ITPD950243A1 - PROCESS OF COATING OBJECTS WITH HYALURONIC ACID OR ITS DERIVATIVES - Google Patents
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Abstract
La presente invenzione si riferisce ad un processo per il rivestimento della superficie esterna di oggetti con acido ialuronico e suoi derivati o altri polimeri naturali o semisintetici per applicazioni in campo sanitario - chirurgico e in diagnostica. Secondo tale processo è possibile legare in maniera stabile il polimero sulle superfici di oggetti realizzati con un'ampia gamma di materiali. Le superfici trattate secondo il processo descritto nella presente invenzione sono caratterizzate da elevata bagnabilità e sono in grado di inibire l'adesione di cellule o batteri presenti nei fluidi biologici.The present invention relates to a process for coating the external surface of objects with hyaluronic acid and its derivatives or other natural or semi-synthetic polymers for applications in the healthcare-surgical and diagnostic fields. According to this process it is possible to bind the polymer on the surfaces of objects made with a wide range of materials in a stable manner. The surfaces treated according to the process described in the present invention are characterized by high wettability and are able to inhibit the adhesion of cells or bacteria present in biological fluids.
Description
Descrizione di una invenzione industriale dal titolo: "PROCESSO DI RIVESTIMENTO DI OGGETTI CON ACIDO IALURONICO O SUOI DERIVATI" Description of an industrial invention entitled: "PROCESS OF COATING OBJECTS WITH HYALURONIC ACID OR ITS DERIVATIVES"
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE La presente invenzione si riferisce ad un processo per il rivestimento della superficie esterna di oggetti con acido ialuronico e suoi derivati o altri polimeri naturali o semisintetici per applicazioni in campo sanitario-chirurgico e in diagnostica. Secondo tale processo è possibile legare in maniera stabile il polimero sulle superfici di oggetti realizzati con un'ampia gamma di materiali. Le superfici trattate secondo il processo descritto nella presente invenzione sono caratterizzate da elevata bagnabilità e sono in grado di inibire l'adesione di cellule o batteri presenti nei fluidi biologici. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a process for coating the external surface of objects with hyaluronic acid and its derivatives or other natural or semi-synthetic polymers for applications in the medical-surgical and diagnostic fields. According to this process it is possible to stably bond the polymer on the surfaces of objects made with a wide range of materials. The surfaces treated according to the process described in the present invention are characterized by high wettability and are able to inhibit the adhesion of cells or bacteria present in biological fluids.
OGGETTO DELL'INVENZIONE OBJECT OF THE INVENTION
L'invenzione riguarda in particolare un processo per il rivestimento di oggetti biomedicali con uno strato sottile di acido ialuronico o suoi derivati. Tale strato sottile viene legato in maniera stabile al materiale sottostante. In questo modo viene realizzata una struttura composita caratterizzata, nella sua interezza, dalle proprietà del maferiale utilizzato per la realizzazione dell'oggetto, dotato però delle caratteristiche superficiali impartite dalla presenza dello strato sottile di acido ialuronico o dei suoi derivati. Tali caratteristiche conferiscono alle superfici dei materiali trattati secondo il processo della presente invenzione un'elevata idrofilia. Le superfici degli oggetti trattati secondo il metodo della presente invenzione sono in grado di prevenire l'adesione di cellule presenti in liquidi biologici e di ridurre l'adesione batterica. The invention relates in particular to a process for coating biomedical objects with a thin layer of hyaluronic acid or its derivatives. This thin layer is stably bonded to the underlying material. In this way, a composite structure is created which is characterized, in its entirety, by the properties of the material used to make the object, but with the surface characteristics imparted by the presence of the thin layer of hyaluronic acid or its derivatives. These characteristics give the surfaces of the materials treated according to the process of the present invention a high hydrophilicity. The surfaces of the objects treated according to the method of the present invention are able to prevent the adhesion of cells present in biological liquids and to reduce bacterial adhesion.
CAMPO DELL'INVENZIONE FIELD OF THE INVENTION
L'acido ialuronico è un mucopolisaccaride naturale presente, seppure in concentrazioni differenti, praticamente in tutti i tessuti. Come noto agli esperti dell'arte, soluzioni acquose di acido ialuronico o dei suoi sali, di derivati dell'acido ialuronico e di polisaccaridi in generale sono caratterizzate da notevole viscosità, scivolosità e capacità di agire da riduttori di attrito, caratteristica che è alla base della presenza e della funzione dei polisaccaridi della famiglia dell’acido ialuronico nel corpo umano e di altri animali (Michels R.G. et al., "Sodium hyaluronate in anterior and posterior segment surgery", Physicochemical and Pharmacological Characteristics of Hyaluronic Acid, 1-15, 1989"). Hyaluronic acid is a natural mucopolysaccharide present, albeit in different concentrations, in practically all tissues. As known to those skilled in the art, aqueous solutions of hyaluronic acid or its salts, hyaluronic acid derivatives and polysaccharides in general are characterized by considerable viscosity, slipperiness and the ability to act as friction reducers, a characteristic which is at the base the presence and function of polysaccharides of the hyaluronic acid family in the human body and other animals (Michels R.G. et al., "Sodium hyaluronate in anterior and posterior segment surgery", Physicochemical and Pharmacological Characteristics of Hyaluronic Acid, 1-15, 1989 ").
Per queste loro qualità, i polisaccaridi della famiglia dell'acido ialuronico (sia quelli naturali che quelli ottenuti per azione di sintesi chimica sui composti naturali) sono stati oggetto di studio e sperimentazione. In particolare, un'intensa attività è stata svolta nell'individuazione di metodi adatti a fissare in modo permanente strati sottili di acido ialuronico (frazione Hyalectin di cui al brevetto europeo N. 0138572) o suoi derivati (US N. 4,851,521) sulla superficie di altri materiali. Lo scopo di questa attività era quello di realizzare oggetti che, pur mantenendo le caratteristiche globali del materiale di cui erano costituiti (materiale che in seguito sarà definito substrato), fossero dotati di migliorate proprietà superficiali. In particolare, a causa della loro elevata idrofilia, l'acido ialuronico o i suoi derivati si prestano particolarmente bene alla realizzazione di oggetti alle cui superfici sia richiesto uno scarso grado di adesione con specie cellulari presenti nei tessuti o fluidi biologici. Tali superfici rivestono particolare interesse in quelle applicazioni in cui l'adesione tra materiali e cellule possa recare danni ai tessuti biologici (Kaufman, H.E. et al., Science, 189, 525, 1977). For these qualities, the polysaccharides of the hyaluronic acid family (both natural and those obtained by chemical synthesis action on natural compounds) have been the subject of study and experimentation. In particular, intense activity was carried out in identifying methods suitable for permanently fixing thin layers of hyaluronic acid (Hyalectin fraction as per European patent No. 0138572) or its derivatives (US No. 4,851,521) on the surface of other materials. The purpose of this activity was to create objects which, while maintaining the global characteristics of the material they were made of (material which will later be defined as substrate), were endowed with improved surface properties. In particular, due to their high hydrophilicity, hyaluronic acid or its derivatives lend themselves particularly well to the creation of objects whose surfaces require a low degree of adhesion with cellular species present in tissues or biological fluids. Such surfaces are of particular interest in those applications in which the adhesion between materials and cells can cause damage to biological tissues (Kaufman, H.E. et al., Science, 189, 525, 1977).
La modifica delle superfici dei materiali mediante acido ialuronico o suoi derivati ha presentato per molti alcune difficoltà. Innanzitutto si è visto che le soluzioni di acido ialuronico hanno una tensione superficiale piuttosto elevata, uguale o inferiore a quella dell’acqua (F. H. Silver et al., Journal of Applied Biomaterials, 5, 89, (1994). Come noto, per ottenere una ricopertura omogenea mediante processo di applicazione da soluzione, il materiale applicato deve avere una tensione superficiale inferiore rispetto al substrato, in modo da ricoprirlo in maniera completa ed omogenea. Poiché praticamente la totalità dei materiali polimerici utilizzabili come substrati presenta tensione superficiale inferiore a quella dell'acqua (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 304, 1994) la formazione di uno strato sottile di acido ialuronico che ricopra in maniera omogenea il substrato risulta impedita. The modification of the surfaces of materials using hyaluronic acid or its derivatives has presented some difficulties for many. First of all, it has been seen that hyaluronic acid solutions have a rather high surface tension, equal to or lower than that of water (F. H. Silver et al., Journal of Applied Biomaterials, 5, 89, (1994). a homogeneous coating by means of a solution application process, the material applied must have a lower surface tension than the substrate, in order to cover it completely and homogeneously. Since practically all of the polymeric materials that can be used as substrates have a surface tension lower than that of 'water (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 304, 1994) the formation of a thin layer of hyaluronic acid which homogeneously covers the substrate is prevented.
