, Labyrinthuloides, Diplophrys, Pyrrhosorus, Chlamydomyxa, Sorodiplophrys, cellule Staminali umane e vegetali, cellule Mammifere, Batteri. In tale caso il gas insufflato è aria o ossigeno, poiché necessaria alle attività metaboliche dei microrganismi aerobici ed, in caso, anche eterotrofi, che si basano sull’ossigeno.

Ulteriormente detti microrganismi possono essere scelti anche del tipo fotosintetici del tipo, comprendente, ad esempio, la classe di microalghe del tipo Cyanophyceae, Chlorophyceae, Haptophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Bacillariophyceae, Prasinophyceae, Eumycota, Chrysophyceae, Xanthophyceae.

In tale caso il gas insufflato nella coltura liquida è una miscela di aria ed anidride carbonica, poiché quest’ ultima necessaria alle attività metaboliche dei microrganismi fotosintetici i quali basano il loro metabolismo di crescita anche sull’ anidride carbonica.

Sempre secondo l’invenzione, gli scopi succitati sono raggiunti grazie ad un metodo per la produzione di microrganismi mediante l’impiego di un bioreattore secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 14. In particolare, il metodo comprende le fase di: a) introdurre in detto canale di reazione detta coltura liquida di detti microrganismi; b) generare un’onda armonica in detta coltura liquida in direzione dell’asse longitudinale di detto canale; detto metodo essendo caratterizzato dal fatto di comprendere, contemporaneamente alla detta fase b), la fase c) di diffondere un gas in forma di bolle entro detta coltura liquida contenuta in detto canale di reazione. Più in particolare, dette bolle sono micro bolle di dimensioni comprese tra 0,5 e 1 ,5 mm.

Inoltre, sempre secondo una forma realizzativa dell’ invenzione, detta fase c) comprende la fase di diffondere detto gas da almeno parte del fondo di detto canale di reazione in direzione della superficie della detta coltura liquida.

Ancora, contemporaneamente alla detta fase c), ed in caso in cui detti microrganismi siano aerobici, o anche aerobici ed eterotrofi, è compresa la fase e) di misurare il livello di saturazione di ossigeno di detta coltura liquida e la fase f) di variare la frequenza di dette onde armoniche di gravità generate da detti mezzi di generazione dell’onda e/o la portata di aria, o ossigeno, diffusa all’interno di detta coltura liquida mediante detti mezzi di diffusione di un gas in forma di bolle, in funzione del livello di saturazione dell’ossigeno misurato da detti mezzi di misurazione della saturazione di ossigeno di detta coltura liquida.

Secondo una ulteriore forma realizzativa dell’invenzione, detta frequenza delle onde armoniche di gravità generate è compresa tra circa 1 e 3 Hz per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,1 ed 1 Hz per livelli misurati di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %.

Allo stesso modo, la portata di aria è compresa tra circa 2 e 0,3 l/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,3 l/min e 0,02 l/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazione dell’ossìgeno inferiore a circa il 5 %.

Verrà ora descritta, a tìtolo solamente esemplificativo e non limitativo, una forma di realizzazione particolare della presente invenzione con riferimento alle figure allegate, in cui:

la figura 1 è un vista in prospettiva di un bioreattore secondo l’invenzione;

la figura 2A è un vista semplificata in dettaglio di una sezione del bioreattore di figura 1, dinante la prima fase di crescita dei microrganismi;

la figura 2B è un vista semplificata in dettaglio di una sezione del bioreattore di figura 1, durante la seconda fase di crescita dei microrganismi.

Con particolare riferimento a tali figure si è indicato con 1 un bioreattore secondo l’invenzione. In figura 1 viene mostrato un bioreattore 1 per la produzione di microrganismi, che comprende un canale di reazione 2 con asse longitudinale X e che contiene una coltura liquida 100 di detti microrganismi. Solo a titolo esemplificativo i microrganismi contenuti nella coltura liquida 100 appartengono alla famiglia del Schizochytrium limacinum, pertanto sono del tipo aerobico, vale a dire il cui metabolismo si basa sull’ossigeno, ed eterotrofo, vale a dire che si riproducono in assenza di luce. Ovviamente, come già anticipato, altri microrganismi aerobici e/o eterotrofi possono essere utilizzati in tale bioreattore.

