ITNA20120018A1

ITNA20120018A1 - CELL FOR THE CREATION OF A TEST OF CHEMOTASSASSES IN 2D AND 3D THROUGH OBSERVATION IN VITRO MICROSCOPY.

Info

Publication number: ITNA20120018A1
Application number: IT000018A
Authority: IT
Inventors: Sergio Caserta; Stefano Guido
Original assignee: Sergio Caserta; Stefano Guido
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2013-10-21

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per TITOLO: "Cella per la realizzazione di un saggio di Chemiotassi in 2D e 3D mediante osservazione in microscopia in vitro". Description of the industrial invention having for TITLE: "Cell for the realization of a chemotaxis assay in 2D and 3D by observation in in vitro microscopy".

CAMPO DI APPLICAZIONE FIELD OF APPLICATION

In condizioni fisiologiche molte attività cellulari sono indotte o guidate da segnali biochimici, legati cioè alla presenza di gradienti di concentrazione di opportune molecole. Gli stimoli chemotattici sono ad esempio il meccanismo con cui i globuli bianchi individuano le sedi di un'infiammazione, migrando attraverso i tessuti circostanti, oppure viene indotta 1'angiogenesi dei vasi sanguigni, o le cellule tumorali migrano verso zone più ricche di nutrienti. L'invenzione industriale presentata in questo brevetto consente di investigare questi meccanismi in condizioni differenti e presenta quindi caratteristiche di grande interesse biomedico e biotecnologico. Under physiological conditions, many cellular activities are induced or guided by biochemical signals, that is, linked to the presence of concentration gradients of suitable molecules. Chemotactic stimuli are for example the mechanism by which white blood cells identify the sites of inflammation, migrating through the surrounding tissues, or angiogenesis of blood vessels is induced, or cancer cells migrate to areas richer in nutrients. The industrial invention presented in this patent allows these mechanisms to be investigated under different conditions and therefore has characteristics of great biomedical and biotechnological interest.

STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE

La tendenza delle cellule a muoversi secondo una direzione preferenziale, in risposta ad uno stimolo chimico, è stata oggetto di studi diffusi, dati i numerosi processi biomedici di cui questo fenomeno rappresenta un elemento significativo . The tendency of cells to move in a preferential direction, in response to a chemical stimulus, has been the subject of widespread studies, given the numerous biomedical processes of which this phenomenon represents a significant element.

Un test di riferimento per analizzare il fenomeno chemotattico utilizza la camera di Boyden. Questa consiste di due celle di coltura combacianti, l'una capovolta sull'altra, separate da una membrana porosa. Nella cella superiore si pone una soluzione contenente le cellule in sospensione e in quella inferiore la medesima soluzione contenente un composto di cui si vuole valutare il potere chemotatt ico . Se la sostanza è chemotattica, le cellule si dirigono verso la camera inferiore passando attraverso i pori della membrana e si accumulano sulla sua superficie inferiore. Una valutazione quantitativa della chemiotassi viene realizzata calcolando la frazione di cellule migrate nella cella inferiore. Il saggio di Boyden presenta tuttavia una serie di limitazioni. Le cellule sono inizialmente concentrate in prossimità della superficie del filtro ovvero in corrispondenza della zona in cui avverrà la migrazione cellulare, il che può alterare il gradiente localmente, inoltre le interazioni tra le cellule possono influenzarne la motilità, è impossibile valutare la risposta di ogni singola cellula a un certo gradiente di concentrazione, né osservarne dinamicamente il movimento. ESPOSIZIONE DEL TROVATO A reference test to analyze the chemotactic phenomenon uses the Boyden chamber. This consists of two mating culture cells, one upside down on the other, separated by a porous membrane. In the upper cell a solution containing the cells in suspension is placed and in the lower one the same solution containing a compound whose chemotactic power is to be evaluated. If the substance is chemotactic, the cells make their way to the lower chamber by passing through the pores of the membrane and accumulate on its lower surface. A quantitative assessment of chemotaxis is performed by calculating the fraction of cells migrated to the lower cell. However, Boyden's essay has a number of limitations. The cells are initially concentrated near the surface of the filter or in correspondence with the area where cell migration will take place, which can alter the gradient locally, moreover the interactions between cells can affect their motility, it is impossible to evaluate the response of each individual cell at a certain concentration gradient, nor dynamically observe its movement. EXPOSURE OF THE FOUND

