ITMI991121A1

ITMI991121A1 - IMMUNOGENIC PEPTIDES AND THEIR USE

Info

Publication number: ITMI991121A1
Application number: IT1999MI001121A
Authority: IT
Inventors: Catia Traversari; Silvia Tanzarella; Claudio Bordignon
Original assignee: Genera Spa
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2000-11-21
Also published as: AU5067600A; CN1227264C; HK1047116A1; CA2374354A1; AU777474B2; IL146605A0; JP2003502026A; CN1360595A; KR20020011418A; WO2000071573A2; EP1179019A2; WO2000071573A3; IT1312568B1

Description

La presente invenzione si riferisce a peptidi derivati da proteine della famiglia MAGE ed al loro uso come agenti immunogenici nella prevenzione e nel trattamento dei tumori. The present invention relates to peptides derived from proteins of the MAGE family and their use as immunogenic agents in the prevention and treatment of tumors.

Negli ultimi anni, l’uso di linfociti T citotossici (CTL) tumore-specifici ha permesso di isolare diversi geni codificanti per antigeni tumorali (Van den Eynde, B.J. et al., Curr. Opin. Immunol., 9:6 84-693, 1997). A seconda del tipo di espressione in tessuti normali o neoplastici, questi antigeni possono essere divisi in quattro classi, a seconda del diverso livello di specificità per i tumori e importanza clinica. La prima classe comprende antigeni codificati da geni espressi in vari tumori di diverso istotipo ma non in tessuti normali, con l’eccezione degli spermatogoni, quali MAGE (Melanoma Associated Antigen), GAGE e BAGE. La seconda classe rappresenta antigeni di differenziamento che sono espressi solo in melanomi e melanociti, quali tirosinasi, melan-A/MART-1 , gplOO, TRP-1 e TRP-2. Gli antigeni appartenenti alla terza classe sono generati per mutazioni puntiformi di geni espressi ubiquitariamente. La quarta classe di antigeni, che è stata definita solo di recente, è rappresentata da TRP-2-INT2, un antigene espresso nei melanomi, ma non in melanociti normali. In recent years, the use of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) has made it possible to isolate several genes encoding tumor antigens (Van den Eynde, B.J. et al., Curr. Opin. Immunol., 9: 6 84-693 , 1997). Depending on the type of expression in normal or neoplastic tissues, these antigens can be divided into four classes, depending on the different level of specificity for tumors and clinical importance. The first class includes antigens encoded by genes expressed in various tumors of different histology but not in normal tissues, with the exception of spermatogonia, such as MAGE (Melanoma Associated Antigen), GAGE and BAGE. The second class represents differentiation antigens which are expressed only in melanomas and melanocytes, such as tyrosinase, melan-A / MART-1, gplOO, TRP-1 and TRP-2. Antigens belonging to the third class are generated by point mutations of ubiquitously expressed genes. The fourth class of antigens, which has only recently been defined, is represented by TRP-2-INT2, an antigen expressed in melanomas, but not in normal melanocytes.

Gli antigeni tumorali della famiglia MAGE hanno suscitato particolare interesse dal momento che sei di questi, MAGE-1, 2, 3, 4, 6 e 12 sono espressi selettivamente in una porzione significativa di tumori primari e metastatici, compresi melanomi, carcinomi polmonari, della vescica, o varici e mammari (van der Bruggen, P.,et al., Science, 254:1643-1647, 1991). MAGE family tumor antigens have aroused particular interest as six of these, MAGE-1, 2, 3, 4, 6 and 12 are selectively expressed in a significant portion of primary and metastatic cancers, including melanomas, lung cancers, bladder, or varices and mammaries (van der Bruggen, P., et al., Science, 254: 1643-1647, 1991).

Peptidi di nove amminoacidi derivati dal processamento intracellulare delle proteine MAGE-1 (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-1647, 1991) e MAGE-3 di lunghezza compresa tra 8 e 10 amminoacidi, sono stati descritti e proposti come agenti immunogeni (WO 95/19783). Peptides of nine amino acids derived from the intracellular processing of the proteins MAGE-1 (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-1647, 1991) and MAGE-3 of length between 8 and 10 amino acids, have been described and proposed as agents immunogens (WO 95/19783).

Attualmente sono in fase di studio protocolli di vaccinazione basati sull’uso di peptidi antigenici codificati da MAGE-1 e 3 in pazienti affetti da melanoma e altre forme neoplastiche (Marchand, M. et al. Int. J. Cancer 80 : 219-230, 1999). A tutt’oggi· gli antigeni MÀGE-2, 4, 6 non possono essere considerati a tutti gli effetti antigeni tumorali ed essere quindi usati come bersaglio di una immunoterapia tumore-specifica. Motivo di ciò è la mancata identificazione di linfociti T citotossici in grado di riconoscere un peptide derivato da MAGE-2, 4, 6. * Vaccination protocols based on the use of antigenic peptides encoded by MAGE-1 and 3 in patients with melanoma and other neoplastic forms are currently being studied (Marchand, M. et al. Int. J. Cancer 80: 219-230 , 1999). To date, the MÀGE-2, 4, 6 antigens cannot be considered to all effects tumor antigens and therefore be used as a target for tumor-specific immunotherapy. The reason for this is the failure to identify cytotoxic T lymphocytes capable of recognizing a peptide derived from MAGE-2, 4, 6. *

I limiti dell’approccio terapeutico basato sull’uso di peptidi sono legati al numero ridotto di epitopi CTL caratterizzàti (cioè di peptidi/antigeni tumorali e dei rispettivi alleli HLA di classe I) e alla generazione in vivo di varianti tumorali prive di antigeni, in grado di sfuggire alla risposta immunitaria indotta da un vaccino monoantigenico (Restifo, N.P., et al., J. Nati.. Cancer. Inst., 88: 100-108, 1996). In. particolare, si è visto che il fenomeno della generazione di varianti con perdita di antigenicità, che rappresenta un’importante causa del fallimento dei protocolli d’immunizzazione, è dovuto alla selezione di cellule tumorali che non esprimono l antigene riconosciuto dai linfociti reattivi al tumore, per esempio in conseguenza di difetti a livello molecolare risultanti nella perdita o “down regulation” di alidi HLA di classe I (Garrido, F., at al., Immunol. Today, 14: 491-499, 1993). Esistono tuttavia situazioni in cui il tumore perde o muta i geni che codificano per l’antigene tumorale (Jager, E. et al. Int. J. Cancer, 71: 142-147, 1997) utilizzando ancora un altro meccanismo per sfuggire al controllo immunitario. The limitations of the therapeutic approach based on the use of peptides are related to the reduced number of characterized CTL epitopes (i.e. of tumor peptides / antigens and of the respective HLA class I alleles) and to the in vivo generation of tumor variants free of antigens, in able to escape the immune response induced by a monoantigenic vaccine (Restifo, N.P., et al., J. Nati .. Cancer. Inst., 88: 100-108, 1996). In particular, it has been seen that the phenomenon of the generation of variants with loss of antigenicity, which represents an important cause of the failure of immunization protocols, is due to the selection of tumor cells that do not express the antigen recognized by the reactive lymphocytes. tumor, for example as a consequence of molecular defects resulting in the loss or "down regulation" of HLA class I halides (Garrido, F., at al., Immunol. Today, 14: 491-499, 1993). However, there are situations in which the tumor loses or mutates the genes that code for the tumor antigen (Jager, E. et al. Int. J. Cancer, 71: 142-147, 1997) using yet another mechanism to get out of control. immune.

In genere i protocolli clinici d’immunizzazione con antigeni tumorali si applicano solo a pazienti affetti da un tumore esprimente un ben caratterizzato antigene e un allele HLA definito. Purtroppo, la maggioranza dei pazienti affetti da tumore non soddisfano questi requisiti. Risulta dunque evidente la necessità di disporre di nuovi determinanti antigenici da impiegare in protocolli di immunizzazione, che siano possibilmente “a largo spettro”, cioè espressi da un più alto numero di istotipi tumorali, o espressi in forma multipla dallo stesso tumore. In general, clinical immunization protocols with tumor antigens are applied only to patients suffering from a tumor expressing a well-characterized antigen and a defined HLA allele. Unfortunately, the majority of cancer patients do not meet these requirements. It is therefore evident the need to have new antigenic determinants to be used in immunization protocols, which are possibly "broad spectrum", ie expressed by a higher number of tumor histotypes, or expressed in multiple forms by the same tumor.

Si è ora trovato, è ciò costituisce un primo aspetto dell’invenzione, un gruppo di peptidi codificati da regioni omologhe dei geni MAGE 1, 2, 3, 4, 6 e 12, che identificano un nuovo epitopo ristretto a HLA-B*3701. It has now been found, and this constitutes a first aspect of the invention, a group of peptides encoded by homologous regions of the MAGE genes 1, 2, 3, 4, 6 and 12, which identify a new epitope restricted to HLA-B * 3701 .

