ITPD20090092A1 - Matrici 3d di polipeptidi elastina umano-simili e metodo di preparazione delle stesse. - Google Patents

Description

Campo dell’invenzione

La presente invenzione à ̈ relativa a idrogeli o matrici 3D ottenibili da polipeptidi elastina umano-simili, opportunamente reticolati mediante reticolazione crociata enzimatica, alla loro preparazione ed al loro uso in campo biomedico.

Stato della tecnica

Le matrici di tipo idrogel suscitano attualmente particolare interesse per gli utilizzi nel campo biotecnologico e biomedico. Biomateriali strutturati ed in grado di trattenere l’acqua rivestono un ruolo chiave sia nella medicina rigenerativa che nello sviluppo delle colture cellulari in vitro. Il principale campo di utilizzo à ̈ come supporto tridimensionale per la crescita di popolazioni cellulari e per la veicolazione di farmaci per attivare specifiche funzioni cellulari.

Il naturale ambiente in cui le cellule proliferano e si sviluppano all’interno dei tessuti à ̈ organizzato attorno alla matrice extracellulare (ECM) che ne costituisce l’impalcatura. Pertanto per la crescita cellulare, uno dei punti nodali consiste nel riuscire a realizzare un appropriato sostituto sintetico della ECM. Sebbene la riproduzione della ECM sia estremamente difficile, sono state stabilite alcune caratteristiche di base essenziali. Tra queste, oltre alla natura chimica del/dei componenti, particolare rilievo rivestono la tridimensionalità, la porosità, le proprietà biomeccaniche e il rapporto fra superficie disponibile per la crescita cellulare e volume. Queste sono, infatti, fra le proprietà microstrutturali fondamentali della ECM e, di conseguenza, caratteri importanti dal momento che permettono il passaggio dei nutrienti e dei segnali biologici e, allo stesso tempo, favoriscono l’eliminazione dei cataboliti.

La scelta del/dei componenti con cui realizzare il biomateriale sta alla base delle caratteristiche finali che questo possiederà. Polimeri sia di derivazione sintetica che naturale rappresentano componenti di elezione, specialmente quando l’obiettivo à ̈ la realizzazione di strutture porose.

Al momento una categoria che riveste grande attenzione riguarda componenti polimerici biomimetici, ossia ispirati a materiali normalmente presenti in natura, ma prodotti artificialmente. I principali vantaggi di questo tipo di approccio sono rappresentati dalla riproducibilità e standardizzazione del materiale di partenza e dall’eliminazione del rischio biologico legato alla veicolazione di agenti patogeni.

Le proteine sono uno dei principali rappresentanti di questa categoria, essendo ormai consolidate le tecnologie del DNA ricombinante che permettono la produzione di geni sintetici e quindi dei prodotti di espressione derivati.

Tra le proteine esistenti in natura, un modello per l’approccio biomimetico à ̈ rappresentato dall’elastina, componente tipico dei tessuti dei vertebrati, caratterizzata e isolata nel 1952 dall’aorta umana e da legamenti equini, (Wise, S.G. and Weiss, A.S., 2009, Int. J. Biochem. Cell Biol., 41: 494-497). L’elastina à ̈ uno dei principali componenti della ECM ed il principale costituente delle fibre elastiche che determinano, appunto, l’elasticità dei tessuti e che conservano l’energia durante il ciclo respiratorio e cardiaco. L’elastina, proteina altamente insolubile, si forma attraverso l’assemblaggio e la reticolazione del suo precursore solubile, la tropoelastina, una proteina con peso molecolare pari a 60-70kDa, costituita dall’alternanza di domini idrofobici e idrofilici contenenti lisina. La tropoelastina umana à ̈ codificata da un singolo gene di 34 esoni, localizzato sul cromosoma 7q11.23, gene che à ̈ in grado di originare diverse isoforme basate sugli splicing alternativi del polipeptide iniziale di 72kDa (Wise, S.G.2009, ref. cit.). Tra le proprietà biofisiche fondamentali dell’elastina sono particolarmente interessanti l’elasticità, la transizione vetrosa e la coacervazione. Per ciò che riguarda l’elasticità, un modello generalmente accettato prevede che il ritorno spontaneo dell’elastina allo stato di rilassamento che precede l’estensione sia di origine entropica, e precisamente sia legato alla gabbia di idratazione costituita dalle molecole di acqua dell’ambiente circostante la proteina (Vrhovski, B. and Weiss, A.S., 1998, Eur. J. Biochem., 258: 1-18). La coacervazione riguarda la transizione di fase dovuta al variare della temperatura; nel caso dell’elastina, l’aumento di temperatura determina l’interazione tra i domini idrofobici con l’esclusione dell’acqua circostante. Di conseguenza si ha l’auto-aggregazione delle molecole che si separano appunto dall’acqua stessa. Questa transizione di fase à ̈ dovuta alla presenza di domini idrofobici basati sulla ripetizione del pentapeptide VPGXG, tipico della tropoelastina di origine bovina (ELN elastin [Bos taurus] Gene ID: 280781, GenBank Accession No. NP_786966). Allo stesso modo (poli)peptidi di origine sintetica e successivamente ricombinante, basati su ripetizioni di tale motivo mantengono le proprietà sopra descritte (Urry, D.W., et al., 2002, Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci.357: 169-184).

I polimeri proteici noti come elastin-like polypeptides (ELP) sono stati inizialmente sviluppati da D.W. Urry sulla base della sequenza ripetuta della tropoelastina bovina e sono stati poi ripresi con variazioni da diversi altri autori.

Urry, D.W. in U.S. Pat. No. 4,474,851, U.S. Pat. No. 4,500,700, U.S. Pat. No.

4,870,055, U.S. Pat. No. 5,250,516 descrive vari componenti derivati dall’elastina comprendenti unità tetra- e penta-peptidiche ripetute derivate dalla sequenza della tropoelastina bovina, mentre in U.S. Pat. No. 4,589,882 descrive polipeptidi ELP comprendenti unità ripetute tetra- e penta-peptidiche derivate dalla sequenza della tropoelastina e componenti capaci di generare legami di cross-linking che possono comprendere amminoacidi, in particolare lisina.

Chilkoti, A., Pat. US No. 2005/0255554A1 descrive proteine di fusione aventi proprietà di transizione di fase, comprendenti ELP formati da sequenze ripetute tetrapeptidici, pentapeptidici, esapeptidici, octapeptidici, nonapeptidici. Ne propone l’utilizzo quali proteine di fusione in modo da sfruttare le proprietà di transizione di fase per la purificazione dell’intero prodotto di espressione.

Keeley, F.W. e collaboratori hanno focalizzato l’attenzione sulla sequenza recante il motivo esapeptidico ripetuto in maniera più regolare della tropoelastina umana (ELN Elastin [Homo sapiens] Gene ID: 2006, isoforme a e d GenBank Accession No NP_000492.2 e NP_001075223) Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly (VAPGVG), codificato dall’esone 24, per le sue capacità di auto-assemblamento (Keeley, F. W., U.S. Pat. No. 2003/0166846A1, Bellingham C. M., et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta, 1550: 6-19). In particolare, il brevetto descrive peptidi autoassemblanti derivati dal motivo esapeptidico della tropoelastina umana. Viene proposto il loro impiego come materiali da ricopertura per protesi impiantabili e come componenti di preparati ad uso cosmetico.

Le proteine artificiali basate sui motivi idrofobici dell’elastina costituiscono anche un materiale di base adattabile per la preparazione di matrici che presentino caratteristiche di idrogel.

Vari autori hanno studiato proprietà, caratteristiche e applicazioni di polipeptidi elastino-simili organizzati in modo da dare origine a supporti tridimensionali.

Weiss e collaboratori hanno esplorato la preparazione di idrogeli utilizzando come macromolecola base, sia l’α-elastina estratta da legamento bovino che la tropoelastina umana ricombinante.

Nel primo caso à ̈ stata utilizzata la glutaraldeide ed un ambiente di CO2ad alta pressione per reticolare i frammenti di α-elastina da legamento bovino, ottenendo in questo modo materiale a porosità adeguata e di consistenza migliore rispetto quello ottenuto a pressione ambiente (Annabi, N., et al., 2009, Biomaterials, 30, 1-7).

La tropoelastina ricombinante umana (GenBank entry AAC98394 (gi182020)) à ̈ stata utilizzata invece per preparare idrogeli utilizzando metodi sia chimici che fisici. E’ descritto l’utilizzo del bis-succinimidil suberato per ottenere la reticolazione irreversibile della proteina ricombinante. Tramite questa procedura sono stati ottenuti biomateriali sottoforma di spugne e fogli (Mithieux S. M., et al., 2004, Biomaterials, 25: 4921-4927). Per quanto riguarda la realizzazione di materiali tramite metodi fisici, variando opportunamente le condizioni di pH, temperatura e concentrazione della tropoelastina ricombinante si ottiene la coalescenza di aggregati fino ad arrivare all’auto-assemblamento irreversibile in un solido e robusto idrogelo (Mithieux, S.M. et al., 2009, Biomaterials, 30: 431-435).

