ITMI981224A1 - RHODOBACTER SPHAEROIDES RV MUTANT AND ITS USE IN HYDROGEN PRODUCTION - Google Patents
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Description
"Mutante di Rhodobacter sohaeroides RV e suo impiego nella produzione di idrogeno". "Rhodobacter sohaeroides RV mutant and its use in hydrogen production".
Descrizione Description
L'invenzione riguarda il mutante di Rhodobacter sphaeroides RV CBS 100805 incapace di sintetizzare l’enzima uptake idrogenasi deputato al consumo dell'idrogeno ed un procedimento per la produzione di idrogeno che impiega detto mutante. The invention relates to the Rhodobacter sphaeroides RV CBS 100805 mutant unable to synthesize the enzyme uptake hydrogenase responsible for the consumption of hydrogen and a process for the production of hydrogen that uses said mutant.
L'idrogeno rappresenta l'elemento più abbondante nel sole e gioca un ruolo chiave nella generazione di energia. Sulla terra, invece, insieme all'ossigeno è il composto fondamentale per il ciclo biologico dell'energia. Hydrogen is the most abundant element in the sun and plays a key role in energy generation. On earth, however, together with oxygen it is the fundamental compound for the biological cycle of energy.
La quantità di idrogeno contenuta nella zona più bassa dell’atmosfera è stimabile a circa 2,2x10<9 >tonnellate, pari a circa 0,55 ppm per volume di aria. Confrontate con le 1,1 x 10<15 >tonnellate di 02, l'idrogeno è certamente da considerarsi sulla terra un gas raro. L'idrogeno, comunque, a differenza dei gas nobili, è continuamente prodotto ed utilizzato da un largo numero di microorganismi sia in condizioni aerobiche che anaerobiche, in presenza od assenza di luce. The amount of hydrogen contained in the lower area of the atmosphere can be estimated at approximately 2.2x10 <9> tons, equal to approximately 0.55 ppm per volume of air. Compared with the 1.1 x 10 <15> tons of 02, hydrogen is certainly to be considered a rare gas on earth. However, unlike noble gases, hydrogen is continuously produced and used by a large number of microorganisms both in aerobic and anaerobic conditions, in the presence or absence of light.
Da un punto di vista energetico, l'idrogeno rappresenta sicuramente una fonte ideale avendo un potere calorico superiore ad ogni altro. Inoltre può essere facilmente conservato, non è inquinante ed il prodotto finale della sua ossidazione, l'acqua, non solo non è tossico, ma risulta un composto indispensabile a garantire la vita sulla terra . From an energy point of view, hydrogen certainly represents an ideal source as it has a higher calorific value than any other. Furthermore, it can be easily preserved, it is not polluting and the final product of its oxidation, water, is not only non-toxic, but is an indispensable compound to guarantee life on earth.
La capacità dei microorganismi di sviluppare idrogeno, unitamente al progressivo esaurimento delle fonti energetiche tradizionali ed ai gravi problemi ambientali ad esse associati, ha stimolato da tempo un considerevole sforzo di ricerca per ottenere per via biologica questa fonte di energia. The ability of microorganisms to develop hydrogen, together with the progressive depletion of traditional energy sources and the serious environmental problems associated with them, has long stimulated a considerable research effort to obtain this energy source biologically.
Nell'ambiente naturale sono presenti numerosi organismi che producono l'idrogeno spontaneamente. In the natural environment there are numerous organisms that produce hydrogen spontaneously.
Tra questi organismi, i batteri fotosintetici anossigenici, come i batteri rossi non sulfurei che comprendono fra gli altri i generi Rhodopseudomonas . Rhodobacter e Rhodospirillum, sono particolarmente adatti per la produzione di idrogeno. Essi, infatti, sono capaci non solo di utilizzare una sorgente di energia a costo zero, la luce, ma possono utilizzare come substrato per la loro crescita sostanze di scarto, abbinando così la produzione di energia allo smaltimento di rifiuti che rappresentano un serio problema ambientale. These organisms include anoxygenic photosynthetic bacteria, such as red non-sulphurous bacteria which include, among others, the genera Rhodopseudomonas. Rhodobacter and Rhodospirillum, are particularly suitable for the production of hydrogen. In fact, they are not only capable of using a source of energy at no cost, light, but can use waste substances as a substrate for their growth, thus combining the production of energy with the disposal of waste that represent a serious environmental problem. .
Tuttavia, questi batteri presentano gli inconvenienti derivanti dalle basse rese di produzione di idrogeno. Ne consegue che l'uso di questi microorganismi rende difficile lo sviluppo di processi per la bioproduzione di idrogeno interessanti da un punto di vista pratico ed economico. However, these bacteria have the drawbacks of low hydrogen production yields. It follows that the use of these microorganisms makes it difficult to develop processes for the bioproduction of hydrogen which are interesting from a practical and economic point of view.
E' noto in letteratura, infatti, che in molti batteri rossi non sulfurei, tra i quali Rhodospirillum rubrum e Rhodobacter caosulatus. due differenti enzimi sono coinvolti nel metabolismo dell'idrogeno: il complesso della nitrogenasi, responsabile della produzione di idrogeno ed una idrogenasi di membrana, detta uptake idrogenasi, che ne catalizza il consumo. In fact, it is known in the literature that in many red non-sulphurous bacteria, including Rhodospirillum rubrum and Rhodobacter caosulatus. two different enzymes are involved in the metabolism of hydrogen: the nitrogenase complex, responsible for the production of hydrogen and a membrane hydrogenase, called uptake hydrogenase, which catalyzes its consumption.
E' stato ipotizzato che il ruolo fisiologico dell'uptake idrogenasi sia quello di ossidare l'idrogeno prodotto dalla nitrogenasi che viene utilizzato come fonte di energia per la crescita cellulare, con il conseguente effetto di diminuire la velocità e la quantità di idrogeno fotoprodotto. It has been hypothesized that the physiological role of uptake hydrogenase is to oxidize the hydrogen produced by nitrogenase which is used as an energy source for cell growth, with the consequent effect of decreasing the rate and quantity of photoproduced hydrogen.
Per migliorare la capacità di produzione di idrogeno da parte di R.sohaeroides RV in termini di velocità e quindi di efficienza, è stato ora costruito un mutante incapace di sintetizzare l'enzima uptake idrogenasi coinvolto nel consumo dell'idrogeno. To improve the hydrogen production capacity of R.sohaeroides RV in terms of speed and thus efficiency, a mutant unable to synthesize the uptake hydrogenase enzyme involved in the consumption of hydrogen has now been constructed.
Tale mutante, denominato SMV089, è stato depositato il 27.04.1998 presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero CBS 100805. This mutant, called SMV089, was deposited on 27.04.1998 at the Centraalbureau Voor Schimmelcultures where it received the CBS number 100805.
Pertanto costituisce uno scopo della presente invenzione il mutante di R,sohaeroides RV CBS 100805 incapace di sintetizzare l'enzima uptake idrogenasi coinvolto nel consumo dell'idrogeno. Therefore, an object of the present invention is the mutant of R, sohaeroides RV CBS 100805 unable to synthesize the uptake hydrogenase enzyme involved in the consumption of hydrogen.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione un processo per la produzione di idrogeno che utilizza il mutante R.sohaeroides RV CBS 100805. A further object of the present invention is a process for the production of hydrogen which uses the mutant R.sohaeroides RV CBS 100805.
Breve descrizione delle figure Brief description of the figures
Figura 1; si riporta la mappa di restrizione del plasmide pSM824. Figure 1; the restriction map of the pSM824 plasmid is reported.
Figura 2: mostra la sequenza nucleotidica del frammento di 2.1 kb corrispondente alla regione 3' del gene huoS ed alla regione 5' del gene hupL clonato dal ceppo R.sphaeroides RV wild-type ed utilizzato per la mutagenesi. Figure 2: shows the nucleotide sequence of the 2.1 kb fragment corresponding to the 3 'region of the huoS gene and the 5' region of the hupL gene cloned from the wild-type R.sphaeroides RV strain and used for mutagenesis.
Figura 3: mostra la mappa di restrizione del plasmide pSM825. Figure 3: shows the restriction map of the pSM825 plasmid.
Figura 4: Analisi su gel di agarosio dei prodotti di PCR ottenuti utilizzando come tempisti i DNA genomici di 9 mutanti. Figure 4: Agarose gel analysis of the PCR products obtained using the genomic DNAs of 9 mutants as timings.
Figura 5: Analisi Southern Blot su DNA genomico del clone mutante SMV089 e dei ceppi R.sphaeroides RV e DSM wild-type digeriti con gli enzimi di restrizione MscI e BstXI ed ibridati con una sonda specifica per il gene hupL. Figure 5: Southern blot analysis on genomic DNA of the mutant clone SMV089 and of the wild-type R.sphaeroides RV and DSM strains digested with the restriction enzymes MscI and BstXI and hybridized with a specific probe for the hupL gene.