Da notare, infine, che l'addo ialuronico è solubile in acqua, per cui oggetti ottenuti per semplice ricopertura con uno strato di addo ialuronico da soluzione perdono immediatamente la loro ricopertura se posti a contatto con soluzioni acquose, compresi i fluidi biologia. Derivati dell’acido ialuronico, anche se non solubili in acqua, sono comunque estremamente idrofili ed hanno una elevata tendenza a rigonfiare in presenza di acqua o soluzioni acquose (H.N.Joshi and E.M. Topp, International Journ. of Pharm. 80 (1992) 213-225). Questa caratteristica comporta, in ambiente acquoso, l'immediato distacco dello strato superficiale idrofilo applicato sul substrato mediante semplice processo di ricopertura da soluzione. Per questi motivi, sono stati studiati dei metodi che prevedono la formazione di un legame chimico tra la superficie del substrato e l'acido ialuronico o i suoi derivati. La presenza di un legame chimico stabile impedisce la dissoluzione dello strato superficiale e conferisce all'oggetto proprietà superficiali migliorate e stabili nel tempo. Finally, it should be noted that the hyaluronic addus is soluble in water, so that objects obtained by simply covering with a layer of hyaluronic addo from solution immediately lose their covering if placed in contact with aqueous solutions, including biological fluids. Derivatives of hyaluronic acid, even if not soluble in water, are however extremely hydrophilic and have a high tendency to swell in the presence of water or aqueous solutions (H.N. Joshi and E.M. Topp, International Journ. Of Pharm. 80 (1992) 213- 225). This characteristic entails, in an aqueous environment, the immediate detachment of the hydrophilic surface layer applied to the substrate by means of a simple solution coating process. For these reasons, methods have been studied that involve the formation of a chemical bond between the surface of the substrate and hyaluronic acid or its derivatives. The presence of a stable chemical bond prevents the dissolution of the surface layer and gives the object improved and stable surface properties over time.
La realizzazione di un legame chimico tra il substrato e lo strato superficiale presuppone l’esistenza di gruppi chimici adeguati in entrambi. Mentre la struttura chimica deH'addo ialuronico assicura la presenza di diverse funzionalità adeguate, la superficie della maggior parte dei materiali sintetici non è particolarmente adatta a questo tipo di operazione. Per questo motivo, i processi tesi a realizzare un legame chimico tra uno strato superficiale di acido ialuronico o suoi derivati ed un substrato sintetico prevedono in genere due stadi. Nel primo stadio vengono introdotti gruppi chimici adeguati sulla superficie, mentre nel secondo, viene attivata la reazione tra i gruppi chimici superficiali introdotti sul substrato e l'acido ialuronico o suoi derivati. Ad esempio, nei brevetti U.S. The creation of a chemical bond between the substrate and the surface layer presupposes the existence of suitable chemical groups in both. While the chemical structure of hyaluronic acid ensures the presence of several suitable functionalities, the surface of most synthetic materials is not particularly suitable for this type of operation. For this reason, the processes aimed at achieving a chemical bond between a surface layer of hyaluronic acid or its derivatives and a synthetic substrate generally involve two stages. In the first stage, suitable chemical groups are introduced on the surface, while in the second, the reaction between the surface chemical groups introduced on the substrate and the hyaluronic acid or its derivatives is activated. For example, in U.S. Pat.
4,657,820, U.S. 4,663,233, U.S. 4,722,867, U.S. 4,801,475, U.S. 4,810,586, U.S. 4,959,074, U.S. 5,023,114, U.S. 5,037,677, viene descritto l'uso di uno strato intermedio tra substrato e strato superficiale di acido ialuronico. Tale strato intermedio aderisce fisicamente al substrato e contiene gruppi chimici adatti a formare un legame con i gruppi chimici dell'acido ialuronico. Per facilitare lo scorrimento e la ricopertura omogenea del substrato da parte di quest'ultimo, inoltre, nei suddetti brevetti si descrive l'uso di albumina che, aggiunta all'acido ialuronico, migliora la capacità di bagnare uniformemente lo strato intermedio. 4,657,820, U.S. 4,663,233, U.S. 4,722,867, U.S. 4,801,475, U.S. 4,810,586, U.S. 4,959,074, U.S. 5,023,114, U.S. 5,037,677, the use of an intermediate layer between substrate and surface layer of hyaluronic acid is described. This intermediate layer physically adheres to the substrate and contains chemical groups suitable for forming a bond with the chemical groups of hyaluronic acid. To facilitate the sliding and homogeneous covering of the substrate by the latter, moreover, the aforementioned patents describe the use of albumin which, added to hyaluronic acid, improves the ability to uniformly wet the intermediate layer.
In altri documenti ancora viene utilizzata la tecnologia del plasma per introdurre gruppi reattivi sul substrato. Questa tecnica (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 6, 1994), consente di modificare la superficie dei materiali polimerici in maniera veloce ed efficace. Nella domanda di brevetto intemazionale WO 94/06485 viene descritta l'introduzione di gruppi funzionali sulla superficie di un materiale polimerico mediante trattamento con plasma di metanolo. Il materiale trattato viene in seguito posto a contatto con una soluzione di epicloridrina che garantisce la presenza di gruppi adatti a reagire con polisaccaridi. In altri articoli (Acta Physiologica Scandinava, 116, 201, 1982; Journal of Biomedicai Materials Research, 18, 953, 1984, Elan et al.) si descrive un trattamento con plasma di ossigeno seguito dall'applicazione di 3-glicidossipropiltrimetossisilano. Le superfici così trattate vengono utilizzate per la formazione di legame covalente con polisaccaridi. Tuttavia, benché in generale soddisfacenti, i metodi sopra descritti presentano alcune difficoltà. In particolare, l'uso di uno strato intermedio presenta la necessità di adeguare la composizione di quest'ultimo alla natura del substrato, in modo da rendere l'adesione la più elevata possibile. Nel caso di produzione di oggetti costituiti con materiali nuovi, o non comunemente utilizzati, è necessario dedicare tempo ed indagini per individuare la formulazione più adeguata per lo strato intermedio. Se gli oggetti da ricoprire sono composti da materiali diversi, risulta difficile applicare uno strato intermedio adeguato per ogni componente evitando sovrapposizioni e sconfinamenti degli strati intermedi in zone non opportune. L'uso dell'albumina per favorire la bagnabilità del substrato, inoltre, può non essere desiderato, specialmente nel caso di prodotti destinati ad applicazioni biomediche. Passando agli altri esempi citati, è preferibile evitare l'uso di epicloridrina e di 3-glicidossipropiltrimetossisilano, essendo noto che entrambi i composti sono estremamente pericolosi per la salute. Infatti, secondo la classificazione dei prodotti pericolosi adottata dalla Comunità Economica Europea, tali composti sono marcati con le denominazioni definite a rischio "R45" ed "R40" rispettivamente, come riportato, ad esempio, nella maggior parte dei cataloghi di prodotti e reagenti chimici. Tale designazione indica, nel primo caso, che il composto può provocare il cancro e, nel secondo, che esiste la possibilità di effetti irreversibili. Più in generale, la ressa di tutte le reazioni, che coinvolgono dei gruppi funzionali immobilizzati su una superficie e molecole grosse come i polisaccaridi precedentemente descritti, è seriamente limitata dall'effetto denominato, nella comune accezione chimica, di ingombro sferico. Le elevate dimensione della molecola del polisaccaride impediscono o ostacolano il contatto tra gruppi reattivi e le probabilità di un incontro reattivo efficace sono decisamente basse. Per ovviare a questa limitazione, nella domanda di brevetto italiana n. PD95A000039 depositata il 7.2.95 viene descritto un processo di ricopertura di oggetti mediante acido ialuronico e suoi derivati, che prevede la reazione in soluzione tra il polimero ed una molecola in grado di legarsi sia ad esso che al substrato (definita "molecola bifunzionale"), dove gli effetti di ingombro sierico sono decisamente ridotti. Il prodotto di reazione viene in seguito fatto reagire con la superficie del substrato, resa reattiva e bagnabile da un trattamento mediante plasma. Anche se questo processo risolve alcuni dei problemi esistenti negli altri processi descritti, esso impone di osservare una cura particolare nella fase di asciugatura della superficie ricoperta dalla soluzione contenente il prodotto di reazione tra la molecola bifunzionale e l'acido ialuronico o derivati. Infatti, l'adesione del prodotto di reazione tra l'acido ialuronico e la molecola bifunzionale al substrato avviene al momento dell'allontanamento dell'acqua. Per ottenere una ricopertura omogenea, nel caso di oggetti con geometria