Nella Cella per la realizzazione di un saggio di Chemiotassi in 2D e 3D mediante osservazione in microscopia in vitro, oggetto della presente invenzione industriale, viene realizzato un gradiente di concentrazione controllato di una specifica sostanza in una cella di flusso, appositamente progettata. In Figura 1 è riportato un disegno 3D della cella. Le dimensioni complessive della cella sono tali da poter essere alloggiata in un supporto per vetrini da microscopio. La cella può essere realizzata in metallo (alluminio anodizzato, acciaio inox o altri), vetro, plastica o altro materiale. Opportuna scelta del materiale potrà consentire di sterilizzare in autoclave la cella, e di evitare che si ossidi a contatto con soluzioni acquose o mezzi di coltura. La cella è costituita da una base e da un coperchio, la base presenta due o più pozzetti, alcuni dei quali comunicanti attraverso un setto<La>dimensione dei pozzetti può variare a seconda della quantità di campione. Nella versione dettagliatamente descritta di seguito, a titolo di esempio, sì considera una cella costituita da tre pozzetti allineati, due laterali di uguali dimensioni e uno centrale più piccolo. La base della cella è costituita da due parti A e B che vengono unite utilizzando due viti. La parte A, riportata in Figura 2, presenta un unico scavo, che costituisce il pozzetto 1 nel quale viene posto il campione in esame. Nella parte A sono presenti due fori passanti per l'inserimento delle viti di serraggio. La parete laterale della parte A, che è l'immagine speculare della parete laterale della parte B, presenta una finestra che mette in comunicazione il pozzetto 1 con il serbatoio di chemoattraente realizzato nella parte B. La parte B, riportata in Figura 3, presenta due scavi. Il primo scavo costituisce il pozzetto 2, di dimensioni identiche al pozzetto 1, ma completamente chiuso lateralmente, in cui viene posto un campione di controllo, identico al quello caricato nel pozzetto 1, che resterà isolato dal chemoattraente. Il secondo scavo della parte B costituisce il pozzetto 3 che verrà utilizzato come serbatoio di chemoattraente, riempiendolo con una soluzione di concentrazione nota della molecola in esame. Il pozzetto 3 può essere anche di dimensioni minori degli altri due, al fine di limitare il quantitativo di molecola necessario per ogni esperimento. Il pozzetto 3 è in comunicazione con la parete laterale della parte B attraverso un canale di collegamento che termina con una finestra speculare di quella presente sulla parete laterale della parte A. Modificando la forma e la posizione della finestra che mette in comunicazione i pozzetti 1 e 3 si potrà modificare il gradiente cui è sottoposto il campione posto nel pozzetto 1. In the Cell for the realization of a chemotaxis assay in 2D and 3D by observation in in vitro microscopy, object of the present industrial invention, a controlled concentration gradient of a specific substance is realized in a specially designed flow cell. Figure 1 shows a 3D drawing of the cell. The overall dimensions of the cell are such that it can be housed in a microscope slide holder. The cell can be made of metal (anodized aluminum, stainless steel or others), glass, plastic or other material. A suitable choice of material will allow the cell to be sterilized in an autoclave, and to prevent it from oxidizing in contact with aqueous solutions or culture media. The cell consists of a base and a lid, the base has two or more wells, some of which communicating through a septum <The size of the wells can vary depending on the quantity of sample. In the version described in detail below, by way of example, we consider a cell consisting of three aligned wells, two lateral ones of equal size and a smaller central one. The base of the cell consists of two parts A and B which are joined using two screws. Part A, shown in Figure 2, presents a single excavation, which constitutes the well 1 in which the sample under examination is placed. In part A there are two through holes for inserting the tightening screws. The side wall of part A, which is the mirror image of the side wall of part B, has a window that connects well 1 with the chemotherapy tank made in part B. Part B, shown in Figure 3, presents two excavations. The first excavation constitutes the well 2, identical in size to the well 1, but completely closed laterally, in which a control sample is placed, identical to the one loaded in the well 1, which will remain isolated from the chemo-attractant. The second excavation of part B constitutes the well 3 which will be used as a chemotherapy tank, filling it with a solution of known concentration of the molecule under examination. Well 3 can also be smaller than the other two, in order to limit the quantity of molecule needed for each experiment. Well 3 is in communication with the side wall of part B through a connecting channel that ends with a mirror window of the one on the side wall of part A. Modifying the shape and position of the window that connects wells 1 and 3 it is possible to modify the gradient to which the sample placed in well 1 is subjected.