Figura 6: Saggio spettrofotometrico del ceppo R.sphaeroides RV wild-type e del ceppo mutante SMV089 che mostra la presenza e l'assenza, rispettivamente dell'attività dell'enzima uptake idrogenasi (rappresentata dalla pendenza della retta della cinetica). Figure 6: Spectrophotometric assay of wild-type R.sphaeroides RV strain and SMV089 mutant strain showing the presence and absence, respectively, of the activity of the enzyme uptake hydrogenase (represented by the slope of the kinetics line).
Figura 7: rappresentazione schematica del bioreattore dove: 1 = serbatoio del substrato; 2 = gas argon flussato per mantenere le condizioni di anaerobiosi; 3 = pompa peristaltica che regola l'immissione del terreno nel fotobioreattore; 4 = fotobioreattore; 5 = piastra magnetica per mantenere l'agitazione all'interno del fotobioreattore; 6 = collegamento elettrico per le lampade alogene collocate all'interno del fotobioreattore; 7 = uscita comune del terreno esausto, della biomassa e del biogas; 8 = trappola; 9 = contatore digitale del biogas evoluto; 10 = scarico del biogas; 11 = pompa peristaltica per l’eliminazione del terreno e biomassa esausti; 12 = scarico del terreno e biomassa e sanitizzazione. Figura 8: Andamento dell'attività nitrogenasica (espressa come velocità di scomparsa del substrato per milligrammo di peso secco) durante l'esperimento di fotoproduzione di idrogeno nel ceppo wild-type e nel mutante SMV089. Figure 7: schematic representation of the bioreactor where: 1 = substrate tank; 2 = argon gas fluxed to maintain anaerobic conditions; 3 = peristaltic pump that regulates the introduction of the soil into the photobioreactor; 4 = photobioreactor; 5 = magnetic plate to keep the agitation inside the photobioreactor; 6 = electrical connection for the halogen lamps located inside the photobioreactor; 7 = common output of exhausted soil, biomass and biogas; 8 = trap; 9 = digital meter for advanced biogas; 10 = biogas discharge; 11 = peristaltic pump for the elimination of exhausted soil and biomass; 12 = land discharge and biomass and sanitation. Figure 8: Trend of nitrogenase activity (expressed as substrate disappearance rate per milligram of dry weight) during the hydrogen photoproduction experiment in the wild-type strain and in the SMV089 mutant.
Descrizione dettagliata dell'invenzione Detailed description of the invention
Le [Ni-Fe] uptake idrogenasi sono enzimi eterodimerici , costituiti da una subunità maggiore (hupL ) ed una subunità minore (hupS ) . [Ni-Fe] uptake hydrogenases are heterodimeric enzymes, consisting of a major subunit (hupL) and a minor subunit (hupS).
Questi enzimi sono stati isolati sia da batteri aerobi che anaerobi e, dato l'alto grado di omologia a livello delle sequenze primarie delle subunità strutturali, si ipotizza che derivino da un comune antenato. These enzymes have been isolated from both aerobic and anaerobic bacteria and, given the high degree of homology at the level of the primary sequences of the structural subunits, it is assumed that they derive from a common ancestor.
L'analisi genetica di uptake idrogenasi isolate da microorganismi differenti ha evidenziato che i geni codificanti sono organizzati in unità funzionali ed appaiono disposti sul genoma in modo altamente conservato, anche se l'ordine relativo può variare. The genetic analysis of uptake hydrogenases isolated from different microorganisms has shown that the coding genes are organized in functional units and appear to be arranged on the genome in a highly conserved way, even if the relative order can vary.
Dal punto di vista biochimico, la subunità maggiore ha funzione catalitica, mentre quella minore interviene nel trasferimento degli elettroni allo specifico carrier. From the biochemical point of view, the major subunit has a catalytic function, while the minor one intervenes in the transfer of electrons to the specific carrier.
La presente invenzione si basa sulla considerazione che per ottenere un ceppo mutante incapace di riciclare l'idrogeno prodotto dalla nitrogenasi, l'inattivazione della subunità maggiore sia la più dannosa a livello strutturale. The present invention is based on the consideration that in order to obtain a mutant strain unable to recycle the hydrogen produced by nitrogenase, the inactivation of the major subunit is the most damaging at the structural level.
Pertanto si è pensato di eliminare la capacità di consumare idrogeno mediante inattivazione del gene (hupL) che codifica per la subunità maggiore dell’enzima uptake idrogenasi, dopo aver verificato per via genetica la presenza di tale enzima nel genoma di R.sphaeroides RV che overproduce idrogeno . Therefore, it was decided to eliminate the ability to consume hydrogen by inactivating the gene (hupL) that encodes the major subunit of the enzyme uptake hydrogenase, after having genetically verified the presence of this enzyme in the genome of R. sphaeroides RV that overproduces hydrogen.
Per la sua inattivazione possono essere utilizzate metodiche convenzionali come la mutagenesi random, che si basa sull’impiego di trasposoni, o la mutagenesi mirata che utilizza interposoni. Questi elementi, dopo inserimento nel genoma, oltre a provocare un'interruzione nella sequenza di un gene, che si manifesta attraverso una mutazione fenotipica, conferiscono all'ospite la resistenza ad un particolare antibiotico. For its inactivation, conventional methods such as random mutagenesis, which is based on the use of transposons, or targeted mutagenesis using interposons, can be used. These elements, after insertion into the genome, in addition to causing an interruption in the sequence of a gene, which manifests itself through a phenotypic mutation, give the host resistance to a particular antibiotic.
Secondo una forma di attuazione preferita della presente invenzione, l'inattivazione del gene hupL di R.sphaeroides RV wild-type è stata effettuata mediante inserimento all'interno del gene codificante per la subunità maggiore dell'enzima idrogenasi uptake di una cassetta genica (interposone) che codifica per la resistenza all'antibiotico Trimetoprim e successiva selezione dei ceppi mutagenizzati su un terreno addizionato con questo antibiotico. According to a preferred embodiment of the present invention, the inactivation of the hupL gene of R.sphaeroides RV wild-type was carried out by insertion into the gene coding for the major subunit of the enzyme hydrogenase uptake of a gene cassette (interposon ) coding for the resistance to the antibiotic Trimethoprim and subsequent selection of the mutagenized strains on a medium supplemented with this antibiotic.
Infatti, teoricamente, solo i cloni in cui è avvenuta l'integrazione dell ’interposone nel DNA genomico del ceppo possono crescere su tale terreno selettivo . In fact, theoretically, only the clones in which the integration of the interposon has taken place in the genomic DNA of the strain can grow on this selective medium.
La costruzione dell'interposone è stata condotta isolando un frammento di circa 2100 bp corrispondente alla regione 3' del gene hupS ed alla regione 5' del gene hupL clonato dal ceppo R.sphaeroides RV wild-type. The construction of the interposon was carried out by isolating a fragment of about 2100 bp corresponding to the 3 'region of the hupS gene and the 5' region of the hupL gene cloned from the wild-type R.sphaeroides RV strain.
Tale frammento è stato clonato nel plasmide pUC18 (Boheringer), previamente modificato per eliminare il sito PstI dal multiple cloning site. Successivamente, il plasmide p34E-Tp (D. De Shaezer and D.E. Woods (1996) BioTechniques, 20: 762-764) contenente il gene che codifica per la resistenza all'antibiotico Trimetoprim è stato digerito con l'enzima di restrizione PstI. This fragment was cloned in the plasmid pUC18 (Boheringer), previously modified to eliminate the PstI site from the multiple cloning site. Subsequently, the p34E-Tp plasmid (D. De Shaezer and D.E. Woods (1996) BioTechniques, 20: 762-764) containing the gene encoding resistance to the antibiotic Trimethoprim was digested with the restriction enzyme PstI.
Quindi il frammento Pstl-PstI di circa 650 bp, comprendente il gene strutturale codificante la resistenza al Trimetoprim e la regione promotore a monte di tale gene, è stato ligato al plasmide pUC18 contenente il frammento di 2100 bp isolato da R .sphaeroides wild-type, e la miscela di ligasi risultante è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli XLl-Blue. Then the Pstl-PstI fragment of about 650 bp, comprising the structural gene encoding the resistance to Trimethoprim and the promoter region upstream of this gene, was ligated to the pUC18 plasmid containing the 2100 bp fragment isolated from wild-type R.sphaeroides , and the resulting ligase mixture was used to transform E.coli XL1-Blue cells.