complessa, è necessario adottare sistemi di asciugatura costosi o complessi come stufe da vuoto, sistemi di rotazione o altri metodi analoghi. Altri metodi descritti nell'arte prevedono la reazione tra polisaccaridi e gruppi amminici. Nel brevetto giapponese JP 04126074 (27.04.92) viene descritto l'uso di un trattamento con plasma di ammoniaca per introdurre gruppi amminici sulla superficie di substrati polimerici. In still other documents, plasma technology is used to introduce reactive groups onto the substrate. This technique (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 6, 1994), allows to modify the surface of polymeric materials in a fast and effective way. In the international patent application WO 94/06485 the introduction of functional groups on the surface of a polymeric material by plasma treatment of methanol is described. The treated material is then placed in contact with an epichlorohydrin solution which guarantees the presence of groups suitable for reacting with polysaccharides. In other articles (Acta Physiologica Scandinava, 116, 201, 1982; Journal of Biomedicai Materials Research, 18, 953, 1984, Elan et al.) A treatment with oxygen plasma followed by the application of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane is described. The surfaces thus treated are used for the formation of a covalent bond with polysaccharides. However, although generally satisfactory, the methods described above present some difficulties. In particular, the use of an intermediate layer entails the need to adapt the composition of the latter to the nature of the substrate, so as to make the adhesion as high as possible. In the case of production of objects made with new or uncommonly used materials, it is necessary to dedicate time and investigations to identify the most suitable formulation for the intermediate layer. If the objects to be covered are composed of different materials, it is difficult to apply an adequate intermediate layer for each component, avoiding overlapping and encroachment of the intermediate layers in inappropriate areas. Furthermore, the use of albumin to promote the wettability of the substrate may not be desired, especially in the case of products intended for biomedical applications. Turning to the other examples cited, it is preferable to avoid the use of epichlorohydrin and 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, it being known that both compounds are extremely dangerous for health. In fact, according to the classification of dangerous products adopted by the European Economic Community, these compounds are marked with the risk names "R45" and "R40" respectively, as reported, for example, in most of the catalogs of chemical products and reagents. This designation indicates, in the first case, that the compound can cause cancer and, in the second, that there is the possibility of irreversible effects. More generally, the rush of all reactions, which involve functional groups immobilized on a surface and large molecules such as the polysaccharides previously described, is seriously limited by the effect called, in the common chemical sense, of spherical dimensions. The large size of the polysaccharide molecule prevents or hinders contact between reactive groups and the chances of an effective reactive encounter are very low. To overcome this limitation, in the Italian patent application n. PD95A000039 filed on 7.2.95 a process of covering objects using hyaluronic acid and its derivatives is described, which involves the reaction in solution between the polymer and a molecule capable of binding both to it and to the substrate (defined "bifunctional molecule") , where the effects of serum bulk are significantly reduced. The reaction product is then reacted with the surface of the substrate, made reactive and wettable by a plasma treatment. Although this process solves some of the problems existing in the other processes described, it requires particular care to be observed in the drying phase of the surface covered by the solution containing the reaction product between the bifunctional molecule and the hyaluronic acid or derivatives. In fact, the adhesion of the reaction product between the hyaluronic acid and the bifunctional molecule to the substrate occurs when the water is removed. To obtain a homogeneous coating, in the case of objects with complex geometry, it is necessary to adopt expensive or complex drying systems such as vacuum ovens, rotation systems or other similar methods. Other methods described in the art provide for the reaction between polysaccharides and amino groups. In the Japanese patent JP 04126074 (27.04.92) the use of a plasma treatment of ammonia is described to introduce amino groups on the surface of polymeric substrates.
Tali gruppi amminici vengono in seguito fatti reagire con acido ialuronico o altri polisaccaridi mediante l'uso di un agente condensante. Nel brevetto US 4,810,784 la superficie di un oggetto in materiale polimerico viene trattata con soluzioni reattive, in modo da introdurre cariche elettrostatiche negative sulla superficie stessa. La superficie così trattata viene posta a contatatto con una soluzione acquosa di polietileneimmina (PEI), un polimero caratterizzato dalla presenza di gruppi amminici e dotato di carica elettrostatica positiva. L'interazione tra le cariche di diverso segno lega PEI sulla superficie modificata e viene dunque ottenuta una superficie ricca di gruppi amminici. Eparina ed airi polisaccaridi vengono legati alla superficie amminata dopo essere stati trattati con soluzioni di nitriti. Come noto nella chimica organica, l'azione dei nitriti provoca la formazione di gruppi aldeidici. Questi ultimi reagiscono con la superficie amminata, legando irreversibilmente il polisaccaride alla superficie stessa. La medesima reazione viene sfruttata introducendo gruppi aldeidici mediante blanda ossidazione con periodato (C. Brink et al., "Colloids and Surfaces", 149, 66, 1992). La reazione tra PEI e gruppi aldeidici presenti o introdotti su polisaccaridi è, inoltre, stata utilizzata per legare alla superficie polisaccaridi in diverse conformazioni (E. Ostenberg et al., Journal of Biomedicai Materials Research, 29, 741, 1995). Il brevetto US 5,409,696 descrive la modifica della superficie di materiali con trattamento mediante plasma contenente vapore d'acqua e successiva reazione della superficie trattata con PEI. La superficie ricca di gruppi amminici così ottenuta è in grado di legare irreversibilmente eparina e altri polisaccaridi mediante l'azione di agenti condensanti. Tipicamente, viene descritta la reazione tra gruppi carbossilici del polisaccaride e gruppi amminici della superficie promossa da etildimetilamminopropilcarbodiimmide (EDC). L'impiego di questo processo per la ricopertura dell'interno di tubi destinati ad entrare a contatto con il sangue è stata descritta da P.V. Narayanan (Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 6, 181, 1994). Such amino groups are then reacted with hyaluronic acid or other polysaccharides by the use of a condensing agent. In US patent 4,810,784 the surface of an object made of polymeric material is treated with reactive solutions, so as to introduce negative electrostatic charges on the surface itself. The surface thus treated is placed in contact with an aqueous solution of polyethyleneimine (PEI), a polymer characterized by the presence of amino groups and endowed with a positive electrostatic charge. The interaction between the charges of different sign binds PEI on the modified surface and therefore a surface rich in amino groups is obtained. Heparin and polysaccharides are bound to the aminated surface after being treated with nitrite solutions. As known in organic chemistry, the action of nitrites causes the formation of aldehyde groups. The latter react with the aminated surface, irreversibly binding the polysaccharide to the surface itself. The same reaction is exploited by introducing aldehyde groups by mild oxidation with periodate (C. Brink et al., "Colloids and Surfaces", 149, 66, 1992). The reaction between PEI and aldehyde groups present or introduced on polysaccharides has also been used to bind polysaccharides in different conformations to the surface (E. Ostenberg et al., Journal of Biomedicai Materials Research, 29, 741, 1995). US patent 5,409,696 describes the modification of the surface of materials with treatment by means of plasma containing water vapor and subsequent reaction of the surface treated with PEI. The surface rich in amino groups thus obtained is able to irreversibly bind heparin and other polysaccharides through the action of condensing agents. Typically, the reaction between carboxyl groups of the polysaccharide and amine groups of the surface promoted by ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC) is described. The use of this process for covering the inside of tubes intended to come into contact with blood has been described by P.V. Narayanan (Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 6, 181, 1994).
