ITMI980874A1 - Peptidi ad attivita' chemiotattica e anti-hiv - Google Patents
Peptidi ad attivita' chemiotattica e anti-hivInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "PEPTIDI AD ATTIVITÀ' CHEMIOTATTICA E ANTI-HIV"
La presente invenzione ha per oggetto peptidi derivati dalla sequenza della proteina Tat di HIV in grado di provocare chemiotassi di monociti, fagociti polimorfonucleati e cellule dendritiche, di attivare i recettori CCR e di inibire l'infezione da HIV.
SFONDO DELL' INVENZIONE
Il genoma di HIV codifica una proteina denominata Tat, sigla per transattivatore. Questa proteina è nota aumentare la transattivazione del genoma di HIV di diversi ordini di grandezza (Jeang, K.-T. (1994), The Human Retroviruses and AIDS Compendium On Linea) , HTTP://HIV-WEB.LANL.GOV.
Tat può essere rilasciata dalle cellule (Ensoll, B., et al., J. Virol. (1993) 67, 277-287) dove può avere attività biologiche diverse dalla transattivazione. E1 stato dimostrato che la Tat extracellulare è in grado di indurre chemiotassi e invasione di cellule e oteliali in vitro e di indurre angiogenesi in vivo (Albini, A.,et al., AIDS (1994) 8, 1237-1244; Albini, A., et al., Proc. Nati. Sci. USA (1995) 92, 4838-4842,; Albini,A., et al., Oncogene (1996) 12, 289-297).
L'attività di Tat su cellule endoteliali è eparino-dipendente (Albini, A., et al., Oncogene (1996) 12, 289-297) e mediata dal recettore della tirosina chinasi KDR (Albini, A., et al., Nature Med.
Si è dimostrato in particolare che sia il dominio RGD sia il dominio basico di TaT possiedono attività chemiotattica parziale per i monociti (Benelli, R., et al., AIDS (1998) 12, 261-268). Tuttavia i peptìdi noti non mostrano effetti aggiuntivi quando impiegati insieme oppure riproducono completamente il potenziale chemiotattico di Tat1-86.
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE
Si è ora trovato che peptidi con sequenza corrispondente o omologa alla regione comprendente il dominio ricco in cisteina, il core e parte del dominio basico della proteina Tat di HIV (amminoacidi 20 e 51 con riferimento alla proteina Tat di HIV-1), sono dotati di attività chemiotattica e sono in grado di inibire l'infezione da HIV.
L'invenzione ha inoltre per oggetto composizioni farmaceutiche che contengono tali polipeptidi nonché l'uso dei peptidi per la preparazione di medicamenti anti retro-virali, in particolare anti-HIV.
L'invenzione, in un suo ulteriore aspetto, riguarda anche sequenze di DNA o RNA che codificano per i polipeptidi dell'invenzione, vettori di espressione che contengono tali sequenze di DNA o RNA, e cellule trasformate con tali vettori di espressione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
I peptidi dell'invenzione comprendono da 10 a 50 amminoacidi, preferibilmente da 20 a 40 amminoacidi.
Per sequenze omologhe si intendono sequenze amminoacidiche che abbiano almeno il 60%, preferibilmente almeno l'80% e ancora più preferibilmente almeno il 90% di omologia con i domini ricchi in cisteina,core o basici delle proteine Tat di HIV.
Per proteina TaT di HIV si intende di seguito una qualunque proteina TaT di un qualunque ceppo di HIV.
Peptidi particolarmente preferiti sono quelli che contengono almeno due residui di cisteina scelta fra quelle corrispondenti alle posizioni 22, 25, 27, 30, 31 e 34 della sequenza della proteina Tat. Peptidi particolarmente preferiti dell'invenzione hanno la seguente sequenza:
X1KCCFH-X2
dove:
rappresenta l'ammina terminale del residuo K oppure rappresenta un amminoacido o un oligopeptide da 2 a 9 amminoacidi con sequenze corrispondenti alla sequenza 20-28 di Tat di HIV-1;
X2 rappresenta il carbossi-terminale del residuo H oppure un amminoacido o un oligopeptide da 2 a 18 amminoacidi con sequenza corrispondente alla sequenza 34-51 di Tat di HIV-1.
