ITPD20090168A1 - FOSPHOLIPID POLYMERIC CONJUGATES - Google Patents
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Description
"CONIUGATI POLIMERICI DI FOSFOLIPIDI" "POLYMER CONJUGATES OF PHOSPHOLIPIDS"
DESCRIZIONE DI INVENZIONE INDUSTRIALE DESCRIPTION OF INDUSTRIAL INVENTION
CAMPO DELL'INVENZIONE FIELD OF THE INVENTION
La presente invenzione concerne nuovi coniugati polimerici di fosfolipidi comprendenti almeno un polimero coniugato, tramite una molecola ramificata ad almeno due fosfolipidi, e il loro uso tal quali o in combinazione con altre sostanze amfipatiche per la veicolazione di agenti biologicamente attivi. Questi detti nuovi coniugati polimero-fosfolipidi possono essere usati in preparazioni, "kits", formulazioni liposomiali per indagini diagnostiche ed in applicazioni terapeutiche. The present invention relates to new polymeric conjugates of phospholipids comprising at least one polymer conjugated, through a molecule branched to at least two phospholipids, and their use as such or in combination with other amphipathic substances for the delivery of biologically active agents. These new polymer-phospholipid conjugates can be used in preparations, "kits", liposomal formulations for diagnostic investigations and in therapeutic applications.
FONDAMENTI DELL'INVENZIONE FOUNDATIONS OF THE INVENTION
L'uso terapeutico o diagnostico di molti agenti richiede una loro formulazione in veicoli acquosi al fine di permettere la somministrazione in organismi viventi. Purtroppo molti agenti attivi hanno un carattere idrofobico e di conseguenza non sono solubili in acqua. Per superare questo limite opportuni formulazioni e/o sistemi di "drug delivery" sono stati studiati, per esempio solventi organici miscibili con l'acqua, miscele acquose di detergenti, co-solventi, coniugati polimerici, nanoparticelle, micelle, lisosomi, etc. Per esempio Parikh et al., U.S. Pat. No. 5,922,355, descrive microparticelle comprendenti sostanze insolubili, e Greenwald, J. Control. Release 74 159-171 (2001), descrive molti coniugati polimerici di farmaci insolubili. Da molti anni anche le micelle vengono studiate per la veicolazione di farmaci e per un lo direzionamento selettivo (Brodin et al., Acta Pharm. Suec. 19 267-284 (1982)) anche di farmaci antitumorali (Fung et al., Biomater. Artif. Cells. Artif. Organs 16: 439 et. seq. (1988); and Yokoyama et al., Cancer Res. 51: 3229-3236 (1991)). Formulazioni liposomiali sono state studiate e sviluppate per aumentare la solubilità e l'emivita sia di molecole idrofobiche che idrofiliche (vedi per esempio U.S. Pat. Nos. 4,837,028 and The therapeutic or diagnostic use of many agents requires their formulation in aqueous vehicles in order to allow administration to living organisms. Unfortunately, many active agents have a hydrophobic character and are consequently not soluble in water. To overcome this limit, suitable formulations and / or "drug delivery" systems have been studied, for example organic solvents miscible with water, aqueous mixtures of detergents, co-solvents, polymeric conjugates, nanoparticles, micelles, lysosomes, etc. For example Parikh et al., U.S. Pat. No. 5,922,355, discloses microparticles comprising insoluble substances, and Greenwald, J. Control. Release 74 159-171 (2001), describes many polymeric conjugates of insoluble drugs. For many years, micelles have also been studied for the delivery of drugs and for selective targeting (Brodin et al., Acta Pharm. Suec. 19 267-284 (1982)) also of anticancer drugs (Fung et al., Biomater. Artif. Cells. Artif. Organs 16: 439 et. Seq. (1988); and Yokoyama et al., Cancer Res. 51: 3229-3236 (1991)). Liposomal formulations have been studied and developed to increase the solubility and half-life of both hydrophobic and hydrophilic molecules (see for example U.S. Pat. Nos. 4,837,028 and
Inoltre i lisosomi possono essere usati per colpire selettivamente dei particolari tipi di cellule o tessuti (vedi per esempio U.S. Pat. Nos. 5,527,528 and 5,620,689). Formulazioni liposomiali offrono ulteriori vantaggi di "drug delivery" come ad esempio un rilascio controllato del principio attivo veicolato. Furthermore, lysosomes can be used to selectively target particular types of cells or tissues (see for example U.S. Pat. Nos. 5,527,528 and 5,620,689). Liposomal formulations offer further advantages of "drug delivery" such as a controlled release of the conveyed active ingredient.
Sebbene i lisosomi presentino già un aumentata emivita piasmatica rispetto al farmaco libero un ulteriore aumento dell'emivita à ̈ necessario per raggiungere particolari regioni bersaglio, cellule o siti, che si trovano distanti dal sito di somministrazione. Una metodica molto studiata per prolungare l'emivita di un liposoma consiste nel ricoprirlo con un agente idrofilico, come ad esempio le catene di un polimero idrofilico quale il poli (etilenglicole) (PEG). Questo approccio permette anche di evitare l'adsorbimento di proteine piasmatiche sulla superficie del liposoma, opsonizzazione , che porta l'agglutinazione degli stessi con un inevitabile aumento della velocità di eliminazione dal torrente sanguigno. Although lysosomes already have an increased piasmatic half-life compared to the free drug, a further increase in half-life is necessary to reach particular target regions, cells or sites, which are distant from the administration site. A well-studied method to prolong the half-life of a liposome consists in covering it with a hydrophilic agent, such as the chains of a hydrophilic polymer such as poly (ethylene glycol) (PEG). This approach also allows to avoid the adsorption of piasmatic proteins on the liposome surface, opsonization, which leads to agglutination of the same with an inevitable increase in the speed of elimination from the bloodstream.
In genere questi liposomi modificati vengono chiamati a liposomi a lunga circolazione o sfericamente stabilizzati. La più usata modifica superficiale di liposomi per questo scopo di prolungamento farmacocinetico consiste nel legame di catene di PEG con un peso molecolare tra 1000 da e 5000 Da. Quando vengono utilizzati dei PEG-fosfolipidi pre sintetizzati in genere vengono aggiunti in una percentuale in moli di circa il 5% (in equivalenti di fosfolipide) di tutti i lìpidi costituenti la formulazione lisosomiale (vedi per esempio, Stealth Liposomes, CRC Press, Lasic, D. and Martin, F., eds., Boca Raton, Fla., (1995) e i riferimenti citati nello stesso). La farmacocinetica di questi liposomi à ̈ caratterizzata da una riduzione dose-indipendente della captazione degli stessi da parte del fegato e della milza, tramite il sistema del fagociti mononucleari, a differenza dei liposomi convenzionali che vengono in confronto più velocemente eliminati dal circolo sanguigno e accumulati in questi organi. Typically these modified liposomes are referred to as long-circulating or spherically stabilized liposomes. The most widely used surface modification of liposomes for this pharmacokinetic prolongation purpose is the binding of PEG chains with a molecular weight between 1000 and 5000 Da. about 5% (in phospholipid equivalents) of all the lice forming the lysosomal formulation (see for example, Stealth Liposomes, CRC Press, Lasic, D. and Martin, F., eds., Boca Raton, Fla., (1995) and the references cited therein). The pharmacokinetics of these liposomes is characterized by a dose-independent reduction of their uptake by the liver and spleen, through the mononuclear phagocyte system, unlike conventional liposomes which are in comparison more quickly eliminated from the bloodstream and accumulated. in these organs.