La sperimentazione ha rivelato che i processi descritti nei brevetti e negli articoli citati non sono completamente soddisfacenti per quanto riguarda la realizzazione di oggetti modificati in superficie mediante acido ialuronico o suoi derivati. Infatti, l'introduzione di gruppi funzionali di tipo amminico mediante plasma di ammoniaca, come nel brevetto JP 04126074 (27.04.92), non è facilmente sfruttabile in un processo produttivo. Gli esperti del settore conoscono che la densità di gruppi funzionali introdotti mediante tale tecnica sulla superficie del substrato è piuttosto bassa e troppo dipendente dalla geometria precisa del reattore utilizzato per il trattamento mediante plasma, dalla natura del substrato, dalla presenza di additivi e/o contaminanti sulla superficie ed all'interno del substrato e dalle condizioni di conservazione del substrato prima e dopo il trattamento, per potere essere di effettiva utilità in un contesto di produzione industriale. Questo aspetto negativo viene riconosciuto dagli addetti al settore e, nei brevetti sopra descritti US 4,810,874 e US 5,409,696, vi si pone rimedio utilizzando PEI, che consente di ottenere un'elevata densità di gruppi amminici. Questi ultimi processi, tuttavia, pur risolvendo efficacemente il primo stadio del processo, cioè l'introduzione di gruppi reattivi sulla superficie del materiale, si rivelano carenti nel secondo stadio, che riguarda il legame tra l'acido ialuronico o suoi derivati e la superficie. Infatti, come precedentemente ricordato, il brevetto US 4,810,874 prescrive l'attivazione di eparina o altri polisaccaridi mediante trattamento chimico. Non è quindi possibile utilizzare il polisaccaride come tale ma è necessario partire da un materiale modificato mediante un'operazione chimica, con relativi costi di tempo, reagenti, mano d'opera e smaltimento reflui. Inoltre, contrariamente agli altri polisaccaridi, l'acido ialuronico è scarsamente sensibile alle reazioni di ossidazione parziale che consentono di introdurre sul polisaccàride stesso gruppi reattivi di tipo aldeidico (J.E. Scott and M.J. Tigwell, Biochem. J., 173, 103, 1978; B.J. Kvam et al., Carbohydrate Research, 230, 1, 1992). Per quanto riguarda il brevetto US 5,409,696 il processo proposto non riesce, se sottoposto a verifica sperimentale, a produrre una struttura superficiale in grado di sfruttare completamente le caratteristiche intrinseche dell'acido ialuronico. Come noto agli esperti, e come dimostrato nell'esempio 4 della domanda di brevetto italiana n. PD 95A000030 del 07.02.1995, le superfici di oggetti ricoperti da addo ialuronico non consentono l'adesione cellulare, a causa della loro natura fortemente idratata ed idrofila (il mantenimento di questa caratteristica è decisamente importante, in quanto consente di realizzare materiali e dispositivi dotati di capacità antiadesive). Utilizzando, invece, il processo descritto nel brevetto US 5,409,696, come evidenziato negli esempi comparativi contenuti nell'apposita sezione, non è possibile ottenere strutture superficiali in grado di inibire l'adesione cellulare. Risultati analoghi si osservano quando, invece dell'arido ialuronico, si utilizzano i suoi esteri semisintetici solubili in acqua (EPA 0216453). Evidentemente, il modo in cui si stabilisce il legame tra superficie amminata e polisaccaride non consente, operando secondo il processo descritto, un pieno sfruttamento delle caratteristiche di idrofilia dell'acido ialuronico o dei suoi derivati. The experimentation has revealed that the processes described in the patents and in the articles cited are not completely satisfactory as regards the realization of objects modified on the surface by means of hyaluronic acid or its derivatives. In fact, the introduction of functional groups of the amino type by means of ammonia plasma, as in the patent JP 04126074 (27.04.92), is not easily exploitable in a production process. Those skilled in the art know that the density of functional groups introduced by this technique on the surface of the substrate is rather low and too dependent on the precise geometry of the reactor used for the plasma treatment, on the nature of the substrate, on the presence of additives and / or contaminants. on the surface and inside the substrate and by the conditions of conservation of the substrate before and after treatment, in order to be of effective use in an industrial production context. This negative aspect is recognized by those skilled in the art and, in the patents described above US 4,810,874 and US 5,409,696, it is remedied by using PEI, which allows to obtain a high density of amino groups. These latter processes, however, while effectively solving the first stage of the process, i.e. the introduction of reactive groups on the surface of the material, are found to be deficient in the second stage, which concerns the bond between hyaluronic acid or its derivatives and the surface. In fact, as previously mentioned, US patent 4,810,874 prescribes the activation of heparin or other polysaccharides by chemical treatment. It is therefore not possible to use the polysaccharide as such but it is necessary to start from a material modified by a chemical operation, with the relative costs of time, reagents, labor and waste disposal. Furthermore, unlike other polysaccharides, hyaluronic acid is scarcely sensitive to partial oxidation reactions which allow the introduction of reactive aldehyde groups on the polysaccharide itself (J.E. Scott and M.J. Tigwell, Biochem. J., 173, 103, 1978; B.J. Kvam et al., Carbohydrate Research, 230, 1, 1992). As far as US patent 5,409,696 is concerned, the proposed process fails, if subjected to experimental verification, to produce a surface structure capable of fully exploiting the intrinsic characteristics of hyaluronic acid. As known to the experts, and as demonstrated in example 4 of the Italian patent application no. PD 95A000030 dated 07.02.1995, the surfaces of objects covered with hyaluronic addus do not allow cell adhesion, due to their highly hydrated and hydrophilic nature (maintaining this characteristic is definitely important, as it allows the creation of materials and devices with of anti-adhesive capacity). By using, on the other hand, the process described in US patent 5,409,696, as highlighted in the comparative examples contained in the appropriate section, it is not possible to obtain surface structures capable of inhibiting cell adhesion. Similar results are observed when, instead of hyaluronic acid, its water-soluble semisynthetic esters (EPA 0216453) are used. Obviously, the way in which the bond between the aminated surface and the polysaccharide is established does not allow, by operating according to the process described, full exploitation of the hydrophilic characteristics of hyaluronic acid or its derivatives.
Non deve essere inoltre trascurato il particolare che il proceso oggetto del brevetto US 5,409,696 trova applicazione solamente nella modifica superficiale di materiali polimerici, come indicato dal suo titolo "Radiofrequency plasma treated polymeric surfaces having immobilized antithrombogenic agente" e dalla descrizione delle modalità operative. Nella comune pratica biomedica e chirurgica trovano notevole applicazione anche materiali ceramici o metallici, ed è auspicabile che i processi di modifica siano applicabili anche a questi substrati. It should also not be overlooked that the process object of US patent 5,409,696 finds application only in the surface modification of polymeric materials, as indicated by its title "Radiofrequency plasma treated polymeric surfaces having immobilized antithrombogenic agent" and by the description of the operating procedures. In common biomedical and surgical practice also ceramic or metallic materials find considerable application, and it is desirable that the modification processes are also applicable to these substrates.
Dalla precedente descrizione, risulta evidente che esiste la necessità di un metodo che consenta la formazione di un legame chimico tra un substrato, di qualunque natura, ed acido ialuronico o suoi derivati, in maniera semplice e affidabile, e che consenta di sfruttarne appieno le caratteristiche intrinseche. From the previous description, it is clear that there is a need for a method that allows the formation of a chemical bond between a substrate, of any nature, and hyaluronic acid or its derivatives, in a simple and reliable way, and that allows to fully exploit its characteristics. intrinsic.
La Richiedente ha ora sorprendentemente trovato che tale metodo esiste e che questo consente la produzione di oggetti, realizzati in materiale metallico, polimerico, ceramico, ricoperti con uno strato sottile di acido ialuronico o suoi derivati o altri polimeri, legati chimicamente al substrato. Tali oggetti presentano le caratteristiche globali del materiale di cui sono realizzati e le favorevoli caratteristiche superficiali impartite dalla presenza di una ricopertura stabile di acido ialuroncio o di un suo derivato. The Applicant has now surprisingly found that such a method exists and that this allows the production of objects, made of metallic, polymeric, ceramic material, covered with a thin layer of hyaluronic acid or its derivatives or other polymers, chemically bonded to the substrate. These objects have the overall characteristics of the material they are made of and the favorable surface characteristics imparted by the presence of a stable coating of hyaluronic acid or one of its derivatives.