In base alla loro provenienza, i peptidi dell’invenzione sono stati denominati MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12127.I36 ed hanno le sequenze riportate in SEQ ID No. 1-3. MAGE-1, 2, 3, 6 condividono la medesima sequenza identificata da SEQ ID No 1, mentre MAGE-4 e 12 hanno le sequenze identificate rispettivamente da SEQ ID No 2 e 3. Based on their origin, the peptides of the invention have been named MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12127.I36 and have the sequences reported in SEQ ID No. 1-3. MAGE-1, 2, 3, 6 share the same sequence identified by SEQ ID No 1, while MAGE-4 and 12 have the sequences identified by SEQ ID No 2 and 3 respectively.

Saggi di citotossicità in vitro hanno dimostrato che cellule T citotossiche riconoscono i peptidi dell’invenzione legati all’allele di istocompatibilità HLA-B*3701 su varie linee cellulari esprimenti i diversi antigeni MAGE-1 , 2, 3, 4, 6, 12, e vengono attivate in seguito ad esposizione agli stessi. In questi saggi il peptide avente sequenza SEQ ID No. 1 ha mostrato attività superiore e dunque è preferito. In vitro cytotoxicity assays have shown that cytotoxic T cells recognize the peptides of the invention linked to the histocompatibility allele HLA-B * 3701 on various cell lines expressing the different MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12 antigens, and are activated following exposure to them. In these assays the peptide having sequence SEQ ID No. 1 showed higher activity and is therefore preferred.

L’identificazione di un epitopo comune a vari antigeni della famiglia MAGE è estremamente vantaggioso in quanto consente di superare almeno in parte gli inconvenienti sopra menzionati. Di maggior rilievo, l’impiego di tale epitopo “pluriantigenico”, nel senso che è condiviso da più antigeni della famiglia MAGE, consente di superare la menzionata perdita di antigenicità, dato che spesso un determinato tumore coesprime più di un gene MAGE rendendo dunque estremamente improbabile la perdita della risposta immunitaria indotta dai peptidi dell’ invenzione. Ciò consente di ampliare notevolmente il numero di pazienti sui quali può essere vantaggiosamente condotto un trattamento immunogenico. The identification of an epitope common to various antigens of the MAGE family is extremely advantageous as it allows to overcome at least in part the aforementioned drawbacks. More importantly, the use of this "pluriantigenic" epitope, in the sense that it is shared by several antigens of the MAGE family, allows to overcome the aforementioned loss of antigenicity, given that often a given tumor coexpresses more than one MAGE gene thus making it extremely the loss of the immune response induced by the peptides of the invention is unlikely. This allows to considerably increase the number of patients on whom an immunogenic treatment can be advantageously carried out.

E’ inoltre importante sottolineare che finora non era mai stato dimostrato il potenziale immunogeno degli antigeni MAGE-2 e MAGE-6 nell’uomo, nonostante fosse noto che il 12% dei carcinomi ovarici esprimono MAGE-2 e/o MAGE-6 e non MAGE-1 e/o MAGE-3. It is also important to underline that the immunogenic potential of the MAGE-2 and MAGE-6 antigens in humans has never been demonstrated so far, although it was known that 12% of ovarian carcinomas express MAGE-2 and / or MAGE-6 and not. MAGE-1 and / or MAGE-3.

I peptidi dell’invenzione possono essere preparati, con tecniche convenzionali, preferibilmente per via sintetica, per esempio secondo la procedura descritta in Merrifield, (1986) Science 232:341-347, e Barany e Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979). La sintesi può essere condotta in soluzione o in fase solida o con un sintetizzatore automatizzato (Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2<nd >ed., Rockford 111., Pierce Chemical Co. (1984). In alternativa, i peptidi possono essere preparati con la tecnologia del DNA ricombinante o ancora a partire da precursori proteici naturali contenenti i frammenti desiderati. I residui amminoacidici possono essere modificati chimicamente, per esempio mediante legame di lipidi, glicosilazioni, coniugazioni con altri peptidi, in modo da ottenere proprietà più favorevoli, come maggiore affinità per la molecola HLA, maggiore immunogenicità, maggiore selettività d’induzione della risposta immunitaria o maggiore biodisponibilità dopo somministrazione. I peptidi possono anche essere coniugati ad altri epitopi noti per indurre una risposta cellulare T “helper” attraverso la stessa o una diversa classe di molecole MHC. The peptides of the invention can be prepared, with conventional techniques, preferably synthetically, for example according to the procedure described in Merrifield, (1986) Science 232: 341-347, and Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979). The synthesis can be carried out in solution or in solid phase or with an automated synthesizer (Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2 <nd> ed., Rockford 111., Pierce Chemical Co. (1984). Alternatively, peptides they can be prepared with recombinant DNA technology or starting from natural protein precursors containing the desired fragments. The amino acid residues can be chemically modified, for example by binding lipids, glycosylations, conjugations with other peptides, in order to obtain more properties favorable, such as greater affinity for the HLA molecule, greater immunogenicity, greater selectivity of induction of the immune response or greater bioavailability after administration. The peptides can also be conjugated to other epitopes known to induce a "helper" T cell response through the same or a different class of MHC molecules.

L’invenzione si riferisce inoltre a composizioni farmaceutiche contenenti una quantità efficace di un peptide qui descritto. Secondo una realizzazione preferita, tali composizioni sono vaccini, particolarmente indicati per la vaccinazione preventiva di pazienti a rischio di sviluppo di neoplasie o nella vaccinazione terapeutica di pazienti neoplastici. Oltre agli ingredienti attivi, le composizioni conterranno eccipienti farmaceuticamente accettabili. Per "quantità efficace" si intende una quantità sufficiente a scatenare una risposta CTL efficace contro il tumore. Tale quantità dipenderà dal peptide utilizzato, dalla via e modalità di somministrazione, dalla gravità della patologia da trattare e dalle condizioni generali del paziente e in generale sarà compresa tra 100-300 pg in 3 o più somministrazioni ad 1 mese di intervallo o a tempi ravvicinati. In genere sono effettuati due inoculi sottocute e due intraderma, in dosi corrispondenti ai 4/10 della dose totale per ogni inoculo sottocutaneo, e 1/10 in ognuno dei siti intraderma. Quando possibile i siti di inoculo sono cambiati ad ogni vaccinazione. Le tecniche di preparazione ed uso dei vaccini sono note all’esperto del settore e sono descritte, per esempio, in Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York (1989) o Cryz, S. J., Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagsgesselschaft (1991). Normalmente i vaccini vengono preparati come iniettabili, sospensioni o soluzioni, ma possono essere impiegati anche in forma di preparazioni solide o a base di liposomi. Gli ingredienti immunogeni possono essere miscelati con eccipienti farmacologicamente accettabili, quali emulsificanti, agenti tamponanti, e adiuvanti che aumentano refficacia del vaccino. Quest’ultimo può essere dato secondo uno schema di dosaggio singolo o multiplo. Nel dosaggio multiplo vengono fomite da 1 a 10 dosi separate, ciascuna contenente una quantità di antigene variabile da 1 pg a 1000 pg, seguite da altre dosi a intervalli di tempo successivi, necessarie per mantenere o rinforzare la risposta immunitaria e, se richiesto dal soggetto, un’ulteriore dose dopo diversi mesi. In ogni caso, il regime di trattamento dipenderà dalla risposta ottenuta dal paziente sotto trattamento, dalle sue condizioni generali, dallo stato d’avanzamento del tumóre. The invention also refers to pharmaceutical compositions containing an effective amount of a peptide described herein. According to a preferred embodiment, these compositions are vaccines, particularly suitable for the preventive vaccination of patients at risk of developing neoplasms or in the therapeutic vaccination of neoplastic patients. In addition to the active ingredients, the compositions will contain pharmaceutically acceptable excipients. By "effective amount" is meant an amount sufficient to trigger an effective CTL response against the tumor. This quantity will depend on the peptide used, the route and method of administration, the severity of the pathology to be treated and the general condition of the patient and in general will be between 100-300 pg in 3 or more administrations at 1 month intervals or at short notice. Generally, two subcutaneous and two intradermal inoculations are performed, in doses corresponding to 4/10 of the total dose for each subcutaneous inoculum, and 1/10 in each of the intradermal sites. Where possible the injection sites are changed with each vaccination. Vaccine preparation and use techniques are known to those skilled in the art and are described, for example, in Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York (1989) or Cryz, S. J., Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagsgesselschaft (1991) . Vaccines are normally prepared as injectables, suspensions or solutions, but they can also be used in the form of solid or liposome-based preparations. The immunogenic ingredients can be mixed with pharmacologically acceptable excipients, such as emulsifiers, buffering agents, and adjuvants which increase the efficacy of the vaccine. The latter can be given according to a single or multiple dosing scheme. In the multiple dosing, 1 to 10 separate doses are provided, each containing an amount of antigen ranging from 1 pg to 1000 pg, followed by other doses at successive intervals, necessary to maintain or strengthen the immune response and, if requested by the subject , another dose after several months. In any case, the treatment regimen will depend on the response obtained by the patient under treatment, on his general condition, on the progress of the tumor.