Secondo la forma realizzativa qui rappresentata, tale bioreattore 1 comprende, altresì, mezzi 3 per generare in detta coltura liquida 100 onde armoniche di gravità 101 che si muovono in direzione dell’asse longitudinale X di detto canale 2. Si osservi che detti mezzi di generazione 3 di onde armoniche di gravità comprendono, in maniera nota, una pala verticale 70 ruotabile in modo alternato, nel senso indicato dalla freccia 71, attorno ad una cerniera avente asse Y e posta sul fondo 2a del canale d reazione 2. Tale pala 70 è messa in movimento da un motore 25 posto all’esterno del canale di reazione 2 e collegato a detta pala 70 mediante una puleggia 26 ed un’asta di collegamento 27. La puleggia 26 ruota nella direzione della freccia 28. Si osservi che, sebbene la forma realizzativa qui rappresentata mostri mezzi di generazione di un’onda 5 che comprendono sostanzialmente una pala ed un motore collegati tra loro mediante sistemi di trasmissione a nastro, tuttavia altre soluzioni che contemplino altri meccanismi di trasmissione meccanica oppure mezzi 3 di generazione di un’onda armonica di gravità 101 completamente differenti da quelli qui illustrati, rientrano ancora neH’ambito di tutela della presente invenzione.

Vantaggiosamente, tale bioreattore 1 comprende mezzi 5 per la diffusone di un gas, del tipo, aria in forma di bolle 120 all’intemo di detta coltura liquida 100 contenuta in detto canale di reazione 2. Nella forma realizzativa qui descritta l’aria contenuta nelle bolle contiene a sua volta l’ossigeno necessario per il metabolismo dei microrganismi presenti nella coltura liquida 100 contenuta nella detta vasca di reazione 2. In pratica, grazie al fatto che dette bolle 120 entrano e sono imprigionate nel moto circolare, o ellittico, 200 dei microrganismi (si vedano figure 2A e 2B), ottenuto grazie all’onda armonica di gravità 101 generata all’interno della coltura 100, viene notevolmente aumentato il tempo di permanenza di dette bolle 120 all’interno della coltura liquida 100 con conseguente migliore trasferimento di ossigeno alla cellula del microrganismo. Si osservi che le figure 2A e 2B devono solo intendersi come esemplificazioni schematiche di ciò che avviene all’interno della coltura liquida 100 contenuta nella vasca di reazione 2 (si veda anche figura 1) durante la diffusione nella coltura 10 delle dette bolle e la contemporanea generazione di onde armoniche di gravità 101.

Secondo la forma realizzativa qui descritta, detti mezzi di diffusione 5 sono almeno in parte disposti e si estendono su parte della superficie del fondo 2a di detto canale 2 di reazione. Si osservi che in forme realizzative qui non descritte detti mezzi di diffusione 5 possono coprire quasi per intero la superficie di fondo 2a di detto canale di reazione 2 senza per questo uscire dall’ ambito di tutela della presente invenzione.

In particolare, tali bolle 120 sono micro bolle di diametro compreso tra 0,5 e 1,5 mm. Dimensioni cosi piccole di bolle permettono di ottenere, come già più sopra ampiamente spiegato, una nube gassosa di mieto bolle 120 che si diffonde aJl’intemo della coltura e che è in grado di realizzare ima superficie di contatto molto prolungata tra l’ossigeno disciolto e racchiuso nel campo di azione del moto circolare, o ellittico, 200 dei microrganismi e tutte le cellule presenti nella coltura, aumentando la solubilità dell’ossigeno. È noto, infatti, che a parità di gas erogato, minore dimensione delle bolle significa maggiore superficie di contatto e quindi maggiore quantità di gas disciolto nell’unità di tempo. Inoltre, minore dimensione delle bolle significa anche una minore velocità di risalita delle stesse e, quindi, un maggiore tempo di contatto gas/fluido. Se a ciò si aggiunge che le micro bolle 120 vengono rallentate nella loro risalita poiché vengono intrappolate all’intemo dei moti circolari, o ellittici, 200 dei microrganismi risulta del tutto evidente che grazie a tale bioreattore 1 si realizza un notevole aumento di produttività di tali microrganismi ed una diminuzione dei tempi di crescita di tali microrganismi.