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE DESCRIPTION OF THE INVENTION
Nella sua forma più ampia, la presente invenzione consente la ricopertura di un oggetto mediante uno strato di acido ialuronico, o di un suo derivato o di un polisaccaride contenente gruppi carbossilici, mediante formazione di un legame chimico con la superficie del substrato. Secondo il metodo della presente invenzione, un materiale, di qualunque natura, verrà trattato mediante plasma di aria, ossigeno, argon, azoto o altri gas o vapori in grado di introdurre funzionalità ossigenate sulla superficie e/o di esercitare un effetto di pulizia e rimozione di contaminanti organici. L'uso di plasma contenente vapore d'acqua, come rivendicato nel brevetto US 5,409,696, non è richiesto secondo il processo della presente invenzione. La superficie del materiale così trattato sarà esposta ad una soluzione acquosa di PEI, in modo da creare una elevata concentrazione superficiale di gruppi amminici. Il materiale così ottenuto verrà fatto reagire con acido ialuronico, suoi derivati o altri polisaccaridi contenenti gruppi carbossilici, in presenza di agenti condensanti quali EDC, in soluzione acquosa o dicicloesilcarbodiimmide (DCC), in solventi organici. Sarà inoltre presente una molecola in grado di aiutare la reazione promossa da EDC: rientrano in questa classe, senza peraltro limitarne l'ampiezza, molecole quali l'idrossisuccinimmide (NHS), l'idrossisulfosuccinimmide, l'idrossibenzotriazoloidrato e molecole analoghe. Il processo, oggetto della presente invenzione, si basa sulla sorprendente osservazione che molecole quali NHS sono in grado di contribuire alla reazione di condensazione promossa da EDC anche quando essa coinvolge gruppi legati sulla superficie ed in assenza di quelle strutture molecolari note agli esperi come "bracci spaziatori". E' infatti noto che NHS aiuta la reazione tra gruppi amminici e gruppi carbossilici promossa da EDC quando entrambi i gruppi si trovino in soluzione (domanda di brevetto italiana N. PD95A000030 del 07.02.1995). Per quanto riguarda, in particolare, l'acido ialuronico, è noto che in soluzione, in assenza di NHS, si formano dei prodotti di reazione intermedi, genericamente definiti come N-acilurea, che ostacolano il pieno compimento della reazione (X.Xu et al. Trans. IV World Biom. Cong., 170, 1992). Quando i gruppi amminici sono legati alla superficie è necessario, per renderli sufficientemente reattivi, ricorrere alle strutture molecolari note agli esperti come "bracci spaziatori". Un "braccio spaziatore" è una sequenza di atomi di carbonio che, allontanando il gruppo reattivo dalla superficie, lo rende più libero e ne aumenta la reattività. Ad esempio, il prodotto CovaLink (Nunc) è costituito da polistirene che contiene gruppi amminici secondari separati dalla superficie da un "braccio spaziatore" di nove atomi di carbonio (K. Gregorius et al. J. Immunol. Meth., 181, 65, 1995) ed NHS si rivela efficace per aumentare la resa della reazione promossa da EDC (J.V. Staros et al., Anal. Biochem., 156, 220, 1986). Ovviamente, la realizzazione in superficie di strutture molecolari complesse, quali gruppi funzionali supportati su bracci spaziatori, impone costi e limitazioni di processo notevoli. Nel processo della presente invenzione, i gruppi amminici si trovano legati alla superficie ed all'interno della struttura di PEI, e non è necessario ricorrere a bracci spaziatori o prestare cura ad altri aspetti strutturali. L'osservazione che NHS è in grado di favorire la reazione di condensazione di gruppi amminici superficiali promossa da EDC, anche in assenza di bracci spaziatori e senza particolare cura degli aspetti molecolari della superficie, è sorprendente e determinante ai fini della realizzazione del processo. Ancora più sorprendente e non anticipabile sulla base delle conoscenze preesistenti è l'osservazione del decisivo effetto della presenza di NHS nella miscela di reazione sulle proprietà di antiadesione cellulare di superfici ricoperte da acido ialuronico o suoi derivati. Infatti, operando in assenza di NHS, come descritto nel brevetto US 5,409,696 non è possibile impartire alle superfici ricoperte da acido ialuronico proprietà antiadesive nei confronti di cellule. Al contrario, operando secondo la presente invenzione, si ottengono superfici perfettamente resistenti alla colonizzazione cellulare. Pur non essendo gli inventori chiamati a spiegare i motivi dei risultati ottenuti e senza voler essere limitati da una particolare teoria, si supponde che la differenza di comportamento sia ascrivibile ad una delle seguenti ragioni: o, in assenza di NHS, la resa della reazione è troppo bassa per cui, pur legandosi dell'acido ialuronico sulla superficie, la sua quantità non è sufficiente a mascherare completamente la superficie del materiale sottostante; oppure il legame che si stabilisce in assenza di NHS provoca un'alterazione delle caratteristiche dell'acido ialuronico legato alla superficie. La struttura risultante non conserva le proprietà che sarebbe lecito attendersi dalla natura del polimero e dalla comune conoscenza chimica. In its broadest form, the present invention allows the coating of an object by means of a layer of hyaluronic acid, or of a derivative thereof or of a polysaccharide containing carboxylic groups, by forming a chemical bond with the surface of the substrate. According to the method of the present invention, a material of any nature will be treated by plasma of air, oxygen, argon, nitrogen or other gases or vapors capable of introducing oxygenated functionalities on the surface and / or exerting a cleaning and removal effect. of organic contaminants. The use of plasma containing water vapor, as claimed in US patent 5,409,696, is not required according to the process of the present invention. The surface of the material thus treated will be exposed to an aqueous solution of PEI, in order to create a high surface concentration of amino groups. The material thus obtained will be reacted with hyaluronic acid, its derivatives or other polysaccharides containing carboxylic groups, in the presence of condensing agents such as EDC, in aqueous solution or dicyclohexylcarbodiimide (DCC), in organic solvents. There will also be a molecule capable of helping the reaction promoted by EDC: this class includes, without limiting its amplitude, molecules such as hydroxysuccinimide (NHS), hydroxysulfosuccinimide, hydroxybenzotriazolohydrate and similar molecules. The process, object of the present invention, is based on the surprising observation that molecules such as NHS are able to contribute to the condensation reaction promoted by EDC even when it involves groups bound on the surface and in the absence of those molecular structures known to experts as "arms spacers ". It is in fact known that NHS helps the reaction between amino groups and carboxylic groups promoted by EDC when both groups are in solution (Italian patent application No. PD95A000030 of 07.02.1995). As regards, in particular, hyaluronic acid, it is known that in solution, in the absence of NHS, intermediate reaction products are formed, generically defined as N-acylurea, which hinder the full completion of the reaction (X.Xu et al. Trans. IV World Biom. Cong., 170, 1992). When the amino groups are bound to the surface it is necessary, in order to make them sufficiently reactive, to resort to the molecular structures known to those skilled in the art as "spacer arms". A "spacer arm" is a sequence of carbon atoms which, by moving the reactive group away from the surface, makes it freer and increases its reactivity. For example, the CovaLink product (Nunc) consists of polystyrene which contains secondary amino groups separated from the surface by a "spacer arm" of nine carbon atoms (K. Gregorius et al. J. Immunol. Meth., 181, 65, 1995) and NHS proves effective in increasing the yield of the reaction promoted by EDC (J.V. Staros et al., Anal. Biochem., 156, 220, 1986). Obviously, the realization on the surface of complex molecular structures, such as functional groups supported on spacer arms, imposes considerable costs and process limitations. In the process of the present invention, the amino groups are bound to the surface and within the PEI structure, and it is not necessary to resort to spacer arms or to pay attention to other structural aspects. The observation that NHS is able to favor the condensation reaction of surface amine groups promoted by EDC, even in the absence of spacer arms and without particular attention to the molecular aspects of the surface, is surprising and decisive for the realization of the process. Even more surprising and unpredictable on the basis of pre-existing knowledge is the observation of the decisive effect of the presence of NHS in the reaction mixture on the cellular anti-adhesion properties of surfaces covered with hyaluronic acid or its derivatives. In fact, by operating in the absence of NHS, as described in US patent 5,409,696, it is not possible to impart anti-adhesive properties towards cells to the surfaces covered with hyaluronic acid. On the contrary, by operating according to the present invention, surfaces perfectly resistant to cellular colonization are obtained. Although the inventors are not called to explain the reasons for the results obtained and without wanting to be limited by a particular theory, it is assumed that the difference in behavior is attributable to one of the following reasons: o, in the absence of NHS, the yield of the reaction is too low so that, although hyaluronic acid is bound to the surface, its quantity is not sufficient to completely mask the surface of the underlying material; or the bond established in the absence of NHS causes an alteration of the characteristics of the hyaluronic acid bound to the surface. The resulting structure does not retain the properties that would be expected from the nature of the polymer and from common chemical knowledge.
In una forma particolarmente favorevole della presente invenzione, un materiale polimerico, metallico o ceramico sarà sottoposto a trattamento mediante plasma di aria o di ossigeno. Le condizioni del trattamento non sono limitanti e possono dipendere dalla geometria del prodotto. Tempi più lunghi saranno utilizzati per modificare l'interno di tubi o parti scarsamente accessibili, mentre per superfici piatte o scoperte saranno necessari tempi più brevi. In a particularly favorable form of the present invention, a polymeric, metallic or ceramic material will be subjected to air or oxygen plasma treatment. Treatment conditions are not limiting and may depend on the geometry of the product. Longer times will be used to modify the interior of pipes or parts that are poorly accessible, while shorter times will be required for flat or uncovered surfaces.