Il più comune fosfolipide PEGhilato disponibile in commercio à ̈ la distearil fosfaditil etanolammina (DSPE). PEG-DSPE (5000 Da) à ̈ stato impiegato nella preparazione liposomiale di doxorubicina (Doxil, Caelix®). The most common commercially available PEGylated phospholipid is distearyl phosphadithyl ethanolamine (DSPE). PEG-DSPE (5000 Da) was used in the liposomal preparation of doxorubicin (Doxil, Caelix®).
E' stato messo in evidenza che i liposomi PEGhilati possono andare incontro ad una inaspettata rapida eliminazione, denominata "accelerated blood clearance" (ABC), soprattutto in seguito a somministrazioni ripetute forse per un'attivazione del sistema del complemento. Come causa di questo fenomeno à ̈ stata indicata la facile perdita dello strato protettivo di PEG attorno ai liposomi, dovuto a distaccamento delle catene di PEG-DSPE (vedi per esempio, Parr MJ, et al. Biochimica et Biophysìca Acta, 1195: 21-30 (1994)). It has been pointed out that PEGhylated liposomes can undergo an unexpected rapid elimination, called "accelerated blood clearance" (ABC), especially following repeated administrations, perhaps due to activation of the complement system. The cause of this phenomenon has been indicated the easy loss of the protective layer of PEG around the liposomes, due to detachment of the PEG-DSPE chains (see for example, Parr MJ, et al. Biochimica et Biophysìca Acta, 1195: 21-30 (1994)).
Di conseguenza, sarebbe auspicabile lo sviluppo di nuovi polimeri fosfolipidi in grado di permanere per più tempo ancorati alla superficie del liposoma evitando una rapida perdita dello strato polimerico idrofilo protettivo. Questi coniugati polimero-fosfolipidi permetterebbero un ulteriore prolungamento dell'emivita piasmatica. Sarebbe importante anche sviluppare dei polimero-fosfolipidi in grado di controllare e rallentare il rilascio di farmaco dal liposoma, al fine di rendere attuabili queste formulazione anche per quei farmaci che possono incorrere in un veloce fuoriuscita dal liposoma vanificando i vantaggi di questo sistema di "drug delivery". Consequently, it would be desirable to develop new phospholipid polymers able to remain anchored to the liposome surface for longer, avoiding a rapid loss of the protective hydrophilic polymeric layer. These polymer-phospholipid conjugates would allow a further prolongation of the piasmatic half-life. It would also be important to develop polymer-phospholipids capable of controlling and slowing down the release of the drug from the liposome, in order to make these formulations feasible even for those drugs that can quickly leak out of the liposome, negating the advantages of this "drug system." delivery ".
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
Inseguito a studi estensivi dedicati allo sviluppo di coniugati in grado di superare il sopra riportato limite di distaccamento del PEG-DSPE dalla superficie del liposoma, abbiamo scoperto che l'emivita piasmatica dei liposomi e il rilascio del farmaco possono essere migliorati mediante l'incorporazione nei liposomi stessi di nuovi coniugati polimero-fosfolipidi, in grado di permanere ancorati alla superficie dei liposomi in modo più stabile. Questi coniugati formando uno strato idrofilico più stabile assicurano anche una maggiore prevenzione dell'adsorbimento di proteine sulla superficie dei liposomi. Following extensive studies dedicated to the development of conjugates capable of overcoming the aforementioned detachment limit of PEG-DSPE from the liposome surface, we have found that the piasmatic half-life of liposomes and drug release can be improved by incorporation into liposomes themselves of new polymer-phospholipid conjugates, able to remain anchored to the surface of the liposomes in a more stable way. By forming a more stable hydrophilic layer, these conjugates also ensure greater prevention of protein adsorption on the liposome surface.
Questi nuovi polimeri-fosfolipidi sono in grado di ancorarsi più stabilmente al doppio strato fosfolipidico del liposoma grazie ad un aumento del numero di fosfolipidi coniugati ad una catena di polimero idrofilico. Assieme, i fosfolipidi di una molecola di coniugato cooperano incrementando le interazioni con i fosfolipidi del doppio strato fosfolipidico del liposoma offrendo maggior stabilità al sistema. L'aumento delle dimensioni della parte idrofobica intercalata nella membrana del liposoma permette di ridurre la velocità di rilascio di farmaci incorporati nel liposoma. These new phospholipid-polymers are able to anchor more firmly to the phospholipid bilayer of the liposome thanks to an increase in the number of phospholipids conjugated to a hydrophilic polymer chain. Together, the phospholipids of a conjugate molecule cooperate by increasing the interactions with the phospholipids of the phospholipid bilayer of the liposome offering greater stability to the system. The increase in the size of the hydrophobic part intercalated in the liposome membrane allows to reduce the speed of release of drugs incorporated in the liposome.
In particolare la presente invenzione fornisce dei coniugati comprendenti un polimero idrofilo legato, direttamente o attraverso altre porzioni, ad almeno due molecole di fosfolipidi. Tali fosfolipidi possono essere coniugati al polimero idrofilo direttamente o attraverso uno o più spaziatori e/o uno o più altri polimeri. L'uso di ulteriori polimeri o di strutture dendrimeriche permette di legare al polimero idrofilo un numero maggiore di molecole di fosfolipidi. Gli spaziatori sono preferibilmente scelti tra gruppi alchilici o gruppi aromatici o peptidi idrolizzabili o altre sequenze biodegradabili. Inoltre, una o più molecole direzionatrici, quali anticorpi, ormoni o In particular, the present invention provides conjugates comprising a hydrophilic polymer linked, directly or through other portions, to at least two phospholipid molecules. These phospholipids can be conjugated to the hydrophilic polymer directly or through one or more spacers and / or one or more other polymers. The use of further polymers or dendrimeric structures allows a greater number of phospholipid molecules to be bound to the hydrophilic polymer. The spacers are preferably selected from alkyl groups or aromatic groups or hydrolyzable peptides or other biodegradable sequences. In addition, one or more targeting molecules, such as antibodies, hormones or
zuccheri , possono essere legate al polimero idrofilo, all'estremità opposta rispetto ai fosfolipidi, direttamente o attraverso spaziatori e/o altri polimeri. sugars, can be bound to the hydrophilic polymer, at the opposite end with respect to the phospholipids, directly or through spacers and / or other polymers.
La natura anfifilica dei coniugati oggetto della presente invenzione permette una stabile localizzazione alla superficie di liposomi. In particolare la componente idrofobica di questi coniugati, costituita dai fosfolipidi, andrà a intercalarsi nel doppio strato fosfolipidico dei liposomi mentre il polimero idrofilo si protenderà verso il mezzo acquoso nel quale i liposomi sono dispersi. Le catene di polimero andranno a formare uno strato idrofilo che protegge il liposoma dal fenomeno dell'opsonizzazione . L' innovazione di questi nuovi coniugati polimerofosfolipidi consiste nel garantire una maggiore stabilità allo strato idrofilico diversamente da quanto mostrato dagli attuali liposomi a lunga circolazione dove lo strato idrofilico costituito usando PEG-DSPE va lentamente sfaldandosi in seguito al distaccamento di PEG-DSPE dal liposoma . The amphiphilic nature of the conjugates object of the present invention allows a stable localization at the surface of liposomes. In particular, the hydrophobic component of these conjugates, consisting of the phospholipids, will intercalate in the phospholipid bilayer of the liposomes while the hydrophilic polymer will extend towards the aqueous medium in which the liposomes are dispersed. The polymer chains will form a hydrophilic layer that protects the liposome from the opsonization phenomenon. The innovation of these new polymerophospholipid conjugates consists in guaranteeing greater stability to the hydrophilic layer unlike what is shown by the current long circulation liposomes where the hydrophilic layer constituted using PEG-DSPE is slowly flaking following the detachment of PEG-DSPE from the liposome.