Chilkoti con altri co-autori (U.S. Pat. No.2008/0312156A1) descrive anche idrogeli da preparare in situ per riparo tissutale di difetti del tessuto cartilagineo derivati da polipeptidi ELP basati sul motivo pentapeptidico Val-Pro-Gly-Xaa-Gly (VPGXG) ottenuti mediante reticolazione con agenti chimici quali leganti fosfinici senza gruppi amminici.

Questi autori hanno realizzato idrogeli lavorando con polipeptidi di diversa lunghezza basati sul motivo pentamerico ripetuto nella tropoelastina bovina e sue variazioni, in particolare sul quarto amminoacido della ripetizione, -VPGXG- ove X sta per un qualunque aminoacido, salvo che ogni 7 o 17 ripetizioni X sia una lisina. Il reticolo à ̈ stato realizzato per via chimica, usando tris-succinimidil amminotriacetato (Trabbic-Carlson, K., et al., 2003, Biomacromolecules, 4: 572-580), o agenti reticolanti organo fosforici privi di gruppi amminici contenenti idrossimetilfosfine, come il β-[tris(idrossimetil)phosphino]-acido propionico, in grado di reagire con ammine primarie e secondarie dando amminometilfosfine stabili (Lim, D.W., 2007, Biomacromolecules, 8: 1463-1470).

Lo stesso autore descrive la preparazione di idrogeli per incapsulare condrociti mediante metodo enzimatico, in particolare utilizzando una transglutaminasi tissutale umana ricombinante attivata dal calcio prodotta dagli autori stessi quale agente reticolante. La reazione enzimatica à ̈ effettuata, in presenza delle cellule, utilizzando due tipi di polipeptidi elastino-simili, basati sul motivo pentapeptidico VPGXG, in cui X può essere una glutammina su un polipeptide o una lisina sull’altro in grado di formare tra di loro un legame covalente (McHale, M. K., et al., 2005, Tissue Eng., 11: 1768-1779).

Sempre con polipeptidi basati sul motivo pentapeptidico della tropoelastina bovina VPGXG, sia il gruppo di Chen, W. (Lao, U. L., et al., 2007, Biomacromolecules, 8: 3736-3739) che quello di H. Ghandehari, che utilizza anche motivi ripetuti tipici della seta (Dinerman, A. A., et al., 2002, Biomaterials, 23: 4203-4210), riportano la realizzazione di materiali con caratteristiche di idrogelo.

Lao, U. L., et al. (ref cit.) descrivono la preparazione di idrogeli fisici reversibili a partire da polipeptidi elastino-simili basati sulla sequenza ripetuta della tropoelastina bovina VPGXG, con una struttura detta a tre blocchi idrofobicoidrofilico-idrofobico alternati che conferisce capacità gelificante a soluzioni con una concentrazione critica che, nel caso di questi autori, a temperatura ambiente risulta essere il 6% p/v. Raffreddando il gel, questo si dissolve e il polimero ritorna in soluzione. Gli autori ne propongono l’utilizzo per la chelazione di ioni metallici (cadmio, nello specifico) in soluzione.

Cappello e Ghandehari con altri co-autori descrivono i polipeptidi SELP (Silkelastin-like protein-based polypeptides) la cui struttura comprende insieme alla ripetizione tipica della tropoelastina bovina anche ripetizioni tipiche della proteina della seta in grado di strutturarsi in modo ordinato. In questo modo la macromolecola à ̈ costituita da zone amorfe (elastin-like) alternate a zone ordinate (silk-like) e questa struttura ne induce la gelificazione irreversibile in soluzione mediante controllo di parametri quali concentrazione, temperatura e pH (Dinerman, A. A., et al., ref cit.).

Per quanto riguarda polipeptidi di origine ricombinante basati sul motivo esapeptidico ripetuto VAPGVG della tropoelastina umana, maggior rilievo rivestono i polipeptidi modellati sulla base dell’elastina umana descritti da Keelely. Per tali polipeptidi sono stati descritti materiali derivati sfruttando le proprietà di auto-assemblaggio (Bellingham, C. M., et al., 2003, Biopolymers, 70: 445-55) ottenuti mediante cross-linking chimico, utilizzando come agente reticolante il pirrolochinolina-chinone, un agente che forma legami a distanza minima. Ancora, Keeley e collaboratori (Vieth, S. et al., 2007, Biopolymers, 85: 199-206) descrivono la realizzazione di materiali con alta resistenza meccanica a trazione a partire dai polipeptidi auto assemblanti sopra descritti (Keeley, F. W., U.S. Pat. ref. cit.). Le preparazioni in forma di fogli sono ottenute mediante cross-linking con pirrolochinolina-chinone e genipina di derivazione naturale. Un altro agente reticolante usato per ottenere idrogeli da polipeptidi elastin-like à ̈ l’isocianato di lisina, i cui prodotti di reazione sono ritenuti abbastanza tollerabili (Srokowski, E.M., et al., 2008, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 19: 785-799).

Anche il gruppo di Rodriguez-Cabello ha progettato un polipeptide elastino-simile comprendente anche il motivo ripetuto della tropoelastina bovina VPGXG. Questo polipeptide à ̈ stato utilizzato assieme al collagene per la preparazione di idrogeli dagli autori assieme al gruppo di Pandit (Garcia, Y., et al., 2008, Tissue Eng. Part A., 14, 1-13). In particolare, la reticolazione della miscela collagene- polipeptide viene effettuata enzimaticamente utilizzando una transglutaminasi microbica commerciale.

Ciò nonostante il problema di disporre di sistemi biocompatibili in grado di inglobare cellule mantenendone il fenotipo cellulare e nello stesso tempo permettendone la crescita e la replicazione à ̈ ancora un problema attuale e per il quale tuttora persiste un bisogno.

È quindi un primo scopo della presente invenzione mettere a punto sistemi biocompatibili applicabili nel campo dell’ingegneria tissutale per la coltura ed incapsulazione di cellule in grado di garantirne non solo la sopravvivenza, ma anche il mantenimento delle caratteristiche fenotipiche, la crescita e la replicazione.

È un ulteriore scopo mettere a punto tali sistemi con l’impiego di polipeptidi biomimetici in grado di formare legami stabili e duraturi senza che tali legami siano ottenuti con manipolazioni chimiche, come pure senza che siano necessarie complesse manipolazioni preparative di tali sistemi.

Sommario

Per il perseguimento degli scopi sopra menzionati gli Inventori hanno individuato opportune macromolecole consistenti in polipeptidi elastino-simili derivati dalla sequenza della tropoelastina umana e comprendente quindi la sequenza ripetuta VAPGVG e sequenze comprendenti amminoacidi capaci in opportune condizioni di formare tra di loro legami covalenti stabili, originando in tal modo matrici 3D. In un primo aspetto sono pertanto oggetto della presente invenzione idrogeli o matrici 3D ottenibili per reticolazione crociata enzimatica di almeno un polipeptide elastina umano-simile di sequenza MRGSHHHHHHGSAA(AAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAP GVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIAP)nGV (SEQIDNO:1), dove n à ̈ un numero intero compreso tra 4 e 12, preferibilmente à ̈ compreso tra 6 e 10 e più preferibilmente n à ̈ uguale a 8.

La reticolazione crociata può essere ottenuta tra una lisina (K) ed una glutammina (Q) comprese nelle porzioni di sequenza AAAAAAKAAAKAAQF (SEQIDNO:3 dell’unità monometrica ripetuta (SEQIDNO:2) all’interno di SEQIDNO:1, in particolare rispettivamente in posizione 7 o 11 ed in posizione 14 di SEQIDNO:3. In un secondo aspetto l’invenzione ha per oggetto il metodo di preparazione di tali matrici comprendente almeno gli step di:

- preparare una soluzione acquosa tamponata a pH 8 di polipeptidi elastina umano-simili di SEQIDNO:1 ad una concentrazione scelta nell’intervallo compreso tra 3% e 6% p/v;

- trattare la soluzione acquosa di tali polipeptidi con una soluzione acquosa di transglutaminasi alla concentrazione di 2mg/ml ad una temperatura compresa tra 20°C e 25°C.

Preferibilmente la forza ionica della soluzione dei polipeptidi di SEQIDNO:1 Ã ̈ pari a 0 e comunque non superiore a 150mM.