In un ulteriore aspetto, l’invenzione fornisce un metodo per indurre una risposta citotossica contro cellule tumorali che esprimono uno o più antigeni MAGE, che comprende il mettere in contatto linfociti T con i peptidi descritti sopra in condizioni idonee all’attivazione delle cellule T citotossiche. Condizioni idonee per ottenere l’effetto citotossico ricercato comprendono l’esposizione diretta dei linfociti T ai peptidi in coltura oppure il legame preventivo dei peptidi con le molecole HLA di classe I, preferibilmente HLA-B*3701, o ancora il legame preventivo dei peptidi con cellule presentanti l’antigene (APC) che esprimono tali molecole HLA, seguito dall’esposizione ai linfociti T. Cellule APC adatte sono costituite da cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) autologhe, oppure cellule dendritiche, macrofagi e cellule B attivate. Ad una coltura di APC viene aggiunto il/i peptide/i per un tempo sufficiente ad ottenere il legame peptide/APC, e successivamente viene aggiunta una popolazione cellulare contenente i linfociti T che vengono così attivati e proliferano. I linfociti possono essere prelevati dal paziente sotto trattamento e, dopo attivazione, reintrodotti nello stesso. Il legame peptide/APC può essere incrementato attraverso un preventivo "stripping" delle molecole di istocompatibilità presenti sulle APC. Eventualmente, le cellule APC possono essere ingegnerizzate in modo da esprimere l’allele di istocompatibilità HLA-B*3701. Inoltre, il terreno di coltura può contenere una o più citochine che contribuiscono ad aumentare Γ attivazione dei precursori CD8<+>. Prima della loro reintroduzione nel paziente, i linfociti possono essere purificati per esempio attraverso una colonna d’affinità con un ligando specifico. In a further aspect, the invention provides a method for inducing a cytotoxic response against tumor cells expressing one or more MAGE antigens, which comprises contacting T lymphocytes with the peptides described above under conditions suitable for the activation of cytotoxic T cells. . Suitable conditions for obtaining the desired cytotoxic effect include direct exposure of T lymphocytes to peptides in culture or preventive binding of peptides with HLA class I molecules, preferably HLA-B * 3701, or preventive binding of peptides with antigen presenting cells (APCs) that express these HLA molecules, followed by exposure to T lymphocytes. Suitable APC cells consist of autologous peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), or dendritic cells, macrophages and activated B cells. The peptide (s) is added to an APC culture for a time sufficient to obtain the peptide / APC bond, and then a cell population containing the T lymphocytes is added, which are thus activated and proliferate. Lymphocytes can be removed from the patient under treatment and, after activation, reintroduced into the patient. The peptide / APC bond can be increased through a preventive "stripping" of the histocompatibility molecules present on the APCs. Optionally, the APC cells can be engineered to express the HLA-B * 3701 histocompatibility allele. Furthermore, the culture medium may contain one or more cytokines which contribute to increase Γ activation of the CD8 <+> precursors. Before their reintroduction into the patient, the lymphocytes can be purified, for example, through an affinity column with a specific ligand.

L’invenzione si riferisce anche a una linea cellulare T citotossica che riconosce in maniera specifica un complesso costituito da una molecola HLA di classe I, preferibilmente la molecola HLA-B*3701, e un peptide scelto dal gruppo SEQ ID 1-6. La linea T citotossica può essere ottenuta per selezione,<' >a partire da un pool linfocitario, di cellule in grado di attivarsi dopo esposizione alle cellule tumorali contenenti i determinanti antigenici qui descritti. The invention also refers to a cytotoxic T cell line that specifically recognizes a complex consisting of a class I HLA molecule, preferably the HLA-B * 3701 molecule, and a peptide selected from the SEQ ID 1-6 group. The cytotoxic T line can be obtained by selection, starting from a lymphocyte pool, of cells capable of being activated after exposure to tumor cells containing the antigenic determinants described herein.

Secondo un’ulteriore aspetto, l’invenzione fornisce cellule che inducono la risposta immunitaria, quali APC, cellule dendritiche etc., ingegnerizzate con vettori codificanti per i peptidi descritti nella presente invenzione (ad esempio vettori virali o retrovirali, quali quelli derivati da adenovirus o da lentivirus o da MLV), tal quali o sotto forma di proteine di fusione con un carrier adatto, per essere espressi in modo efficiente nella cellula, e quindi processati ed esposti sulla superficie cellulare. In tale caso<' >il DNA codificante per gli epitopi descritti nella presente invenzione, potrà èssere inserito, sotto controllo di un opportuno promotore, per esempio un promotore virale quale il CMV, SV40, nel caso sia richiesto un livello di espressione molto alto, oppure un promotore inducibile quale quello controllato da ecdisone, nel vettore di espressione idoneo. In tale caso gli epitopi descritti sono codificati dalla regione del cDNA di MAGE-1 (GenBank, N. M7748I) corrispondenti agli aminoacidi 127-136 e dalle regioni omologhe per- gli altri antigeni della famiglia MAGE: According to a further aspect, the invention provides cells that induce the immune response, such as APC, dendritic cells, etc., engineered with vectors encoding the peptides described in the present invention (for example viral or retroviral vectors, such as those derived from adenovirus or lentivirus or MLV), as such or in the form of fusion proteins with a suitable carrier, to be efficiently expressed in the cell, and then processed and exposed on the cell surface. In this case, the DNA encoding the epitopes described in the present invention can be inserted, under the control of a suitable promoter, for example a viral promoter such as CMV, SV40, if a very high level of expression is required, or an inducible promoter such as that controlled by ecdysone, in the suitable expression vector. In this case the described epitopes are encoded by the region of the cDNA of MAGE-1 (GenBank, N. M7748I) corresponding to the amino acids 127-136 and by the homologous regions for the other antigens of the MAGE family:

Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione si riferisce ad una linea cellulare di melanoma, denominata MSR3-mel e depositata presso il CBA -Interlab Celi line Collection - (Genova, IT) al N. PD99001, che esprime livelli non rilevabili di antigeni di istocompatibilità. Come descritto in dettaglio nell’ esempio 1, questa linea cellulare può essere trasfettata con il cDNA codificante per qualsiasi allele del sistema di istocompatibilità e successivamente trasfettata o trasdotta con il cDNA codificante per gli antigeni tumorali che non esprime, o per frammenti di essi, o ancora per antigeni virali, ed essere quindi utilizzata per l’induzione in vitro di effettori antigenespecifici, oppure reintrodotta nel paziente secondo applicazioni di immunoterapia attiva in vivo. In una realizzazione preferita, gli antigeni tumorali sono antigeni di melanoma e la molecola di istocompatibilità è HLA di classe I B*370l. La linea MSR3-mel può essere convenientemente usata per l’induzione o l’espansione ex-vivo di linfociti T citotossici antigene-specifici da utilizzare in protocolli di immunoterapia adottiva e/o per l identificazione di nuovi determinanti antigenici. Inoltre, la linea MSR3-mel geneticamente modificata con geni codificanti molecole. HLA e/o antigeni tumorali può essere impiegata come vaccino. According to a further aspect, the invention refers to a melanoma cell line, called MSR3-mel and deposited at the CBA -Interlab Celi line Collection - (Genoa, IT) under No. PD99001, which expresses undetectable levels of antigens of histocompatibility. As described in detail in Example 1, this cell line can be transfected with the cDNA coding for any allele of the histocompatibility system and subsequently transfected or transduced with the cDNA coding for the tumor antigens it does not express, or for fragments thereof, or again for viral antigens, and therefore be used for the in vitro induction of antigenspecific effectors, or reintroduced in the patient according to applications of active immunotherapy in vivo. In a preferred embodiment, the tumor antigens are melanoma antigens and the histocompatibility molecule is HLA class I B * 370l. The MSR3-mel line can be conveniently used for the ex vivo induction or expansion of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy protocols and / or for the identification of new antigenic determinants. Furthermore, the MSR3-mel line is genetically modified with genes encoding molecules. HLA and / or tumor antigens can be used as a vaccine.

Secondo un ultimo aspetto, l invenzione si riferisce ad anticorpi, loro frammenti o derivati, diretti contro i peptidi sopra descritti. La metodologia generale per produrre anticorpi è ben nota ed è descritta per esempio in Kohler e Milstein, Nature 256 (1975), 494 oppure in J.G.R. Hurrel, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Ine., Boco Raron, FL (1982). Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali, preferibilmente monoclonali, e i loro frammenti possono essere F(ab’)2, Fab, Fv o scFv. According to a last aspect, the invention relates to antibodies, their fragments or derivatives, directed against the peptides described above. The general methodology for producing antibodies is well known and is described for example in Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 494 or in J.G.R. Hurrel, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Ine., Boco Raron, FL (1982). The antibodies can be monoclonal or polyclonal, preferably monoclonal, and their fragments can be F (ab ') 2, Fab, Fv or scFv.