1 liposomi ottenuti con i nuovi coniugati polimerofosfolipidi hanno dimostrato una prolungata farmacocinetica in vivo rispetto agli attuali liposomi a lunga circolazione . The liposomes obtained with the new polymerophospholipid conjugates demonstrated a prolonged in vivo pharmacokinetics compared to the current long circulation liposomes.
Gli inventori hanno anche visto che i liposomi ottenuti con i coniugati oggetto della presente invenzione possono rilasciare più lentamente l'agente terapeutico e per un periodo di tempo prolungato adatto ad applicazioni diagnostiche o terapeutiche. The inventors have also seen that the liposomes obtained with the conjugates of the present invention can release the therapeutic agent more slowly and for a prolonged period of time suitable for diagnostic or therapeutic applications.
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione fornisce nuovi coniugati polimerofosfolipidi che possono essere impiegati nella preparazione di liposomi a lunga circolazione veicolanti agenti biologicamente attivi da impiegare sia a scopo diagnostico che terapeutico. The present invention provides new polymerophospholipid conjugates which can be used in the preparation of long-circulation liposomes carrying biologically active agents to be used for both diagnostic and therapeutic purposes.
I polimero-fosfolipidi oggetto della presente invenzione (riportati qui anche come "coniugati") comprendono un polimero idrofilo legato attraverso un'unità ramificante a due o più molecole di fosfolipidi, il polimero idrofilo può anche eventualmente essere legato, direttamente o attraverso un'unità ramificante, ad una o più molecole direzionanti . The polymer-phospholipids object of the present invention (also referred to here as "conjugates") comprise a hydrophilic polymer linked through a branching unit to two or more phospholipid molecules, the hydrophilic polymer can also optionally be linked, directly or through a unit branching, to one or more directing molecules.
I coniugati possiedono preferibilmente la seguente formula: Conjugates preferably have the following formula:
(PL )n-MF-Poll- [Pol2- (BM )m]y(PL) n-MF-Poll- [Pol2- (BM) m] y
dove : where is it :
y à ̈ 0 o 1, m=l~10, n=2-20 e in alcune forme preferite dell'invenzione n>2 oppure n>3 oppure n>4 oppure n>5 oppure n>6, oppure n>10 y is 0 or 1, m = l ~ 10, n = 2-20 and in some preferred forms of the invention n> 2 or n> 3 or n> 4 or n> 5 or n> 6, or n> 10
PL Ã ̈ un fosfolipide, PL is a phospholipid,
MF un' unità ramificante presentante residui funzionalizzabili per legare direttamente o attraverso altre porzioni PL e Poli, MF a branching unit with functionalizable residues to bind PL and Poly directly or through other portions,
Poli à ̈ un polimero idrofilo solubile in acqua, sintetico o naturale. Poli is a hydrophilic polymer soluble in water, synthetic or natural.
Pol2 e BM possono essere presenti o assenti. In particolare, quando y=0, Pol2 e BM sono assenti. Pol2 and BM may be present or absent. In particular, when y = 0, Pol2 and BM are absent.
Pol2, se presente, à ̈ un'unità ramificante che presenta residui funzionalizzabìli per legare direttamente o attraverso altre porzioni BM e Poli, Pol2, if present, is a branching unit that has functionalizable residues to bind BM and Poli directly or through other portions,
BM, se presente, Ã ̈ una molecola direzionante, BM, if present, is a directing molecule,
e le differenti porzioni sono coniugate, preferibilmente attraverso legami esterei, ammidici, carbammici, eterei, tioeterei, disolfuro o altri legami covalenti, direttamente o attraverso uno o più spaziatori, gli spaziatori preferibilmente scelti tra gruppi alchilici, quali NH2-(CH2)n-NH2(n=0-12) o HOOC-(CH2 )m-COOH (m=0-12), o gruppi aromatici o molecole idrolizzatili in funzione del pH o peptidi (quali Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly ) idrolizzabili da specifici enzimi lisosomiali. and the different portions are conjugated, preferably through ester, amide, carbamate, ether, thioether, disulfide or other covalent bonds, directly or through one or more spacers, the spacers preferably selected between alkyl groups, such as NH2- (CH2) n- NH2 (n = 0-12) or HOOC- (CH2) m-COOH (m = 0-12), or aromatic groups or hydrolysable molecules as a function of pH or peptides (such as Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu -Phe-Gly) hydrolyzable by specific lysosomal enzymes.
Preferibilmente il fosfolipide PL possiede la seguente formula generale: Preferably, the PL phospholipid has the following general formula:
R1-0-CH, R1-0-CH,
R2-0-CH O R2-0-CH O
CHr-O-P-O— R3 CHr-O-P-Oâ € ”R3
<2>I <2> I
o or
dove : where is it :
RI e R2 sono indipendentemente un gruppo alchilico, saturo 0 insaturo, o un gruppo acilico, saturo o insaturo, preferibilmente comprendente da 12 a 22 carboni, eventualmente sostituito con uno o più gruppi preferibilmente selezionati tra un gruppo ossi, un gruppo idrossilico o amminico. Gruppi acilici possono essere ad esempio, ma non esclusivamente, stearoil, palmitoil. R1 and R2 are independently an alkyl group, saturated or unsaturated, or an acyl group, saturated or unsaturated, preferably comprising from 12 to 22 carbons, optionally substituted with one or more groups preferably selected from an oxy group, a hydroxyl or amino group. Acyl groups can be for example, but not exclusively, stearoil, palmitoyl.
R3 Ã ̈ un legame o un qualsiasi gruppo che permette la coniugazione del fosfolipide con un polimero, come ad esempio, ma non esclusivamente, etanolammina , serina, glicerolo . R3 is a bond or any group that allows the conjugation of the phospholipid with a polymer, such as, for example, but not exclusively, ethanolamine, serine, glycerol.
1 fosfolipidi (PL) usati per la presente invenzione sono molecole amfipatiche contenenti un gruppo fosforico; i fosfolipidi possono essere naturali o ottenuti per via sintetica (Vedi J.M. Berg, J.L. Tymoczko, and L. The phospholipids (PL) used for the present invention are amphipathic molecules containing a phosphoric group; phospholipids can be natural or synthetically obtained (See J.M. Berg, J.L. Tymoczko, and L.
Biochemistry . 5th ed. 2002, New York: W.H. Freeman. Vili 974, (e pagine seguenti); J. Lindberg, et al. J. Org. Chem. Biochemistry. 5th ed. 2002, New York: W.H. Freeman. VIII 974, (and following pages); J. Lindberg, et al. J. Org. Chem.
67(1): 194-199 (2002)). I fosfolipidi presenti nel coniugato sono capaci di interagire con il doppio strato fosfolipidico dei liposomi o di promuovere la formazione di micelle . 67 (1): 194-199 (2002)). The phospholipids present in the conjugate are capable of interacting with the phospholipid bilayer of the liposomes or of promoting the formation of micelles.
Tra i fosfolipidi preferibilmente, ma non esclusivamente, utilizzati nella presente invenzione vi sono distearoilfosfatidil-etanolammina (DSPE), dipalmitoil-f osfatidiletanolammina (DPPE), dimiristoil-fosfatidil-etanolammina (DMPE), dioleoil-fosfatìdil-etanolammina (DOPE) , dielaidoil-fosfatidil-etanolammina (DEPE), distearoilfosfatidil-serina (DSPS), dipalmitoil-fosfatidil-serina (DPPS), dimiristoil-fosfatidil-serina (DMPS), dioleoilfosfatidil-serina (DOPS) , dimiristoil-fosfatidiletanolammina (DMPE), distearoil-fosfatidil-glicerolo (DSPG), dipalmitoil-fosfatidil-glicerolo (DPPG), dimiristoil-fosfatidil-glicerolo (DMPG) . Among the phospholipids preferably, but not exclusively, used in the present invention are distearoylphosphatidyl-ethanolamine (DSPE), dipalmitoyl-f osfatidylethanolamine (DPPE), dimyristyl-phosphatidyl-ethanolamine (DMPE), dioleoyl-phosphatedylamine (DOPE-ethanol) dielaidoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DEPE), distearoylphosphatidyl-serine (DSPS), dipalmitoyl-phosphatidyl-serine (DPPS), dimyristoyl-phosphatidyl-serine (DMPS), dioleoylphosphatidyl-serine (DOPS), dimylethyl-diethyl-diethyl-ethyl-diethyl-ethyl phosphatidyl-glycerol (DSPG), dipalmitoyl-phosphatidyl-glycerol (DPPG), dimyristoyl-phosphatidyl-glycerol (DMPG).