Opzionalmente il metodo ulteriormente comprende uno step di eliminazione dell’agente tamponante e dell’enzima transglutaminasi per diffusione degli stessi dall’idrogelo immergendo lo stesso in un mezzo acquoso quale acqua, soluzione fisiologica o mezzo di coltura.

Con il metodo di preparazione prima indicato si ottengono dal polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) matrici reticolate caratterizzate da valori del rapporto di stretching (Î1⁄2) del legame C-N (a 1090-1045 cm<-1>) e stretching (Î1⁄2) del legame C-H (a 2940-2840 cm<-1>) (Î1⁄2 (C-N)/Î1⁄2 (C-H)) compresi tra 0,031 e 0,020.

Tali matrici 3D sono inoltre caratterizzate da:

- un modulo conservativo (E’) compreso tra il valore minimo di 1×10<-4>e un valore massimo pari a 3,5×10<-3>MPa per matrici preparate con concentrazioni di polipeptide comprese tra il 3% ed il 6% p/v;

- un fattore di perdita (tanÎ ́ = E’’/E’) compreso tra 0,002 e 0,6 per matrici preparate con concentrazioni di polipeptide comprese tra il 3% ed il 6% p/v

misurati a 37°C ed in ambiente acquoso.

Gli idrogeli o matrici 3D così ottenuti possono essere usati sia come substrati piani su cui seminare e far crescere cellule sia come matrici 3D in cui incapsulare e far crescere cellule.

In questo secondo caso, per l’incapsulazione delle cellule nell’idrogelo oggetto dell’invenzione, le cellule possono essere aggiunte alle soluzioni acquose tamponate dei polipeptidi di SEQIDNO:1 prima dello step di reticolazione enzimatica e le soluzioni di polipeptidi hanno in questo caso una forza ionica fisiologica per aggiunta di 150mM NaCl. Successivamente viene poi addizionata la transglutaminasi e il tutto viene depositato nella sede adatta alla coltura cellulare ed immerso nel mezzo di coltura.

Un aspetto della presente invenzione riguarda infatti la realizzazione di supporti per la coltura di cellule con lo scopo di riprodurre un ambiente di crescita tridimensionale più simile a quello naturale rispetto a quelli a due dimensioni routinariamente utilizzati.

È quindi secondo quest’ultimo aspetto oggetto della presente invenzione l’uso di tali idrogeli o matrici 3D per la coltivazione di cellule per un loro impiego nel campo biomedico sia a scopi di ricerca che nell’ingegneria tissutale.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione à ̈ rappresentato dalla possibilità di incorporare nelle matrici, comprendenti o meno cellule, mediante il metodo descritto, altri composti quali ad esempio molecole farmacologicamente o biologicamente attive. A seconda della natura del composto, questo potrà:

- essere meramente trattenuto (e quindi concentrato all’interno) nella fase liquida di cui la matrice à ̈ permeata con rilascio del composto tale e quale secondo una sua cinetica;

- essere effettivamente incorporato diventando stabilmente parte della matrice stessa.

Gli scopi e i vantaggi delle matrici tridimensionali oggetto della presente invenzione, saranno meglio compresi nel corso della descrizione dettagliata seguente dove, a titolo esemplificativo ma non limitativo dell’invenzione, saranno descritti esempi di idrogeli ottenuti da polipeptidi di SEQIDNO:1 e la loro caratterizzazione chimico-fisica oltre che la compatibilità biologica con cellule isolate ed incapsulate negli stessi.

Breve descrizione delle figure

Figura 1. La figura mostra il profilo di transizione di fase seguito mediante turbidimetria di una soluzione allo 0,2% del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) (qui di seguito indicato come HELP8) in tampone 10mM TRIS/HCl a pH 7,5. (A) ed a pH 8 (B).

Figura 2. La figura mostra la variazione della temperatura di transizione di fase in funzione della concentrazione di polipeptide HELP8in soluzione 10mM TRIS/HCl pH 8 (â—‹) oppure in soluzione 10mM TRIS/HCl pH 8 150mM NaCl (â— ).

Figura 3. La figura mostra le analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) di matrici 3D al 5% HELP8ottenute per reticolazione enzimatica con transglutaminasi in assenza (A) e in presenza di 150mM NaCl (B).

Figura 4. La figura mostra l’analisi elettroforetica di campioni di 5% HELP8in 10mM TRIS/HCl pH 8 trattati con transglutaminasi e prelevati a diversi tempi. In (A) si vede il risultato dell’esperimento effettuato a temperatura ambiente, in (B) lo stesso esperimento condotto a 37°C.

Figura 5. La figura mostra le analisi al SEM di sezioni trasversali di matrici 3D al 3% (A), 5% (B) e 6% (C) HELP8che evidenziano la struttura interna. Ingrandimento 500x.

Figura 6. La figura mostra l’andamento del modulo conservativo in funzione della frequenza negli 11 cicli di sollecitazione ai quali i campioni di matrici 3D ottenute con concentrazione di HELP8pari al 5% sono stati sottoposti (A) ed i valori medi e deviazione standard del modulo conservativo (E’) degli stessi campioni relativi al ciclo 1, 6 e 11 (B).

Figura 7. La figura mostra l’andamento del modulo conservativo in funzione della frequenza negli 11 cicli di sollecitazione ai quali i campioni di matrici 3D ottenute con concentrazione di HELP8pari al 6% sono stati sottoposti.

Figura 8. La figura mostra i valori medi e deviazione standard del modulo conservativo (E’) dei campioni di matrici 3D ottenute con concentrazione di HELP8pari al 6% relativi al ciclo 1, 6 e 11 (A) ed i i valori medi e deviazione standard del fattore di perdita (tanÎ ́ = E’’/E’) degli stessi campioni relativi al ciclo 1, 6 e 11 (B).

Figura 9. La figura mostra i valori medi e deviazione standard dei valori di assorbimento di acqua e successiva degradazione per campioni di matrici 3D ottenute con concentrazione di HELP8pari al 5% (â— ) e al 6% (â– ).

Figura 10. La figura mostra i valori medi e deviazione standard dei valori di assorbimento di acqua per matrici 3D ottenute con concentrazione di HELP8pari al 5% entro 400 minuti (A) e fino a 1500 minuti (B).

Figura 11. La figura mostra i valori medi e deviazione standard dei valori di assorbimento di acqua per matrici 3D ottenute con concentrazione di HELP8pari al 6% entro 12 minuti (A) ed i valori medi e deviazione standard dei valori di assorbimento di acqua e successiva degradazione per gli stessi campioni fino a 1500 minuti (B).

Figura 12. La figura mostra l’andamento nel tempo della crescita cellulare della linea cellulare HepG2 su plastica standard trattata (A) e su matrice 3D di HELP8al 5% (B) a diversi tempi dopo la semina.

Figura 13. La figura mostra un esempio di saggio proliferativo effettuato con cellule HepG2 seminate su plastica standard trattata e su matrice 3D di HELP8al 5% lungo un periodo di 10 giorni (240 ore).

Figura 14. La figura mostra una colonia di cellule HepG2 trasferita su plastica standard trattata dopo aver proliferato per una settimana su matrice 3D di HELP8al 5% (A) e la stessa colonia dopo ulteriori 12 giorni di coltura (B).

Figura 15. La figura mostra le cellule MCF-7 a una settimana dalla semina su plastica standard trattata (A) e su matrice 3D HELP8al 5% (B).

Figura 16. La figura mostra le cellule MCF-724 ore dopo l’incapsulazione (A) e 168 ore dopo l’incapsulazione (B) in una matrice di HELP8al 3%.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Definizioni

Per la rappresentazione degli amminoacidi formanti le sequenze à ̈ stata utilizzata la nomenclatura standard IUPAC o il codice a singola lettera.

Con elastina si intende la proteina naturalmente organizzata e derivata dalla tropoelastina. Con tropoelastina umana ci si riferisce in particolare alle due isoforme a e d (GenBank Accession No NP_000492.2 e NP_001075223) che sono i prodotti espressi dal gene ELN (GenBank, Gene ID: 2006) in cui à ̈ presente la seguente sequenza ripetitiva:

-AAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGV GVAPGVGVAPGI-.

Il termine ELP (Elastin-Like Polypeptide) Ã ̈ qui di seguito utilizzato per indicare genericamente polipeptidi elastino-simili consistenti in polipeptidi comprendenti le sequenze ripetute di elastina e tropoelastina, aventi caratteristiche di coacervazione.