Il termine HIV si riferisce ad un qualsiasi membro della famiglia di virus retrovirali quali HTLV-1,HTLV-2, HTLV-III (HIV-1) o HIV-2, ma si riferisce preferibilmente a HIV-1.
I polipeptidi dell'invenzione possono essere preparati con metodi convenzionali di sintesi peptidica, sia in fase solida sia in fase omogenea.Altrettanto convenzionali sono i metodi di stabilizzazione con i quali i polipeptidi dell'invenzione possono essere resi stabili alla degradazione metabolica,per esempio,ad opera delle proteasi.
Tali metodi possono essere ad esempio basati sull'impiego di amminoacidi non naturali della serie D, legami retro-invertiti o funzionalizzazioni dei gruppi NH2 o COOH terminali o di altri gruppi funzionali degli amminoacidi della sequenza.
I polipeptidi dell'invenzione possono eventualmente inseriti all'interno della sequenza di proteine note, ad esempio albumina, cosi da fornire proteine chimeriche che possano offrire caratteristiche desiderate di trasporto, stabilità e farmacocinetica.
Le sequenze amminoacidiche possono essere alterate ricorrendo a sostituzioni conservative di amminoacidi, quali descritte ad esempio in H. Neurath e R.L.Hill "The proteins",Academic Press,N.Y. (1979).
Alternativamente i peptidi dell'invenzione possono essere ottenuti anche con metodi di DNA ricombinante. Allo scopo, sequenze di DNA opportune, ottenute per via sintetica o utilizzando la PCR con opportuni primer sulla sequenza genica di Tat di HIV, sono inserite in vettori di espressione per cellule procariote o eucariote, secondo metodi noti.
I peptidi dell'invenzione si sono rivelati in grado di stimolare la chemiotassi di monociti, fagociti polimorfonucleari e cellule dendritiche e di mobilizzare gli ioni calcio nelle stesse cellule.
Gli stessi peptidi si sono inoltre dimostrati in grado di attivare i recettori delle chemochine CCR e CXCR e di inibire l'infezione da HIV.
Infine, si è osservata la capacità per i peptidi dell'invenzione di agire da ligandi dei recettori a sette domini transmembrana accoppiati a proteine G.
I peptidi dell'invenzione o loro derivati, o proteine chimeriche che li contengono, possono essere utilizzati nella terapia o profilassi dell’AIDS.
Allo scopo, saranno somministrati opportunamente formulati in composizioni farmaceutiche secondo quanto descritto ad esempio in "Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook",Mack Publishing Company, New York,U.S.A.
Le composizioni secondo l'invenzione conterranno una quantità efficace dei peptidi (o loro derivati e proteine chimeriche), per esempio da 0,1 a 100 mg e saranno somministrate preferibilmente per via parenterale, in particolare per via sottocutanea, intraperitoneale, intramuscolare. Il dosaggio giornaliero dipenderà ovviamente da più fattori,quali gravità della patologia,peso, sesso ed età del paziente e sarà scelto di volta in volta sulla base degli studi tossicologici, farmacocinetici e farmacodinamici di ogni singolo peptide o derivato. In linea di massima, il dosaggio giornaliero di peptide potrà comunque essere compreso tra 10 e 1500 pmol/kg di peso corporeo e il trattamento potrà essere continuato anche per lunghi periodi. Sono anche possibili altre vie di somministrazione, ad esempio topica, transdermica, intranasale o inalatoria o quella orale, ricorrendo alla formulazione dei peptidi in liposomi o altre tecniche note per la somministrazione di peptidi o proteine per via gastroenterica, quali quelle descritte in W093/25583.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
FIGURA 1
A: migrazione dei Monociti indotta da 100 nM di Tat o dai peptidi Cys20-39 e CYS24-51 di Tat. La migrazione al mezzo senza siero e alla formil-Metionina-Leucina-Fenilalanina (f-MLP) sono indicati rispettivamente come controlli positivi e negativi. TaT, e i peptidi CysL24-5i e Cys20-39 inducono migrazione significativamente di più elevata che il valore basale (SFM). Ogni punto è stato fatto in sestuplicato e ripetuto due volte.