BM può essere presente oppure no, e se presente à ̈ una molecola direzionante specifica per il riconoscimento di tumori, siti infiammati o infetti per l'impiego in diagnostica o in terapia. Tra le molecole direzionanti preferite dall'invenzione vi sono peptidi, anticorpi monoclonali, frammenti di anticorpi, biotina, ormoni e zuccheri . BM may or may not be present, and if present it is a specific targeting molecule for the recognition of tumors, inflamed or infected sites for use in diagnostics or therapy. Among the preferred targeting molecules of the invention are peptides, monoclonal antibodies, antibody fragments, biotin, hormones and sugars.
Il numero intero n, che indica il numero di molecole di fosfolipide coniugato tramite la molecola ramificata a Poli e' un numero maggiore di 1, per esempio, ma non esclusivamente, da 2 a 20, e preferibilmente da 4 a 8, per ottenere un composto con una componente idrofobica maggiore rispetto ai coniugati PEG-DSPE. The integer n, which indicates the number of phospholipid molecules conjugated through the poly branched molecule is a number greater than 1, for example, but not exclusively, from 2 to 20, and preferably from 4 to 8, to obtain a compound with a higher hydrophobic component than PEG-DSPE conjugates.
Secondo alcune forme preferite dell' invenzione n>2 oppure n>3 oppure n>4 oppure n>5 oppure n>6, oppure n>10. According to some preferred forms of the invention n> 2 or n> 3 or n> 4 or n> 5 or n> 6, or n> 10.
MF à ̈ un'unità ramificante, che secondo alcune forme dell' invenzione può essere una molecola ramificata tri- o tetrafunzionale, un polimero ramificato o una struttura dendrimerica ; MF presenta residui funzionalizzabili per legare direttamente o attraverso altre porzioni PL e Poli. MF preferiti includono acido glutammico, acido aspartico, acido beta-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, 3-idrossi 2 ammino propanolo, lisina o un altro acido amminobicarbossilico o amminotricarbossilico. Polimeri polifunzionali idrofili preferiti includono acido poliaspartico, acido poliglutammico, poli (idrossietilaspartammide), poli(idrossietilglutammide), poli (idrossipropilmetacrilammide) e polìlisina. Nelle situazioni preferite, il polimero polifunzionale ha un peso molecolare tra i 500 e i 5000 Da. Quando MF à ̈ un dendrimero, la porzione ramificata à ̈ rappresentata da acido glutammico, acido aspartico, acido beta-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, lisina o 3-idrossi 2 animino propanolo o un altro acido amminobicarbossilico e amminotricarbossilico. Tra i gruppi funzionali di MF preferiti vi sono gruppi carbossilici e amminici. Quando MF à ̈ legato direttamente a Poli, la coniugazione può essere mediata da un legame estereo, ammidico, carbammico o da altri legami covalenti. MF is a branching unit, which according to some forms of the invention can be a branched tri- or tetrafunctional molecule, a branched polymer or a dendrimeric structure; MF has functionalizable residues to bind PL and Poly directly or through other portions. Preferred MFs include glutamic acid, aspartic acid, beta-glutamic acid, homoglutamic acid, aminoadipic acid, 3-hydroxy 2 amino propanol, lysine or another aminobicarboxylic or aminotricarboxylic acid. Preferred hydrophilic polyfunctional polymers include polyaspartic acid, polyglutamic acid, poly (hydroxyethylaspartamide), poly (hydroxyethylglutamide), poly (hydroxypropyl methacrylamide) and polylysine. In preferred situations, the polyfunctional polymer has a molecular weight between 500 and 5000 Da. When MF is a dendrimer, the branched portion is represented by glutamic acid, aspartic acid, beta-glutamic acid, homoglutamic acid, aminoadipic acid, lysine or 3-hydroxy 2 amino propanol or another aminobicarboxylic and aminotricarboxylic acid. Among the preferred MF functional groups are carboxyl and amino groups. When MF is directly linked to Poly, conjugation can be mediated by an ester, amide, carbamate or other covalent bond.
Pol2, se presente, à ̈ un'unità ramificante e secondo alcune forme dell'invenzione à ̈ una molecola ramificante tri- o tetra-funzionale , un polimero multifunzionale o una struttura dendrimerica , che presenta residui funzionalizzabili per il legame covalente di più BM (in questo caso m≥l, per es., da 1 a 10, e preferibilmente da 1 e 4), per ottenere un composto più selettivamente direzionato. La porzione ramificata può essere preferibilmente rappresentata da acido glutammico, acido aspartico, acido beta-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, 3-idrossi 2 ammino propanolo o un altro acido amminobicarbossilico o amminotricarbossilico. Pol2 possiede inoltre un gruppo funzionale per la coniugazione a Poli direttamente o attraverso uno spaziatore. Tra ì gruppi funzionali preferiti di Pol2 vi sono gruppi carbossilici e amminici. Quando Pol2 à ̈ legato direttamente a Poli, la coniugazione può essere mediata da un legame estereo, ammidico, carbammico o da altri legami covalenti. Pol2, if present, is a branching unit and according to some forms of the invention it is a tri- or tetra-functional branching molecule, a multifunctional polymer or a dendrimeric structure, which has functionalizable residues for the covalent bonding of several BM ( in this case mâ ‰ ¥ l, for example, from 1 to 10, and preferably from 1 and 4), to obtain a more selectively directed compound. The branched portion may preferably be represented by glutamic acid, aspartic acid, beta-glutamic acid, homoglutamic acid, aminoadipic acid, 3-hydroxy 2 amino propanol or another aminobicarboxylic or aminotricarboxylic acid. Pol2 also possesses a functional group for conjugation to Poles either directly or through a spacer. Among the preferred functional groups of Pol2 there are carboxylic and amino groups. When Pol2 is directly bonded to Poly, conjugation can be mediated by an ester, amide, carbamate or other covalent bond.