L'analisi di restrizione delle colonie ottenute dopo trasformazione ha confermato l'isolamento di un clone positivo contenente il gene della resistenza al Trimetoprim (gene dhfrllb codificante per una diidrofolato reduttasi di E .coli) inserito nel gene hupL. La sequenza nucleotidica di tale clone ha evidenziato l'inserimento dell'interposone in orientamento opposto rispetto alla direzione di trascrizione del gene codificante per la subunità maggiore dell'enzima idrogenasi uptake. Colony restriction analysis obtained after transformation confirmed the isolation of a positive clone containing the trimethoprim resistance gene (dhfrllb gene encoding an E. coli dihydrofolate reductase) inserted in the hupL gene. The nucleotide sequence of this clone showed the insertion of the interposon in the opposite orientation with respect to the transcription direction of the gene encoding the major subunit of the enzyme hydrogenase uptake.
Il gene hupL interrotto è stato poi clonato in un vettore suicida, cioè un vettore che è incapace di replicarsi in R.sphaeroides, e la costruzione finale è stata introdotta mediante coniugazione nel ceppo E.coli S17-1 e nel ceppo wild-type R.sphaeroides RV reso resistente all'antibiotico rifampicina. The disrupted hupL gene was then cloned into a suicide vector, i.e. a vector that is unable to replicate in R.sphaeroides, and the final construction was introduced by conjugation into E. coli S17-1 strain and wild-type R strain. .sphaeroides RV made resistant to the antibiotic rifampicin.
La selezione dei mutanti di R.sphaeroides RV è stata condotta su Trimetoprim per confermare l’avvenuta ricombinazione fra la copia mutagenizzata del gene hupL. portata dal vettore suicida, e la copia funzionale che si trova sul DNA genomico . The selection of R.sphaeroides RV mutants was conducted on Trimethoprim to confirm the recombination between the mutagenized copy of the hupL gene. carried by the suicidal vector, and the functional copy found on the genomic DNA.
I cloni sono stati caratterizzati mediante amplificazione genica del frammento mutagenizzato. In un caso, si è ottenuto un frammento di DNA con una dimensione maggiore rispetto al controllo negativo, che evidenziava la presenza dell 'interposone al suo interno. Su tale clone positivo è stata effettuata l’analisi Southern blot per confermare la natura ed il sito dell'evento di mutagenesi. Il DNA genomico è stato estratto, digerito con gli enzimi di restrizione MscI oppure BstXI ed ibridizzato con un oligonucleotide sintetico specifico per il gene hupL. Il DNA genomico wild-type, preparato nelle stesse condizioni è stato utilizzato come controllo negativo. The clones were characterized by gene amplification of the mutagenized fragment. In one case, a DNA fragment with a larger size than the negative control was obtained, which showed the presence of the interposon inside it. Southern blot analysis was performed on this positive clone to confirm the nature and site of the mutagenesis event. The genomic DNA was extracted, digested with the restriction enzymes MscI or BstXI and hybridized with a synthetic oligonucleotide specific for the hupL gene. Wild-type genomic DNA prepared under the same conditions was used as a negative control.
Anche in questo caso è stata evidenziata una banda di ibridazione delle dimensioni attese. Il clone positivo, denominato SMV089, è stato caratterizzato fisiologicamente mediante crescita in differenti terreni. Also in this case a hybridization band of the expected size was highlighted. The positive clone, named SMV089, was physiologically characterized by growth in different media.
Questo clone ha mostrato, similmente al ceppo wild-type, una stessa capacità di crescita sia in terreno completo, ad esempio aSy (J.Miyake, X.Y. Mao and S.Kawamura, j.Ferment. Technol., 62:531-535, 1984), che in terreno specifico per la produzione di idrogeno (E.Nakada, Y.Kaji, K.Aoyama, S.Nishikata, Y.Asada and J.Miyake). This clone showed, similarly to the wild-type strain, the same growth capacity both in complete medium, e.g. aSy (J.Miyake, X.Y. Mao and S.Kawamura, j.Ferment. Technol., 62: 531-535, 1984), and in a specific medium for the production of hydrogen (E.Nakada, Y.Kaji, K.Aoyama, S.Nishikata, Y.Asada and J.Miyake).
La determinazione dell'attività dell'enzima idrogenasi uptake, condotta mediante analisi spettrofotometrica sul clone SMV089, è risultata negativa, confermando così l'incapacità del ceppo mutante a consumare l 'idrogeno prodotto. The determination of the activity of the uptake hydrogenase enzyme, carried out by spectrophotometric analysis on the SMV089 clone, was negative, thus confirming the inability of the mutant strain to consume the hydrogen produced.
Inoltre, sorprendentemente, si è osservata una attività dell'enzima nitrogenasi, responsabile della produzione di H2,più elevata (in media il 46% più attiva) rispetto al ceppo wild-type. Moreover, surprisingly, a higher activity of the enzyme nitrogenase, responsible for the production of H2, was observed (on average 46% more active) compared to the wild-type strain.
L'analisi dei poliidrossibutirrati (secondo il metodo di Brandi et al.,(1988), Appi. Environ. Microbiol. .54, 1977-1982) ha mostrato, inoltre, che la concentrazione dell'estere metilico dell'acido β-idrossibutirrico nel ceppo mutante è inferiore rispetto a quella del wild-type. The analysis of polyhydroxybutyrates (according to the method of Brandi et al., (1988), Appi. Environ. Microbiol. .54, 1977-1982) also showed that the concentration of the methyl ester of β-hydroxybutyric acid in the mutant strain it is lower than that of the wild-type.
Il mutante di R.sphaeroides RV della presente invenzione è quindi particolarmente adatto nello sviluppo di processi di fermentazione per la produzione di idrogeno. The R.sphaeroides RV mutant of the present invention is therefore particularly suitable in the development of fermentation processes for the production of hydrogen.
La fermentazione può essere condotta in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, tracce di vitamine o di amminoacidi . Fermentation can be carried out in an aqueous medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen as well as various cations, anions and, possibly, traces of vitamins or amino acids.
Sorgenti di carbonio assimilabili includono acidi organici quale piruvato, malato, lattato, succinato od altre sorgenti di carbonio convenzionali. Fonti di azoto possono essere scelti, ad esempio, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne. Similar carbon sources include organic acids such as pyruvate, malate, lactate, succinate or other conventional carbon sources. Sources of nitrogen can be selected, for example, from mineral ammonium salts, such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride or ammonium carbonate and urea or materials containing organic or inorganic nitrogen such as peptone, yeast extract or extract of meat.
Esempi non limitativi di cationi ed anioni possono essere scelti tra potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese e nitrati. Non-limiting examples of cations and anions can be selected from potassium, sodium, magnesium, iron, calcium, acid phosphates, sulphates, chlorides, manganese and nitrates.
Secondo una forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione si utilizza come substrato un materiale derivante dalla fermentazione acidogenica controllata di rifiuti mercatali (E. D'Addarlo et al. (1992), Wat. Sci. Tech. 27, 183-192) avente la composizione riportata nell'esempio 6. According to a preferred embodiment of the process of the present invention, a material deriving from the controlled acidogenic fermentation of commercial waste is used as the substrate (E. D'Addarlo et al. (1992), Wat. Sci. Tech. 27, 183-192) having the composition reported in example 6.
La fermentazione viene condotta in anaerobiosi, garantita dal flusso continuo di argon, in presenza di luce con una intensità luminosa compresa tra 6.000 e 20.000 lux, ad una temperatura compresa tra 25' e 40'C, preferibilmente tra 30* e 37’C. Fermentation is carried out in anaerobiosis, guaranteed by the continuous flow of argon, in the presence of light with a light intensity between 6,000 and 20,000 lux, at a temperature between 25 'and 40'C, preferably between 30 * and 37'C.
Il pH del mezzo di fermentazione è mantenuto entro valori compresi tra 6,50 e 8,0 e di preferenza tra 6,8 e 7,3. La regolazione del pH può essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio. Preferibilmente si utilizza una soluzione di idrossido di sodio 1-5 M. The pH of the fermentation medium is kept within values between 6.50 and 8.0 and preferably between 6.8 and 7.3. The pH adjustment can be carried out, for example, by adding a basic aqueous solution such as an aqueous solution of ammonia, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium carbonate or potassium. A 1-5 M sodium hydroxide solution is preferably used.
Durante la fermentazione si procede al recupero dell'idrogeno mediante tecniche convenzionali. During fermentation, the hydrogen is recovered using conventional techniques.
Il processo può essere condotto in continuo in apparecchiature del tipo mostrato in figura 7. The process can be carried out continuously in equipment of the type shown in figure 7.