B: Polarizzazione dei Monociti indotta da 100 nM di TaT e dai peptidi di TaT Cys20-39 e cYsL24-51·
FIGURA 2
A: l'equilibrio di competizione del peptide CysL24_51 radio marcato con I125 legante i monociti. Il peptide radio marcato CysL24_51 e miscelato con competitore non marcato (· = peptide CysL24_si Δ = TaT-1.
86) e incubato con monociti attaccati per 40 minuti a 20 gradi centigradi. Le cellule erano allora lavate con tampone di legame ed il peptide legato è stato determinato mediante solubilizzazione in PBS al 2% SDS e contato con contatore di raggi gamma. Le barre di errore indicano la deviazione standard dei punti triplicati, gli esperimenti sono stati ripetuti in tre tempi.
B: grafico di Scatchard dell'equilibrio di competizione di TaT1-86 per CysL24_51 radio marcato legante i monociti.
FIGURA 3
Induzione di flussi di Ca++ in monociti utilizzando dosi crescenti di TaT1-86.
FIGURA 4
Esperimenti di desensitizzazione incrociata con TaT1- 86 CysL24_51 e β-chemochine su monociti. La risposta al ligando (indicata in cima di ogni panello)è data come percentuale della massima risposta alla stessa concentrazione di ligando senza desensitizzazione.Le concentrazioni dei ligandi sono indicati sulla ascissa, - indica l'aggiunta di nessun agente desensitizzante.
L'invenzione sarà ora descritta in maggior dettaglio nei seguenti Esempi.
Esempio 1
Sintesi dei peptidi
I peptidi di sequenza KCCFHCQVCFITKALGISYGRK (Cys24-51), KCCFHCQVCFI (Cys20-39) sono stati sintetizzati mantenendo protetti i residui cisteinici per evitare la formazione casuale di ponti disolfuro intra o inter-catenari, la purificazione è avvenuta tramite HPLC. La purezza dei composti è stata verificata tramite spettrometria di massa. Il peptide liofilizzato è stato conservato a -20°C; per gli esperimenti il peptide è stato dissolto in PBS 0,1% BSA (contenente 10 mM di DTT, utilizzato quale riducente) alla concentrazione finale di 250 μΜ ed aliquotato in microprovette in volumi di 10 μL.
Esempio 2
Attività anti-HIV
I peptidi dell'Esempio 1 sono stati sciolti in PBS 0,1% BSA privo di DTT. PEMC preparati da "buffy coats" tramite centrifugazione su gradiente di Ficoll sono stati coltivati per cinque giorni i PBMC in presenza di 0,5 pg/ml di PHA e 20 U/ml di IL-2; il sesto giorno le cellule sono state lavate e risospese in terreno di coltura contenente 5 o 1,25 μΜ del peptide; dopo 30' abbiamo aggiunto il virus: HIV-1 ceppo 2028 che utilizza i co-recettori CCR5, CCR3 e CXCR4; SF162 utilizzante il solo CCR5; 2005 utilizzante il solo CXCR4 opppure HIV-2 ceppo ROD/B utilizzante i co-recettori CXCR4, CCR3, BOB, BONZO, CCR2b E V28. Dopo tre ore le cellule sono state lavate per quattro volte e risospese in presenza del peptide e di IL-2. I test di infezione sono stati anche effettuati su cellule U87 CD4+ trasfettate con i singoli CCR per verificare lo specifico potenziale inibitorio del peptide su ogni recettore chemochinico. I risultati sono stati riportati nella successiva tabella.