Secondo la forma realizzativa qui descritta, detti mezzi 5 per la diffusione dell’ aria comprendono una lastra 6 in materiale poroso e, dunque, dotata di pori o fori di dimensioni micrometriche, disposta su almeno parte della superficie di fondo di detto canale, ed all’interno di detto canale di reazione 2, e mezzi 7 per comprimere detta aria, disposti all’esterno di detto canale di reazione 2. Tali mezzi di compressione 7, del tipo, ad esempio, un compressore, sono collegati fluidicamente, mediante un condotto 8, alla superficie inferiore 6b di detta lastra 6 in materiale poroso per la diffusione di detta aria in forma di bolle all’ interno di detta coltura liquida 100 attraverso detta lastra 6 in materiale poroso. Ciò permette di ottenere una nube di micro bolle 120 di aria che avanza fin verso la superficie 100a della coltura liquida 100, rallentata, o ostacolata, dalla presenza dei succitati moti circolari, o ellittici, 200 di detti microrganismi (si vedano figure 2A e 2B).

Si osservi che i mezzi di diffusione 5 citati sono già noti e descritti nella domanda di brevetto italiano No. MI2009A00611 a nome A.T.I. APPLICAZIONI TECNOLOGICHE INNOVATIVE S.r.l..

Nella stesa privativa MI2009A00611 sono citati altri diffusori noti del tipo, ad esempio, a membrana, che potrebbero essere impiegati in maniera equivalente nel bioreattore secondo l’invenzione. Inoltre, mezzi di diffusione completamente contenuti nella coltura liquida rientrano, comunque, nell’ambito di tutela della presente invenzione.

Ancora, detto bioreattore 1 comprende mezzi 10 per misurare la saturazione dell’ossigeno presente in detta coltura liquida 100. Tali mezzi 10 di misurazione della saturazione comprendono un analizzatore di gas 19 ed un sensore 20 disposto all’ interno della detta coltura liquida 100. Inoltre, detto bioreattore 1 comprende una unità di controllo 11 in grado di comandare, in base ai valore di saturazione dell’ossigeno misurato da detti mezzi di misurazione 11 della saturazione dell’ossigeno, la variazione di frequenza della detta pala 70, nel suo moto rotatorio alternato, modificando i giri del motore 25 e variando così la frequenza delle dette onde armoniche di gravità 101 generate da detti mezzi di generazione delle onde 3 in detta coltura liquida 100. Secondo l’invenzione, la frequenza di dette onde armoniche 101 generate è compresa tra 0,1 e 3 Hz e, pertanto, anche la frequenza del moto alternato della pala 70 sarà di valore identico.

Come più sopra menzionato, durante la prima fase di crescita dei microrganismi, o fase esponenziale, (si veda figura 2A) il livello di saturazione dell’ossigeno misurato da detti mezzi di misurazione della saturazione dell’ossigeno 10 è sempre superiore a circa il 5%, pertanto l’umtà di controllo 11 comanderà una frequenza di rotazione alternata della pala 70 e, dunque, dell’onda armonica di gravità 101, compresa tra 1 e 3 Hz. Tali frequenze, si è riscontrato sperimentalmente, inducono un moto circolare nei microrganismi interessati estremamente favorevoli durante tale prima fase esponenziale, poiché tale moto circolare permette di avere un maggiore spazio per l’erogazione deH’aria necessaria al nutrimento della prima fase.