HELP (Human-Elastin-Like Polypeptide) à ̈ qui di seguito utilizzato per indicare i polipeptidi elastina umano-simili su cui si basano gli idrogeli o matrici 3D oggetto dell’invenzione. Tali polipeptidi sono ottenuti dal gene che codifica per la proteina artificiale basata sul motivo esapeptidico ripetuto dell’elastina umana VAPGVG come descritto da Bandiera A., et al., 2005, Biotechnol. Appl. Biochem., 42: 247-256. La sequenza dei polipeptidi HELP à ̈ la seguente:

MRGSHHHHHHGSAA(AAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAP GVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIAP)nGV (SEQIDNO:1) dove n à ̈ un numero intero compreso tra 4 e 12, preferibilmente à ̈ compreso tra 6 e 10 e più preferibilmente à ̈ 8. In tali polipeptidi di SEQIDNO:1 la sequenza AAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVG VAPGVGVAPGIAP (SEQIDNO:2) costituisce l’unità monomerica ripetuta contenente sia il domino di cross-linking che il dominio da cui derivano le proprietà tipiche dei polipeptidi ELP. Quando tale unità monometrica di SEQIDNO:2 à ̈ ripetuta 8 volte, il polipeptide à ̈ indicato come polipeptide di SEQIDNO1 (n=8) o anche HELP8.

In particolare, la sequenza AAAAAAKAAAKAAQF (SEQIDNO:3) dei polipeptidi HELP costituisce il dominio (c.d. dominio di cross-linking) in cui la reazione di reticolazione crociata si realizza, essendo una delle due lisine (K) in posizione 7 o 11 secondo la SEQIDNO:3 presenti in un dominio di cross-linking dei polipeptidi HELP e la glutammina (Q) in posizione 14 secondo la SEQIDNO:3 di un secondo dominio di cross-linking dei polipeptidi HELP gli amminoacidi che possono formare legami covalenti stabili mediante una reazione catalizzata. Tali legami possono formarsi tra domini di cross-linking di molecole diverse di polipeptidi o possono anche formarsi intracatena tra domini di cross-linking della stessa molecola di polipeptide. Le caratteristiche elastino-simili dei polipeptidi sono invece date dalla porzione di sequenza ripetuta GLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIAP

(SEQIDNO:4), comprendendo questa il motivo ripetuto esapeptidico VAPGVG (SEQIDNO:5) tipico dell’elastina umana.

Per idrogel o idrogeli si intendono strutture semisolide idratate in grado di mantenere forma e dimensione quando non soggette a deformazione.

Per matrici 3D o tridimensionali si intendono strutture solide (non idratate) o semisolide (idratate) in grado di mantenere forma e dimensione quando non soggette a deformazione. Di conseguenza i termini idrogeli o matrici 3D o semplicemente matrici devono essere considerati equivalenti, essendo sostanzialmente costituiti entrambi da reticoli formati da polipeptidi HELP di SEQIDNo:1 per reticolazione enzimatica.

Per incapsulazione o microincapsulazione si intende il processo di inclusione di materiale, biologico o meno, all’interno di idrogeli o matrici 3D sia solide che semisolide.

Descrizione

L’invenzione riguarda la realizzazione, mediante reticolazione enzimatica, di matrici 3D basate su polipeptidi elastino-simili HELP di SEQIDNO:1 con caratteristiche determinate per quanto riguarda le proprietà fisiche, in particolare strutturali e meccaniche, capaci di renderle adatte ad un uso preferibilmente come supporto a cellule mantenendone la vitalità, fenotipo e le capacità proliferative. Come già ampiamente riportato nello Stato dell’arte sono noti diversi metodi di preparazione di idrogeli da polipeptidi ELP ottenuti formando una rete fra polipeptidi o tra le catene dello stesso polipeptide, in particolare a livello dei domini di cross-linking contenenti lisine e glutammina (vedi per esempio Vrhovski, B. and Weiss, A.S., 1998, ref. cit.). La formazione di tali idrogeli viene ottenuta sostanzialmente mediante una messa in fase tra le catene polipeptidiche a livello di questi domini, in modo che lisine e glutammine vengano a trovarsi in posizione favorevole per la formazione di un legame covalente. In particolare, uno degli enzimi che può catalizzare la formazione di tale legame à ̈ la transglutaminasi, la cui reazione catalizzata in ambiente acquoso dà origine ad un ponte ε-(γglutamil)lisina secondo il seguente schema:

Gln-(CH2)2-CONH2+2HN-(CH2)4-Lys → Gln-(CH2)2-COHN-(CH2)4-Lys NH3Considerando la sequenza primaria dei polipeptidi HELP di SEQIDNO:1, si osserva che sia la lisina (K) che la glutammina (Q) sono presenti nella sequenza AAAAAAKAAAKAAQF (SEQID:NO:3) dell’unità monometrica ripetuta (SEQIDNO:2) e che tale sequenza può quindi costituire un dominio di cross-linking per un polipeptide HELP, in quanto una analoga reazione di formazione di un ponte ε-(γ-glutamil)lisina potrebbe verificarsi tra una glutammina di un dominio di cross-linking AAAAAAKAAAKAAQF (SEQIDNO:3) ed una lisina di un secondo dominio di cross-linking AAAAAAKAAAKAAQF (SEQIDNO:3) di un altro polipeptide HELP di SEQIDNO:1.

Ciò nonostante, benché la formazione di legami covalenti tra una lisina ed una glutammina di due differenti domini di cross-linking sia plausibile, come pure può essere plausibile che durante il processo di reticolazione, in una qualche misura, si possano formare anche legami intracatena su uno stesso polipeptide, non necessariamente tali processi di reticolazione possono portare alla formazione di idrogeli aventi caratteristiche biofisiche adeguate all’uso previsto, potendo determinare la reazione di cross-linking matrici con zone disomogenee per quanto riguarda la struttura, che si ripercuotono in ultima analisi sulle proprietà meccaniche. In particolare, à ̈ importante assicurare l’uniformità sia per quanto riguarda la forma esteriore della matrice, a livello macroscopico, che per quanto riguarda la struttura e la porosità interne. Zone a maggiore o minore compattamento, oltre ad alterare la forma della matrice che si ottiene, provocano anche discontinuità nella distribuzione della soluzione acquosa di cui la matrice stessa può essere permeata quando à ̈ sostanzialmente in forma di idrogel.

La realizzazione di una struttura “a spugna†adeguatamente porosa, che costituisca un ambiente uniformemente permeabile in ogni sua parte da una fase acquosa, deve essere accompagnata anche da un adeguato grado di elasticità della struttura che, qualora sottoposta a stimolo meccanico, deve poter ritornare pressoché nello stato iniziale senza subire deformazione residua significativa. Allo scopo di ottenere matrici 3D con caratteristiche adeguate, e cioà ̈ essenzialmente a struttura il più possibile omogenea, sia per quanto riguarda la forma in toto della matrice che si ottiene che a livello microstrutturale, si à ̈ perseguita la via della reticolazione enzimatica, in opportune condizioni di reazione, per evitare l’utilizzo di reagenti chimici potenzialmente tossici e nocivi o comunque inadeguati per gli usi previsti.

Il grado di reticolazione dipende infatti da molte variabili, tra cui le principali sono: i) la concentrazione del polipeptide; ii) pH e forza ionica delle soluzioni; iii) la temperatura a cui avviene la reazione. Inoltre entrano in gioco variabili che influiscono anche sul grado di aggregazione del polimero quali: iv) la quantità di enzima impiegato ed v) il tempo di reazione.

Per gli scopi dell’invenzione le condizioni di preparazione per ottenere matrici, aventi caratteristiche di tridimensionalità, porosità, proprietà meccaniche e rapporto superficie/volume adeguate per fare da supporto alla crescita di cellule, da polipeptidi HELP sono le seguenti:

- concentrazione di polipeptidi HELP di SEQIDNO:1 comprese nell’intervallo tra il 3% ed il 6% p/v;

- solvente: soluzioni acquose tamponate a pH 8;

- enzima: soluzione 60mg/ml di transglutaminasi, preferibilmente microbica commerciale, utilizzata in diluizione 1:30 (= 2mg/ml);

- forza ionica: compresa tra 0 e 150mM NaCl;

- temperatura: 20-25°C.

Qualora le matrici 3D secondo l’invenzione siano usate come carrier per l’incapsulazione di cellule e/o di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive alle soluzioni acquose di polipeptidi di SEQIDNO:1 sono ulteriormente aggiunti tali cellule e/o sostanze attive.

Tali condizioni si sono dimostrate essenziali, come sarà più evidente nella parte sperimentale qui di seguito riportata, per ottenere idrogel o matrici 3D con le caratteristiche biofisiche volute ed adatte a garantire che tali matrici possano essere impiegate come supporto per la crescita cellulare e per l’incapsulamento delle cellule stesse.