Operando nelle condizioni preferite, si è osservato che la velocità di produzione di H2 da parte del ceppo mutante SMV089 si manteneva più elevata rispetto al ceppo wild-type nel corso di tutto l'esperimento, determinando un incremento della quantità totale di idrogeno fotoprodotto, a parità di durata delle fermentazioni, del 47% se riferita a litro di reattore e del 66% se riferita a milligrammo di peso secco della biomassa. Operating under the preferred conditions, it was observed that the production rate of H2 by the SMV089 mutant strain remained higher than the wild-type strain throughout the experiment, resulting in an increase in the total quantity of photoproduced hydrogen, a equal duration of fermentation, 47% if referring to liter of reactor and 66% if referring to milligram of dry weight of the biomass.
La migliore produttività riscontrata nel ceppo mutante si correla sia ad una più elevata attività dell'enzima nitrogenasi, che all'inattivazione dell'uptake idrogenasi. The improved productivity found in the mutant strain is correlated both to a higher activity of the nitrogenase enzyme and to the inactivation of the hydrogenase uptake.
Tali risultati sono stati confermati in un secondo esperimento in cui il ceppo mutante è stato fermentato nelle condizioni preferite, ma utilizzando come substrato un differente lotto di materiale di scarto. La comparazione ha di nuovo evidenziato, a prescindere dalla variabilità correlata alla differente concentrazione dei componenti nei diversi lotti di terreno, le migliori prestazioni del ceppo mutante in termini di fotoproduzione di H2. These results were confirmed in a second experiment in which the mutant strain was fermented under the preferred conditions, but using a different batch of waste material as substrate. The comparison has again highlighted, regardless of the variability related to the different concentration of the components in the different lots of medium, the best performance of the mutant strain in terms of H2 photoproduction.
I seguenti esempi, che hanno l'unico scopo di descrivere in maggior dettaglio la presente invenzione, non devono in alcun modo essere interpretati come una limitazione agli scopi della stessa. The following examples, which have the sole purpose of describing the present invention in greater detail, must in no way be interpreted as a limitation to the purposes thereof.
Esempio 1 Example 1
Estrazione del DNA genomico da R.sphaeroides RV Una beuta da 500 mi contenente 100 mi di terreno LB (10 g/1 triptone, 5 g/1 yeast extract, 10 g/1 NaCl) è stata inoculata con il ceppo R .sphaeroides RV (fornito dal National Institute of Bioscience and Human-technology (NIBH), Tsukuba, Giappone) e la miscela risultante è stata mantenuta sotto agitazione (220 rpm) a 30°C per 48 in condizioni di aerobiosi/buio. Genomic DNA extraction from R.sphaeroides RV A 500 ml flask containing 100 ml of LB medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 NaCl) was inoculated with the R .sphaeroides RV strain (provided by the National Institute of Bioscience and Human-technology (NIBH), Tsukuba, Japan) and the resulting mixture was stirred (220 rpm) at 30 ° C for 48 under aerobic / dark conditions.
Quindi, le cellule sono state recuperate mediante centrifugazione della brodocoltura in un rotore SS34 modello Sorvall RC-5B (a 4°C e 5000 rpm per 10 minuti) e poi lavate (2x120 mi) con la soluzione tampone TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4). La sospensione risultante è stata nuovamente centrifugata come sopra riportato e le cellule sono state recuperate e risospese in 9,5 mi di soluzione tampone TE. Dopo aggiunta di 0,5 mi di 10% SDS (sodio dodecilsolfato) e 50 μl di una soluzione di Proteinasi K (20 mg/ml), la sospensione è stata incubata a 37°C per 1 ora. Then, the cells were recovered by centrifugation of the broth culture in a Sorvall RC-5B model SS34 rotor (at 4 ° C and 5000 rpm for 10 minutes) and then washed (2x120 ml) with TE buffer solution (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4). The resulting suspension was centrifuged again as reported above and the cells were recovered and resuspended in 9.5 ml of TE buffer solution. After addition of 0.5 ml of 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 50 μl of a solution of Proteinase K (20 mg / ml), the suspension was incubated at 37 ° C for 1 hour.
Quindi sono stati addizionati 1,8 mi di NaCl 5 M e 1,5 mi di una soluzione costituita da 10 % esadeciltrimetil ammonio bromuro (CTAB) in 0,7 M NaCl e la soluzione risultante è stata incubata a 65 “C per 20 minuti. Then 1.8 ml of 5 M NaCl and 1.5 ml of a solution consisting of 10% hexadecyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) in 0.7 M NaCl were added and the resulting solution was incubated at 65 "C for 20 minutes .
Successivamente la soluzione è stata deproteinizzata con uguale volume di cloroformio: isoamil alcol (24:1, v/v) ed il DNA è stato precipitato con 0,6 volumi di isopropanolo. Subsequently the solution was deproteinized with equal volume of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1, v / v) and the DNA was precipitated with 0.6 volumes of isopropanol.
Il DNA è stato lavato con 1 mi di etanolo (70%) e recuperato con una bacchetta di vetro. Infine il DNA raccolto è stato disciolto in 4 mi di TE e la sua concentrazione è stata determinata mediante lettura spettrofotometrica a 260 nm. The DNA was washed with 1 ml of ethanol (70%) and recovered with a glass rod. Finally, the collected DNA was dissolved in 4 ml of TE and its concentration was determined by spectrophotometric reading at 260 nm.
Il DNA genomico è stato ulteriormente purificato mediante centrifugazione su gradiente di CsCl (1%) contenente 0,1 mg/ml di bromuro di etidio (55.000 rpm per 16 ore in rotore Beckman V65Ti). The genomic DNA was further purified by CsCl gradient centrifugation (1%) containing 0.1 mg / ml of ethidium bromide (55,000 rpm for 16 hours in a Beckman V65Ti rotor).
La banda di DNA è stata visualizzata sotto luce UV ed il bromuro di etidio è stato allontanato mediante estrazione con butanolo saturo in acqua. Dopo dialisi contro tampone TE, il DNA è stato precipitato con etanolo e risospeso nel volume desiderato. The DNA band was visualized under UV light and the ethidium bromide was removed by extraction with butanol saturated in water. After dialysis against TE buffer, the DNA was precipitated with ethanol and resuspended in the desired volume.
Esempio 2 Example 2
Isolamento di un frammento di DNA che comprende la porzione 3 ‘-terminale del gene hupS e la porzione 5'-terminale del gene hupL Isolation of a DNA fragment comprising the 3 '-terminal portion of the hupS gene and the 5'-terminal portion of the hupL gene
Il DNA genomico ottenuto come riportato nell'esempio 1 è stato amplificato mediante la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR), secondo le indicazioni riportate da Leung et al. (Leung D.W., Chen E., Goeddel D.V., Technique - a Journal of methods in celi and molecular biology, 1, n° 1 (1989): pp. 11-15), utilizzando come primers la seguente coppia di oligonucleotidi sintetizzati sulla base di sequenze nucleotidiche conservate dei geni hupS e hupL e ottenute mediante la tecnica dell'IPCR su DNA genomico di R, sphaeroides DSM158: The genomic DNA obtained as reported in example 1 was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique, according to the indications reported by Leung et al. (Leung D.W., Chen E., Goeddel D.V., Technique - a Journal of methods in celi and molecular biology, 1, n ° 1 (1989): pp. 11-15), using as primers the following pair of oligonucleotides synthesized on the base of conserved nucleotide sequences of the hupS and hupL genes and obtained by the IPCR technique on the genomic DNA of R, sphaeroides DSM158:
(1) 5’AATACAAGGG CAACTACATT C 3' (FORWARD) (1) 5'AATACAAGGG CAACTACATT C 3 '(FORWARD)
(2) 5'GCCCTCGACC TGGTTCTTGA TGTCCT 3' (REVERSE) L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal Cycler 480 (Perkin -Elmer Cetus) utilizzando una miscela di reazione (100 μl) contenente: (2) 5'GCCCTCGACC TGGTTCTTGA TGTCCT 3 '(REVERSE) Amplification was carried out in a DNA Thermal Cycler 480 (Perkin -Elmer Cetus) apparatus using a reaction mixture (100 μl) containing:
- 500 ng di DNA genomico - 500 ng of genomic DNA
- 10 mM Tris HC1 pH 8,3 - 10 mM Tris HC1 pH 8.3
- 2 mM MgSO4 - 2 mM MgSO4
- 25 mM KC1 - 25 mM KC1
- 5 mM (NHJ2S04 - 5 mM (NHJ2S04
- 100 picomoli dei due primers - 100 picomoles of the two primers
- 200 μΜ di dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - 200 μΜ of dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
2,5 Unità di Pwo DNA polimerasi (Boehringer Mannheim) . 2.5 Units of Pwo DNA polymerase (Boehringer Mannheim).