Questi dati indicano che entrambi i peptidi sono in grado di inibire i ceppi di HIV utilizzanti il co-recettore CXCR4 (2005) o il co-recettore CCR5 (ceppo SF162) , mentre il peptide CysL24-51 è in grado di inibire anche i ceppi utilizzanti il co-recettore CCR3 (2028) .
Esempio 3
Induzione nei monociti di chemiotassi.e polarizzazione
I monociti purificati sono stati immediatamente lavati e risospesi in RPMI senza siero contenente lo 0,1% di BSA ed utilizzati secondo il metodo descritto da Benelli et al. (AIDS (1998) 12, 261-268).
II peptide CysL24_51,che si estende dall'inizio del dominio basico attraverso la maggior parte dei domini ricchi di cisteine, ha mostrato una potente attività chemiotattica, superiore a quella degli altri peptidi e anche a quella del Tat stesso (Fig. la). Il peptide che comprende solo l’intero dominio cisteinico (Cys20-39)ha evidenziato una significativa attività chemiotattica, sebbene inferiore a quella del peptide CysL24_51 L'induzione della polarizzazione nei monociti è un saggio estremamente sensibile per verificare la stimolazione monocitaria.Quando i peptidi sono stati testati, in quantità equimolari per saggiare la loro capacità di indurre la polarizzazione dei monociti, il peptide Cys ha mostrato un livello di attività paragonabile a quello del dominio RGD (Fig. lb). Il peptide CysL24-51 si è dimostrato anche più potente, avvicinando i livelli di polarizzazione indotti da Tat intero o da f-MLP (Fig. lb).
Esempio 4
Recettori cellulari di superficie per il dominio ricco si cisteine e il dominio core di Tat
Per studiare l'eventualità che il peptide cysL24-51 induca direttamente la chemiotassi e la polarizzazione dei monociti mediante interazione con un recettore di superficie, è stata esaminata la sua capacità di legare la superficie cellulare dei monociti. Il peptide CysL24-51 non contiene il dominio di Tat che è in grado di interagire con le integrine (RGD) o con recettori tirosin-chinasici (basico), e perciò il suo legame a questi recettori è stato escluso. Il peptide CysL24-51 radio-marcato ha mostrato un legame specifico con la superficie dei monociti; questo legame veniva effettivamente spiazzato da un eccesso di peptide non marcato (Fig. 2a). La IC50 per la competizione con il peptide stesso era approssimativamente 32 nM. Il legame del peptide CysL24-51 era ancor più significativamente spiazzato da Tat^_gg intero, con una IC50 circa 1,25 nM:questo indica che Tat ha un'affinità considerevolmente più alta per gli stessi recettori con cui interagisce il peptide CysL24-51 (Fig.2a).
L'analisi scatchard per determinare la competizione di Tat con il peptide CysL24-51 per il legame ai monociti ha evidenziato un'affinità per Tat di 3,1 ± 0,2 nM con 960 ± 10 siti di legame per cellula (Fig. 2b). L'analisi scatchard per la competizione del peptide CysL24_51 ha mostrato che la sua affinità era 50 volte più bassa (170 ± 33 nM) con 27450 ± 11030 siti per cellula. Questi dati mostrano chiaramente che il peptide CysL24-51 può legare specifici recettori sulla superficie cellulare dei monociti e che Tat ha un'affinità anche più alta per i medesimi recettori. Quindi il dominio ricco di cisteine/core di Tat interagisce con recettori sulla superficie dei monociti che sembrerebbero mediare la chemiotassi dei monociti.