Al contrario, nel momento in cui i mezzi di misurazione 11 rilevano una saturazione dell’ossigeno inferiore, o pari, al 5%, che corrisponde, per quanto detto sopra, alla seconda fase di crescita lineare stazionaria dei microrganismi nella coltura liquida 100, la frequenza dell’onda armonica di gravità 101 indotta da detti mezzi 3 di generazione di un’onda armonica di gravità sarà compresa tra circa 0,1 ed 1 Hz, con conseguenti moti ellittici 200 dei microrganismi presenti nella coltura liquida 100 (si veda figura 2B).

Tale unità di controllo 11 che, in modo noto, può comprendere una centralina di controllo o, in alternativa, un computer o simile, è anche in grado di variare la portata dell’aria diffusa da detto diffusore 5, ad esempio agendo su una valvola automatizzata (qui non mostrata) di regolazione del flusso di aria, in funzione del valore di saturazione delTossigeno misurato da detti mezzi di misurazione 10 della saturazione dell’ossigeno di detta coltura liquida 100. In particolare, la detta portata di aria è compresa tra circa 2 l/min a 0,02 l/min per litro di coltura liquida. Più in dettaglio, e secondo le fasi di crescita del microrganismo rilevate in base al livello di saturazione delTossigeno misurato, la portata di aria insufflata nella coltura 100 è compresa tra circa 2 e 0,3 l/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazione delTossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,3 l/min e 0,02 1/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazione delTossigeno inferiore a circa il 5 %.

Secondo la forma realizzativa qui descritta (figura 1), detto canale 2 comprende una parete inclinata 2b disposta all’ estremità 2c di detto canale di reazione ed opposta a quella 2d in cui sono disposti detti mezzi 3 per generare un’onda armonica di gravità. Tale parete inclinata 2b è impiegata per facilitare e mantenere la formazione delle onde armoniche di gravità.

Nel caso di microrganismi aerobici ed eterotrofi, vale a dire in grado di svilupparsi in assenza di luce, il bioreattore comprende un elemento di copertura superiore 4 (si veda figura 1) per detto canale di reazione 2. Tale copertura superiore 4 e detto canale 2 sono però impermeabili alla radiazione luminosa 150. Ovviamente, rientrano nell’ambito di tutela della presente invenzione anche bioreattori 1 privi di elemento di copertura superiore 4 o anche dotati di elemento di copertura 4 superiore 4 trasparente alla luce solare. In tali casi i microrganismi impiegati possono essere del tipo fotosintetici. Va però menzionato che, in tale ultimo caso, il gas diffuso all’intemo di detta coltura liquida 100 è una miscela di aria ed anidride carbonica, non dunque aria o ossigeno, poiché tali microrganismi fotosintetici hanno bisogno di anidride carbonica per lo svolgimento delle proprie funzioni metaboliche.

Si osservi che in figura 1 è mostrato, per semplicità, un elemento di copertura 4 dotato solo di una valvola di sfogo 160 per l’aria, tuttavia, in modo noto, tale elemento di copertura 4 può essere dotato di ulteriori clementi, quali, ad esempio, mezzi per prelevare campioni dalla coltura o mezzi per introdurre prodotti o nutrimenti nella coltura liquida o altri simili necessari per la coltura in continuo o in semi-continuo. Tali ulteriori elementi non vengono qui descritti poiché noti al tecnico del settore.

L’invenzione comprende, inoltre, un metodo per la produzione di microrganismi mediante un bioreattore 1 secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 14.

Tale metodo di produzione di microrganismi comprende le fase di: a) introdurre all’interno di detto canale di reazione 2 detta coltura liquida 100 di detti microrganismi che, nel caso specifico della forma realizzativa qui descritta, sono aerobici ed eterotrofi e b) generare, mediante detti mezzi 3 di generazione di un’onda armonica, un’onda armonica di gravità 101 in detta coltura liquida 100 in direzione dell’asse longitudinale X di detto canale di reazione 2. Vantaggiosamente, sempre secondo l’invenzione, detto metodo comprende, contemporaneamente alla detta fase b), la fase c) di diffondere aria in forma di bolle entro detta coltura liquida 100 in detto canale di reazione 2.