All'interno di ciascun pozzetto, in corrispondenza dei punti di contatto tra il liquido o gel in cui sono immerse le cellule e le pareti, si genera un menisco che può causare distorsioni nelle immagini. Al di sopra del canale di collegamento, tra il foro di apertura di tale comparto e la parete del pezzo che andrà in contatto con la parte A, è realizzato uno scavo a 'L'. Facendo traboccare il liquido o il gel nel pozzetto 1 al di sopra dello scavo a L, è possibile evitare effetti lente nella zona del pozzetto 1 confinante con la finestra di comunicazione con il pozzetto 3. In figura 4 è riportato un esploso delle varie parti che costituiscono la cella, è anche indicato schematicamente il flusso di chemoattraente che dal pozzetto 3 entra in quello 1 attraverso il canale di collegamento, al di sotto dello scavo ad 'L', per diffondere verso il campione. Per assicurare un passaggio graduale di chemoattraente e quindi un opportuno gradiente di concentrazione, tra le due parti viene inserito un filtro poroso, come riportato in figura 4, che ha una dimensione di poco superiore a quella della finestra sulle pareti laterali dei due pezzi, così da evitare che il chemoattraente fluisca attraverso vie preferenziali. Il fondo della cella è costituito da due vetrini, non riportati in figura, inseriti in opportuni scavi realizzati nella base delle due parti e fissati con silicone resistente alle alte temperature, per consentire di autoclavare la cella. Sulla parete di contatto tra le due parti, prima di assemblarle per mezzo delle viti di serraggio, viene applicato uno strato di silicone, al fine di garantire la tenuta. Il coperchio della cella ha dimensioni leggermente superiori a quelle della base per garantire il passaggio della miscela di aria e C02 dall'ambiente circostante all'interno della cella dove Al fine di misurare il gradiente di concentrazione all'interno del pozzetto 1, è possibile inserire nel pozzetto 3 una molecola fluorescente, quale la sostanza chemoattraente opportunamente marcata, o una molecola differente, avente un peso molecolare simile al chemoattraente di interesse, quale ad esempio il Fitc destrano. Misurando l'intensità della fluorescenza nel campione nel pozzetto 1 è possibile, tramite una opportuna taratura, calcolare il profilo spaziale di concentrazione della molecola diffondente al variare del tempo, ottenendo quindi informazioni dettagliate sul gradiente di concentrazione, nonché sul coefficiente di diffusione della molecola . Inside each well, at the points of contact between the liquid or gel in which the cells and the walls are immersed, a meniscus is generated which can cause distortions in the images. Above the connection channel, between the opening hole of this compartment and the wall of the piece that will come into contact with part A, an 'L' shaped excavation is made. By letting the liquid or gel overflow in well 1 above the L-shaped excavation, it is possible to avoid slow effects in the area of well 1 bordering the communication window with well 3. Figure 4 shows an exploded view of the various parts that make up the cell, it is also schematically indicated the flow of chemoattractant that from well 3 enters that 1 through the connection channel, below the 'L' shaped excavation, to diffuse towards the sample. To ensure a gradual passage of chemo-attractant and therefore an appropriate concentration gradient, a porous filter is inserted between the two parts, as shown in figure 4, which has a size slightly greater than that of the window on the side walls of the two pieces, so to prevent the chemoattente from flowing through preferential routes. The bottom of the cell consists of two slides, not shown in the figure, inserted in suitable hollows made in the base of the two parts and fixed with silicone resistant to high temperatures, to allow the cell to be autoclaved. On the contact wall between the two parts, before assembling them by means of the clamping screws, a layer of silicone is applied in order to guarantee the seal. The cell cover has slightly larger dimensions than the base to ensure the passage of the mixture of air and C02 from the surrounding environment into the cell where In order to measure the concentration gradient inside the well 1, it is possible to insert in well 3 a fluorescent molecule, such as the appropriately marked chemo-attractant substance, or a different molecule, having a molecular weight similar to the chemo-attractant of interest, such as for example Fitc dextran. By measuring the intensity of the fluorescence in the sample in well 1, it is possible, through an appropriate calibration, to calculate the spatial concentration profile of the diffusing molecule over time, thus obtaining detailed information on the concentration gradient, as well as on the diffusion coefficient of the molecule.