Dopo denaturazione per 2 minuti a 98’C, è stato fatto partire il programma ciclico, che comprendeva : After denaturation for 2 minutes at 98 C, the cyclical program was started, which included:
1 minuto a 98°C (denaturazione) 1 minute at 98 ° C (denaturation)
1 minuto a 60°C (annealing) 1 minute at 60 ° C (annealing)
2 minuti a 72°C (allungamento) 2 minutes at 72 ° C (elongation)
per 25 cicli complessivi, seguita da 8 minuti a 72°C (estensione finale). for a total of 25 cycles, followed by 8 minutes at 72 ° C (final extension).
Il prodotto di amplificazione così ottenuto è stato trattato con fenolo-cloroformio (1:1), precipitato con NaCl (1/10 vol/vol) ed EtOH (2 voi) e risospeso in 20 μl di H20. Quindi un frammento di circa 2100 bp è stato purificato su gel low-melting (SeaPlaque, FMC BioProducts) allo 0,8% in TAE (Tris acetato EDTA). Dopo eluizione dal gel, tale frammento è stato clonato nel plasmide pUC18 (Boheringer) previamente modificato per eliminare il sito PstI dal multiple cloning site. In pratica il plasmide pUC18 è stato digerito con gli enzimi di restrizione HindiI e Sphl, che fiancheggiano il sito PstI nel polylinker; le estremità sono state smussate incubando a 30°C per 15 minuti con DNA polimerasi Klenow e ligate di nuovo con T4 DNA ligasi. The resulting amplification product was treated with phenol-chloroform (1: 1), precipitated with NaCl (1/10 vol / vol) and EtOH (2 vol.) And resuspended in 20 μl of H20. Then a fragment of about 2100 bp was purified on low-melting gel (SeaPlaque, FMC BioProducts) at 0.8% in TAE (Tris acetate EDTA). After elution from the gel, this fragment was cloned in the plasmid pUC18 (Boheringer) previously modified to eliminate the PstI site from the multiple cloning site. In practice, the pUC18 plasmid was digested with the restriction enzymes HindiI and Sphl, which flank the PstI site in the polylinker; the ends were blunted by incubating at 30 ° C for 15 minutes with Klenow DNA polymerase and ligated again with T4 DNA ligase.
Il plasmide così ottenuto è stato digerito di nuovo con l'enzima di restrizione Smal e ligato in presenza del frammento di DNA in 30 pi di miscela di reazione (DNA 5 pg/ml). Due pi di detta miscela sono stati utilizzati per trasformare cellule di E .coli XLl-Blue rese elettrocompetenti (Dower W.J. et al., Nucleic Acids Research, 16. 6127-6145, 1988). I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB agarizzato contenente 100 pg/ml di Ampicillina. The plasmid thus obtained was digested again with the restriction enzyme Smal and ligated in the presence of the DNA fragment in 30 µl of reaction mixture (DNA 5 µg / ml). Two more of said mixture were used to transform electrocompetent XL1-Blue E. coli cells (Dower W.J. et al., Nucleic Acids Research, 16.6127-6145, 1988). The transformants were selected on plates of LB agar medium containing 100 pg / ml of Ampicillin.
L'analisi del DNA plasmidico estratto dai cloni positivi ha evidenziato la presenza di un frammento di circa 2100 bp corrispondente alle dimensioni attese. Il plasmide contenuto nel clone positivo è stato denominato pSM824 (Figura 1). The analysis of the plasmid DNA extracted from the positive clones revealed the presence of a fragment of about 2100 bp corresponding to the expected size. The plasmid contained in the positive clone was named pSM824 (Figure 1).
Il plasmide è stato poi sottoposto ad analisi di sequenza utilizzando il DNA sequencer ABI 373 (Perkin Elmer). La sequenza ha confermato che il frammento di 2100 bp corrispondeva alla regione di DNA comprendente circa 650 paia di basi (bp) del gene hupS e circa 1450 bp del gene hupL. The plasmid was then subjected to sequence analysis using the ABI 373 DNA sequencer (Perkin Elmer). The sequence confirmed that the 2100 bp fragment corresponded to the DNA region comprising approximately 650 base pairs (bp) of the hupS gene and approximately 1450 bp of the hupL gene.
Esempio 3 Example 3
Inattivazione del gene hupL Inactivation of the hupL gene
Il plasmide p34E-Tp (D. De Shaezer and D.E. Woods (1996) BioTechniques, 20: 762-764) (5 μg) contenente il gene che codifica per la resistenza all'antibiotico Trimetoprim (dhfrllb), preceduto dal promotore forte P1 di E. coli è stato digerito con 5 unità dell'enzima di restrizione PstI (Boehringer) a 37*C per 1 ora. La miscela di digestione è stata caricata su gel di agarosio low melting (Seaplaque) allo 0,6% e corsa a 70 volts per 4 ore. The p34E-Tp plasmid (D. De Shaezer and D.E. Woods (1996) BioTechniques, 20: 762-764) (5 μg) containing the gene encoding resistance to the antibiotic Trimethoprim (dhfrllb), preceded by the strong P1 promoter of E. coli was digested with 5 units of the restriction enzyme PstI (Boehringer) at 37 ° C for 1 hour. The digestion mix was loaded onto low melting (Seaplaque) 0.6% agarose gel and run at 70 volts for 4 hours.
Il frammento Pstl-PstI di circa 650 bp, comprendente il gene strutturale codificante la resistenza al Trimetoprim e la regione promotore a monte di tale gene, è stato eluito dal gel. The approximately 650 bp Pstl-PstI fragment, comprising the structural gene encoding the trimethoprim resistance and the promoter region upstream of this gene, was eluted from the gel.
Parallelamente il plasmide pSM824 (2 μg) è stato digerito con l'enzima PstI. Quindi il plasmide pSM824 digerito ed il frammento Pstl-PstI sono stati ligati in 20 μl di tampone di ligazione, in presenza di 1 unità di T4 DNA ligasi utilizzando un rapporto plasmide frammento di 1:5. La reazione di ligasi è stata condotta a 16 "C per circa 16 ore. In parallel, the pSM824 plasmid (2 μg) was digested with the PstI enzyme. Then the digested pSM824 plasmid and the Pstl-PstI fragment were ligated in 20 μl of ligation buffer, in the presence of 1 unit of T4 DNA ligase using a plasmid to fragment ratio of 1: 5. The ligase reaction was carried out at 16 ° C for about 16 hours.
La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule elettrocompetenti di E .coli XLl-blue. La selezione dei trasformanti è stata condotta su piastre di terreno LB agarizzato contenenti 1,5 mg/ml di Trimetoprim e 100 ^g/ml di ampicillina . The ligase mixture was used to transform electrocompetent E. coli XLl-blue cells. The selection of the transformants was carried out on plates of LB agarized medium containing 1.5 mg / ml of Trimethoprim and 100 ^ g / ml of ampicillin.
L'analisi dei cloni positivi ha evidenziato la presenza di un clone con l'inserimento atteso del gene della resistenza al Trimetoprim nel gene hupL. L'analisi di restrizione e l'analisi di sequenza nucleotidica ha rivelato che il gene dhfrll era inserito nell'orientamento opposto rispetto al gene hupL . Analysis of the positive clones revealed the presence of a clone with the expected insertion of the trimethoprim resistance gene into the hupL gene. Restriction analysis and nucleotide sequence analysis revealed that the dhfrll gene was inserted in the opposite orientation to the hupL gene.
Esempio 3 Example 3
Il clone positivo è stato sottoposto ad amplificazione genica con Pwo DNA polimerasi in presenza dei primers FORWARD e REVERSE descritti sopra, in maniera da recuperare l’intero frammento di DNA costituito dalla regione comprendente le due porzioni dei geni hupS e hupL e in cui fosse già presente l'interposone all'interno di hupL. The positive clone was subjected to gene amplification with Pwo DNA polymerase in the presence of the FORWARD and REVERSE primers described above, in order to recover the entire DNA fragment consisting of the region comprising the two portions of the hupS and hupL genes and in which it was already present the interposon within hupL.
Nel contempo, il plasmide suicida pWKR102A è stato digerito con l'enzima di restrizione HindlII e trattato con Klenow Polimerasi in presenza di dNTPs a 25*C per 30 minuti per creare delle estremità compatibili. At the same time, the suicide plasmid pWKR102A was digested with the restriction enzyme HindlII and treated with Klenow Polymerase in the presence of dNTPs at 25 ° C for 30 minutes to create compatible ends.
Il prodotto di amplificazione è stato dunque miscelato al vettore così preparato e la miscela è stata incubata in tampone di ligazione contenente 5 unità di T4 DNA ligasi. La reazione è stata condotta a 23’C per 16 ore. The amplification product was then mixed with the vector thus prepared and the mixture was incubated in ligation buffer containing 5 units of T4 DNA ligase. The reaction was carried out at 23'C for 16 hours.