Poli à ̈ un polimero idrofilo solubile in acqua, sintetico o naturale, che possiede almeno uno gruppo funzionale per la coniugazione a MF e almeno due gruppi funzionali se sono presenti anche Pol2 e BM. Tramite MF, Poli à ̈ coniugato ad almeno due PL. Quando Poli à ̈ un polimero monofunzionalizzato l'unico gruppo derivatizzabile deve essere coniugato al blocco comprendente i PL. Tale coniugazione può essere diretta o mediata da spaziatori. Quando Poli possiede due gruppi terminali (Poli bifunzionale o eterobifunzionale) uno deve essere coinvolto nella coniugazione al blocco PL, comprendente almeno due molecole di PL (anche diverse tra loro), e l'altro può essere alternativamente coniugato direttamente o tramite Pol2 a BM. In ogni caso la coniugazione può essere diretta o attraverso spaziatori. Tra i Poli monofunzionali, bifunzionali o eterobifunzionali preferiti vi sono poli (etilenglicole), polivinilpirrolidone o poliacriloilmorfolina, poli(2-etil-2-ossazolina) . Il/i gruppo/i terminale/i di Poli può/possono essere attivato/i ad esempio secondo procedure note (ad esempio per PEG-COOH, PEG-NH2)e altre (Sabine Herman, et al. J. of Bioactive and Compatible Polymers, 10: 145-187 (1995)). Il polimero Poli ha preferenzialmente un peso molecolare medio compreso tra 1000 e 40000 Da, preferibilmente di almeno 1500 Da, più preferibilmente di almeno 2000 Da, e ancora più preferibilmente di almeno 5000 Da. Nelle situazione preferite, Poli à ̈ un derivato di poli(etilenglicole) (PEG) , lineare o branched, monofunzionale, bifunzionale o eterobifunzionale, con un peso molecolare medio tra i 1000 e i 40000 Da. Alcuni Poli preferiti sono mPEG-OH 2000 Da, mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-OH 3400 Da, mPEG-COOH 3400 Da, mPEG-OH 5000 Da e mPEG-COOH 5000 Da. Poli is a hydrophilic polymer soluble in water, synthetic or natural, which has at least one functional group for conjugation to MF and at least two functional groups if Pol2 and BM are also present. Through MF, Poli is conjugated to at least two PLs. When Poli is a monofunctionalized polymer, the only derivatizable group must be conjugated to the block comprising the PLs. This conjugation can be directed or mediated by spacers. When Poly has two terminal groups (bifunctional or heterobifunctional Poly) one must be involved in the conjugation to the PL block, comprising at least two molecules of PL (even different from each other), and the other can be alternatively conjugated directly or through Pol2 to BM. In any case, the conjugation can be direct or through spacers. Among the preferred monofunctional, bifunctional or heterobifunctional poles are poly (ethylene glycol), polyvinylpyrrolidone or polyacryloylmorpholine, poly (2-ethyl-2-oxazoline). The terminal group (s) of Poli can / can be activated for example according to known procedures (for example for PEG-COOH, PEG-NH2) and others (Sabine Herman, et al. J. of Bioactive and Compatible Polymers, 10: 145-187 (1995)). The Poly polymer preferably has an average molecular weight between 1000 and 40,000 Da, preferably at least 1500 Da, more preferably at least 2000 Da, and even more preferably at least 5000 Da. In preferred situations, Poly is a derivative of poly ( ethylene glycol) (PEG), linear or branched, monofunctional, bifunctional or heterobifunctional, with an average molecular weight between 1000 and 40000 Da. Some preferred Poles are mPEG-OH 2000 Da, mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-OH 3400 Da, mPEG-COOH 3400 Da, mPEG-OH 5000 Da and mPEG-COOH 5000 Da.
Le differenti porzioni dei coniugati sono legate preferibilmente via legami esterei, ammidici, carbammici o altri legami covalenti, direttamente o attraverso uno o più spaziatori, gli spaziatori preferibilmente scelti tra gruppi alchilici quali NH2- (CH2)n-NH2(n=0-12) o HOOC-{CH2)m-COOH (m=0-12), o gruppi aromatici o molecole idrolizzabili in funzione del pH o peptidi (quali Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly ) idrolizzabili da specifici enzimi lisosomiali . The different portions of the conjugates are preferably linked via ester, amide, carbamate or other covalent bonds, directly or through one or more spacers, the spacers preferably selected from alkyl groups such as NH2- (CH2) n-NH2 (n = 0-12 ) or HOOC- {CH2) m-COOH (m = 0-12), or aromatic groups or molecules hydrolysable as a function of pH or peptides (such as Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly) hydrolyzable from specific lysosomal enzymes.
Tra i coniugati preferiti in accordo con la presente invenzione vi sono coniugati che possiedono le seguente formula : Among the preferred conjugates according to the present invention there are conjugates having the following formula:
nei quali, come di seguito riportato, y à ̈ 0, n=2-20, e nei quali, secondo alcune forme preferite dell' invenzione n>2 oppure n>3 oppure n>4 oppure n>5 oppure n>6, oppure n>10. Tra i coniugati preferiti aventi questa formula, vi sono coniugati nei quali Poli à ̈ poli(etilenglicole) (PEG), lineare o branched, monofunzionale, bifunzionale o eterobifunzionale , con un peso molecolare medio tra i 1000 e i 40000 Da, e preferibilmente mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-COOH 3400 Da o mPEG-COOH 5000 Da. ME à ̈ una molecola ramificante che può avere una struttura dendrimerica; per esempio, MF può contenere uno o più residui di acido betaglutammico (BG) come molecola ramificante, o MF può essere un omopolimero, basato sull'acido glutammico (AG). PL à ̈ distearoil fosfatidii etanolammina (DSPE) e n=2 o 4. in which, as reported below, y is 0, n = 2-20, and in which, according to some preferred forms of the invention n> 2 or n> 3 or n> 4 or n> 5 or n> 6, or n> 10. Among the preferred conjugates having this formula, there are conjugates in which Poly à poly (ethylene glycol) (PEG), linear or branched, monofunctional, bifunctional or heterobifunctional, with an average molecular weight between 1000 and 40000 Da, and preferably mPEG- COOH 2000 Da, mPEG-COOH 3400 Da or mPEG-COOH 5000 Da. ME is a branching molecule that can have a dendrimeric structure; for example, MF may contain one or more residues of beta-glutamic acid (BG) as a branching molecule, or MF may be a homopolymer, based on glutamic acid (AG). PL is distearoyl phosphatides ethanolamine (DSPE) and n = 2 or 4.
Alcuni esempi di coniugati preferiti secondo la presente invenzione hanno la seguente formula: Some examples of preferred conjugates according to the present invention have the following formula:
î…‡ I coniugati in accordo con la presente invenzione sono adatti sia per un uso diretto, quali molecole anfifiliche per la solubilizzazione di molecole idrofobiche, o per la preparazione di liposomi a lunga circolazione. In ogni caso I coniugati oggetto della presente invenzione possono essere usati in percentuali molari variabili dal 1-100% della composizione lipidica totale. I liposomi così ottenuti possono essere impiegati per la veicolazione, conservazione e formulazione di farmaci (idrofili ed idrofobica), peptidi, proteine e agenti diagnostici. î… ‡ The conjugates according to the present invention are suitable both for direct use, as amphiphilic molecules for the solubilization of hydrophobic molecules, or for the preparation of long-circulation liposomes. In any case, the conjugates object of the present invention can be used in molar percentages ranging from 1-100% of the total lipid composition. The liposomes thus obtained can be used for the delivery, storage and formulation of drugs (hydrophilic and hydrophobic), peptides, proteins and diagnostic agents.
ESEMPI EXAMPLES
Esempio 1: Preparazione di (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da Example 1: Preparation of (DSPE) 2-BG-mPEG 5000 Da
Step 1. Sintesi (COOH)2~BG-mPEG 5000 Da. Step 1. Synthesis (COOH) 2 ~ BG-mPEG 5000 Da.
Il gruppo carbossilico di mPEG-COOH (5000 Da) à ̈ stato attivato via DCCI/NHS e coniugato al gruppo amminico dell'acido β-glutammico, per ottenere il prodotto desiderato: COOH)2-BG-mPEG 5000 Da. The carboxyl group of mPEG-COOH (5000 Da) was activated via DCCI / NHS and conjugated to the amino group of β-glutamic acid, to obtain the desired product: COOH) 2-BG-mPEG 5000 Da.