Relativamente alle caratteristiche degli idrogeli ottenuti da polipeptidi HELP, in particolare quando n nella SEQIDNO:1 à ̈ uguale a 8, à ̈ stato verificato, infatti, che una matrice di consistenza adeguata, quale supporto per la crescita cellulare in grado di mostrare capacità di recupero elastico, può essere ottenuta con soluzioni di HELP nell’intervallo di concentrazioni tra il 3% ed il 6% (peso/volume). Utilizzando concentrazioni minori del 3% non si riesce ad ottenere una matrice di consistenza manipolabile e che mantenga una forma tridimensionale, in quanto il reticolato tende a collassare su se stesso, con conseguente esclusione dell’acqua. Oltre il 6%, le matrici che si ottengono mostrano una struttura tridimensionale troppo compatta e meno omogenea.

Soluzioni della sola proteina artificiale di SEQIDNO:1 (n=8) in acqua bi-distillata sono risultate avere un pH compreso fra 7,2 e 7,3 dunque molto vicino al fisiologico. Tuttavia, si à ̈ visto che la transizione di fase del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) à ̈ un processo che presenta una sua specifica criticità. Infatti, l’analisi turbidimetrica di soluzioni diluite di polipeptide ha messo in risalto che anche leggere variazioni di pH possono dare luogo ad un’aggregazione disomogenea particolarmente stabile e difficilmente reversibile all’interno della soluzione, come accade utilizzando un tampone a pH 7,5. Stabilizzando la soluzione a pH 8 con tampone TRIS/HCl, si evidenzia per il polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) il comportamento di tipo elastino-simile voluto, con una transizione di fase piuttosto rapida e una buona reversibilità di questo processo come mostrato nella parte sperimentale.

Inoltre la presenza di tampone favorisce una più elevata riproducibilità evitando l’eventuale acidificazione del mezzo dovuta all’azione dell’enzima.

Oltre al pH, particolarmente significativa nella reazione di reticolazione con polipeptidi HELP di SEQIDNO:1 Ã ̈ la forza ionica.

Per la preparazione delle soluzioni acquose di polipeptidi di SEQIDNO:1 à ̈ preferibile l’utilizzo di soluzione tampone di TRIS/HCl 10mM aventi una forza ionica uguale a 0 o al massimo sino a 150mM, in cui il sale à ̈ NaCl. In queste condizioni infatti si evita di interferire con l’auto-assemblamento dei polipeptidi nella soluzione di partenza e la reazione di reticolazione risulta più rapida. Sono da preferirsi pertanto soluzioni acquose di HELP tamponate a pH 8 con TRIS/HCl senza alcuna aggiunta di sali per la preparazione delle matrici su cui, in un secondo momento, verranno seminate le cellule.

Nel caso invece sia prevista l’incapsulazione di cellule contestualmente alla preparazione delle matrici stesse, allora à ̈ preferibile l’utilizzo di soluzioni con 150mM NaCl per evitare uno stress eccessivo alle cellule ed una conseguente perdita di vitalità cellulare.

La concentrazione di transglutaminasi di 2mg/ml à ̈ stata scelta poiché si à ̈ osservato sperimentalmente che a questa concentrazione di enzima e per le soluzioni di HELP8più concentrate (5% e 6%) la reazione si completava in 15’-20’. Circa la temperatura le condizioni più favorevoli sono rappresentate da temperature comprese tra 20°C e 25° C, nonostante temperature superiori (28°C-37°C) siano ottimali per l’azione dell’enzima.

In definitiva, i risultati sperimentali hanno evidenziato la possibilità di ottenere effettivamente materiali con le caratteristiche di idrogel stabile volute a partire da soluzioni acquose di HELP di SEQIDNO:1. Inoltre à ̈ risultato ben evidente che differenze nelle condizioni in cui avviene la gelificazione si riflettono sulle sue proprietà e sulla struttura del materiale che viene ottenuto, sia a livello macro che microscopico.

Pertanto gli idrogeli o le matrici 3D secondo l’invenzione possono essere preparati miscelando tra di loro soluzioni acquose tamponate a pH 8 con TRIS/HCl di almeno un polipeptide di SEQIDNO:1 in concentrazioni comprese tra 3% e 6% p/v, a forza ionica compresa fra 0 e 150mM e soluzioni acquose di transglutaminasi alla concentrazione di 2mg/ml a temperatura ambiente. Le due soluzioni acquose contenenti tale polipeptide di SEQIDNO:1 HELP e la transglutaminasi rispettivamente sono velocemente mescolate tra di loro e quindi tutta la soluzione derivante à ̈ posta in un adeguato recipiente e lasciata a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.

Una volta preparata, la matrice può essere conservata in soluzione acquosa (acqua, soluzione fisiologica, mezzo di coltura, etc). Tipicamente, questo passaggio favorisce la diffusione dell’enzima ed altri agenti impiegati per la reazione di reticolazioni quali ad esempio agenti tamponanti all’esterno della matrice che viene quindi facilmente rimosso sostituendo il mezzo acquoso.

Infatti, benché la loro presenza non influisca sulle caratteristiche dell’idrogel né sulle cellule eventualmente seminate sopra o incapsulate, sia l’enzima che l’agente tamponante possono essere eliminati dagli idrogeli così ottenuti, quando si voglia utilizzarli come supporto per crescita cellulare. In questo caso, per escludere eventuali e non prevedibili effetti dovuti alla presenza dell’enzima sulle cellule, prima della semina delle stesse, la matrice può essere lasciata da 3 a 18 ore in mezzo fisiologico o di coltura, per favorire la diffusione all’esterno e quindi la rimozione dell’enzima stesso. In alternativa, per una conservazione a lungo termine, la matrice può essere conservata a secco, previa liofilizzazione.

Il metodo di preparazione oggetto dell’invenzione si à ̈ dimostrato adeguato per quanto attiene alla formazione di un legame covalente ε-(γ-glutamil)lisina mediante reazione catalizzata dalla transglutaminasi e per l’ottenimento di idrogeli o matrici 3D aventi adeguata tridimensionalità e comportamento dinamicomeccanico.

Infatti, con la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier in modalità di riflessione totale attenuata (ATR-FTIR) per il polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) si à ̈ potuto verificare che il grado di reticolazione, misurato come rapporto di stretching (Î1⁄2) del legame C-N (a 1090-1045 cm<-1>) e stretching (Î1⁄2) del legame C-H (a 2940-2840 cm<-1>) (Î1⁄2 (C-N)/Î1⁄2 (C-H)), per le diverse concentrazioni del polipeptide di SEQIDNO:1 HELP8, ha un andamento lineare e le matrici 3D ottenute sono caratterizzate da valori di Î1⁄2 (C-N)/Î1⁄2 (C-H) compresi tra 0,031 e 0,020.

Tali matrici, preparate con soluzioni acquose in concentrazioni di HELP8comprese tra 3 e 6%, hanno inoltre dimostrato di avere: a) un modulo conservativo (E’) compreso tra il valore minimo di 1×10<-4>e un valore massimo pari a 3,5×10<-3>MPa; b) un fattore di perdita (tanÎ ́ = E’’/E’) compreso tra 0,002 e 0,6 misurati a 37°C ed in ambiente acquoso.

Il comportamento evidenziato dalle analisi dinamico-meccaniche a compressione degli idrogeli con concentrazione di HELP8compresa tra 3 e 6% risulta essere fortemente influenzato dall’organizzazione strutturale. In particolare, mentre per le matrici al 6% di HELP8il contributo della componente elastica aumenta all’aumentare della frequenza di sollecitazione, per quelle a minore concentrazione di HELP si osserva un contributo della componente elastica costante, indipendente dalla frequenza di sollecitazione. Questa differenza di comportamento meccanico si riflette anche in una differente capacità e velocità di recupero della forma al termine dell’applicazione della sollecitazione imposta.

Gli idrogeli o matrici 3D secondo l’invenzione si sono dimostrati adatti ad essere impiegati come supporti per la coltura di cellule, in quanto come mostrato nella parte sperimentale sono di garantire la sopravvivenza e le caratteristiche fenotipiche delle cellule che supportano. Tali supporti si prefigurano particolarmente adatti per far crescere determinati tipi cellulari che fisiologicamente aderiscono a strutture contenti elastina, come ad esempio fibroblasti, cellule muscolari lisce, condrociti, cheratinociti, osteociti, ma anche cellule staminali. Le cellule seminate su questo tipo di supporti possono proliferare sulla superficie, ma possono eventualmente anche penetrare ed infiltrarsi per proliferare all’interno. Le modalità di semina delle cellule sopra le matrici 3D preparate con i polipeptidi di SEQIDNO:1, piuttosto che di incapsulamento nelle stesse durante la preparazione di tali matrici, dipendono quindi sostanzialmente dalle necessità operative e dal tipo di impiego previsto per la coltura cellulare.