Più in particolare, dette bolle sono micro bolle di dimensioni comprese tra 0,5 e 1 ,5 mm.

Sempre secondo l’invenzione, la detta fase c) comprende la fase di diffondere aria da parte del fondo 2a di detto canale di reazione 2 in direzione della superficie 100a della detta coltura liquida 100.

Ancora secondo il metodo, contemporaneamente alla detta fase c), è compresa la fase e) di misurare il livello di saturazione di ossigeno di detta coltura liquida 100 e la fase f) di variare la frequenza di dette onde armoniche di gravità 101 generate da detti mezzi di generazione dell’onda 3 e/o la portata di aria diffusa all’interno di detta coltura liquida 100 mediante deti mezzi di diffusione 5, in funzione del livello di saturazione dell’ossigeno misurato da deti mezzi di misurazione 10 della saturazione di ossigeno in deta coltura liquida.

In pratica, una volta conosciuto il livello di saturazione dell’ossigeno presente nella coltura liquida 100 e, dunque, la fase di crescita dei microrganismi presenti nella coltura liquida 100, è possibile variare la frequenza delle onde armoniche e/o la portata di aria insufflata al fine sia di ridurre i consumi del bioreattore sia, soprattutto, per accompagnare le differenti esigenze dei microrganismi durante le varie fasi della loro crescita all’interno della coltura liquida 100.

In particolare, per livelli di saturazione dell’ossigeno superiore al 5%, la frequenza dell’onda armonica di gravità è mantenuta compresa tra circa 1 e 3 Hz, mentre per livelli di saturazioni dell’ossigeno inferiori a circa il 5% la frequenza è mantenuta compresa tra circa 0,1 ed 1 Hz. Nel primo caso i microrganismi si trovano nella loro fase di crescita esponenziale ed i moti 200 indoti dalla frequenza dell’onda impostata sono di tipo circolare. Nel secondo caso i microrganismi si trovano nella fase di crescita stazionaria, pertanto la frequenza dell’onda indotta è tale da provocare moti ellittici 200 di detti microrganismi all’interno della detta coltura liquida 100.

Ancora, per livelli di saturazione dell’ossigeno superiore al 5%, la portata di aria immessa nella coltura liquida attraverso detti mezzi di diffusione 5 è compresa tra circa 2 c 0,3 l/min per litro di coltura liquida, mentre per livelli di saturazioni dell’ossigeno inferiori a circa il 5% la portata di aria immessa nella coltura liquida è compresa tra circa 0,3 l/min e 0,02 l/min. Come detto più sopra il livello di saturazione dell’ossigeno misurato all’interno della detta coltura liquida 100 permette di stabilire la fase di crescita dei microrganismi e, quindi, di determinare, in un certo modo, la misura del consumo di ossigeno dei microrganismi. Durante la fase di crescita lineare, il consumo di ossigeno tende a scendere gradualmente e, pertanto, la portata dell’aria viene diminuita di conseguenza.

Va, infine, precisato che il metodo, precedentemente alla detta fase b) comprende l’ulteriore fase di coprire mediante un elemento di copertura 4 impermeabile alla radiazione solare detto canale di reazione 2, anch’esso impermeabile alla radiazione solare.

Nel caso di impiego di microrganismi fotosintetici tale fase di copertura del canale di reazione o è assente, poiché il canale di reazione è privo di tale elemento di copertura 4 o è presente, ma in questo caso è necessario che almeno l’elemento di copertura 4 sia trasparente alla radiazione luminosa. Per tali microrganismi fotosintetici, inoltre, il gas insufflato è una miscela di aria ed anidride carbonica, anziché aria o ossigeno.