Descrizione delle Figure Description of the Figures

Figura 1: Espressione di molecole HLA di classe I da parte di MSR3-mel e MSR-B37. Le cellule tumorali sono state incubate con l'anticorpo monoclonale W6/32 (anti-HLA di classe I) o con un isotipo di controllo, lavate e marcate con anticorpi di capra anti-Ig di topo accoppiati a fluoresceina. L'analisi è stata condotta prima e dopo la trasfezione di MSR3-mel con HLA-B*3701 . Figure 1: Expression of HLA class I molecules by MSR3-mel and MSR-B37. Tumor cells were incubated with W6 / 32 monoclonal antibody (anti-HLA class I) or a control isotype, washed and labeled with fluorescein-coupled goat anti-mouse Ig antibodies. The analysis was conducted before and after transfection of MSR3-mel with HLA-B * 3701.

Figura 2: Riconoscimento di un antigene ristretto da HLA-B*3701 da parte di CTL 337. L'attività citotossica dei CTL 337 è stata valutata rispetto ai melanomi autoioghi MSR3-mel e MSR3-B37, e-contro il melanoma allogenico ET 1 a vari rapporti E/T. Figure 2: Recognition of an antigen restricted by HLA-B * 3701 by CTL 337. The cytotoxic activity of CTL 337 was evaluated with respect to autoiogenic melanomas MSR3-mel and MSR3-B37, and-against allogeneic melanoma ET 1 at various E / T ratios.

Figura 3: Identificazione degli antigeni tumorali riconosciuti dai CTL 337. Cellule Cos-7 sono state co-trasfettate con solo HLA-B*3701 o anche con i cDNA codificanti i geni MAGE-1, 2, 3, 6 e 12. Dopo 48 ore i CTL 337 sono stati aggiunti e si è misurato il rilascio di γ-IFN 24 ore dopo, come descritto in Materiali e Metodi. MSR3-B37 è stato incorporato come controllo positivo. Figure 3: Identification of tumor antigens recognized by CTL 337. Cos-7 cells were co-transfected with HLA-B * 3701 alone or also with cDNAs encoding the MAGE-1, 2, 3, 6 and 12 genes. After 48 hours the CTL 337 was added and the release of γ-IFN was measured 24 hours later, as described in Materials and Methods. MSR3-B37 was incorporated as a positive control.

Figura 4: A) Riconoscimento da parte di CTL 337 del peptide MAGE. 127-136· MSR3-EBV sono state <■ >incubate con triplici diluizioni del peptide MAGE.i27-i36 partendo da 10 mM e usate come cellule bersaglio in un saggio di citotossicità standard. Il rapporto E/T è stato fissato a 10:1. La quantità di peptide necessaria per avere metà della lisi massima è indicata come ED50. B) Binding dei peptidi M4.I27.i36 e M12.1127.136 a HLA-B*3701 valutata in un saggio di competizione. Figure 4: A) Recognition by CTL 337 of the MAGE peptide. 127-136 · MSR3-EBV were incubated with triple dilutions of the MAGE.i27-i36 peptide starting at 10 mM and used as target cells in a standard cytotoxicity assay. The E / T ratio was set at 10: 1. The amount of peptide needed to have half of the maximum lysis is referred to as ED50. B) Binding of the peptides M4.I27.i36 and M12.1127.136 to HLA-B * 3701 evaluated in a competition assay.

I peptidi competitori comprendevano il peptide M4.,27-136 KELVTKAEML e il peptide M12.1127.136 REPFTKAEML. Il peptide M3.A1 (cioè M3.271.279), non in grado di legare la molecola HLA-B*3701, è stato usato come controllo negativo. La lisi senza peptidi competitori era del 52%. Competing peptides included the M4., 27-136 KELVTKAEML peptide and the M12.1127.136 REPFTKAEML peptide. M3.A1 peptide (i.e. M3.271.279), unable to bind the HLA-B * 3701 molecule, was used as a negative control. Lysis without competing peptides was 52%.

Figura 5: Riconoscimento da parte di CTL 337 di una linea cellulare di melanoma positiva a MAGE-6. La linea Me 14932 negativa per HLA-B*3701 e la linea Me 14932-LB37 positiva per HLA-B*3701 sono state pulsate con 16 μΜ del peptide MAGE.127.136 oppure non pulsate, e usate come cellule bersaglio in un saggio di citotossicità<'>standard nei rapporti E/T indicati. Figure 5: Recognition by CTL 337 of a MAGE-6 positive melanoma cell line. The HLA-B * 3701 negative Me 14932 line and the HLA-B * 3701 positive Me 14932-LB37 line were pulsed with 16 μΜ of the peptide MAGE.127.136 or non-pulsed, and used as target cells in a cytotoxicity assay <'> standard in the E / T ratios indicated.

Materiali e metodi Materials and methods

Peptidi sintetici Synthetic peptides

I peptidi sintetici sono stati forniti da PRIMM (Milano, Italia). I peptidi sono MAGE. 127.136 (REPVTKAEML), codificato dai codoni 127-136 dei geni di MAGE-1, 2, 3, e 6, M4.127.136 (KELVTKAEML) e M12.I27.136 (REPFTKAEML), corrispondenti agli amminoacidi 127-136 codificati rispettivamente dai geni MAGE-4 e MAGE<:>12. I peptidi sono sciolti a una concentrazione di, 10 mM in DMSO e diluiti ulteriormente in NaCl 0,9%. Synthetic peptides were provided by PRIMM (Milan, Italy). The peptides are MAGE. 127.136 (REPVTKAEML), encoded by codons 127-136 of the genes of MAGE-1, 2, 3, and 6, M4.127.136 (KELVTKAEML) and M12.I27.136 (REPFTKAEML), corresponding to the amino acids 127-136 encoded respectively by MAGE-4 and MAGE <:> genes 12. The peptides are dissolved at a concentration of .10 mM in DMSO and further diluted in 0.9% NaCl.

Subclonazione dell'allele HLA-B*3701. Subcloning of the HLA-B * 3701 allele.

L'RNA totale è stato preparato da PBL MSR3 con il kit per RNA "Rneasy Total" (QUIAGEN, Hilden, Germania). La sintesi di cDNA a singolo filamento è stata condotta su 2 pg di RNA totale usando primer oligo-dT e trascrittasi inversa derivata dal virus della leucemia murina di Moloney senza attività RNase-H (MMLV-RT RNase-Ή- Superscript; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) secondo le istruzioni del produttore. cDNA corrispondente a 300 ng di RNA totale è stato amplificato con PCR usando una coppia di primer idonea per amplificazione specifica e clonazione direzionale della regione codificante totale degli alleli HLA-B. Il prodotto di PCR di 1,1 kb è stato subclonato nel vettore di espressione eucariotico pcDNA 3.1 (Invitrogen Corporation, Oxon,* G.B.). I cloni plasmidici codificanti HLA-B*3701 o B*5201 1 (gli alleli HLA-B37 e B5 del paziente MSR3) sono stati identificati usando enzimi di restrizione diagnostici. Il gene HLA-B*3701 è stato quindi sequenziato per verificare la corrispondenza rispetto alla sequenza di DNA pubblicata. Questo plasmide è stato chiamato pcDNA 3.1/B*3701. Total RNA was prepared from PBL MSR3 with the "Rneasy Total" RNA kit (QUIAGEN, Hilden, Germany). Synthesis of single-stranded cDNA was performed on 2 µg of total RNA using oligo-dT primers and Moloney mouse leukemia virus-derived reverse transcriptase without RNase-H activity (MMLV-RT RNase-Ή- Superscript; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) according to the manufacturer's instructions. cDNA corresponding to 300 ng of total RNA was amplified by PCR using a primer pair suitable for specific amplification and directional cloning of the total coding region of the HLA-B alleles. The 1.1 kb PCR product was subcloned into the eukaryotic expression vector pcDNA 3.1 (Invitrogen Corporation, Oxon, * G.B.). Plasmid clones encoding HLA-B * 3701 or B * 5201 1 (patient MSR3's HLA-B37 and B5 alleles) were identified using diagnostic restriction enzymes. The HLA-B * 3701 gene was then sequenced to verify the match against the published DNA sequence. This plasmid was named pcDNA 3.1 / B * 3701.

Trasfezione di linee cellulari di melanoma Transfection of melanoma cell lines

Linee cellulari di melanoma sono state trasfettate con la tecnica di precipitazione con calcio-fosfato con pcDNA 3.1/HLA-B*3701, e selezionate in G418. L'espressione della molecola HLA-B*3701 in trasfettanti stabili è stata verificata per citofluorimetria con l'anticorpo monoclonale W6/32 specifico per HLA-A, B e C. Melanoma cell lines were transfected by the calcium-phosphate precipitation technique with pcDNA 3.1 / HLA-B * 3701, and selected in G418. The expression of the HLA-B * 3701 molecule in stable transfectants was verified by flow cytometry with the W6 / 32 monoclonal antibody specific for HLA-A, B and C.