440 mg di mPEG-COOH (0,088 mmol; MW 5000 Da) sciolti in 10 mi di CH2CI2 sono stati raffreddati a 4°C e sono stati quindi aggiunti di 15,20 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) (0,132 mmol; MW 115,19 Da) e 54,47 mg di N,N'dicicloesilcarbodimide (DDC) (0,264 mmol; MW 206,33 Da). La miscela à ̈ stata mantenuta sotto atmosfera di Argon e lasciata a temperatura ambiente. Dopo 5 ore sotto costante 440 mg of mPEG-COOH (0.088 mmol; MW 5000 Da) dissolved in 10 ml of CH2CI2 were cooled to 4 ° C and then 15.20 mg of N-hydroxysuccinimide (NHS) (0.132 mmol; MW 115 , 19 Da) and 54.47 mg of N, N'dicyclohexylcarbodimide (DDC) (0.264 mmol; MW 206.33 Da). The mixture was kept under an Argon atmosphere and left at room temperature. After 5 hours under constant
la soluzione viene filtrata su gooch e fatta gocciolare in 150 ml di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto. the solution is filtered on gooch and made to drop in 150 ml of diethyl ether under vigorous stirring. The precipitate is placed at 4 ° C for 6 hours and then filtered on gooch and dried under vacuum.
362 mg di mPEG-NHS (0,071 mmol; MW 5100 Da) vengono addizionati a una soluzione di 52,50 mg di beta-glutammico (0,357 mmol; MW 147,1 Da) in tampone borato 0,2 M pH 8. Dopo tre ore la soluzione viene acidificata a pH 3 con HC1 0,1 N, filtrata ed estratta con CHCI3(6 x 80 mi). La fase organica, anidrificata con Na2S04anidro, viene concentrata a 2-3 mi in rotavapor. Questa soluzione viene fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto. 362 mg of mPEG-NHS (0.071 mmol; MW 5100 Da) are added to a solution of 52.50 mg of beta-glutamic (0.357 mmol; MW 147.1 Da) in 0.2 M borate buffer pH 8. After three hours the solution is acidified to pH 3 with 0.1 N HCl, filtered and extracted with CHCI3 (6 x 80 ml). The organic phase, dried with Na2SO4anhydrous, is concentrated to 2-3 ml in rotavapor. This solution is dripped into 150 ml of diethyl ether under vigorous stirring. The precipitate is placed at 4 ° C for 6 hours and then filtered on gooch and dried under vacuum.
La resa fu pari al 82%. The yield was 82%.
Step 2. Sintesi (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da. Step 2. Synthesis (DSPE) 2-BG-mPEG 5000 Da.
I gruppi carbossilici di (COOH)2-BG-mPEG sono stati attivati via DCCI/NHS e fatti reagire con il gruppo amminico della DSPE per ottenere il prodotto desiderato: (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da. The carboxyl groups of (COOH) 2-BG-mPEG were activated via DCCI / NHS and reacted with the amino group of the DSPE to obtain the desired product: (DSPE) 2-BG-mPEG 5000 Da.
286 mg dì (COOH)2-BG-mPEG (0,055 mmol; MW 5200 Da) sciolti in 10 mi di CH2CI2sono stati raffreddati a 4°C e sono stati quindi aggiunti di 19,00 mg di ΠΗS (0,165 mmol; MW 115,19 Da) e 68,90 mg di DDC (0,330 mmol; MW 206,33 Da). La miscela à ̈ stata mantenuta sotto atmosfera di lasciata a temperatura ambiente. Dopo 5 ore sotto costante agitazione, la soluzione viene filtrata su gooch e fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto. 286 mg day (COOH) 2-BG-mPEG (0.055 mmol; MW 5200 Da) dissolved in 10 ml of CH2CI2 were cooled to 4 ° C and then added 19.00 mg of Î Î — S (0.165 mmol ; MW 115.19 Da) and 68.90 mg of DDC (0.330 mmol; MW 206.33 Da). The mixture was kept under a left atmosphere at room temperature. After 5 hours under constant stirring, the solution is filtered on gooch and made to drop in 150 ml of diethyl ether under vigorous stirring. The precipitate is placed at 4 ° C for 6 hours and then filtered on gooch and dried under vacuum.
254 mg di (NHS)2-BG-mPEG (0,047 mmol ; MW 5400 Da) vengono addizionati a una soluzione, precedentemente costituita, di 77,8 mg di DSPE (0,104 mmol; MW 748,06 Da) in 15 mi di CHCI3. Alla soluzione sì addizionano 28,98 Î1⁄4Î di Et3N (0,208 mmol; MW 101,19 Da). Si lascia reagire per 12 ore a 45°C. la soluzione viene filtrata e tirata a secco in rotavapor . 254 mg of (NHS) 2-BG-mPEG (0.047 mmol; MW 5400 Da) are added to a previously made solution of 77.8 mg of DSPE (0.104 mmol; MW 748.06 Da) in 15 ml of CHCI3 . To the solution add 28.98 Î1⁄4Î of Et3N (0.208 mmol; MW 101.19 Da). It is left to react for 12 hours at 45 ° C. the solution is filtered and dried in a rotavapor.
Step 3. Purificazione (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da. Step 3. Purification (DSPE) 2-BG-mPEG 5000 Da.
Il residuo secco ottenuto dallo step 2 viene ripreso con acqua e dializzato contro acqua contenente 50 mM NaCl con una membrana di dialisi avente un cut-off di 100 kDa per eliminare il polimero che non ha reagito. Dopo 24 ore la soluzione del coniugato viene liofilizzata. Il coniugato liofilizzato viene caratterizzato mediante<1>H-NMR. Se di evidenzia la presenza di DSPE libera si prosegue con la seguente purificazione. Il coniugato viene sciolto in CHCI3e addizionato di un eccesso di 2 equivalenti di cloruro dell'acido laurico e di 1,5 equivalenti di Et3N per ogni equivalente di DSPE libera. Dopo 3 ore sotto costante agitazione, la soluzione viene filtrata su gooch e fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato purificato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto. Resa finale: 70% The dry residue obtained from step 2 is taken up with water and dialyzed against water containing 50 mM NaCl with a dialysis membrane having a cut-off of 100 kDa to eliminate the polymer that has not reacted. After 24 hours the conjugate solution is lyophilized. The lyophilized conjugate is characterized by <1> H-NMR. If the presence of free DSPE is evident, the following purification is continued. The conjugate is dissolved in CHCI3e with the addition of an excess of 2 equivalents of chloride of lauric acid and 1.5 equivalents of Et3N for each equivalent of free DSPE. After 3 hours under constant stirring, the solution is filtered on gooch and made to drop in 150 ml of diethyl ether under vigorous stirring. The purified precipitate is placed at 4 ° C for 6 hours and then filtered on gooch and dried under vacuum. Final yield: 70%
Esempio 2: Preparazione di (DSPE)4-(BG)2-BG-mPEG 5000Da Step 1. Sintesi (COOH)«- (BG)2-BG-mPEG 5000Da. Example 2: Preparation of (DSPE) 4- (BG) 2-BG-mPEG 5000Da Step 1. Synthesis (COOH) «- (BG) 2-BG-mPEG 5000Da.
I gruppi carbossilici attivati di (NHS)2-BG-mPEG (5400 Da), ottenuti come descritto allo step 2 dell'esempio 1, sono stati coniugati al gruppo amminico dell'acido β-glutammico, per ottenere il prodotto desiderato: (COOH)4- (BG)2-BG~mPEG 5000 Da. The activated carboxylic groups of (NHS) 2-BG-mPEG (5400 Da), obtained as described in step 2 of Example 1, were conjugated to the amino group of β-glutamic acid, to obtain the desired product: (COOH ) 4- (BG) 2-BG ~ mPEG 5000 Da.