Su questa base si può quindi prefigurare l’uso di tali supporti:

- in vitro, per scopi biotecnologici e di ricerca, quali mimetici dell’ambiente cellulare fisiologico alternativo a materiali tradizionalmente utilizzati; - in vivo, come supporti adatti ad essere infiltrati da cellule endogene ai fini di rigenerazione/ricostruzione/aumento di tessuti o come supporti adatti a veicolare cellule esogene sempre per gli stessi fini.

Parte sperimentale

Esempio 1: preparazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8

Il polipeptide à ̈ stato preparato come descritto da Bandiera A., et al., 2005, Biotechnol. Appl. Biochem., 42: 247-256. Il gene sintetico che codifica per HELP8à ̈ stato introdotto nel vettore pQE-8 (Qiagen) ed il vettore così ottenuto à ̈ stato verificato mediante sequenziamento standard. HELP viene espresso nel ceppo batterico di E. coli NEB Express I<q>co-trasformato col vettore pLysS. L’espressione viene indotta con 0,1mM IPTG ed i batteri vengono raccolti tipicamente dopo 4 ore. Le cellule vengono lisate in condizioni native (20mM TRIS/HCl pH 8, 100mM NaCl, 0,1mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoetanolo, 0,1 mM PMSF, 0,1% (v/v) Tween 20) mediante sonicazione. Dopo centrifugazione a freddo (5°C), dal sopranatante reso 1,5M NaCl viene fatto precipitare a caldo (42°C) il polipeptide HELP8sfruttando la sua proprietà di transizione di fase. Il precipitato viene raccolto per centrifugazione a caldo (37°C) e rispeso in acqua fredda. Tipicamente vengono fatti 3 cicli di questo tipo. Dopo l’ultima risospensione in acqua, la soluzione contenente HELP viene portata a secco mediante liofilizzazione.

Esempio 2: preparazione di matrici 3D dal polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8Tipicamente, viene preparata una soluzione 50mg/ml di HELP8a partire dal polipeptide liofilizzato che viene pesato, posto in un recipiente adeguato e risospeso nel volume opportuno di una soluzione tamponata 10mM TRIS/HCl a pH 8 per ottenere la concentrazione voluta di HELP8, mantenendo a freddo (in ghiaccio) la soluzione per un tempo di 15 minuti. La soluzione viene prelevata, lasciata raggiungere la temperatura ambiente (tipicamente 20-25°C) e poi addizionata della soluzione dell’enzima. L’enzima utilizzato à ̈ una transglutaminasi (TGasi) commerciale di origine batterica (Bacterial Transglutaminase, N-Zyme BioTec GmbH) con cui à ̈ stata preparata una soluzione acquosa concentrata di 60mg/ml che viene usata in diluizione 1:30 per la reazione (pertanto la concentrazione di lavoro dell’enzima à ̈ 2mg/ml).

Immediatamente dopo l’addizione dell’enzima, tutta la soluzione viene velocemente mescolata e colata nel recipiente stampo e lasciata a temperatura ambiente per almeno 30’. La matrice ottenuta può essere conservata in soluzione acquosa (acqua, soluzione fisiologica, mezzo di coltura, etc). o può essere conservata a secco, previa liofilizzazione.

Esempio 3: caratterizzazione delle condizioni per la reazione di reticolazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8per la preparazione delle matrici 3D A. pH

La transizione di fase del polipeptide à ̈ stata studiata su soluzioni acquose di HELP8non trattate con transglutaminasi mediante turbidimetria seguendo il cambiamento dell’assorbanza della soluzione a 350nm mediante uno spettrofotometro Varian DMS80 UV-vis munito di cella termostatabile ad una velocità di riscaldamento di 1°C/min. Per l’esperimento à ̈ stata impiegata la concentrazione di HELP8al 0,2% per ovviare ad eventuali artefatti dovuti alla nonlimpidità delle soluzioni.

In figura 1, sono riportati i profili di transizione di fase per soluzioni allo 0,2% di HELP8:

- a pH 7,5 (figura 1, A), si evidenzia un processo non uniforme in cui l’aggregazione inizia in modo graduale per una piccola frazione di polipeptide e poi procede più velocemente fino a terminare nella formazione di aggregati macroscopici. Probabilmente ciò à ̈ dovuto ad un’aggregazione disomogenea anche se particolarmente stabile all’interno della soluzione, visto che risulta oltretutto difficilmente reversibile;

- a pH 8 (figura 1, B), il profilo à ̈ risultato molto più simile a quelli riportati in letteratura per i polimeri ELP.

B. Forza ionica

Nella figura 2, à ̈ riportata la temperatura di semitransizione di HELP8in funzione della sua concentrazione in soluzioni acquose non trattate con transglutaminasi, ovvero la temperatura alla quale metà del polipeptide risulta in stato aggregato, determinata mediante turbidimetria in funzione della concentrazione del polimero stesso e rispettivamente nelle due condizioni di assenza (â—‹) e presenza (â— ) di 150mM NaCl. Queste misure hanno evidenziato un comportamento anomalo rispetto quello descritto per i polimeri ELP in generale. Per questi ultimi, all’aumento della forza ionica corrisponde un abbassamento della temperatura di transizione di fase della macromolecola (Luan, C.H., et al., ref cit.). Per soluzioni di HELP a bassa concentrazione ovvero tra 0,05 e 0,5% e in condizioni di forza ionica tra 0 e 150mM, si à ̈ osservato un comportamento inaspettato, in quanto l’aggiunta di NaCl aumenta la temperatura di transizione del polipeptide anziché abbassarla, come si evince dai risultati sperimentali (figura 2). Ciò probabilmente indica una specifica capacità di auto-assemblamento delle catene polipeptidiche che conferisce un determinato ordine alla struttura.

Infatti, sperimentalmente si à ̈ visto che l’aggiunta di 150mM di NaCl durante la preparazione delle matrici per reticolazione con transglutaminasi dà origine a matrici la cui struttura interna à ̈ molto meno omogenea, come evidenziato dalle immagini al microscopio elettronico a scansione (figura 3) in cui si vede l’aspetto della struttura interna di matrici di HELP8al 5% la cui reticolazione à ̈ stata effettuata a temperatura ambiente, in assenza (A) o presenza (B) di 150mM NaCl . C. Concentrazione dell’enzima

Nella figura 4 à ̈ stata seguita mediante elettroforesi SDS-PAGE l’azione dell’enzima transglutaminasi su HELP8al 5% in Tris/HCl 10mM pH 8 a temperatura ambiente, bloccandone l’azione a diversi tempi con l’aggiunta di solvente campioni denaturante per elettroforesi (A). Le catene, da libere nella situazione iniziale, col procedere della reazione vengono bloccate in reticoli a peso molecolare più alto che non possono più migrare nel gel. La presenza in tutti i pozzetti della transglutaminasi testimonia che eventuali molecole proteiche libere sarebbero state pure rilevate e la scomparsa di HELP8non à ̈ dovuta ad artefatti del metodo ma effettivamente dovuta all’incorporazione nel reticolo che si forma. A temperatura ambiente, questo processo à ̈ quasi completo entro 5’ come si vede in figura 4 (A), sicuramente completo dopo 10’.

D. Temperatura

La temperatura ambiente (20-25°C) à ̈ risultata la condizione più favorevole per la preparazione delle matrici, come evidenziato in figura 4. In particolare, in (B) si vede il risultato di un esperimento esattamente identico al precedente, ma condotto a 37°C piuttosto che a temperatura ambiente. Si può vedere come, a parità di tempo, rimanga più polipeptide libero quando l’enzima viene fatto agire a 37°C. Ciò indica chiaramente che a questa temperatura la reticolazione à ̈ meno efficace a causa dell’induzione della separazione di fase del polipeptide che ostacola l’accesso dell’enzima ai siti di reticolazione.

Esempio 4: caratterizzazione al microscopio elettronico a scansione della struttura delle matrici solide ottenuti dalla reticolazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8

Per tale analisi le matrici subito dopo la preparazione sono state congelate a -20°C e poi portate a secco mediante liofilizzazione. I campioni così ottenuti sono stati sezionati con una lametta, montati sugli appositi supporti per microscopia e rivestiti da un film metallico. L’analisi à ̈ stata effettuata mediante microscopio a sistema integrato Leica Stereoscan 430i per microscopia elettronica a scansione. Sono state preparate matrici al 3, 5 e 6% di HELP8nelle condizioni descritte all’esempio 2.