La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule competenti di E.coli S17-1 mediante elettroporazione. La selezione dei trasformanti è stata effettuata su piastre di LB agar contenenti 20 μg/ml di cloramfenicolo e 1,5 mg/ml di Trimetoprim. Tra i cloni positivi è stato isolato un clone contenente un plasmide, indicato pSM825 (figura 3), con l'inserto corretto. The ligase mixture was used to transform competent E.coli S17-1 cells by electroporation. The selection of transformants was carried out on LB agar plates containing 20 μg / ml of chloramphenicol and 1.5 mg / ml of trimethoprim. A clone containing a plasmid, designated pSM825 (Figure 3), with the correct insert was isolated from the positive clones.
Il clone contenente pSM825 è stato chiamato SMC508. Esempio 4 The clone containing pSM825 was named SMC508. Example 4
Coniugazione di E.coli con R.sphaeroides RV Conjugation of E. coli with R.sphaeroides RV
Il ceppo E.coli SMC508 è stato inoculato in 5 mi di terreno LB contenente 20 μg/ml di cloramfenicolo e coltivato a 37’C per una notte. The E. coli SMC508 strain was inoculated in 5 ml of LB medium containing 20 μg / ml of chloramphenicol and cultured at 37'C for one night.
Il ceppo R.sphaeroides RV wild-type è stato reso resistente all'antibiotico rifampicina (Rif) mediante pressione selettiva fino ad un massimo di 150 yg/ml di antibiotico . The wild-type R.sphaeroides RV strain was made resistant to the antibiotic rifampicin (Rif) by selective pressure up to a maximum of 150 yg / ml of antibiotic.
Il ceppo R .sphaeroides RV (RifR) è stato inoculato in 40 mi di terreno aSy avente la seguente composizione: The strain R.sphaeroides RV (RifR) was inoculated in 40 ml of aSy medium having the following composition:
in condizioni aerobiche al buio per due giorni. under aerobic conditions in the dark for two days.
Quindi, 3 mi della coltura di R.sphaeroides RV (RifR) sono stati miscelati in tubi Falcon con un volume di SMC508 corrispondente a 1/10 della densità ottica della coltura di R,sphaeroides RV. Then, 3 ml of the culture of R. sphaeroides RV (RifR) was mixed in Falcon tubes with a volume of SMC508 corresponding to 1/10 of the optical density of the culture of R, sphaeroides RV.
I batteri sono stati recuperati per centrifugazione a 3000 rpm, a temperatura ambiente per 10 minuti, risospesi in 100 μΐ di terreno aSy e aliquote di tale sospensione sono state distribuite su piastre dello stesso terreno agarizzato. The bacteria were recovered by centrifugation at 3000 rpm, at room temperature for 10 minutes, resuspended in 100 μΐ of aSy medium and aliquots of this suspension were distributed on plates of the same agar medium.
Le piastre sono state incubate a 35°C per 6 ore così da consentire lo scambio di materiale genetico fra i due tipi di cellule. Quindi, le cellule sono state recuperate dalle piastre, risospese in 400 μl di terreno aSy ed aliquotate su piastre di terreno The plates were incubated at 35 ° C for 6 hours to allow the exchange of genetic material between the two types of cells. Then, the cells were recovered from the plates, resuspended in 400 μl of aSy medium and aliquoted onto medium plates.
aSy contenente rifampicina (150 pg/ml) e Trimetoprim (25 μg/ml). aSy containing rifampicin (150 pg / ml) and trimethoprim (25 μg / ml).
Dopo 10 giorni di crescita al buio in condizioni aerobiche, su ciascuna piastra sono state ottenute numerose colonie Trimetoprim-resistenti (TpR), rifampicina resistenti (Rifr). After 10 days of growth in the dark under aerobic conditions, numerous trimethoprim-resistant (TpR), rifampin-resistant (Rifr) colonies were obtained on each plate.
Dieci colonie sono state selezionate per una caratterizzazione approfondita. Da questi cloni è stato estratto il DNA genomico e su questo prodotto si è effettuato un esperimento di PCR con i seguenti oligonucleotidi primers: Ten colonies were selected for in-depth characterization. Genomic DNA was extracted from these clones and a PCR experiment was performed on this product with the following oligonucleotide primers:
(3) 5' AACGTGGACG ATCAGGGCAT CAT 3’ (FORWARD) (4) 5' CCATAGGCAT ACCAGGAGTG ATCGA 3· (REVERSE). (3) 5 'AACGTGGACG ATCAGGGCAT CAT 3' (FORWARD) (4) 5 'CCATAGGCAT ACCAGGAGTG ATCGA 3 · (REVERSE).
Il prodotto di amplificazione atteso è un frammento del gene hupL, in cui la presenza dell 'interposone è evidenziata mediante incremento della dimensione del prodotto di circa 650 bp (figura 4). The expected amplification product is a fragment of the hupL gene, in which the presence of the interposon is highlighted by increasing the size of the product of about 650 bp (Figure 4).
Uno dei dieci cloni ha prodotto un frammento delle dimensioni attese (1600 bp) derivante dal processo di doppio cross-over sul DNA genomico. Un altro clone ha prodotto due frammenti (1600 bp e 950 bp, corrispondente al frammento wild-type), frutto di una ricombinazione avvenuta con singolo cross-over che aveva generato sul DNA genomico una duplicazione genica e cioè la presenza di un gene mutato accanto al gene wild-type. Infine otto cloni hanno prodotto esclusivamente il frammento wild-type, testimoniando così di aver sviluppato spontaneamente la resistenza all'antibiotico Trimetoprim. One of the ten clones produced a fragment of the expected size (1600 bp) resulting from the double cross-over process on the genomic DNA. Another clone produced two fragments (1600 bp and 950 bp, corresponding to the wild-type fragment), the result of a recombination occurred with a single cross-over that had generated a gene duplication on the genomic DNA, i.e. the presence of a mutated gene next to it. to the wild-type gene. Finally, eight clones produced exclusively the wild-type fragment, thus proving that they spontaneously developed resistance to the antibiotic Trimethoprim.
Per confermare il sito di mutagenesi, sono stati condotti degli esperimenti mediante analisi Southern Blot con il DNA genomico isolato dall'unico clone positivo. To confirm the site of mutagenesis, Southern Blot analysis experiments were conducted with genomic DNA isolated from the single positive clone.
Il ceppo R.sphaeroides RV wild-type (Rifp) ed il mutante sono stati inoculati in 5 mi di LB contenente 20 pg/ml di kanamicina ed incubati a 30 °C per 2 giorni in condizioni aerobiche al buio. The strain R.sphaeroides RV wild-type (Rifp) and the mutant were inoculated in 5 ml of LB containing 20 pg / ml of kanamycin and incubated at 30 ° C for 2 days under aerobic conditions in the dark.
Poi il DNA genomico è stato estratto e digerito con gli enzimi di restrizione MscI oppure BstXI. Then the genomic DNA was extracted and digested with the restriction enzymes MscI or BstXI.
I prodotti della digestione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Dopo la separazione elettroforetica è stato eseguito un Southern blot secondo procedure standard e la membrana su cui era stato fissato il DNA è stata sottoposta ad ibridazione con una sonda specifica per il gene hupL. The digestion products were analyzed by agarose gel electrophoresis. After the electrophoretic separation, a Southern blot was performed according to standard procedures and the membrane on which the DNA was fixed was subjected to hybridization with a specific probe for the hupL gene.
Lo sviluppo dell'autoradiografia ha mostrato la presenza nel DNA genomico del ceppo mutante digerito con Bstxi di un'unica banda di circa 700 bp più alta rispetto a quella del ceppo wild-type (figura 5). Questo confermava l'avvenuto doppio cross-over e quindi la presenza sul DNA genomico del gene huoL inattivato per mutagenesi da interposone. The development of autoradiography showed the presence in the genomic DNA of the mutant strain digested with Bstxi of a single band approximately 700 bp higher than that of the wild-type strain (Figure 5). This confirmed the double cross-over and therefore the presence on the genomic DNA of the huoL gene inactivated by interposon mutagenesis.
Il mutante è stato indicato con la sigla SMV089. Esempio 5 The mutant was indicated with the initials SMV089. Example 5
Crescita del ceppo mutante SMV089 Growth of the SMV089 mutant strain
Il ceppo mutante SMV089 è stato coltivato in diversi terreni e la sua crescita è stata confrontata con quella del ceppo wild-type. The SMV089 mutant strain was grown in different media and its growth was compared to that of the wild-type strain.
I terreni utilizzati avevano le seguenti composizioni : The soils used had the following compositions:
I terreni sono stati sterilizzati per filtrazione con filtri NalgeneR da 0,2 pm e ogni traccia di ossigeno è stata eliminata gorgogliando argon per 30 minuti. The media was sterilized by filtration with 0.2 µm NalgeneR filters and any trace of oxygen was eliminated by bubbling argon for 30 minutes.