383 mg di (NHS )2-BG-mPEG (0,071 mmol; MW 5400Da) vengono addizionati a una soluzione di 104.4 mg di beta-glutammico (0,71 mmol; MW 147,1 Da) in tampone borato 0.2 M pH 8. Dopo tre ore la soluzione viene acidificata a pH 3 con HC1 0.1 N, filtrata ed estratta con CHC13(6 x 80 mi). La fase organica, anidrificata con Na2S04anidro, viene concentrata a 2-3 mi in rotavapor. Questa soluzione viene fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto. 383 mg of (NHS) 2-BG-mPEG (0.071 mmol; MW 5400Da) are added to a solution of 104.4 mg of beta-glutamic (0.71 mmol; MW 147.1 Da) in 0.2 M borate buffer pH 8. After three hours the solution is acidified to pH 3 with 0.1 N HC1, filtered and extracted with CHC13 (6 x 80 ml). The organic phase, dried with Na2SO4anhydrous, is concentrated to 2-3 ml in rotavapor. This solution is dripped into 150 ml of diethyl ether under vigorous stirring. The precipitate is placed at 4 ° C for 6 hours and then filtered on gooch and dried under vacuum.
La resa fu pari al 80%. The yield was 80%.
Step 2. Sintesi e purificazione (DSPE )4- (BG)2-BG-mPEG 5000 Da. Step 2. Synthesis and purification (DSPE) 4- (BG) 2-BG-mPEG 5000 Da.
I gruppi carbossilici di (COOH)4-(BG)2-BG-mPEG 5000 Da sono stati attivati via DCCI/NHS e fatti reagire con il gruppo amminico della DSPE per ottenere il prodotto desiderato: (DSPE)4-(BG)2<_>BG-mPEG 5000 Da. Carboxyl groups of (COOH) 4- (BG) 2-BG-mPEG 5000 Da were activated via DCCI / NHS and reacted with the amino group of DSPE to obtain the desired product: (DSPE) 4- (BG) 2 <_> BG-mPEG 5000 Da.
La reazione di coniugazione e la purificazione del prodotto vengono condotte come riportato allo step 2 e 3 dell'esempio 1, usando eccessi di DSPE e EtN3in proporzione ai carbossili attivati di (NHS)4-(BG)2-BG-mPEG. Resa finale: 65% The conjugation reaction and the purification of the product are carried out as reported in steps 2 and 3 of Example 1, using excesses of DSPE and EtN3 in proportion to the activated carboxyls of (NHS) 4- (BG) 2-BG-mPEG. Final yield: 65%
Esempio 3: Preparazione di (DSPE)4-(AG)4-mPEG 5000 Da Example 3: Preparation of (DSPE) 4- (AG) 4-mPEG 5000 Da
I gruppi carbossilici di (AG)n-mPEG 5000 Da, detto anche copolimero PEG-acido poliglutammico, con una valore medio di n di circa 4 sono stati attivati in situ via EDC/NHS e fatti reagire con il gruppo amminico della DSPE per ottenere il prodotto desiderato: (DSPE)4-(AG)4-mPEG 5000 Da. The carboxyl groups of (AG) n-mPEG 5000 Da, also called PEG-polyglutamic acid copolymer, with an average value of n of about 4 were activated in situ via EDC / NHS and reacted with the amino group of the DSPE to obtain the desired product: (DSPE) 4- (AG) 4-mPEG 5000 Da.
400 mg di (AG)n-mPEG (0,073 nunol; MW 5500 Da) vengono sciolti in DMSO e addizionati di 112 mg di N'-(3-dimetilaminopropil )-N-etilcarbodimide HC1 (EDC) (0,584 mmol; MW 191,71 Da) e 50,45 mg di NHS (0,438 mmol ; MW 115,19 Da). Dopo tre ore questa soluzione viene addizionata a una soluzione dì 240,0 mg di DSPE (0,321 mmol; MW 748,06 Da) in CHCI3, ottenendo un rapporto DMSO/CHCI3do 3 : 1 (v/v). Alla soluzione si addizionano 89,48 400 mg of (AG) n-mPEG (0.073 nunol; MW 5500 Da) are dissolved in DMSO and added with 112 mg of N '- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodimide HC1 (EDC) (0.584 mmol; MW 191, 71 Da) and 50.45 mg of NHS (0.438 mmol; MW 115.19 Da). After three hours this solution is added to a solution of 240.0 mg of DSPE (0.321 mmol; MW 748.06 Da) in CHCl3, obtaining a DMSO / CHCI3do 3: 1 (v / v) ratio. 89.48 are added to the solution
(0,642 mmol; MW 101,19 Da). Si lascia reagire per 12 ore a 45°C. la soluzione viene filtrata e tirata a secco in rotavapor. Il residuo viene ripreso in acqua e il prodotto purificato come riportato allo step 3 dell'esempio 1. (0.642 mmol; MW 101.19 Da). It is left to react for 12 hours at 45 ° C. the solution is filtered and dried in a rotavapor. The residue is taken up in water and the purified product as reported in step 3 of example 1.
Resa finale: 85% Final yield: 85%
Esempio 4 : Preparazione di una formulazione liposomiale comprendente uno dei coniugati oggetto della presente invenzione Example 4: Preparation of a liposomal formulation comprising one of the conjugates object of the present invention
I liposomi possono essere preparati con varie metodiche. In questo caso, come esempio non esclusivo, Ã ̈ riportato il metodo definito "d'evaporazione di un film sottile" ("thin layer evaporation" ). Liposomes can be prepared with various methods. In this case, as a non-exclusive example, the method defined as "thin layer evaporation" is reported.
Come farmaco modello à ̈ stata incorporata nella formulazione liposomiale 1' epirubicina, noto farmaco antitumorale, al fine di studiarne le cinetiche di rilascio dai liposomi e la farmacocinetica degli stessi in topi. As a model drug, epirubicin, a well-known anticancer drug, was incorporated into the liposomal formulation in order to study its release kinetics from liposomes and their pharmacokinetics in mice.
La metodica di seguito riportata à ̈ stata impiegata per preparare : The following method was used to prepare:
1) liposomi convenzionali, costituiti solo da fosfatidilcolina/colesterolo, 1) conventional liposomes, consisting only of phosphatidylcholine / cholesterol,
2) liposomi a lunga circolazioni, costituiti da fosfatidilcolina/colesterolo/DSPE-mPEG 5000 Da (prodotto commerciale per la preparazione di liposomi a lunga circolazione ) 2) long-circulating liposomes, consisting of phosphatidylcholine / cholesterol / DSPE-mPEG 5000 Da (commercial product for the preparation of long-circulating liposomes)
3) nuovi liposomi a lunga circolazione contententi uno dei coniugati oggetto della presente invenzione e in particolare sono stati preparate due formulazioni, una contenente fosfatidilcolina/colesterolo/ (DSPE )2-BG-mPEG 5000 Da e l'altra una contenente fosfatidi lcolina /colesterolo/ (DSPE)4- (BG)2- (BG)-mPEG 5000 Da. 3) new long-circulation liposomes containing one of the conjugates object of the present invention and in particular two formulations have been prepared, one containing phosphatidylcholine / cholesterol / (DSPE) 2-BG-mPEG 5000 Da and the other one containing lcholine / cholesterol phosphatides / (DSPE) 4- (BG) 2- (BG) -mPEG 5000 Da.
In tabella 1 sono riportate le concentrazioni molari e i mg utilizzati per la preparazione dei diverse formulazioni liposomiali . Table 1 shows the molar concentrations and the mg used for the preparation of the various liposomal formulations.