In tutti e tre i casi, si ottiene un materiale a struttura omogenea, di aspetto spugnoso, che occupa tutto il volume dello stampo in cui à ̈ stata effettuata la reticolazione e con pori di diverse dimensioni, comunque dell’ordine dei micrometri. Le strutture rilevate sono visibili a diverso ingrandimento nelle microfotografie di figura 5. Con questa analisi, all’aumentare della percentuale di polipeptide impiegata, si evidenzia un restringimento delle cavità presenti a cui si accompagna un progressivo ispessimento delle pareti che le delimitano.

Esempio 5: caratterizzazione degli idrogeli ottenuti dalla reticolazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8mediante analisi dinamico-meccaniche (DMA) a compressione

Per la valutazione delle proprietà dinamico-meccaniche delle matrici di HELP8ottenute per reticolazione con transglutaminasi sono state eseguite analisi mediante analizzatore DMA (Dynamic Mechanical Analyzer, modello 2980, TA Instruments) applicando una sollecitazione in compressione a 37°C con rampa di frequenza compresa tra 0.5 e 5 Hz. Le matrici sono state preparate con concentrazione di HELP8pari al 5 e al 6% come descritto all’esempio 2. Per ogni matrice le prove sono state eseguite in triplicato.

Ai campioni, sottoposti ad analisi dinamico-meccaniche in compressione a 37°C e mantenuti in ambiente acquoso per l’intera durata della prova, à ̈ stata applicata prima un’isoterma per 5 minuti a 37°C, successivamente una sollecitazione in compressione con ampiezza di oscillazione pari a 20 µm, precarico 0,05 N con una rampa di frequenza compresa tra 0,5 e 5 Hz (0,5, 1, 2, 3, 4, 5 Hz), compiendo 11 cicli di compressione.

Le matrici mostrano un modulo conservativo (E’) compreso tra il valore minimo di 7×10<-4>e un valore massimo pari a 3,5×10<-3>MPa ed un valore di fattore di perdita (tanÎ ́, dato dal rapporto E’’/E’) compreso tra 0,002 e 0,6.

A. Matrici al 5% di HELP8

Nella figura 6 A à ̈ mostrato l’andamento del modulo conservativo (E’) in funzione della frequenza negli 11 cicli di sollecitazione ai quali i campioni sono stati sottoposti. Si nota come, al crescere della frequenza di analisi e al crescere del numero di cicli ai quali il campione à ̈ sottoposto il valore del modulo conservativo E’ rimanga in un intervallo di valori limitato, evidenziando come il contributo elastico rimanga costante nel corso della prova.

Ciò à ̈ anche confermato dai valori di modulo conservativo al primo, sesto e undicesimo ciclo di sollecitazione (nessuna differenza significativa). Nella figura 6 B sono mostrati i valori medi e deviazione standard del modulo conservativo dei campioni di HELP al 5% relativi al ciclo 1, 6 e 11.

B. Matrici al 6% di HELP8

Le medesime analisi dinamico-meccaniche sono state effettuate per i campioni a concentrazione di HELP8pari al 6%. Nella figura 7 à ̈ illustrato l’andamento del modulo conservativo (E’) in funzione della frequenza negli 11 cicli di sollecitazione. Si può notare come al crescere della frequenza di analisi e al crescere del numero di cicli ai quali il campione à ̈ sottoposto aumenti il valore del modulo conservativo, significativo di un maggiore contributo della componente elastica all’aumentare della frequenza di sollecitazione.

Nella figura 8 sono riportati i valori medi e deviazione standard del modulo conservativo (E’) (A) e del fattore di perdita (tanÎ ́) (B) dei campioni con concentrazione di HELP8pari al 6% relativi al ciclo 1, 6 e 11. E’ possibile osservare come nel primo ciclo di sollecitazione il valore del modulo conservativo aumenta, all’aumentare della frequenza di sollecitazione, mentre non si riscontrano differenze significative tra il sesto e l’undicesimo ciclo a nessuna delle frequenze di sollecitazione.

Esempio 6: caratterizzazione delle matrici 3D ottenute dalla reticolazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8mediante analisi di rigonfiamento (water uptake) e perdita di peso

Le matrici disidratate di HELP8reticolate con transglutaminasi, quando sottoposte a prove di rigonfiamento in acqua distillata a temperatura ambiente, mostrano a plateau un valore di rigonfiamento (water uptake, W.U.) massimo calcolato come da formula (1), compreso tra 1000 e 3000%. Raggiunto il plateau di assorbimento, le matrici mostrano una perdita di peso dipendente dalla concentrazione di HELP impiegata per l’ottenimento delle matrici stesse.

PW.U.%= w<−>P d ⋅ 100 formula (1)

P d

dove:

- W.U.% = rigonfiamento (water uptake) percentuale

- Pw= peso del provino rigonfiato

- Pd= peso del provino secco.

Sono state eseguite prove di water uptake e successiva degradazione su matrici ottenute con concentrazione di HELP pari al 5 e 6%. Le prove sono state eseguite in triplicato, in acqua distillata a temperatura ambiente pesando i campioni a differenti tempi di prova (5, 10, 15, 30 minuti, 1, 2, 3, 4, 6, 8, e 24 ore). Per ogni tempo di prova à ̈ stata calcolata la variazione ponderale rispetto al peso di ciascun campione a secco al tempo iniziale utilizzando la formula (1).

Nella figura 9 vengono mostrati gli andamenti di assorbimento di acqua e successiva degradazione nel tempo delle due matrici di HELP8considerate. Sono riportati i valori medi e la deviazione standard dei valori di assorbimento di acqua e la successiva degradazione per le matrici ottenute con una concentrazione di HELP8pari al 5% (â— ) e al 6% (â– ).

Nella figura 10, in A sono riportati i valori medi e deviazione standard dei valori di assorbimento di acqua delle matrici ottenute con concentrazione di HELP8pari al 5%, relativi al primo tratto della curva (entro 400 min) che riguarda il raggiungimento del massimo assorbimento, avvenuto dopo 360 minuti. Dopo questo tempo, come si può vedere in B, dopo il raggiungimento del massimo assorbimento, si osserva un leggero calo ponderale, dovuto probabilmente ad una perdita di coesione del materiale.

Similmente, nella figura 11, per quanto riguarda le matrici ottenute con concentrazione di HELP8pari al 6%, in A à ̈ mostrato il primo tratto della curva che riguarda il raggiungimento del massimo assorbimento, avvenuto dopo 10 minuti. In seguito, come si può vedere in B, si osserva un rapido calo ponderale fino ad arrivare a plateau intorno ad un valore pari al 500% di variazione ponderale dopo 24 ore di prova, indicativo di una significativa perdita di coesione del materiale. Esempio 7: caratterizzazione mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier delle matrici 3D ottenute dalla reticolazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8

Le matrici di HELP8reticolate con transglutaminasi, liofilizzate (essiccate fino a raggiungimento di peso costante), quando analizzate mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier in modalità di riflessione totale attenuata (ATR-FTIR) mostrano uno spettro differente rispetto a quello dell’HELP8non trattato con l’enzima.

Un indice del grado di reticolazione può essere espresso come rapporto tra la banda attribuita allo stretching del legame C-N (a 1090-1045 cm<-1>) del gruppo amminico primario e la banda attribuita allo stretching del legame C-H (a 2940-2840 cm<-1>), preso come riferimento. Come da aspettarsi, a seguito della reazione di reticolazione per azione dell’enzima, il valore di tale rapporto diminuisce di un ordine di grandezza passando da HELP polipeptide lineare a HELP8reticolato (vedi Tabella 1).

Tabella 1. Valori del rapporto tra stretching (Î1⁄2) del legame C-N e Î1⁄2 del legame C-H, per HELP8non trattato con l’enzima e matrici di HELP8reticolate.

Î1⁄2 (C-N) / Î1⁄2 (C-H)

HELP80,458

Matrice al 3% 0,031

Matrice al 5% 0,027

Matrice al 6% 0,020

Esempio 8: coltura di cellule su supporti di idrogel ottenuti per reticolazione del polipeptide di SEQIDNO:1 (n=8) HELP8

La matrice di HELP8al 5% ottenuta secondo le condizioni descritte à ̈ stata saggiata in qualità di supporto per la crescita di linee cellulari. Tutte le prove sono state fatte in triplicato.

Il polipeptide HELP8à ̈ stato sterilizzato per filtrazione e poi liofilizzato. Il materiale così ottenuto à ̈ stato ridisciolto nel volume necessario di 10mMTris/HCl a pH8 per ottenere la soluzione al 5% che à ̈ stata fatta reticolare utilizzando transglutaminasi pure sterilizzata per filtrazione nei pozzetti di un microtiter sterile. Dopo la preparazione, la matrice può eventualmente essere lasciata immersa in soluzione fisiologica o mezzo di coltura per favorire la diffusione dell’enzima e quindi la sua rimozione prima della semina delle cellule.