Il materiale trattato sarà posto in una soluzione acquosa di PEI, a concentrazione compresa tra lo 0.01% e il 10% e preferibilmente tra lo 0.5 ed il 2%. Il tempo di reazione non è limitante e sarà compreso tra 10 minuti e 10 ore. Al termine di questa fase, il materiale verrà lavato e posto in una soluzione di acido ialuronico o suo derivato o altro polisaccaride contenente gruppi carbossilici. La concentrazione del polisaccaride sarà compresa tra lo 0.005 ed il 5% e preferibilmente tra lo 0.05 e l'l%. Alla soluzione verranno aggiunte NHS e EDC, in concentrazione compresa tra 0.001 e 1%. La reazione avverrà a temperatura ambiente o con lieve riscaldamento e potrà durare da 10 minuti a 48 ore. Qualora il polisaccaride ed il substrato lo consentano, la reazione potrà avvenire in solvente organico, utilizzando DCC ed NHS nelle concentrazioni specificate in precedenza. The treated material will be placed in an aqueous solution of PEI, at a concentration between 0.01% and 10% and preferably between 0.5 and 2%. The reaction time is not limiting and will be between 10 minutes and 10 hours. At the end of this phase, the material will be washed and placed in a solution of hyaluronic acid or its derivative or other polysaccharide containing carboxylic groups. The polysaccharide concentration will be between 0.005 and 5% and preferably between 0.05 and 1%. NHS and EDC will be added to the solution, in a concentration between 0.001 and 1%. The reaction will take place at room temperature or with slight heating and may last from 10 minutes to 48 hours. If the polysaccharide and the substrate allow it, the reaction can take place in organic solvent, using DCC and NHS in the concentrations specified above.
L'importanza del trovato non può sfuggire agli esperti del ramo. II metodo della presente invenzione consente, infatti, di ottenere oggetti dotati delle favorevoli caratteristiche superficiali impartite dalla presenza di una ricopertura di acido ialuronico o di un suo derivato, stabile nel tempo, per la presenza di legami chimici tra lo strato superficiale ed il substrato. Le superfici di tali oggetti, inoltre, presenteranno elevate caratteristiche di resistenza all'adesione di cellule e batteri presenti nei fluidi biologici. The importance of the invention cannot escape those skilled in the art. The method of the present invention allows, in fact, to obtain objects endowed with the favorable surface characteristics imparted by the presence of a covering of hyaluronic acid or a derivative thereof, stable over time, due to the presence of chemical bonds between the surface layer and the substrate. Furthermore, the surfaces of these objects will have high resistance characteristics to the adhesion of cells and bacteria present in biological fluids.
In alternativa all'acido ialuronico o ai suoi derivati parziali (EPA 0216453), o a polisaccaridi contenenti gruppi carbossilici, è possibile applicare il suddetto processo ad esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico (EP 0265116), esteri interni di polisaccaridi acidi (EPA 0341745), esteri della carbossimetilcellulosa, carbossimetilchitina e carbossimetilamido (EP 0342557), esteri attivi di polisaccaridi carbossilici (domanda di brevetto italiana N. PD94A000043) esteri solfatati di acido ialuronico (domanda di brevetto italiana N. PD94000054), esteri dell'acido alginico (EP 0251905), esteri del gellano (EPA 0518710), esteri interni del gellano (WO 94/03499), esteri della chitina e del chitosano (EPA 0603264), esteri dell'acido pectico e pectinico (EPA 0621877). As an alternative to hyaluronic acid or its partial derivatives (EPA 0216453), or to polysaccharides containing carboxylic groups, it is possible to apply the above process to esters of polyvalent alcohols of hyaluronic acid (EP 0265116), internal esters of acid polysaccharides (EPA 0341745) , esters of carboxymethylcellulose, carboxymethylchitine and carboxymethyl starch (EP 0342557), active esters of carboxylic polysaccharides (Italian patent application No. PD94A000043) sulphated esters of hyaluronic acid (Italian patent application No. PD94000054), esters of alginic acid (EP 0251905 ), esters of gellan (EPA 0518710), internal esters of gellan (WO 94/03499), esters of chitin and chitosan (EPA 0603264), esters of pectic and pectinic acid (EPA 0621877).
Si citano di seguito alcuni esempi puramente illustrativi e tutte quelle variazioni che possono risultare ovvie all'esperto del ramo sono comprese nella presente invenzione. Some purely illustrative examples are cited below and all those variations which may be obvious to the skilled in the art are included in the present invention.
ESEMPI DI PREPARAZIONE EXAMPLES OF PREPARATION
Esempio 1 Example 1
Un campione di polistirene, ottenuto da capsule Petri di grado batteriologico (Corning) viene sottoposto a trattamento mediante plasma in un reattore a piatti paralleli (Gambetti Kenologia). Il trattamento viene svolto con una pressione di 100 mTorr di ossigeno, una potenza di scarica di 50 W, una velocità di flusso di 20 cm3(Std)/min ed un tempo di trattamento di 30 secondi. I campioni trattati vengono immersi per due ore in una soluzione allo 0.5% di PEI (Aldrich) in acqua. Dopo due ore essi vengono estratti, lavati con acqua ed immersi in provette contenenti 5mL delle seguenti soluzioni: A sample of polystyrene, obtained from bacteriological grade Petri dishes (Corning) is subjected to plasma treatment in a parallel plate reactor (Gambetti Kenologia). The treatment is carried out with a pressure of 100 mTorr of oxygen, a discharge power of 50 W, a flow rate of 20 cm3 (Std) / min and a treatment time of 30 seconds. The treated samples are immersed for two hours in a 0.5% solution of PEI (Aldrich) in water. After two hours they are extracted, washed with water and immersed in test tubes containing 5mL of the following solutions:
1) 1% (in peso) di acido ialuronico (Fidia Advanced Biopolymers, Brindisi) 1) 1% (by weight) of hyaluronic acid (Fidia Advanced Biopolymers, Brindisi)
2) 1% (in peso) di acido ialuronico, 0.02 g di l-etil-3-(3-dimetilamminopropiDcarbodiimmide (Sigma), 0.02 g di N-idrossisuccinimmide (Sigma). 2) 1% (by weight) of hyaluronic acid, 0.02 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylDcarbodiimide (Sigma), 0.02 g of N-hydroxysuccinimide (Sigma).
3) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 25% con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers). 3) 1% (by weight) of 25% esterified hyaluronic acid with benzyl alcohol (Fidia Advanced Biopolymers).
4) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 25% con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers), 0.02 g di 1-etil-3-(3-dimetilammino-propil)carbodiimmide (Sigma), 0.3 g di N-idrossisuccinimmide (Sigma). 4) 1% (by weight) of 25% esterified hyaluronic acid with benzyl alcohol (Fidia Advanced Biopolymers), 0.02 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide (Sigma), 0.3 g of N- hydroxysuccinimide (Sigma).
5) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 50 % con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers). 5) 1% (by weight) of 50% esterified hyaluronic acid with benzyl alcohol (Fidia Advanced Biopolymers).
6) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 50% con alcool benzilico, 0.02 g di l-etil3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma), 0.02 g di N-idrossisuccinimmide (Sigma). 6) 1% (by weight) of hyaluronic acid esterified at 50% with benzyl alcohol, 0.02 g of 1-ethyl3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (Sigma), 0.02 g of N-hydroxysuccinimide (Sigma).
I campioni vengono mantenuti a temperatura ambiente nelle provette per 12 ore ed in seguito lavati in acqua per una notte. L'efficacia del trattamento viene valutata mediante analisi ESCA (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis). Come noto (Garbassi F. et al. "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 3, 1994), questa tecnica consente di valutare la composizione chimica della superficie dei materiali. Per l'analisi viene utilizzato uno strumento Perkin Elmer PHI 5500 ESCA System. Accanto ai campioni precedentemente descritti viene analizzato, come riferimento, un campione trattato mediante plasma e sottoposto solamente al contatto con la soluzione di PEI. The samples are kept at room temperature in the tubes for 12 hours and then washed in water overnight. The effectiveness of the treatment is evaluated by ESCA (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis) analysis. As known (Garbassi F. et al. "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 3, 1994), this technique allows to evaluate the chemical composition of the surface of materials. A Perkin Elmer PHI 5500 ESCA System instrument is used for the analysis. Next to the previously described samples, a sample treated by plasma and subjected only to contact with the PEI solution is analyzed as a reference.
I dati evidenziano un notevole aumento della quantità di ossigeno presente sulla superficie a seguito del processo di modifica, come atteso dall'introduzione di acido ialuronico e dei suoi esteri. Al contrario, in assenza di EDC ed NHS, la composizione superficiale rimane simile a quella del riferimento. Inoltre, Tanalisi dettagliata del picco C1s evidenzia un'elevata quantità di legami C-O, in accordo con la struttura molecolare attesa. Gli spettri ESCA dei campioni 1 e 2 sono riportati nelle figure la e lb. The data show a significant increase in the amount of oxygen present on the surface following the modification process, as expected from the introduction of hyaluronic acid and its esters. On the contrary, in the absence of EDC and NHS, the surface composition remains similar to that of the reference. Furthermore, the detailed analysis of the C1s peak shows a high amount of C-O bonds, in agreement with the expected molecular structure. The ESCA spectra of samples 1 and 2 are shown in figures la and lb.