Ogni preparazione liposomiali viene preparata separatamente addizionando in un pallone la fosf atidilcolina , il colesterolo e seconda dei casi il coniugato amfifilico, sciolti in 3 ml di CHCI3. La miscela viene tirata a secco in rotavapor ed essiccata sotto vuoto. Il film sottile del residuo secco viene idratato con 2 mi di PBS contenente l'epirubicina . La miscela viene scaldata a 60°C (3 min) e agitata con vortex (3 min) per 3 volte e quindi posta in frigo a 4°C per 1 ora. La sospensione di lìposomi così ottenuta viene sonnicata in bagno di ghiaccio per 5 min e filtrata con un filtro 0,22 Î1⁄4m. Il filtrato viene purificato mediante GPC con resina sephadex G-50 su colonna (15 x 1 cm) eluita con PBS. I liposomi purificati sono impiegati per studi di rilascio del farmaco incorporato e per studi farmacocinetici. Each liposomal preparation is prepared separately by adding phosphatidylcholine, cholesterol and, depending on the case, the amphiphilic conjugate in a flask, dissolved in 3 ml of CHCI3. The mixture is dried in a rotavapor and dried under vacuum. The thin film of the dry residue is hydrated with 2 ml of PBS containing epirubicin. The mixture is heated to 60 ° C (3 min) and vortexed (3 min) 3 times and then placed in the fridge at 4 ° C for 1 hour. The lìposomi suspension thus obtained is dozed in an ice bath for 5 min and filtered with a 0.22 Î1⁄4m filter. The filtrate is purified by GPC with sephadex G-50 resin on a column (15 x 1 cm) eluted with PBS. Purified liposomes are used for embedded drug release and pharmacokinetic studies.
Tabella 1. Composizioni delle formulazioni liposomiali preparate . 0 Formulazione Componente millimoli milligrammi liposomiale Table 1. Compositions of the prepared liposomal formulations. 0 Formulation Component millimole milligrams liposomal
Fosfatidilcolina 0,08 63 Phosphatidylcholine 0.08 63
LIPO 1 Colesterolo 0,053 21 LIPO 1 Cholesterol 0.053 21
Epirubicina 0,007 4 Epirubicin 0.007 4
Fosfatidilcolina 0,08 63 Phosphatidylcholine 0.08 63
DSPE-mPEG 5000 Da 0,0052 31 DSPE-mPEG 5000 From 0.0052 31
LIPO 2 LIPO 2
Colesterolo 0,053 21 Epirubicina 0,007 4 Cholesterol 0.053 21 Epirubicin 0.007 4
Fosfatidilcolina 0,08 63 (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da 0,0052 35 Phosphatidylcholine 0.08 63 (DSPE) 2-BG-mPEG 5000 From 0.0052 35
LIPO 3 LIPO 3
Colesterolo 0,053 21 Epirubicina 0,007 4 Cholesterol 0.053 21 Epirubicin 0.007 4
Fosfatidilcolina 0,08 63 Phosphatidylcholine 0.08 63
(DSPE)4- (BG) (BG)-mPEG44(DSPE) 4- (BG) (BG) -mPEG44
LIPO 4 5000 Da LIPO 4 5000 Da
Colesterolo 0,053 21 Epirubicina 0,007 4 Cholesterol 0.053 21 Epirubicin 0.007 4
Esempio 5 : Studio di rilascio di epirubicina da liposomi preparati come riportato all'esempio 4. Example 5: Study of release of epirubicin from liposomes prepared as reported in example 4.
Il rilascio del farmaco contenuto in ognuna delle soluzioni liposomiali ottenute come riportato all'esempio 4 à ̈ sta studiato ponendo 2 mi di una formulazione in una membrana da dialisi con cut-off lOOOODa e immersa in 100 mi di PBS. A tempi predeterminati sono stati eseguiti prelievi nella soluzione ricevente e il farmaco à ̈ stato valutato via RP-HPLC . Dall'elaborazione delle cinetiche di rilascio di epirubicina per ogni formulazione liposomiale si à ̈ dimostrato che la formulazione LIPO 4 presenta una velocità di rilascio inferiore a tutte le altre preparazioni (tabella 2). In particolare il rallentamento della cinetica di rilascio cresce all'aumentare del numero di fosfolipidi coniugati al PEG. The release of the drug contained in each of the liposomal solutions obtained as reported in Example 4 is being studied by placing 2 ml of a formulation in a dialysis membrane with cut-off 100OODa and immersed in 100 ml of PBS. At predetermined times, withdrawals were made in the receiving solution and the drug was evaluated by RP-HPLC. From the elaboration of the epirubicin release kinetics for each liposomal formulation it has been shown that the LIPO 4 formulation has a lower release rate than all the other preparations (table 2). In particular, the slowdown in the release kinetics increases with the increase in the number of phospholipids conjugated to the PEG.
Tabella 2. T1⁄2di rilascio di epirubicina dale formulazioni liposomìali preparate come riportato all'esempio 4. Table 2. T1⁄2 release of epirubicin from the liposomal formulations prepared as reported in example 4.
Rilascio di Release of
epirubicina epirubicin
Formulazione Formulation
tw tw
(ore) (hours)
LIPO 1 9,51 LIPO 1 9.51
LIPO 2 9,57 LIPO 2 9.57
LIPO 3 11,92 LIPO 3 11.92
LIPO 4 30,10 LIPO 4 30.10
Esempio 6: Studio della farmacocinetica delle formulazioni liposomiali preparate come riportato all'esempio 4. Example 6: Study of the pharmacokinetics of the liposomal formulations prepared as reported in example 4.
Le formulazioni sono state testate direttamente come ottenute all'esempio 4 o dopo eventuale concentrazione della sospensione liposomiale mediante ultrafiltrazione con membrana a cut-off 60000 Da. La farmacocinetica à ̈ stata valutate in topi Balb-c del peso di 23 g. Gli animali sono stati trattati con una dose dì 3 mg/kg (epirubicina equiv.) iniettando attraverso la vena caudale 180 Î1⁄4Î di sospensione liposomiale. A intervalli stabili si sono prelevati 150 Î1⁄4Î di sangue dal bulbo retrooculare, che sono stati analizzati per determinarne il quantitativo di epirubicina. In tabella 3 sono riportati i principali parametri farmacocinetici che dimostrano la maggiore emivita piasmatica della formulazione LIP04, composta da liposomi contenenti (DSPE)4- (BG)2- (BG)-mPEG 5000 Da. The formulations were tested directly as obtained in example 4 or after possible concentration of the liposomal suspension by ultrafiltration with a membrane cut-off 60000 Da. The pharmacokinetics were evaluated in Balb-c mice weighing 23 g. The animals were treated with a dose of 3 mg / kg (epirubicin equiv.) By injecting 180 Î1⁄4ε of liposomal suspension through the tail vein. At stable intervals, 150 Î1⁄4ε of blood were taken from the retroocular bulb, which were analyzed to determine the amount of epirubicin. Table 3 shows the main pharmacokinetic parameters that demonstrate the longer piasmatic half-life of the LIP04 formulation, composed of liposomes containing (DSPE) 4- (BG) 2- (BG) -mPEG 5000 Da.
Tabella 3 . Principali parametri farmacocinetici di epirubìcina libera delle formulazioni liposomiali ottenute dall'esempio 4. Table 3. Main pharmacokinetic parameters of free epirubicin of the liposomal formulations obtained from example 4.
Composto/ formulazione t1⁄2a t1⁄2β CI (min) (min) (ml/min) Epirubicina 1,4 182,4 0,175 LIPO 1 18,7 163,1 0,2128 LIPO 2 19,6 206,9 0,4370 LIPO 3 7,95 1248,6 0,0579 LIPO 4 11 , 1 2783,1 0,0563 Compound / formulation t1⁄2a t1⁄2β CI (min) (min) (ml / min) Epirubicin 1.4 182.4 0.175 LIPO 1 18.7 163.1 0.2128 LIPO 2 19.6 206.9 0, 4370 LIPO 3 7.95 1248.6 0.0579 LIPO 4 11, 1 2783.1 0.0563
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