Induzione in vitro della linea di linfociti T citotossici 337 (CTL 337). In vitro induction of the cytotoxic T cell line 337 (CTL 337).

La linea CTL 337 è stata ottenuta usando un protocollo precedentemente descritto da altri (Van den Eynde, et al., Int. J. Cancer., 44: 634-640, 1989) con piccole modificazioni. Brevemente, i PBL di pazienti MSR3 sono stati separati in gradiente Ficoll e coltivati (da 1 a 2xl0<6>/pozzetto) con le cellule di melanoma MSR3-B37 autologhe irradiate (da 0,5 a lxl0<5>/pozzetto) in 2 mi di IMDM addizionato di siero umano al 10% (HS), glutammina e antibiotici. Dopo 3 giorni di coltura, sono stati aggiunti 10 U/ml di IL-2 (Chiron, Milano) e 5 ng/ml di IL-7 (Genzyme Corp.). I linfociti sono stati ristimolati settimanalmente con 0,5xl0<5 >cellule MSR3-B37 irradiate ed esaminati in un saggio di citotossicità dopo tre stimolazioni. Dopo la quinta stimolazione, 2x1 0<6 >LG2-EBV irradiate sono state aggiunte come cellule di supporto, e IL-2 è stata aumentata a 50 U/ml. The CTL 337 line was obtained using a protocol previously described by others (Van den Eynde, et al., Int. J. Cancer., 44: 634-640, 1989) with minor modifications. Briefly, PBLs from MSR3 patients were separated in Ficoll gradient and cultured (1 to 2xl0 <6> / well) with irradiated autologous MSR3-B37 melanoma cells (0.5 to lxl0 <5> / well) in 2 ml of IMDM with added 10% human serum (HS), glutamine and antibiotics. After 3 days of culture, 10 U / ml of IL-2 (Chiron, Milan) and 5 ng / ml of IL-7 (Genzyme Corp.) were added. Lymphocytes were re-stimulated weekly with 0.5xl0 <5> irradiated MSR3-B37 cells and examined in a cytotoxicity assay after three stimulations. After the fifth stimulation, irradiated 2x1 0 <6> LG2-EBV were added as support cells, and IL-2 was increased to 50 U / ml.

Saggio di attività citolitica e studi di "binding" peptidico. Cytolytic activity assay and peptide binding studies.

L'attività litica delle linee cellulari T citotossiche è stata esaminata nel saggio di rilascio del cromo come precedentemente descritto (Fleischhauer, K., et al., Cancer Res., 58: 2969-2972, 1998). I peptidi sono stati testati in saggi di rilascio del cromo: cellule bersaglio marcate con <5l>Cr sono state incubate per un'ora a temperatura ambiente in micropiastre da 96 pozzetti con varie concentrazioni del peptide prima dell'aggiunta di cellule effettrici a un determinato rapporto bersaglio/effettore. Il "binding" del peptide M4.127-i36 e M12.127.136 alla molecola HLA-B*3701 è stato studiato in un saggio di competizione come precedentemente descritto (Herman, J., et al., Immuogenetics, 43: 377-384, 1996). Come peptide standard è stato usato il peptide MAGE.,27-136 (300 nM) riconosciuto da CTL 337. I CTL sono stati usati a un rapporto E/T di 30:1. The lytic activity of cytotoxic T cell lines was examined in the chromium release assay as previously described (Fleischhauer, K., et al., Cancer Res., 58: 2969-2972, 1998). The peptides were tested in chromium release assays: <5l> Cr-labeled target cells were incubated for one hour at room temperature in 96-well microplates with various concentrations of the peptide before adding effector cells to a given target / effector ratio. The binding of the peptide M4.127-i36 and M12.127.136 to the HLA-B * 3701 molecule was studied in a competition assay as previously described (Herman, J., et al., Immuogenetics, 43: 377-384 , 1996). The peptide MAGE., 27-136 (300 nM) recognized by CTL 337 was used as the standard peptide. The CTLs were used at an E / T ratio of 30: 1.

Produzione di sub-frammenti di MAGE-1. Production of MAGE-1 sub-fragments.

Sub-frammenti del gene MAGE-1 (frammenti di 495 e 1.072 bp) sono stati ottenuti per digestione del cDNA di MAGE-1 con BglII e EcoRI. Dopo purificazione su gel di agarosio i frammenti sono stati clonati nel plasmide pcDNA 3.1 (Invitrogen). I cloni sono stati isolati, il DNA plasmidico è stato estratto e trasfettato in cellule Cos-7 insieme al gene HLA-B*3701. Sub-fragments of the MAGE-1 gene (fragments of 495 and 1,072 bp) were obtained by digesting the MAGE-1 cDNA with BglII and EcoRI. After purification on agarose gel the fragments were cloned into pcDNA 3.1 plasmid (Invitrogen). Clones were isolated, plasmid DNA was extracted and transfected into Cos-7 cells along with the HLA-B * 3701 gene.

Trasfezione di cellule Cos-7 e saggio di rilascio di γ-IFN. Transfection of Cos-7 cells and γ-IFN release assay.

La trasfezione di cellule Cos-7 è stata condotta con il metodo del DEAE-destrano-clorochina (Coulie, P.G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 91: 6458-6463,. 1994.). Brevemente, l,5xl0<4 >cellule Cos-7 sono state trasfettate con 100 ng di plasmide pcDNA 3.1/B*3701 e 100 ng di vettori contenenti il cDNA di uno dei seguenti geni: MAGE-1, 2, 3, 4, 6, e 12. Le cellule Cos-7 trasfettate sono state esaminate nel saggio γ-IFN dopo 48 ore: 5000 CTL rispondenti, al quinto giorno dopo stimolazione, sono stati aggiunti in 150 μΐ di IMDM/10% HS addizionati con 25 U/ml di IL-2. Dopo 24 ore a 37°C, 100 μΐ di sumatante sono stati raccolti ed è stata misurata la concentrazione di y-IFM usando un kit di rilascio di γ-IFM (Genzyme, MA) secondo le istruzioni del produttore. Transfection of Cos-7 cells was carried out by the DEAE-dextran-chloroquine method (Coulie, P.G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 91: 6458-6463 ,. 1994.). Briefly, 1.5xl0 <4> Cos-7 cells were transfected with 100 ng of pcDNA 3.1 / B * 3701 plasmid and 100 ng of vectors containing the cDNA of one of the following genes: MAGE-1, 2, 3, 4, 6, and 12. The transfected Cos-7 cells were examined in the γ-IFN assay after 48 hours: 5000 CTL respondents, on the fifth day after stimulation, were added in 150 μΐ of IMDM / 10% HS added with 25 U / ml of IL-2. After 24 hours at 37 ° C, 100 μΐ of sumatant was collected and the concentration of y-IFM was measured using a γ-IFM release kit (Genzyme, MA) according to the manufacturer's instructions.

Trasferimento genico di HLA-B*3701 in Me 14932 mediato da vettore retrovirale. Gene transfer of HLA-B * 3701 to Me 14932 mediated by retroviral vector.

II vettore retrovirale B37-CSM, codificante la molecola HLA-B*3701 del paziente MSR3 è stato costruito come precedentemente descritto (Fleischhauer, K., et al., J. Immunol., /J9:2513-2521, 1997). Brevemente, il cDNA di lunghezza totale codificante per la molecola HLA-B*3701 è stato clonato sotto controllo dell'LTR virale, mentre la forma tronca del recettore umano del fattore di crescita nervoso a bassa affinità (ALNGFR) è stato posto, sotto controllo del promotore di SV40. La linea cellulare di fibroblasti murini ecotropica GP+E86 è stata trasfettata in maniera transiente con 30 [ig di costrutto retrovirale con il metodo del calcio-fosfato standard. L'infezione della linea cellulare "packaging" murina anfotropica GP+env Am 12, con il surnatante di colture di 48 ore di cellule GP+E86 trasfettate, è stata condotta per 4 ore in presenza di 8 pg/ml di polibrene. Le cellule packaging infettate sono state immunoselezionate per l’espressione di ALNGFR con palline magnetiche (Dynabeads M-450<‘>, Dynal A.S., Oslo, Norvegia) rivestite con l'anticorpo monoclonale 20.4 specifico per LNGFR (American Type Culture Collection, Rockville, MD). La trasduzione di Me 14932 è stata condotta coltivando con surnatante contenente retrovirus in presenza di polibrene (8 pg/ml). Cinque o sei cicli di infezione di almeno quattro ore sono stati condotti. L'efficienza dell’infezione è stata valutata con analisi di immunofluorescenza con l’anticorpo monoclonale 20.4 specifico per LNGFR e con l'anticorpo monoclonale specifico per HLA-Bw4. The retroviral vector B37-CSM, encoding the HLA-B * 3701 molecule of the MSR3 patient was constructed as previously described (Fleischhauer, K., et al., J. Immunol., / J9: 2513-2521, 1997). Briefly, the full length cDNA encoding the HLA-B * 3701 molecule was cloned under control of the viral LTR, while the truncated form of the human low-affinity nerve growth factor receptor (ALNGFR) was placed under control. of the promoter of SV40. The ecotropic murine fibroblast cell line GP + E86 was transiently transfected with 30 [ig of retroviral construct by the standard calcium-phosphate method. Infection of the amphotropic murine packaging cell line GP + env Am 12, with the supernatant of 48 hour cultures of transfected GP + E86 cells, was carried out for 4 hours in the presence of 8 µg / ml of polybrene. Infected packaging cells were immunoselected for expression of ALNGFR with magnetic beads (Dynabeads M-450 <'>, Dynal A.S., Oslo, Norway) coated with the monoclonal antibody 20.4 specific for LNGFR (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Transduction of Me 14932 was carried out by culturing with supernatant containing retrovirus in the presence of polybrene (8 pg / ml). Five or six cycles of infection of at least four hours were conducted. The efficiency of the infection was evaluated with immunofluorescence analysis with the monoclonal antibody 20.4 specific for LNGFR and with the monoclonal antibody specific for HLA-Bw4.