Le colture sono state incubate alla luce con lampade al tungsteno ad un'intensità di 9.500 lux, a 30°C per 3 giorni in provette per anaerobiosi contenenti 24 mi di terreno. Al termine della crescita sono state misurate le densità ottiche a 600 mn. I risultati sono riportati in Tabella 1. Cultures were incubated in light with tungsten lamps at an intensity of 9,500 lux, at 30 ° C for 3 days in anaerobic tubes containing 24 ml of medium. At the end of the growth the optical densities at 600 nm were measured. The results are reported in Table 1.
Dai valori riportati in Tabella, si osserva che la mutazione nel gene huoL non ha influenzato negativamente la capacità di crescita del ceppo mutante, anche in terreno sintetico (B) stimolante la produzione di idrogeno. From the values reported in the Table, it is observed that the mutation in the huoL gene did not negatively affect the growth capacity of the mutant strain, even in synthetic medium (B) stimulating the production of hydrogen.
Esempio 6 Example 6
Saggio di idrogenasi uptake Uptake hydrogenase assay
Per evidenziare l'attività catalitica dell'enzima idrogenasi uptake è stato messo a punto un saggio colorimetrico in vibro basato sulla decolorazione di una soluzione di blu di metilene. To highlight the catalytic activity of the uptake hydrogenase enzyme, a vibro colorimetric assay was developed based on the discoloration of a solution of methylene blue.
In presenza di uptake idrogenasi attiva, l'idrogeno viene ossidato e gli elettroni vengono trasferiti ad un accettore artificiale, nel nostro caso il blu di metilene, che, riducendosi, cambia colorazione. In the presence of active hydrogenase uptake, the hydrogen is oxidized and the electrons are transferred to an artificial acceptor, in our case methylene blue, which, when reduced, changes color.
E' possibile seguire spettrofotometricamente, all’opportuna lunghezza d'onda, la scomparsa del colore blu che fa seguito alla riduzione dell 'accettore di elettroni artificiale. It is possible to follow spectrophotometrically, at the appropriate wavelength, the disappearance of the blue color that follows the reduction of the artificial electron acceptor.
Il saggio è stato realizzato nel seguente modo: in una cuvetta di vetro filettata e corredata di tappo a vite con setto forabile, è stato introdotto 1 mi di una soluzione di Tris HC120 mM, pH 8 e blu di metilene 120 μΜ. La cuvetta è stata sigillata e, attraverso un ago che fora il setto di gomma, si è fatto gorgogliare nella soluzione idrogeno molecolare per 5 minuti. In seguito sono stati iniettati con microsiringa 50 μl di coltura anaerobica del ceppo mutante (o di R. sphaeroides RV, usato come controllo positivo) e la cuvetta è stata Immediatamente posta nello spettrofotometro dove è stata seguita la cinetica di discoloramento della soluzione a 570 nm. La pendenza della curva ottenuta è direttamente proporzionale all'attività dell'enzima idrogenasi uptake. The assay was carried out as follows: 1 ml of a solution of Tris HC120 mM, pH 8 and methylene blue 120 μΜ was introduced into a threaded glass cuvette equipped with a screw cap with pierceable septum. The cuvette was sealed and, through a needle piercing the rubber septum, it was bubbled in the molecular hydrogen solution for 5 minutes. Subsequently, 50 μl of anaerobic culture of the mutant strain (or of R. sphaeroides RV, used as a positive control) was injected with a microsyringe and the cuvette was immediately placed in the spectrophotometer where the discoloration kinetics of the solution at 570 nm were followed. . The slope of the curve obtained is directly proportional to the activity of the uptake hydrogenase enzyme.
Esempio 7 Example 7
Saggio di nitroaenasi Nitroaenase assay
Per evidenziare l'attività catalitica dell'enzima nitrogenasi è stato messo a punto un saggio in vitro al gas-cromatografo, basato sulla riduzione dell'acetilene. In presenza di nitrogenasi attiva, l'acetilene viene ridotto ad etilene. La reazione è altamente specifica poiché nessun altro sistema enzimatico è in grado di ridurre l'acetilene. E' possibile seguire la scomparsa dell'acetilene e la relativa comparsa dell'etilene mediante analisi al gas-cromatografo. To highlight the catalytic activity of the nitrogenase enzyme, an in vitro gas chromatograph assay was set up, based on the reduction of acetylene. In the presence of active nitrogenase, acetylene is reduced to ethylene. The reaction is highly specific as no other enzyme system is capable of reducing acetylene. It is possible to follow the disappearance of acetylene and the relative appearance of ethylene by gas chromatograph analysis.
Il saggio è stato realizzato nel seguente modo: dal fotobioreattore, mantenuto sotto atmosfera di argon, sono stati prelevati 6 mi di brodocoltura e trasferiti in una provetta da 20 mi munita di tappo a tenuta. Il campione è stato incubato a 30’C per 5 minuti sotto agitazione e alla luce fornita da una lampada da 200 watt. Quindi sono stati aggiunti 2 mi di acetilene e, a tempi stabiliti (0, 5, 15 e 20 minuti), sono stati prelevati 50 μΐ di spazio di testa ed analizzati al GC. La colonna utilizzata è una HayeSepR S di 2 m di lunghezza e 1 min di diametro e l'analisi è eseguita a 45°C con un flusso di He (carrier) di 6 ml/min e con un tempo di analisi di 5 minuti (J. Meyer et al. (1978), J. of Bact. 136, 201-208). The assay was carried out as follows: from the photobioreactor, maintained under an argon atmosphere, 6 ml of broth culture was taken and transferred to a 20 ml tube fitted with a sealing cap. The sample was incubated at 30'C for 5 minutes under stirring and in the light provided by a 200 watt lamp. Then 2 ml of acetylene were added and, at set times (0, 5, 15 and 20 minutes), 50 μΐ of headspace was taken and analyzed on the GC. The column used is a HayeSepR S of 2 m in length and 1 min in diameter and the analysis is performed at 45 ° C with a flow of He (carrier) of 6 ml / min and with an analysis time of 5 minutes ( J. Meyer et al. (1978), J. of Bact. 136, 201-208).
I risultati ottenuti mostrano che la nitrogenasi del ceppo mutante SMV089 è più attiva di quella del ceppo wild-type. Questa maggiore attività è stimabile intorno al 46% in più (figura 8) . The results obtained show that the nitrogenase of the SMV089 mutant strain is more active than that of the wild-type strain. This increased activity can be estimated at around 46% more (figure 8).
Esempio 8 Example 8
Fotoproduzione di idrogeno Photoproduction of hydrogen
La fotoproduzione d'idrogeno per il ceppo mutante SMV089 è stata valutata sia con un esperimento di fermentazione eseguito in parallelo con il ceppo wild-type R.sphaeroides RV utilizzando lo stesso lotto di terreno (Lotto #1), sia comparando i risultati ottenuti con il ceppo mutante SMV089 usando due differenti lotti di terreno (Lotti #1 e #2). The photoproduction of hydrogen for the SMV089 mutant strain was evaluated both with a fermentation experiment performed in parallel with the wild-type strain R.sphaeroides RV using the same lot of medium (Lot # 1), and by comparing the results obtained with the SMV089 mutant strain using two different soil lots (Lots # 1 and # 2).
I ceppi sono stati coltivati in chemostati da 1 litro muniti di agitatore magnetico, di un modulo per il controllo del pH, di 2 lampade alogene da 100 Watt poste all'interno per garantire l'illuminazione della coltura e di un sistema refrigerante per mantenere la temperatura a 30’C (figura 6). The strains were grown in 1 liter chemostats equipped with a magnetic stirrer, a pH control module, 2 100 Watt halogen lamps placed inside to ensure the illumination of the crop and a refrigeration system to maintain the temperature at 30'C (figure 6).
Il preinoculo per la fermentazione è stato preparato in due passaggi successivi descritti qui di seguito: The preinoculum for fermentation was prepared in two successive steps described below:
1. 50 μl di glicerinato in 25 mi di terreno aSy sono stati incubati a 30°C, in aerobiosi/buio, per due giorni; 1. 50 μl of glycerin in 25 ml of aSy medium were incubated at 30 ° C, in aerobic / dark conditions, for two days;
2. Una diluizione 1:10 della precedente coltura è stata utilizzata per il successivo inoculo in provette per anaerobiosi contenenti 60 mi dello stesso terreno usato per la crescita in chemostato. Le provette sono state incubate a 30 “C in anaerobiosi, alla luce (lampade al tungsteno, 9.500 lux) per 2 giorni. 2. A 1:10 dilution of the previous culture was used for subsequent inoculation into anaerobic tubes containing 60 ml of the same medium used for growth in the chemostat. The tubes were incubated at 30 ° C anaerobically in light (tungsten lamps, 9,500 lux) for 2 days.