Qui di seguito sono riportati alcuni esempi di funzionamento del bìorealtore secondo l’invenzione. Tali esempi non sono comunque da considerasi in alcun modo limitativi della soluzione descritta. In tali esempi sono stati utilizzati dei bioreattori 1 di diversi volumi; 50 L, 100 L, 500 L e 1000 L. Il microrganismo utilizzato per la crescita è lo Schizochytrium limacinum SR21. Come fonte di carbonio è stato utilizzato il glucosio. Ogni bioreattore 1 è stato dosato con un contenuto, nel suo liquido colturale, di azoto, fosforo, sali minerali, metalli in tracce e vitamine. Nella fase di crescita esponenziale è stato consumato solo azoto, mentre il carbonio organico è stato consumato durante tutta la fase di fermentazione. 1 campioni sono stati liofilizzati e trasformati in Acidi Grassi Metile Estere (FAME Fatty Acid Metil Ester) e analizzati con gas cromatografia.

Esempio 1

Produzione in continuo con bioreattore da 50 litri e con emissione di micro bolle.

Ore Produzione gr./lt DHA % FAME%

50.3 38.6 17.2 49.3

42.3 48.1 18.4 51.6 45.1

53 14.4 41.8

56.5 58.7 13.8 53.7

Media 48.5 49.6 15.9 49.1

De.St* 6.0 8.51 2.4 5.1

<■>"Deviazione Standard

Nel Bireattore da 50 litri. La crescita è stata controllata durante la fase esponenziale, utilizzando un’onda con una ampiezza il cui diametro risulta circolare e avente una misura di 1/3 dell’altezza dello stesso liquido colturale in fase di equilibrio. Mentre nella fase lineare stazionaria è stata utilizzata un’ampiezza di tipo ellittico.

Nel presente esempio si può notare che il tempo di crescita dello Schizochytrium linacinum SR21,con l’emissione di micro bolle in combinazione con Fidrodinamica delle onde, va da un minimo di 42 h ad un Massimo di 56 h con una produttività che va da 38 gr/lt. a 58 /gr/lt.

Esempio 2

Produzione in continuo con Bioreattore ad Induzione d’Onda da 200 litri con ed emissione di Microbolle.

Ore Produzione gr./lt. DHA % FAME %

41.0 57.6 23.5 52.6

49.0 61.0 23.8 55.3

36.0 53.0 21.4 47.3

38.0 58.5 19.8 45.8

50.0 57.6 23.9 53.4

51.0 61.1 21.6 50.6

52.0 61.7 23.7 54.9

44.0 59.7 22.3 53.8

Media 45.1 58.7 22.5 51.7

De.St.* 6.22 5.01 1.42 7.29

‘Deviazione Standard

Questo esempio illustra la produzione di Schizochytrium limacinum SR21 in un bioreattore da 200 litri. Anche in questo caso la crescita è stata controllata durante la fase esponenziale. Nel presente esempio il tempo di crescita del microrganismo Schizochytrium limacinum SR21, con remissione di micro bolle in combinazione con Γ idrodinamica delle onde, va da un minimo di 36 h ad un massimo di 52 h con una produttività che va da 53 gr/lt. a 61 /gr/lt.

Esempio 3

Produzione in continuo con Bioreattore da 500 litri con emissione di micro bolle.

Ore produzione gr./lt. DHA % FAME %

44 58.7 22.3 52.4

50 61.3 22.5 55.0

48 53.4 22.8 53.3

43 50.1 19.8 50.0

61 62.0 23.2 55.0

51 57.2 23.6 53.5

48 51.3 19.9 45.6

52 60.4 19.7 51.6

Media 49.6 56.8 21.7 52.0

De.St.* 14.76 12.27 4.10 5.16

‘Deviazione Standard

Questo esempio illustra la produzione di Schizochytrium limacinum SR21 in un bioreattore da 500 litri. Anche in questo caso la crescita è stata controllata durante la fase esponenziale. Nel presente esempio il tempo di crescita del microrganismo Schizochytrium limacinum SR21, con remissione di micro bolle in combinazione con ridrodinamica delle onde, va da un minimo di 44 h ad un Massimo di 52 h con una produttività che va da 50.1 gr/lt. a 62 /gr/lt.