Analisi RT-PCR. RT-PCR analysis.

I cDNA di MAGE-1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e della microglobulina β2 (β2ιη) sono stati individuati per amplificazione con PCR. La miscela di reazione contenente 5 μΐ di sospensione di cDNA, 4 μΐ di una miscela di dNTP 10 mM (contenente ciascun dNTP a 2,5 mM), 5 μΐ di tampone per DNA polimerasi lOx (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia), 2 U di DNA polimerasi DynaXyme (Finnzymes Oy) e acqua distillata sterile fino a 50 μΐ di volume di reazione totale. Per le sequenze di primer oligonucleotidici e i programmi di amplificazione PCR vedere Weynants et al. (Weynants, P., et al., Int. J. Cancer, 56: 826-829, 1994) (MAGE-1, 2 e 3), De Plaen et al. (De Plaen, E., et al., J. Immunol., 159 : 2513-2521, 1997) (MAGE-4, 6 e 12). Il cDNA β2ιη è stato amplificato usando il primer Beta 5' (5'-AAC CAC GTG ACT TTG TCA CAG C-3 '), e il primer anti-senso beta 3' (5'-CTG CTC AGA TAC ATC AAA CAT G-3'); l'amplificazione PCR è stata condotta per 30 cicli ( 1 min a 94°C, 30sec a 56°C e 2 min a 72°C); la lunghezza attesa del prodotto di amplificazione β2ιτι è 230 bp. L'integrità dell'RNA è stata esaminata per reazione PCR con primer oligonucleotidici specifici per β-actina (De Smet, C., et al., Immunogenetics, 39: 121-129, 1994). I campioni venivano giudicati positivi quando una banda della grandezza appropriata era visibile su gel di agarosio in presenza di bromuro di etidio. The cDNAs of MAGE-1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 and of the microglobulin β2 (β2ιη) were detected by PCR amplification. The reaction mix containing 5 μΐ of cDNA suspension, 4 μΐ of a 10 mM dNTP mix (containing each dNTP at 2.5 mM), 5 μΐ of buffer for DNA polymerase 10x (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 2 U of DynaXyme DNA polymerase (Finnzymes Oy) and sterile distilled water up to 50 μΐ of total reaction volume. For oligonucleotide primer sequences and PCR amplification programs see Weynants et al. (Weynants, P., et al., Int. J. Cancer, 56: 826-829, 1994) (MAGE-1, 2 and 3), De Plaen et al. (De Plaen, E., et al., J. Immunol., 159: 2513-2521, 1997) (MAGE-4, 6 and 12). The β2ιη cDNA was amplified using the Beta 5 'primer (5'-AAC CAC GTG ACT TTG TCA CAG C-3'), and the beta 3 'anti-sense primer (5'-CTG CTC AGA TAC ATC AAA CAT G -3 '); PCR amplification was carried out for 30 cycles (1 min at 94 ° C, 30sec at 56 ° C and 2 min at 72 ° C); the expected length of the amplification product β2ιτι is 230 bp. RNA integrity was examined by PCR reaction with β-actin specific oligonucleotide primers (De Smet, C., et al., Immunogenetics, 39: 121-129, 1994). Samples were judged positive when a band of the appropriate size was visible on agarose gel in the presence of ethidium bromide.

L’invenzione verrà illustrata in maggior dettaglio negli esempi che seguono. The invention will be illustrated in greater detail in the following examples.

ESEMPI EXAMPLES

Esempio 1 Example 1

MSR3-B37 induce una risposta immune antigene-specifica. MSR3-B37 induces an antigen-specific immune response.

La linea di melanoma MSR3 è stata ottenuta da una metastasi cutanea prelevata da un paziente MSR3. L'espressione degli alleli HLA di classe I da parte delle cellule tumorali è stata valutata con analisi di immunofluorescenza con l'anticorpo monoclonale W6/32 specifico per HLA-A, B e C. Il livello non rilevabile o scarsamente rilevabile di molecole di superficie (Fig. 1) sembrava non adeguato per consentire la presentazione dell'antigene agli immunoeffettori. Infatti, la linea MSR3 non era in grado di indurre una risposta citotossica da parte di PBL autoioghi. La mancanza di espressione di classe I da parte di MSR3-mel non era causata da un difetto di sintesi di β2ιη, dal momento che l'mRNA specifico per β2ηι. poteva essere determinato per analisi RT-PCR. The MSR3 melanoma line was obtained from a skin metastasis from an MSR3 patient. The expression of HLA class I alleles by tumor cells was evaluated by immunofluorescence analysis with the monoclonal antibody W6 / 32 specific for HLA-A, B and C. The undetectable or poorly detectable level of surface molecules (Fig. 1) seemed inadequate to allow antigen presentation to immunoeffectors. In fact, the MSR3 line was not able to induce a cytotoxic response by autoiogenic PBLs. The lack of class I expression by MSR3-mel was not caused by a synthesis defect of β2ιη, since the β2ηι-specific mRNA. could be determined by RT-PCR analysis.

Per determinare se l'espressione dell'antigene HLA di classe I poteva essere ristabilita, le cellule MSR3-mel sono state trasfettate stabilmente con cDNA codificante la molecola HLA-B*3701 autoioga. Dopo selezione con G418 l'analisi cito fluorimetrica mostrava la colorazione della linea cellulare trasfettata MSR3-B37 da parte dell'anticorpo monoclonale W6/32 (Fig. 1). To determine whether expression of the HLA class I antigen could be reestablished, MSR3-mel cells were stably transfected with cDNA encoding the self-hygienic HLA-B * 3701 molecule. After selection with G418 cytofluorometric analysis showed the staining of the transfected cell line MSR3-B37 by the monoclonal antibody W6 / 32 (Fig. 1).

Per valutare la presenza sulla superficie della linea MSR3-B37 di antigeni tumore-specifici, è stata esaminata la capacità delle cellule di. melanoma di indurre effettori citotossici tumore-specifici e la loro suscettibilità alla lisi da parte di tali CTL. I PBL del paziente sono stati stimolati in vitro con MSR3-B37 come descritto in Materiali e Metodi. Dopo tre cicli di stimolazione, la linea cellulare T citotossica 337 policlonale (CTL 337) lisava specificamente la linea cellulare MSR3-B37 ma non MSR3-mel non trasfettata (Fig. 2). Cellule MSR3-EBV autologhe e T blasti attivati con PHA non venivano riconosciuti, suggerendo che gli epitopi riconosciuti da questi CTL sono specifici del melanoma. Infatti, oltre alle cellule di melanoma autologhe, i CTL 337 erano anche in grado di Usare la linea di melanoma ET1-HLA-B*3701-positiva (Fig. 2) suggerendo che uno o più antigeni condivisi da cellule di melanoma vengono riconosciuti. To evaluate the presence on the surface of the MSR3-B37 line of tumor-specific antigens, the capacity of the cells was examined. melanoma to induce tumor-specific cytotoxic effectors and their susceptibility to lysis by such CTLs. The patient's PBLs were stimulated in vitro with MSR3-B37 as described in Materials and Methods. After three cycles of stimulation, the polyclonal cytotoxic T cell line 337 (CTL 337) specifically lysed the MSR3-B37 but not the non-transfected MSR3-mel cell line (Fig. 2). Autologous MSR3-EBV cells and PHA-activated T blasts were not recognized, suggesting that the epitopes recognized by these CTLs are specific to melanoma. Indeed, in addition to autologous melanoma cells, CTL 337 were also able to use the ET1-HLA-B * 3701-positive melanoma line (Fig. 2) suggesting that one or more antigens shared by melanoma cells are recognized.