Esempio 2 Example 2
Altri campioni preparati secondo il processo descritto nell'esempio 1 vengono immersi in acqua per due mesi. Viene ripetuta l'analisi ESCA. Non si osservano diminuzioni o alterazioni della concentrazione superficiale di ossigeno, a conferma della stabilità del legame tra polisaccaride e superficie. Other samples prepared according to the process described in example 1 are immersed in water for two months. The ESCA analysis is repeated. No decreases or alterations in the surface oxygen concentration are observed, confirming the stability of the bond between the polysaccharide and the surface.
Esempio 3 Example 3
Un film di polietilene da imballaggio viene sottoposto a trattamento plasma ed immerso in EDC come descritto nell'esempio 1. Si preparano due campioni che vengono immersi nelle seguenti soluzioni di dimetilsolfossido (Fluka): A polyethylene film for packaging is subjected to plasma treatment and immersed in EDC as described in example 1. Two samples are prepared which are immersed in the following solutions of dimethyl sulfoxide (Fluka):
1) 1% di acido ialuronico esterificato al 75% con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers) 1) 1% 75% esterified hyaluronic acid with benzyl alcohol (Fidia Advanced Biopolymers)
2) 1% di acido ialuronico esterificato al 75% con alcool benzilico, 0.02 g di l-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide, 0.02 g di N-idrossisuccinimmide. 2) 1% 75% esterified hyaluronic acid with benzyl alcohol, 0.02 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 0.02 g of N-hydroxysuccinimide.
Dopo 24 ore di lavaggio in dimetilsolfossido, i campioni vengono sottoposti ad analisi ESCA. Si ottengono i seguenti risultati: After 24 hours of washing in dimethyl sulfoxide, the samples are subjected to ESCA analysis. The following results are obtained:
Esempio 4 Example 4
Un campione di acciaio 316, un tipo comunemente utilizzato per applicazioni biomediche, viene trattato mediante plasma di aria per 15 minuti, quindi posto a contatto con una soluzione di PEI allo 0.5% per 2 ore. Acido ialuronico viene legato alla superficie del materiale utilizzando la soluzione 2 dell'esempio 1. Il materiale viene quindi analizzato mediante analisi ESCA. Il picco Cls ottenuto dall'analisi è riportato nelle Figure 2: la Fig. 2a si riferisce al campione dopo esposizione alla soluzione di PEI, la Fig. 2b illustra il picco Cls del campione sottoposto alla modifica completa. In quest'ultimo caso è possibile osservare la tipica forma allargata, a molte componenti, caratteristica del picco Cls dei polisaccaridi (si veda, ad esempio, il già citato articolo di E. Ostenberg et al., Journal of Biomedicai Materials Research, 29, 741, 1995), che conferma la presenza di acido ialuronico in superficie. A 316 steel sample, a type commonly used for biomedical applications, is treated with air plasma for 15 minutes, then placed in contact with a 0.5% PEI solution for 2 hours. Hyaluronic acid is bound to the surface of the material using solution 2 of Example 1. The material is then analyzed by ESCA analysis. The Cls peak obtained from the analysis is shown in Figures 2: Fig. 2a refers to the sample after exposure to the PEI solution, Fig. 2b illustrates the Cls peak of the sample subjected to complete modification. In the latter case it is possible to observe the typical enlarged form, with many components, characteristic of the Cls peak of the polysaccharides (see, for example, the aforementioned article by E. Ostenberg et al., Journal of Biomedicai Materials Research, 29, 741, 1995), which confirms the presence of hyaluronic acid on the surface.
Esempio 5 Example 5
Alcune capsule Fetri per colture cellulari (Corning) vengono sottoposte al processo di modifica descritto nell'esempio 1 (3 capsule per ciascun trattamento). Le capsule così preparate ricevono 5 mL di sospensione cellulare (cellule fibroblastiche di tessuto connettivo di topo, L-929 in Minimum Essential Eagle's Medium addizionato del 10% di siero di vitello fetale, degli antibiotici penicillina, streptomicina e amfoteridna B e di L-glutamina, SPA, Milano), vengono poste in incubatore (Forma) a 37 °C e atmosfera al 5% di CO2 e 98% di umidità. Le interazioni tra le cellule e il supporto in polistirene trattato come riportato nell'esempio 1 sono valutate microscopicamente con microscopio ottico invertito a contrasto di fase (Leica) ad intervalli di tempo regolari. In particolare, viene analizzata l'eventuale capacità delle cellule di aderire ai supporti diversamente trattati e l'entità di tale adesione con riferimento ad un controllo costituito da una capsula Petri trattata solamente con plasma, in cui la capacità di adesione è massima. In questo esempio (derivante dalla media delle osservazioni condotte a 24 ore), il punteggio 5 si riferisce alla massima capacità di adesione, il punteggio 0 all'assenza di adesione. Si ottengono i seguenti risultati: Some Fetri capsules for cell cultures (Corning) are subjected to the modification process described in Example 1 (3 capsules for each treatment). The capsules thus prepared receive 5 mL of cell suspension (mouse connective tissue fibroblast cells, L-929 in Minimum Essential Eagle's Medium with the addition of 10% fetal calf serum, the antibiotics penicillin, streptomycin and amphoteridna B and L-glutamine , SPA, Milan), are placed in an incubator (Forma) at 37 ° C and an atmosphere at 5% CO2 and 98% humidity. The interactions between the cells and the polystyrene support treated as reported in Example 1 are evaluated microscopically with an inverted phase contrast optical microscope (Leica) at regular time intervals. In particular, the possible ability of the cells to adhere to differently treated supports and the extent of such adhesion are analyzed with reference to a control consisting of a Petri dish treated only with plasma, in which the adhesion capacity is maximum. In this example (derived from the average of the observations conducted at 24 hours), the score 5 refers to the maximum adhesion capacity, the score 0 to the absence of adhesion. The following results are obtained:
L'esperimento conferma la presenza di uno strato idrofilo saldamente legato in grado di impedire l'adesione cellulare. The experiment confirms the presence of a firmly bonded hydrophilic layer capable of preventing cell adhesion.
Esempio 6: Example 6:
Quattro capsule di Petri in polistirene vengono trattate secondo il processo di modifica descritto nell'esempio 1, utilizzando la soluzione 2 di acido ialuronico (tali campioni verranno definiti A). Un uguale numero di capsule viene trattato secondo il processo di ricopertura mediante acido ialuronico descritto nell'esempio 11 del brevetto US 5,409, o96 (tali campioni sono definiti B). Le capsule modificate vengono poste a contatto con una sospensione di cellule L-929, come descritto nell'esempio precedente. L'adesione cellulare viene valutata come nell'esempio precedente e si ottengono i seguenti risultati: Four polystyrene Petri dishes are treated according to the modification process described in example 1, using hyaluronic acid solution 2 (these samples will be defined A). An equal number of capsules are treated according to the hyaluronic acid coating process described in example 11 of US patent 5,409, 96 (such samples are defined B). The modified capsules are contacted with a suspension of L-929 cells, as described in the previous example. Cell adhesion is evaluated as in the previous example and the following results are obtained:
Nelle Figure 3a e 3b sono riportate delle immagini, ottenute al microscopio ottico che evidenziano lo stato delle superfici al termine della prova. La Fig. 3a si riferisce al campione A, quella 3b al campione B. E' chiaramente evidente il diverso grado di resistenza all'adesione cellulare ottenuto nei due processi. Figures 3a and 3b show images, obtained under an optical microscope, which show the state of the surfaces at the end of the test. Fig. 3a refers to sample A, that 3b to sample B. The different degree of resistance to cell adhesion obtained in the two processes is clearly evident.