La procedura sperimentale da seguire per effettuare il saggio di Chemiotassi 2D e 3D mediante osservazione in microscopia Time Lapse in vitro, richede i seguenti step: 1. Montaggio della cella di chemiotassi e sterilizzazione in autoclave. The experimental procedure to be followed to perform the 2D and 3D Chemotaxis assay by observation in in vitro Time Lapse microscopy requires the following steps: 1. Assembly of the chemotaxis cell and sterilization in an autoclave.

2. Preparazione di una sospensione di cellule, con una densità di cellule opportuna, in modo che queste interagiscano o meno tra di loro durante la migrazione. Le cellule possono essere disperse in un substrato 3D, che simuli le condizioni fisiologiche in cui le cellule possono muoversi in qualunque direzione dello spazio, come un gel di collagene. Alternativamente le cellule possono essere piastrate in monostrati, sia sulla superficie di vetro, eventualmente rivestimenta da opportuni coatings, che su un monolayer incluso tra due strati di substrato, al fine di investigare la motilità in 2D, o di effettuare dei test di invasione, verificando la loro capacità di penetrare nello strato di substrato. Dopo aver caricato nella cella la soluzione di collagene, la cella viene incubata a 37°C per ^<circa>40 minuti per indurre la gelif icazione e fibrillogenesi del collagene. Durante la fibrillogenesi è possibile indurre un allineamento delle fibre di collagene tramite dei campi magnetici, al fine di studiare il fenomeno della contact guidance. Anche una opportuna concentrazione di cellule in sospensione può influenzare l'orientazione delle fibrille di collagene (tractional structuring) , con conseguente effetto sulla contact guidance . 2. Preparation of a suspension of cells, with a suitable density of cells, so that they interact or not with each other during migration. Cells can be dispersed in a 3D substrate, which simulates the physiological conditions in which cells can move in any direction of space, such as a collagen gel. Alternatively, the cells can be plated in monolayers, both on the glass surface, possibly coated with appropriate coatings, and on a monolayer included between two substrate layers, in order to investigate the motility in 2D, or to carry out invasion tests, verifying their ability to penetrate the substrate layer. After loading the collagen solution into the cell, the cell is incubated at 37 ° C for ^ <approximately> 40 minutes to induce gelation and fibrillogenesis of the collagen. During fibrillogenesis it is possible to induce an alignment of collagen fibers through magnetic fields, in order to study the phenomenon of contact guidance. An appropriate concentration of suspended cells can also influence the orientation of the collagen fibrils (tractional structuring), with a consequent effect on contact guidance.

3. Preparazione di una soluzione di chemoatt raente . La scelta del chemoattraente da utilizzare e la sua concentrazione dipende della linea cellulare e dal processo di interesse. 3. Preparation of a chemotherapy solution. The choice of chemoattractant to use and its concentration depends on the cell line and process of interest.