Questi dati indicano che l'espressione di HLA di classe I può essere ristabilita per trasfezione di cellule di melanoma MSR3 e che la linea di melanoma trasfettata con la molecola HLA-B*3701 è in grado di indurre una risposta cellulare T citotossica tumore-specifica. These data indicate that HLA class I expression can be re-established by transfection of MSR3 melanoma cells and that the melanoma line transfected with the HLA-B * 3701 molecule is capable of inducing a tumor-specific cytotoxic T cell response. .

Esempio 2 Example 2

Identificazione dell'epitopo antigenico riconosciuto dai CTL 337. Identification of the antigenic epitope recognized by the CTL 337.

Per identificare l'antigene riconosciuto dai CTL 337, è stato valutato il rilascio di γ-IFN da CTL 337 in presenza di cellule Cos-7 trasfettate con il plasmide pcDNA 3.1/B*3701 e con il cDNA codificante i sei membri della famiglia MAGE (cioè, MAGE-1, 2, 3, 4, 6 e 12), alcuni dei quali sono espressi da entrambe MSR3-mel e ET1. I CTL 337 riconoscevano specificamente cellule Cos-7 trasfettate con MAGE-1, 2, 3 e 6, suggerendo che l'epitopo bersaglio dei CTL 337 era condiviso dai 4 differenti antigeni o che componenti distinti della linea cellulare T oligoclonale riconoscevano peptidi derivati dai quattro prodotti del gene MAGE. Un basso livello di γ-IFN era determinato in presenza di cellule Cos-7 trasfettate con MAGE-4 e MAGE-12 (Fig. 3). To identify the antigen recognized by CTL 337, the release of γ-IFN from CTL 337 was evaluated in the presence of Cos-7 cells transfected with the pcDNA 3.1 / B * 3701 plasmid and with the cDNA encoding the six members of the MAGE family (i.e., MAGE-1, 2, 3, 4, 6, and 12), some of which are expressed by both MSR3-mel and ET1. CTL 337 specifically recognized Cos-7 cells transfected with MAGE-1, 2, 3 and 6, suggesting that the target epitope of CTL 337 was shared by the 4 different antigens or that distinct components of the oligoclonal T cell line recognized peptides derived from the four products of the MAGE gene. A low level of γ-IFN was determined in the presence of Cos-7 cells transfected with MAGE-4 and MAGE-12 (Fig. 3).

Per identificare la sequenza codificante il/i peptidi antigenici riconosciuti dai CTL 337, è stato digerito il cDNA codificante MAGE-1 con BglII e EcoRI ottenendo due sub-frammenti di circa 495 e 1072 bp. Questi frammenti sono stati clonati nel plasmide pcDNA 3.1 e trasfettati in cellule Cos-7 insieme alla molecola HLA-B*3701. La presenza di un codone d'inizio a 202 bp e 707 bp rispettivamente nei frammenti 495 e 1.072 bp, garantiva l'espressione dei due sub-frammenti nelle cellule trasfettate. Il livello di γ-IFN rilasciato dai CTL 337 in presenza di cellule Cos-7 trasfettate con il frammento di 495 bp era comparabile a quello dato dal gene di MAGE-1 intero, indicando che il peptide antigenico era codificato all'interno di questa regione. La sequenza amminoacidica codificata dal frammento di 495 bp è stata analizzata per trovare i peptidi recanti il motivo di legame HLA-B*3701 (Rammensee, H.G., et al., Immunogenetics, 4L·. 178-228, 1995). Sono stati identificati cinque peptidi recanti aspartato o glutammato in posizione 2 e isoleucina o leucina in posizione 9/10. Uno di questi peptidi, RJEPVTKAEML, era presente anche nelle sequenze amminoacidiche codificate da MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6. Questo peptide, chiamato MAGE.127-136, è stato usato per sensibilizzare la linea MSR3-EBV alla lisi da parte di CTL 337 in un saggio di titolazione. Le cellule MSR3-EBV sono state pulsate con il peptide REPVTKAEML e poi usate come cellule bersaglio nel saggio di citotossicità (Fig. 4a). La metà della lisi massima è stata ottenuta con una concentrazione del peptide di 90 nM. Non è stata osservata alcuna lisi di MSR3-EBV pulsata con un peptide non correlato in grado di legare HLA-B*3701 (Fig. 4b). To identify the sequence encoding the antigenic peptide (s) recognized by CTL 337, the cDNA encoding MAGE-1 with BglII and EcoRI was digested to obtain two sub-fragments of about 495 and 1072 bp. These fragments were cloned into the pcDNA 3.1 plasmid and transfected into Cos-7 cells along with the HLA-B * 3701 molecule. The presence of a start codon at 202 bp and 707 bp in the fragments 495 and 1.072 bp, respectively, ensured the expression of the two sub-fragments in the transfected cells. The level of γ-IFN released by CTL 337 in the presence of Cos-7 cells transfected with the 495 bp fragment was comparable to that given by the whole MAGE-1 gene, indicating that the antigenic peptide was encoded within this region . The amino acid sequence encoded by the 495 bp fragment was analyzed to find the peptides bearing the HLA-B * 3701 binding motif (Rammensee, H.G., et al., Immunogenetics, 4L ·. 178-228, 1995). Five peptides were identified bearing aspartate or glutamate in position 2 and isoleucine or leucine in position 9/10. One of these peptides, RJEPVTKAEML, was also present in the amino acid sequences encoded by MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6. This peptide, named MAGE.127-136, was used to sensitize the MSR3-EBV line to lysis by CTL 337 in a titration assay. MSR3-EBV cells were pulsed with the REPVTKAEML peptide and then used as target cells in the cytotoxicity assay (Fig. 4a). Half of the maximum lysis was achieved with a peptide concentration of 90 nM. No pulsed MSR3-EBV lysis with an unrelated peptide capable of binding HLA-B * 3701 was observed (Fig. 4b).

Livelli bassi di γ-IFN erano rilasciati da CTL 337 in presenza di cellule Cos-7 esprimenti MAGE-4 e MAGE-12 (Fig. 3). Per verificare se il rilascio poteva essere attribuito al riconoscimento dei peptidi codificati dal codone 127-136 airintemo di MAGE-4 è stato condotto uno studio di "binding" del peptide, usando come bersagli cellule MSR3-EBV pulsate con i due peptidi. Il peptide M4.127.136, KELVTKAEML, differisce dal peptide REPVTKAELM per due amminoacidi (lisina vs arginina in posizione 1 e leucina vs prolina in posizione 3), mentre il peptide M12.127-136 REPFTKAEML differisce per un solo amminoacido (fenilalanina vs vaiina in posizione 4). I risultati indicavano che i due peptidi possono legarsi a HLA-B*3701, dal momento che quantità crescenti di ciascuno di essi erano in grado di inibire la lisi di MSR3-EBV pulsate con il peptide REPVTKAEML ma non con il peptide di legame di HLA-A1 non correlato (cioè M3. 271-279) (Fig. 4b). Tuttavia, nessun riconoscimento di cellule EBV pulsate con i peptidi M4.127-136 e M12.127.]36 è stato osservato. Low levels of γ-IFN were released from CTL 337 in the presence of Cos-7 cells expressing MAGE-4 and MAGE-12 (Fig. 3). To verify whether the release could be attributed to the recognition of the peptides encoded by codon 127-136 within the MAGE-4 interior, a "binding" study of the peptide was conducted, using MSR3-EBV cells pulsed with the two peptides as targets. The M4.127.136 peptide, KELVTKAEML, differs from the REPVTKAELM peptide by two amino acids (lysine vs arginine in position 1 and leucine vs proline in position 3), while the peptide M12.127-136 REPFTKAEML differs by only one amino acid vs phenylalanine (phenylalanine). position 4). The results indicated that the two peptides can bind to HLA-B * 3701, since increasing amounts of each were able to inhibit the lysis of MSR3-EBV pulsed with the REPVTKAEML peptide but not with the HLA binding peptide. -A1 unrelated (i.e. M3. 271-279) (Fig. 4b). However, no recognition of EBV cells pulsed with the peptides M4.127-136 and M12.127.] 36 was observed.

Nel complesso, questi dati indicano che i CTL 337 sono in grado di riconoscere un peptide processato per via endogena dei prodotti MAGE-1, 2, 3 e 6. Overall, these data indicate that CTL 337s are capable of recognizing an endogenously processed peptide of the MAGE-1, 2, 3 and 6 products.

Esempio 3 Example 3

CTL 337 riconosce specificamente i prodotti del gene MAGE-2 e MAGE-6. CTL 337 specifically recognizes MAGE-2 and MAGE-6 gene products.