Esempio 7: Example 7:
Quattro capsule di Petri in polistirene vengono trattate secondo il processo di modifica descritto nell'esempio 1, utilizzando le soluzioni di esteri di acido ialuronico 4 e 6 (tali campioni vengono definiti C e D rispettivamente). Un uguale numero di capsule viene trattato secondo il processo descritto nel brevetto US 5,409,696, utilizzando i medesimi esteri dell'acido ialuronico (tali campioni sono definiti E ed F). Le capsule modificate vengono poste a contatto con una sospensione di cellule L-929, come descritto nell'esempio precedente. L'adesione cellulare viene valutata come nell'esempio precedente e si ottengono i seguenti risultati: Four polystyrene Petri dishes are treated according to the modification process described in Example 1, using the solutions of hyaluronic acid esters 4 and 6 (these samples are defined as C and D respectively). An equal number of capsules are treated according to the process described in US patent 5,409,696, using the same esters of hyaluronic acid (such samples are defined E and F). The modified capsules are contacted with a suspension of L-929 cells, as described in the previous example. Cell adhesion is evaluated as in the previous example and the following results are obtained:
Nelle Figure 4a e 4b sono riportate delle immagini, ottenute al microscopio ottico, che evidenziano Io stato delle superfici al termine della prova. La Fig. 4a si riferisce al campione D, quella 4b al campione F. E' chiaramente evidente il diverso grado di resistenza all'adesione cellulare ottenuto nei due processi. Figures 4a and 4b show images, obtained under an optical microscope, which show the state of the surfaces at the end of the test. Fig. 4a refers to sample D, that 4b to sample F. The different degree of resistance to cell adhesion obtained in the two processes is clearly evident.
Esempio 8: Example 8:
Una lastrina di Titanio (Aldrich) viene sottoposta al processo di modifica mediante plasma e trattamento con PEI descritto nell'esempio 4. La superficie così trattata viene fatta reagire con la soluzione 6 dell'esempio 1. Titanio non modificato e Titanio su cui è stato eseguito il processo di modifica (quattro campioni per ogni materiale) vengono posti a contatto con una sospensione di cellule L-929, come all'esempio precedente. L'adesione cellulare viene valutata dopo 24 ore, colorando le cellule con blu di toluidina ed osservando i campioni in coltura mediante un microscopio metallografico. I risultati delle osservazioni sono illustrati nelle Fig. 5a e 5b. La Fig. 5a si riferisce al Titanio non modificato, la Fig. 5b al Titanio modificato con l'estere dell'acido ialuronico secondo il presente processo. E' chiaro che le cellule si comportano in maniera differente sulle due superfici. Nel caso del materiale modificato, le cellule mantengono una morfologia rotondeggiante e non assumono l'aspetto "allargato" e piatto tipico delle cellule che hanno ben aderito al substrato, osservabile nel caso del materiale tal quale (Fig. 5a). A plate of Titanium (Aldrich) is subjected to the modification process by means of plasma and treatment with PEI described in Example 4. The surface thus treated is reacted with the solution 6 of Example 1. Unmodified Titanium and Titanium on which it has been after the modification process (four samples for each material) are placed in contact with a suspension of L-929 cells, as in the previous example. Cell adhesion is assessed after 24 hours by staining the cells with toluidine blue and observing the cultured samples under a metallographic microscope. The results of the observations are illustrated in Fig. 5a and 5b. Fig. 5a refers to unmodified Titanium, Fig. 5b to Titanium modified with the hyaluronic acid ester according to the present process. It is clear that the cells behave differently on the two surfaces. In the case of the modified material, the cells maintain a rounded morphology and do not take on the "enlarged" and flat appearance typical of cells that have well adhered to the substrate, which can be observed in the case of the material as it is (Fig. 5a).
Esempio 9: Example 9:
Il processo di modifica descritto nell'esempio 8 viene eseguito su un campione di vetro per microscopio. Vetro modificato, vetro normale ed una capsula di polistirene modificato mediante plasma (utilizzato come controllo con capacità di adesione massima) vengono posti a contatto con le cellule L-929. L'adesione cellulare viene valutata dopo 24 ore. Si ottengono i seguenti risultati: The modification process described in Example 8 is performed on a microscope glass sample. Modified glass, normal glass and a plasma modified polystyrene capsule (used as a control with maximum adhesion capacity) are placed in contact with the L-929 cells. Cell adhesion is evaluated after 24 hours. The following results are obtained:
Esempio 10 Example 10
Il processo di modifica descritto nell'esempio 1 viene eseguito su due lenti intraoculari (Sanitaria Scaligera), utilizzando una soluzione allo 0.5% di acido ialuronico grado oftalmico (Fidia Advanced Biopolymers), 0.4% di EDC e 0.4% di NHS. Le lenti modificate ed un uguale numero di lenti non modificate vengono poste in capsule di Petri e messe a contatto con la sospensione di cellule L-929, come agli esempi precedenti. La resistenza all'adesione di cellule dei campioni è illustrata nelle figure 6 e 7. Si tratta di fotografie relative alla superfide delle lenti modificate secondo il presente processo (6a e 7a) e non modificate (6b e 7b). Dalle immagini risulta evidente la diversa capacità di inibire l'adesione cellulare delle due superfid. The modification process described in example 1 is performed on two intraocular lenses (Sanitaria Scaligera), using a solution of 0.5% ophthalmic grade hyaluronic acid (Fidia Advanced Biopolymers), 0.4% EDC and 0.4% NHS. The modified lenses and an equal number of unmodified lenses are placed in Petri dishes and contacted with the L-929 cell suspension, as in the previous examples. The cell adhesion resistance of the samples is illustrated in Figures 6 and 7. These are photographs relating to the surface of the lenses modified according to the present process (6a and 7a) and unmodified (6b and 7b). The images show the different ability to inhibit cell adhesion of the two superfids.
Scopo della presente invenzione è pertanto quello di rendere disponibile un nuovo ed innovativo processo per la produzione di oggetti ricoperti con uno strato sottile di acido ialuronico o suoi derivati o altri polimeri legati chimicamente al substrato. Tale processo può trovare applicazione nella realizzazione di materiali e dispositivi con proprietà superficiali migliorate ed, in particolare, di materiali e dispositivi caratterizzati da superfici idrofile. Più in particolare, il processo può trovare impiego nella preparazione di materiali per applicazioni biomedicali e chirurgiche, in urologia, ortopedia, otorinolaringoiatria, gastroenterologia, oftalmologia, nel settore cardio-vascolare e in diagnostica. Tra le applicazioni biomedicali, si possono realizzare dispositivi utilizzabili in applicazioni paracorporee o extracorporee, come cateteri, sacche per sangue, tubicini, sonde, siringhe, strumenti chirurgici, contenitori, sistemi di filtrazione; per applicazioni protesiche e di impianto o in chirurgia si possono rivestire tendini artificiali, giunture, viti di fissaggio, valvole cardiache, protesi ossee e cardiovascolari, graft, cateteri venosi, lenti intraoculari, materiali per sostituzioni di tessuti soffici, ecc. Fra i dispositivi semipermanenti si possono rivestire lenti a contatto. Per la realizzazione di dispositivi complessi che simulano processi fisiologici, si possono ottenere reni artificiali, ossigenatoti di sangue, cuori artificiali, pancreas e fegato artificiali. Infine, in diagnostica si possono rivestire accessori di laboratorio, piastre per la coltivazione e/o rigenerazione di cellule e tessuti e come supporto di principi attivi quali peptidi, proteine e anticorpi. The aim of the present invention is therefore to make available a new and innovative process for the production of objects covered with a thin layer of hyaluronic acid or its derivatives or other polymers chemically bonded to the substrate. This process can find application in the production of materials and devices with improved surface properties and, in particular, of materials and devices characterized by hydrophilic surfaces. More specifically, the process can be used in the preparation of materials for biomedical and surgical applications, in urology, orthopedics, otolaryngology, gastroenterology, ophthalmology, in the cardio-vascular sector and in diagnostics. Among the biomedical applications, it is possible to create devices that can be used in paracorporeal or extracorporeal applications, such as catheters, blood bags, tubes, probes, syringes, surgical instruments, containers, filtration systems; artificial tendons, joints, fixation screws, heart valves, bone and cardiovascular prostheses, grafts, venous catheters, intraocular lenses, soft tissue replacement materials, etc. can be coated for prosthetic and implant applications or in surgery. Contact lenses can be coated among the semi-permanent devices. For the realization of complex devices that simulate physiological processes, artificial kidneys, blood oxygenators, artificial hearts, artificial pancreas and liver can be obtained. Finally, in diagnostics it is possible to coat laboratory accessories, plates for the cultivation and / or regeneration of cells and tissues and as a support for active ingredients such as peptides, proteins and antibodies.
Essendo l’invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell’invenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni: Since the invention is thus described, it is clear that these methods can be modified in various ways. These modifications are not to be considered as divergences from the spirit and perspectives of the invention and all those modifications that would appear evident to an expert in the field are included within the scope of the following claims:
Claims (41)
Priority Applications (20)
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| CA002212519A CA2212519C (en) | 1995-02-07 | 1996-02-07 | Process for the coating of objects with hyaluronic acid, derivatives thereof, and semisynthetic polymers |
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Family Applications (1)
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Also Published As
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| ITPD950243A0 (en) | 1995-12-20 |
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