Esempio 4

Produzione in continuo con bioreattore da 10001 e con emissione di micro bolle.

Ore Produzione gr./lt DHA % FAME %

37.0 77.3 17.0 46.3

49.0 106.2 17.9 47.2

51.0 101.7 16.3 47.0

34.0 91.2 17.2 46.0

42.0 94.6 17.5 46.9

Media 42.6 94.2 17.1 46.6

De.St* 7.36 7.7 0.60 5.1

*Deviazione Standard

Questo esempio illustra la produzione di Schizochytrium limacinum SR21 in un bioreattore da 1000 litri. Nel presente esempio il tempo di crescita del microrganismo Schizochytrium limacinum SR21, con l’emissione di micro bolle in combinazione con l’idrodinamica delle onde, va da un minimo di 34 h ad un Massimo di 51 h con una produttività che va da 77.3 gr/lt. a 106.2 /gr/lt. In questo caso si è riscontrato che per volumi del canale superiori ai 500 litri, è possibile ottenere risultati migliori in termini di crescita dei microrganismi eterotrofi, in quanto si è riscontrata una maggiore resa nel rapporto emissione delle micro bolle di aria con l’andamento idrodinamico delle onde armoniche .

Claims

1.4) RIVENDICAZIONI 1. Bioreatore (1) per la produzione di microrganismi, comprendente un canale di reazione (2) contenente una coltura liquida (100) di deti microrganismi, mezzi (3) per generare in detta coltura liquida onde armoniche di gravità (101) che si propagano in direzione dell’asse longitudinale (X) di detto canale di reazione (2), caraterizzato dal fatto di comprendere mezzi (5) per la diffusone di un gas (200) in forma di bolle all’intemo di detta coltura liquida (100) contenuta in deto canale di reazione (2).

2. Bioreatore (1) secondo la rivendicazione 1, caraterizzato dal fato che deti mezzi di diffusione (5) sono disposti, almeno in parte, e si estendono su almeno parte del fondo (2a) di detto canale di reazione per la diffusione di deto gas in direzione della superficie (100a) della detta coltura liquida (100).

3. Bioreatore (1) secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che dette bolle sono micro bolle di diametro compreso tra 0,5 e 1 ,5 mm.

4. Bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni da 2 a 3, caratterizzato dal fato che detti mezzi (5) per la diffusione di detto gas comprendono almeno una lastra (6) in materiale poroso disposta su almeno parte della superficie dì fondo (2a) di deto canale di reazione e mezzi (7) per comprimere detto gas, detti mezzi di compressione essendo fluidicamente collegati a detta lastra in materiale poroso per la diffusione di deto gas all’interno di detta coltura liquida atraverso detta almeno una lastra in materiale poroso.

5. Bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che deto gas è scelto tra aria o ossigeno, oppure una miscela di aria ed anidride carbonica.

6. Bioreatore (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di comprendere, inoltre, mezzi (10) per misurare la saturazione dell’ossigeno presente in detta coltura liquida ed almeno ima unità di controllo (11) per variare la frequenza delle dette onde armoniche generate da detti mezzi di generazione delle onde e/o la portata di aria, o ossigeno, diffusa da detto diffusore all’ interno di deta coltura liquida in funzione del valore di saturazione dell’ossigeno misurato da detti mezzi di misurazione della saturazione dell’ossigeno in detta coltura liquida.

7. Bioreatore (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta frequenza di dete onde armoniche generate è compresa tra 0,1 e 3 Hz.

8. Bioreattore (1) secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detta frequenza di dete onde armoniche generate è compresa tra circa 1 e 3 Hz per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,1 ed 1 Hz per livelli misurati di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %.

9. Bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni da 6 a 8, caratterizzato dal fatto che detta portata di aria è compresa tra circa 2 l/min a 0,02 l/min per litro di coltura liquida.

10. Bioreattore (1) secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detta portata di aia è compresa tra circa 2 e 0,3 l/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,3 l/min e 0,02 1/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %.

11. Bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto canale di reazione (2) comprende una parete inclinata (2b) disposta all’ estremità (2c) di detto canale di reazione ed opposta a quella (2d) in cui sono disposti detti mezzi per generare un’onda armonica,

12. Bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di comprendere un elemento di copertura superiore (4) per detto canale di reazione (2),

13. Bioreattore (1) secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detto elemento di copertura e detto canale di reazione sono impermeabili alla radiazione luminosa.

14. Bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detti microrganismi sono scelti tra microrganismi aerobici e/o eterotrofi del tipo diatomee, dinoflagellati del genere Crypthecodinium cohnii, lieviti del genere Yarrowia, funghi del genere Mucor e Mortierella, membri del gruppo Streamenopiles microbica le quali includono microalghe eterotrofe e i Thraustochytris che comprendono i generi Schizochytrium, la quale specie può comprendere aggregatimi, limacinum, mangrovie, minutum, octosporum, i Traustochytrium, la quale specie può comprendere arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striato, i generi Ulkenia, la quale specie può comprendere amoeboidea, kerguelensis, minuta, profónda, irradiano, sailens sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis, i generi Aplanochytrium, Japonochytnum, Labrinthulids, Labyrinthuloides, Diplophrys, Pyrrhosorus, Chlamydomyxa, Sorodiplophrys, cellule Staminali umane e vegetali, cellule Mammifere, Batteri, oppure detti microrganismi sono del tipo fotosintetici e comprendono la classe di microalghe del tipo Cyanophyceae, Chlorophyceae, Haptophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Bacillariophyceae, Prasinophyceae, Eumycota, Chrysophyceae, Xanthophyceae.

15. Metodo per la produzione di microrganismi mediante un bioreattore (1) secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 14, comprendente le fase di: a) introdurre all’ interno di detto canale di reazione detta coltura liquida di detti microrganismi; b) generare un’onda armonica in detta coltura liquida in direzione dell’asse longitudinale di detto canale; detto metodo essendo caratterizzato dal fatto di comprendere, contemporaneamente alla detta fase b), la fase c) di diffondere un gas in forma di bolle entro detta coltura liquida contenuta in detto canale di reazione (2).

16. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che dette bolle sono micro bolle di dimensioni comprese tra 0,5 e 1 ,5 mm.

17. Metodo secondo la rivendicazione 15 o 16, caratterizzato dal fatto che detta fase c) comprende la fase di diffondere gas da almeno parte del fondo di detto canale di reazione in direzione della superficie della detta coltura liquida.

18. Metodo secondo una o più delle rivendicazioni da 15 a 17, caratterizzato dal fatto che detto gas è scelto tra aria o ossigeno, oppure una miscela di aria ed anidride carbonica.

19. Metodo secondo una o più delle rivendicazioni da 15 a 18, caratterizzato dal fatto che, contemporaneamente alla detta fase c), è compresa la fase e) di misurare il livello di saturazione di ossigeno di detta coltura liquida e la fase f) di variare la frequenza di dette onde armoniche di gravità generate da detti mezzi di generazione dell’onda e/o la portata di aria, o di ossigeno, diffusa aH’intemo di detta coltura liquida, in funzione del livello di saturazione dell’ossigeno misurato da detti mezzi di misurazione della saturazione di ossigeno di detta coltura liquida.

20. Metodo secondo la rivendicazione 19, caratterizzato dal fatto che la frequenza di dette onde armoniche generate è compresa tra circa 1 e 3 Hz per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,1 ed 1 Hz per livelli jnisurati di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %.

21. Metodo secondo la rivendicazione 19 o 20, caratterizzato dal fatto che detta portata di aria è compresa tra circa 2 e 0,3 l/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazioni dell’ossigeno superiori a circa il 5% ed è compresa tra circa 0,3 l/min e 0,02 l/min per litro di coltura liquida per livelli misurati di saturazione dell’ossigeno inferiore a circa il 5 %.