Finora non esiste prova nell'uomo dell'immunogenicità delle proteine codificate da MAGE-2 e MAGE-6. Infatti,, mentre sono stati identificati peptidi codificati da MAGE-1, 3, 4, e 12 che legano molecole HLA di classe I per formare complessi antigenici riconosciuti dai vari CTL, non sono stati identificati peptidi codificati dai geni MAGE-2 o MAGE-6. To date, there is no evidence in humans of the immunogenicity of the proteins encoded by MAGE-2 and MAGE-6. In fact, while peptides encoded by MAGE-1, 3, 4, and 12 have been identified that bind HLA class I molecules to form antigenic complexes recognized by the various CTLs, no peptides encoded by the MAGE-2 or MAGE- genes have been identified. 6.

Per dimostrare che nel melanoma il peptide REPVTKAEML poteva essere processato anche a partire dal gene MAGE-2 e MAGE-6 e presentato ai CTL 337, si sono cercate linee cellulari di melanoma che esprimessero MAGE-2 o MAGE-6 ma nessun altro gene MAGE. Sfortunatamente, l'espressione dei geni MAGE nei melanomi è strettamente correlata e la maggior parte dei melanomi esprimono più di un componente della famiglia genica MAGE. In effetti, non è stato possibile trovare una linea di melanoma che esprimesse selettivamente MAGE-2 mentre si è riusciti a trovare una linea di melanoma, Me 14932, che esprime selettivamente MAGE-6. To demonstrate that in melanoma the REPVTKAEML peptide could also be processed starting from the MAGE-2 and MAGE-6 gene and presented to CTL 337, we searched for melanoma cell lines expressing MAGE-2 or MAGE-6 but no other MAGE gene. . Unfortunately, the expression of MAGE genes in melanomas is closely related and most melanomas express more than one member of the MAGE gene family. Indeed, it was not possible to find a melanoma line that selectively expresses MAGE-2 while a melanoma line, Me 14932, which selectively expresses MAGE-6, could be found.

La linea di melanoma Me 14932 è stata analizzata con RT-PCR usando primer oligorfucleotidici specifici per ciascun gene MAGE e si è mostrata positiva solo per MAGE-6, con un basso livello di espressione. Per verificare se il peptide REPVTKAEML viene processato endogenamente dai prodotti di MAGE-6 e presentato da HLA-B*3701, Mel4932 è stata trasdotta con un vettore retrovirale codificante la molecola HLA-B*3701 e un marcatore di superficie cellulare (ALNGFR) come descritto in Materiali e Metodi. Le cellule trasdotte, Me 14932-LB37, sono state purificate con immunobeads per selezione dell'espressione di superfìcie di ALNGFR. Come indicato dalla colorazione immunofluorescente con un anticorpo monoclonale specifico per HLA-Bw4, l'espressione sulla superficie cellulare di HLA-B*3701 su cellule Me 14932 trasdotte era di almeno due volte inferiore di quella delle cellule di melanoma MSR3-B37. I CTL 337 erano in grado di riconoscere la linea Me 14932-LB37 in un saggio di citotossicità e il livello di lisi veniva aumentato per aggiunta .esogena del peptide REPVTKAEML, mentre non si rilevava riconoscimento della linea Me 14932 pulsata e non pulsata (Fig. 5). I bassi livelli di lisi del melanoma Me 14932-LB37 possono essere connessi alla debole espressione del gene MAGE-6 o alla debole espressione delle molecole di superficie HLA-B*3701. The Me 14932 melanoma line was analyzed by RT-PCR using oligorphucleotide primers specific for each MAGE gene and showed positive only for MAGE-6, with a low level of expression. To test whether the REPVTKAEML peptide is endogenously processed by MAGE-6 products and presented by HLA-B * 3701, Mel4932 was transduced with a retroviral vector encoding the HLA-B * 3701 molecule and a cell surface marker (ALNGFR) such as described in Materials and Methods. The transduced cells, Me 14932-LB37, were purified with immunobeads by selection of the surface expression of ALNGFR. As indicated by immunofluorescent staining with a monoclonal antibody specific for HLA-Bw4, the cell surface expression of HLA-B * 3701 on transduced Me 14932 cells was at least two-fold lower than that of MSR3-B37 melanoma cells. CTL 337 were able to recognize the Me 14932-LB37 line in a cytotoxicity assay and the level of lysis was increased by exogenous addition of the REPVTKAEML peptide, while no recognition of the pulsed and non-pulsed Me 14932 line was detected (Fig. 5). Low lysis levels of Me 14932-LB37 melanoma may be related to weak expression of the MAGE-6 gene or weak expression of HLA-B * 3701 surface molecules.

Per valutare se l'inclusione di MAGE-2 e MAGE-6 nella lista di possibili antigeni bersaglio per immunoterapia specifica poteva aumentare la proporzione di pazienti trattabili, è stata analizzata l'espressione di MAGE-1, 2, 3 e 6 in campioni di tumore di vari istotipi. .1 melanomi non sono stati analizzati poiché l'espressione dei vari geni MAGE era chiaramente correlata (Dalerba, P., et al., Int. J. Cancer, 77: 200-204, 1998). I risultati indicano che il 12% dei carcinomi ovarici e il 5% dei carcinomi del colon e della mammella esprimono MAGE-2 e/o MAGE-6 in assenza di MAGE-1 e MAGE-3 (Tabella). D'altra parte, in tutti i carcinomi della vescica e del polmone studiati, i quattro geni venivano sempre co-espressi. To evaluate whether the inclusion of MAGE-2 and MAGE-6 in the list of possible target antigens for specific immunotherapy could increase the proportion of treatable patients, the expression of MAGE-1, 2, 3 and 6 in samples of tumor of various histotypes. .1 melanomas were not analyzed as the expression of the various MAGE genes was clearly correlated (Dalerba, P., et al., Int. J. Cancer, 77: 200-204, 1998). The results indicate that 12% of ovarian carcinomas and 5% of colon and breast carcinomas express MAGE-2 and / or MAGE-6 in the absence of MAGE-1 and MAGE-3 (Table). On the other hand, in all bladder and lung carcinomas studied, the four genes were always co-expressed.

In conclusione, i dati riportati in questo studio indicano che MAGE-2 e MAGE-6 possono essere inclusi nella lista di possibili bersagli antigenici per immunoterapia tumore-specifica, aumentando il numero di pazienti che possono beneficiare di questa terapia. In conclusion, the data reported in this study indicate that MAGE-2 and MAGE-6 can be included in the list of possible antigenic targets for tumor-specific immunotherapy, increasing the number of patients who can benefit from this therapy.

Tabella Table

Claims

LIST OF SEQUENCES (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: GENERATE (A) NAME: GenEra S.p.A. (B) VIA: Olgettina, 58 (C) CITY: Milan (E) COUNTRY: Italy (F) POSTAL CODE (Post Code): 20132 (ii) TITLE OF THE INVENTION: Immunogenic peptides and their use (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 3 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) TYPE OF MEDIA: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) TYPE OF FILAMENT: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (v) TYPE OF FRAGMENT: internal (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Arg Jun Pro Val Thr Lys Ala Giu Met Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) TYPE OF FILAMENT: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (v) TYPE OF FRAGMENT: internal (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Lys Giu Leu Val Thr Lys Ala Giu Met Leu 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) TYPE OF FILAMENT: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (v) TYPE OF FRAGMENT: internal (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Arg Jun Pro Phe Thr Lys Ala Giu Met Leu 1 5 10 CLAIMS 1. Peptides that bind the HLA-B * 3701 allele selected from the group comprising: a) REPVTKAEML b) KELVTKAEML c) REPFTKAEML 2. Monoclonal or polyclonal antibodies directed against the peptides of claim 1. Pharmaceutical composition comprising an effective amount of a peptide of claim 1 together with pharmaceutically acceptable excipients. 4. Composition according to claim 3, for use as a vaccine. 5. Method for inducing a cytotoxic response towards tumor cells expressing an antigen of MAGE-1,2,3,4,6,12, which comprises contacting T lymphocytes with the peptides of claim 1 under conditions suitable for activation of the lymphocytes themselves. Method according to claim 5, wherein the lymphocytes are directly exposed to the peptides in culture. 7. Method according to claim 5, in which the peptides are previously bonded to HL A class I molecules, preferably to the HLA-B * 3701 allele. 8. Cytotoxic T cell line that specifically recognizes a complex consisting of a class I HLA molecule, preferably HLA-B * 3701, and a peptide of claim 1. 9. Melanoma cell line not expressing histocompatibility antigens, deposited at CBA - Interlab Celi Line Collection - under No. PD99001. 10. Cell line of claim 9, genetically engineered with. genes encoding HLA molecules and / or tumor antigens. 11. Cell line according to claim 10, wherein said HLA molecule is of class I B * 3701, and the tumor antigen is of melanoma. 12. Use of the line of claims 9-11 for the ex vivo induction and expansion of antigen specific cytotoxic T lymphocytes. 13. Use of the line of claims 10 and 11 for the preparation of a vaccine. 14. Use of the peptides of claim 1 for the preparation of an anti-tumor medicament. Use according to claim 14, wherein said medicament is a vaccine.