4. L'esperimento di Time Lapse può essere realizzato mediante una stazione di video-microscopia equipaggiata con fotocamera o telecamera per l'acquisizione e digitalizzazione delle immagini, motorizzazioni, incubatore che consenta di controllare temperatura, umidità, C02 e pH, in modo che il campione si trovi in condizioni simili a quelle fisiologiche. Le acquisizioni potranno essere effettuate in campo chiaro, campo scuro, contrasto di fase, fluorescenza, confocalità o altro a seconda del campione in esame e degli specifici scopi del test. Vengono selezionate una o più posizioni di interesse all'interno dei pozzetti contenenti le cellule; per ogni posizione possono essere periodicamente acquisite una o più immagini a diversa profondità ("z-stack") . La durata dell'esperimento e la frequenza di acquisizione possono variare a seconda del campione in esame, della linea cellulare e degli specifici scopi del test. 4. The Time Lapse experiment can be carried out by means of a video-microscopy station equipped with a camera or video camera for the acquisition and digitization of images, motorizations, an incubator that allows to control temperature, humidity, C02 and pH, so that the sample is in conditions similar to physiological ones. The acquisitions can be made in bright field, dark field, phase contrast, fluorescence, confocality or other depending on the sample being tested and the specific purposes of the test. One or more positions of interest are selected within the wells containing the cells; for each position, one or more images at different depths ("z-stack") can be periodically acquired. The duration of the experiment and the frequency of acquisition may vary depending on the sample under examination, the cell line and the specific purposes of the test.

5. L'analisi della motilità al fine di determinare parametri quantitativi può essere condotta durante l'esperimento o in successivamente, con tecniche 5. The motility analysis in order to determine quantitative parameters can be carried out during the experiment or thereafter, with techniques

v/3⁄4autornatizzate o manuali. È possibile utilizzare routine predefinite o macro appositamente scritte, che operino in ambienti software commerciali o freeware, al fine di processare le immagini acquisite durante gli esperimenti. Per ogni acquisizione vengono individuate e memorizzate le posizioni di un opportuno numero di cellule; vengono poi ricostruite le traiettorie 3D o 2D percorse da ciascuna cellule durante l'intero esperimento. È possibile confrontare le traiettorie ottenute in presenza o meno del gradiente di chemoattraente, quantificare e confrontare i valori e le evoluzioni nel tempo di velocità e sue componenti, componenti degli spostamenti, orientazione e polarizzazione delle cellule, coefficienti di diffusione e coefficienti di motilità in modulo e componenti, tempo di persistenza, direzionalità, indice chemotattico o altri parametri . v / 3⁄4autornatized or manual. It is possible to use predefined routines or specially written macros, which operate in commercial or freeware software environments, in order to process the images acquired during the experiments. For each acquisition, the positions of an appropriate number of cells are identified and memorized; the 3D or 2D trajectories traveled by each cell during the whole experiment are then reconstructed. It is possible to compare the trajectories obtained in the presence or not of the chemoattractant gradient, quantify and compare the values and changes over time of velocity and its components, displacement components, orientation and polarization of the cells, diffusion coefficients and motility coefficients in modulus and components, persistence time, directionality, chemotactic index or other parameters.

A titolo di esempio non esaustivo si riporta la proiezione sul piano orizzontale delle traiettorie ottenute in un esperimento di Time-Lapse condotto su fibroblasti con il prototipo di cella descritta nel presente brevetto. Tutte le traiettorie sono state riportate a partire da un'origine comune. Le cellule di controllo poste nel pozzetto 2, figura 5a, non presentano nessuna direzione privilegiata. Il campione nel pozzetto 1, in presenza di un gradiente di concentrazione di SDF, figura 5b, presenta la maggior parte delle traiettorie delle cellule rivolta nella direzione del gradiente di concentrazione. By way of non-exhaustive example, the projection on the horizontal plane of the trajectories obtained in a Time-Lapse experiment conducted on fibroblasts with the cell prototype described in the present patent is reported. All trajectories were reported from a common origin. The control cells placed in well 2, figure 5a, do not show any privileged direction. The sample in well 1, in the presence of an SDF concentration gradient, Figure 5b, has most of the cell trajectories facing in the direction of the concentration gradient.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1: disegno 3D della cella. Figure 1: 3D drawing of the cell.