I chemostati sono stati inoculati con una diluizione del secondo inoculo (2) calcolando una densità ottica iniziale a 600 nm di 0,2. The chemostats were inoculated with a dilution of the second inoculum (2) calculating an initial optical density at 600 nm of 0.2.
II terreno di coltura utilizzato deriva dalla fermentazione acidogenica controllata di rifiuti mercatali (E. D'Addario et al. (1992), Wat.Sci.Tech. 27., 183-192). La composizione media di questo tipo di terreno è la seguente: The culture medium used derives from the controlled acidogenic fermentation of commercial waste (E. D'Addario et al. (1992), Wat.Sci.Tech. 27., 183-192). The average composition of this type of soil is as follows:
Per la fermentazione dei ceppi il terreno è stato prima diluito 1:10 con acqua distillata così da ottenere una concentrazione di acido lattico di 3,6 g*l_1 e poi addizionato con i seguenti componenti : For the fermentation of the strains, the medium was first diluted 1:10 with distilled water to obtain a lactic acid concentration of 3.6 g * l_1 and then added with the following components:
L'anaerobiosi è stata mantenuta con un flusso continuo di argon. L'intensità di luce utilizzata è stata regolata a 6.000 lux e le due fermentazioni sono state fatte partire in batch. The anaerobiosis was maintained with a continuous flow of argon. The intensity of light used was adjusted to 6,000 lux and the two fermentations were started in batches.
Quando dopo circa 24 ore è iniziata la produzione di idrogeno, la fermentazione è stata condotta in continuo. When the production of hydrogen started after about 24 hours, the fermentation was carried out continuously.
Poiché la velocità di flusso (F) del terreno nel chemostato era stata fissata ad un valore di 31 ml/ora ed il volume del reattore (V) era di 930 mi, secondo l'equazione D=F/V, dove D corrisponde alla velocità di diluizione, il valore di HRT (tempo di residenza idraulica) (1/D) era pari a 30, cioè teoricamente ogni 30 ore il fotobioreattore subiva un ricambio totale di terreno. Since the flow rate (F) of the medium in the chemostat was set at a value of 31 ml / hour and the reactor volume (V) was 930 ml, according to the equation D = F / V, where D corresponds to dilution rate, the HRT value (hydraulic residence time) (1 / D) was equal to 30, ie theoretically every 30 hours the photobioreactor underwent a total change of soil.
La fermentazione è stata seguita valutando i seguenti parametri analitici: Fermentation was followed by evaluating the following analytical parameters:
1. la densità ottica misurata a 600 nm per seguire la crescita batterica; 1. the optical density measured at 600 nm to follow bacterial growth;
2. il pH era mantenuto automaticamente ad un valore di 7,0 mediante aggiunta di NaOH 1 M 2. the pH was automatically maintained at a value of 7.0 by adding 1 M NaOH
3. il biogas totale prodotto misurato mediante un contatore digitale collegato ad una delle uscite del chemostato; 3. the total biogas produced measured by means of a digital meter connected to one of the outputs of the chemostat;
4. la percentuale di idrogeno contenuta nel biogas determinata con un gas-cromatografo VARIAN 3400 equipaggiato con una colonna Carbosieve II 80-100 mesh Supelco 200x3 mm (figura 5); 4. the percentage of hydrogen contained in the biogas determined with a VARIAN 3400 gas chromatograph equipped with a Carbosieve II 80-100 mesh Supelco 200x3 mm column (figure 5);
5. la quantità di poliidrossibutirrati accumulati dalla cellula mediante analisi gas-cromatografica. 5. the quantity of polyhydroxybutyrates accumulated by the cell by gas-chromatographic analysis.
L'intensità della luce è stata misurata prima dell'inoculo sulla superficie esterna del reattore utilizzando un LSI luxmetro. The light intensity was measured before inoculation on the external surface of the reactor using an LSI luxmeter.
Dai valori del biogas prodotto e dalla percentuale di idrogeno presente è stata calcolata la quantità di idrogeno evoluto/giorno riferita sia a litro di reattore (ml H2/l reattore/giorno)/ che a mg di peso secco (mi H2/mg peso secco/giorno). From the values of the biogas produced and the percentage of hydrogen present, the quantity of evolved hydrogen / day referred to both liter of reactor (ml H2 / l reactor / day) / and mg of dry weight (ml H2 / mg dry weight) was calculated /day).
Nelle Tabelle che seguono sono riportati i dati di due esperimenti differenti volti in primo luogo a comparare le capacità produttive del mutante SMV089 con quelle del wild-type nelle stesse condizioni di fermentazione (stesso lotto di terreno #1) e quindi a confermare le prestazioni del ceppo mutante in diverse condizioni di fermentazione (usando cioè due lotti di terreno differenti, il #1 ed il #2). The following tables show the data of two different experiments aimed primarily at comparing the production capacities of the SMV089 mutant with those of the wild-type under the same fermentation conditions (same lot of soil # 1) and therefore to confirm the performance of the mutant strain under different fermentation conditions (i.e. using two different soil lots, # 1 and # 2).
In particolare, nella Tabella 2 vengono riportati i valori di produzione di idrogeno per litro di reattore calcolati in base ai valori di biogas totale ed alla percentuale di idrogeno misurata al gas-cromatografo, risultata essere superiore nel ceppo mutante SMV089 rispetto al ceppo wild-type. In particular, Table 2 shows the hydrogen production values per liter of reactor calculated on the basis of the total biogas values and the percentage of hydrogen measured by the gas-chromatograph, which was found to be higher in the SMV089 mutant strain than in the wild-type strain. .
Nella Tabella 3 vengono riportati i valori di produzione di idrogeno per milligrammo di peso secco calcolati con lo stesso procedimento sopra descritto . Table 3 shows the hydrogen production values per milligram of dry weight calculated with the same procedure described above.
La fermentazione dei ceppi è stata fermata quando la produzione di idrogeno aveva raggiunto livelli non significativi. In termini di durata, la fotoproduzione di idrogeno del ceppo mutante SMV089 è paragonabile a quella ottenuta con il ceppo wild-type. Per quanto riguarda la velocità giornaliera invece, nel mutante si mantiene più elevata del wild-type nel corso di tutto l'esperimento, determinando un incremento della quantità totale di idrogeno fotoprodotto, a parità di durata delle fermentazioni, del 47%, se riferita a litro di reattore, e del 66% se riferita a milligrammo di peso secco. The fermentation of the strains was stopped when the hydrogen production had reached insignificant levels. In terms of duration, the hydrogen photoproduction of the SMV089 mutant strain is comparable to that obtained with the wild-type strain. As regards the daily speed, on the other hand, in the mutant it remains higher than the wild-type throughout the experiment, resulting in an increase in the total quantity of photoproduced hydrogen, for the same duration of fermentations, of 47%, if referred to liter of reactor, and 66% if referred to milligram of dry weight.
Le prestazioni del ceppo mutante, valutate a partire da lotti di substrato differenti, hanno di nuovo evidenziato un elevata quantità di idrogeno totale fotoprodotto ed un range di variabilità dei valori di gas misurati dello 0,3%-7%, confermando così le migliori capacità produttive a prescindere dalla variabilità correlata alla differente concentrazione dei componenti nei diversi lotti di terreno . The performance of the mutant strain, evaluated starting from different substrate batches, again highlighted a high quantity of photoproduced total hydrogen and a range of variability of the measured gas values of 0.3% -7%, thus confirming the best capabilities. productive regardless of the variability related to the different concentration of the components in the different lots of soil.
L'analisi al gas-cromatografo dei poliidrossibutirrati (secondo il metodo di Brandi et al.,(1988), Appi. Environ. Microbiol. 54, 1977-1982) ha mostrato in entrambi i ceppi la presenza del picco caratteristico dell'estere metilico dell'acido β-idrossibutirrico. Il PHB raggiunge valori massimi di accumulo, sia nel céppo mutante che nel wild-type, di circa il 5% riferiti al peso secco, nei giorni finali della fermentazione, ma la sua concentrazione nel ceppo mutante si mantiene inferiore rispetto al wild-type durante tutto il corso dell'esperimento. Gas chromatographic analysis of polyhydroxybutyrates (according to the method of Brandi et al., (1988), Appi. Environ. Microbiol. 54, 1977-1982) showed the presence of the characteristic peak of the methyl ester in both strains of β-hydroxybutyric acid. PHB reaches maximum accumulation values, both in the mutant céppo and in the wild-type, of about 5% referred to the dry weight, in the final days of fermentation, but its concentration in the mutant strain remains lower than in the wild-type during the whole course of the experiment.
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