Tutti i pozzetti sono stati seminati allo stesso modo, in parallelo, con 5000 cellule HepG2 e sono stati seguiti per 10 giorni senza cambiare mai il terreno, che à ̈ costituito da DMEM completo, addizionato di 10% di siero fetale bovino, penicillina e streptomicina. L’analisi sulla proliferazione cellulare à ̈ stata fatta a tempi predeterminati, in particolare si à ̈ seguito l’andamento a 24, 48, 72, 96, 168, 240 ore, comparando la crescita su 5% HELP8con quella su plastica standard trattata. Ai tempi indicati, dopo la semina, à ̈ stata fatta una valutazione della proliferazione cellulare mediante saggio colorimetrico con WST-1 (Water Soluble Tetrazolium -1, Roche Applied Science).

Questo tipo di prova dà una risposta proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive nelle condizioni sperimentali utilizzate. Le cellule trasformano la molecola, che assorbe molto poco a 450nm, in un composto che ha un picco di assorbimento proprio a questa lunghezza d’onda e che viene liberato nell’ambiente circostante.

Parallelamente, à ̈ stato scelto un campo di cellule cresciute su plastica standard trattata ed uno di cellule cresciute su HELP8per documentarne la morfologia. Come evidenziato nelle figure 12 e 13, le cellule crescono sulla matrice con un avvio più lento, come già riportato in letteratura per altri supporti tridimensionali. Si vede chiaramente mentre le cellule su plastica standard trattata entro i dieci giorni hanno raggiunto lo stato di confluenza, quelle su matrice HELP8entravano nella fase esponenziale. La proliferazione sulla matrice implica per queste cellule una crescita “ad isole†e con una morfologia cellulare più rotondeggiante rispetto quella che si vede sulla plastica standard trattata, come descritto in letteratura. Il supporto non risulta pertanto tossico.

E’ parso interessante verificare quindi il grado di vitalità cellulare delle cellule HepG2 che sono state fatte proliferare su HELP8:dopo una settimana à ̈ stata prelevata una delle colonie a forma di “isola†che formatasi sulla matrice che à ̈ stata trasferita sulla superficie di plastica standard trattata. Nella figura 14 à ̈ evidenziato l’aspetto di una colonia appena trasferita su plastica standard trattata (A) e l’ aspetto della stessa dopo 12 giorni di coltura (B), senza ulteriori cambi di terreno. Le cellule a contatto con la plastica standard trattata ricominciano ad attaccarvisi ed a diffondersi ad alone attorno, dimostrando buona vitalità.

Sono state effettuate prove di crescita anche per un’altra linea cellulare, sempre di origine umana, di cui à ̈ riportata la crescita in altre matrici tridimensionali. Le cellule MCF-7, al pari delle HepG2, si sono dimostrate in grado di crescere bene sulla matrice HELP8al 5%, come evidenziato in figura 15. Anche questa linea cellulare nelle stesse condizioni di terreno ha dimostrato un buon grado di proliferazione ed una morfologia più rotondeggiante rispetto quella che si sviluppa sulla plastica standard trattata.

Esempio 9: incapsulazione di cellule negli idrogeli ottenuti per reticolazione del polipeptide di SEQIDNO: 1 (n=8) HELP8

Con queste cellule à ̈ stata fatta la prova di incapsulazione, le cellule raccolte in un fondello mediante centrifugazione, sono state risospese direttamente nella soluzione di HELP8al 3% in 10mM Tris/HCl, 150mM NaCl sterile, poi à ̈ stato aggiunto l’enzima transglutaminasi come descritto in precedenza e il tutto à ̈ stato mescolato e subito trasferito nei pozzetti, lasciando 30 minuti a temperatura ambiente. A reticolazione avvenuta, à ̈ stato aggiunto il terreno di coltura e le cellule sono state osservate sotto il microscopio a contrasto di fase. Come si evidenzia nella figura 16, le cellule incapsulate hanno mostrato non solo sopravvivenza ma anche buona capacità proliferativa, indicando che il trattamento diretto con l’enzima sulle cellule non ne intacca la vitalità.

Claims (17)

1. Rivendicazioni 1. Matrici 3D di polipeptidi elastina umano-simili caratterizzati dal fatto di essere ottenibili per reticolazione enzimatica di almeno un polipeptide elastina umano-simile avente sequenza MRGSHHHHHHGSAA(AAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAP GVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIAP)nGV (SEQIDNO:1) in cui n à ̈ un numero intero compreso tra 4 e 12.
2. 2. Matrici 3D secondo la rivendicazione 1, in cui nella SEQIDNO:1 n à ̈ un numero intero compreso tra 6 e 10.
3. 3. Matrici 3D secondo la rivendicazione 1, in cui nella SEQIDNO:1 n à ̈ uguale ad 8.
4. 4. Matrici 3D secondo la rivendicazione 1, in cui la reticolazione à ̈ ottenibile mediante almeno gli step di: - preparare una soluzione acquosa tamponata a pH 8 del polipeptide elastina umano-simile avente SEQIDNO:1 ad una concentrazione scelta nell’intervallo compreso nell’intervallo tra 3% e 6% p/v; - trattare le soluzione acquose del polipeptide con una soluzione acquosa di transglutaminasi alla concentrazione di 2mg/ml ad una temperatura compresa tra 20°C e 25°C.
5. 5. Matrici 3D secondo la rivendicazione 4, in cui le soluzioni acquose del polipeptide elastina umano-simile aventi SEQIDNO:1 sono tamponate con TRIS/HCl 10mM.
6. 6. Matrici 3D secondo la rivendicazione 4, in cui le soluzioni acquose hanno una forza ionica compresa tra 0 e 150mM.
7. 7. Matrici 3D secondo la rivendicazione 3, caratterizzate da valori del rapporto di stretching (Î1⁄2) del legame C-N (a 1090-1045 cm<-1>) e di stretching (Î1⁄2) del legame C-H (a 2940-2840 cm<-1>) (Î1⁄2 (C-N)/Î1⁄2 (C-H)) compresi tra 0,031 e 0,020.
8. 8. Matrici 3D secondo una delle rivendicazioni precedenti comprendenti cellule e/o molecole farmacologicamente o biologicamente attive.
9. 9. Metodo di preparazione di matrici 3D di polipeptidi elastina umano-simili caratterizzati dal fatto di essere ottenibili per reticolazione enzimatica di almeno un polipeptide elastina umano-simile avente sequenza MRGSHHHHHHGSAA(AAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAP GVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIAP)nGV (SEQIDNO:1) in cui n à ̈ un numero intero compreso tra 4 e 12 comprendente almeno gli step di: - preparare una soluzione acquosa tamponata a pH 8 del polipeptide elastina umano-simile avente SEQIDNO:1 ad una concentrazione compresa nell’intervallo tra 3% e 6% p/v; - trattare la soluzione acquosa del polipeptide con una soluzione acquosa di transglutaminasi alla concentrazione di 2mg/ml ad una temperatura compresa tra 20°C e 25°C.
10. 10 Metodo di preparazione matrici 3D secondo la rivendicazione 9, in cui nella SEQIDNO:1 n à ̈ un numero intero compreso tra 6 e 10.
11. 11. Metodo di preparazione matrici 3D secondo la rivendicazione 9, in cui nella SEQIDNO:1 n à ̈ uguale a 8.
12. 12. Metodo di preparazione matrici 3D secondo la rivendicazione 9, in cui le soluzioni acquose del polipeptide elastina umano-simile avente SEQIDNO:1 sono tamponate con TRIS/HCl 10mM.
13. 13. Metodo di preparazione matrici 3D secondo le rivendicazioni 9 e 11, in cui le soluzioni acquose hanno una forza ionica compresa tra 0 e 150mM.
14. 14. Metodo di preparazione matrici 3D di secondo la rivendicazione 9, in cui alle soluzioni acquose sono ulteriormente aggiunte cellule in sospensione e/o molecole farmacologicamente o biologicamente attive.
15. 15. Metodo di preparazione matrici 3D di secondo la rivendicazione 9, in cui à ̈ ulteriormente compreso uno step di eliminazione dell’agente tamponante e/o dell’enzima per diffusione in mezzo acquoso.
16. 16. Uso delle matrici 3D di polipeptidi elastina umano-simili come definiti in una delle rivendicazioni 1-8 nel campo biomedico a scopi di ricerca.
17. 17. Uso delle matrici 3D di polipeptidi elastina umano-simili come definiti in una delle rivendicazioni 1-8 nel campo biomedico nell’ingegneria tissutale.