Figura 2: disegno 3D della parte A della cella. Figure 2: 3D drawing of part A of the cell.

Figura 3: disegno 3D della parte B della cella. Figure 3: 3D drawing of part B of the cell.

Figura 4: esploso 3D dei vari pezzi della cella e schema di assemblaggio. Figure 4: 3D exploded view of the various pieces of the cell and assembly diagram.

Figura 5: esempio di analisi delle traiettorie in condizioni isotrope (a) ed in presenza di gradiente di chemoattraente (b). Figure 5: example of trajectory analysis in isotropic conditions (a) and in the presence of a chemo-attractant gradient (b).

Claims

Claims of the industrial invention having as TITLE: "Cell for the realization of a chemotaxis assay in 2D and 3D by observation in in vitro microscopy". CLAIMS 1) Cell for the realization of UN in 2D and 3D by observation in in vitro microscopy that can be autoclavable and reusable, characterized by the fact that it consists of two or more parts of metal, glass, plastic or other material assembled by means of screws or other fixing system, bearing two or more wells, separated or not by a membrane of the desired porosity and material; the cell is also characterized by the fact of allowing the creation of a controlled concentration gradient of a specific molecule in a substrate suitable for cell growth and migration, such as a collagen gel or other, and by being able to host one or more samples control, not affected by the chemo-attractant gradient, in different wells of the same cell.

2) Cell referred to in 1) characterized by holes of different shape, size and position in the membrane support, which separates the well containing the chemotherapy agent from the one containing the sample under examination in order to modify the concentration gradient which will be measurable by microscopy in fluorescence or other techniques by acquiring dynamic images in real time.

3) Use of the cell referred to in 1) to perform cell motility measurements dynamically, in conditions that simulate physiological ones in vitro, keeping the sample at controlled temperature, humidity, C02 concentration and pH, in the presence or not of chemotactic stimuli, through Time-Lapse microscopy or other techniques, observing the cells in a 3D matrix of the desired substrate, or observing cell monolayers, plated on the glass surface, possibly coated with appropriate coatings, or on the surface of the substrate, or between two layers of the same substrate or of different substrates, studying or not the ability of cells to invade a specific substrate or tissue by penetrating inside it, in the presence or not of chemotactic stimuli; the substrates may or may not have fibers oriented by magnetic fields or other techniques, so as to induce a cellular response of contact guidance in the presence or absence of chemotactic gradients, having the same or different orientation than that of the fibers.

4) Use of the cell referred to in 1) inserting into the substrate inside the wells cultures or co-cultures of cell lines of different types, such as fibroblasts and lymphocytes, or other, or biopsies, and generate the chemotactic gradient by cultivating in one or multiple wells of the cell referred to in 1) suitably stimulated cell lines, for example for the controlled production of chemokines.

5) To study by means of the cell referred to in 1) the effect of chemotaxis on the differentiation of stem cells in both 2D and 3D.

6) Use the cell referred to in 1) to perform dynamic measurements of specific properties at the single cell level, such as calcium imaging or the displacement of cellular structures such as mitochondria or veicles to fix the substrate in the cell referred to in 1) at the end of the experiment to carry out immunohistochemical tests.

7) Administer or withdraw material, such as culture medium, specific molecules, solutions, or other, in the cell referred to in 1) dynamically during the experiment, through direct injection, microinjection, perfusion systems or other techniques, in a to modify the chemotactic gradient, the chemical composition of the sample in one of the wells, or for other purposes.

8) Cell referred to in 1) characterized by the presence of an "L" -shaped excavation that allows the sample to be observed even very close to the edge of the well, preventing the presence of menisci in the free surface from creating "slow effects".