Esenpio 5
Induzione di flussi si Ca++ tramite Tat
Poiché il Ca-H-citoplasmatico libero è un mediatore intracellulare chiave nella trasmissione del segnale chemiotattico indotto dalle chemochine abbiamo analizzato se HIV-1 Tat può indurre entrata di Ca++ in queste cellule. L'aggiunta di quantità crescenti di Tat1-86 a monociti umani marcati con l'agente chelante del Ca++ fluorescente FURA-2 ha prodotto un aumento dose-dipendente della concentrazione di Ca++ intracellulare rapido e transiente (Fig.3).
Esempio 6
Interazione con i recettori delle chemochine
La desensitizzazione del recettore dopo stimolazione da parte di chemochine consente di valutare l'utilizzo di recettori comuni da parte di diversi agonisti. La desensitizzazione con alte concentrazioni del peptide CysL24_5i ha inibito l'entrata di Ca++ indotta da Tat1-86 mentre la desensitizzazione con alte concentrazioni di Tat1-86 inibiva i flussi di Ca++ indotti dai peptidi Cys20-39 e cys24-51 Questi dati indicano che le proprietà analoghe a quelle delle chemochine di Tat sono associate alla regione chemochine-like interna alla molecola.
Le somiglianze strutturali tra Tat e le chemochine e i loro comuni meccanismi di trasduzione del segnale suggeriscono fortemente che Tat potrebbe interagire con recettori della chemochina CC sia conosciuti che nuovi.E' stata pertanto valutata la desensitizzazione incrociata tra il peptide CysL24-51 Tat1-86 e le chemochine CC che, come è noto agiscono sui monociti in esperimenti di mobilizzazione del Ca++ (Fig. 4). Il peptide CysL24-51 desensitizza fortemente la risposta a MCP-1 e viceversa, mentre la desensitizzazione osservata con MIP-Ια risulta più debole. MCP-1 e MCP-3 desensitizzano efficacemente la risposta a Tat1-86, mentre la eotassina riduce la risposta a Tat del 20%. Tat1-86 desensitizza parzialmente la risposta a MCP-1 e può bloccare completamente la risposta alla eotassina in monociti freschi.
La condivisione di recettori è una comune caratteristica della famiglia delle chemochine: ogni chemochina può attivare un differente range di recettori (23). La parziale desensitizzazione tra Tat o il peptide CysL24-51e le chemochine MCP-1, MCP-3 e eotassina suggeriscono che Tat interagisce sia con gli stessi che con differenti recettori come queste chemochine.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Peptidi aventi da 10 a 50 amminoacidi con sequenza corrispondente o omologa alla regione comprendente il dominio ricco in cisteina, il core e parte del dominio basico della proteina Tat di HIV (amminoacidi 20 e 51 con riferimento alla proteina Tat di HIV-1), dotati di attività chemiotattica e in grado di inibire l'infezione da HIV.
- 2. Peptidi secondo la rivendicazione 1,capaci di mobilizzare gli ioni calcio in monociti, fagociti polimorfonucleati e cellule dendritiche.
- 3. Peptidi secondo la rivendicazione l o 2, aventi da 20 a 40 amminoacidi.
- 4. Peptidi secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti contenenti almeno due residui di cisteina corrispondenti alle posizioni 22, 25, 27, 30, 31 e 34 della sequenza della proteina TaT di HIV-1.
- 5. Peptidi secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti aventi la seguente sequenza: X1KCCFH-X2 dove: -X1 rappresenta l'airanina terminale del residuo K oppure un amminoacido o un oligopeptide da 2 a 9 amminoacidi con sequenza corrispondente alla sequenza 20-28 di TaT di HIV; -X2 rappresenta il carbossi terminale del residuo H oppure un amminoacido o un oligopeptide da 2 a 18 amminoacidi con sequenza corrispondente alla sequenza 34-51 di TaT di HIV-1.
- 6. Peptidi secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti scelti nel gruppo costituito da:KCCFHCQVCFITKALGISYGRK,KCCFHCQVCFI.
- 7. Conposizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo un peptide delle rivendicazioni 1-6, in miscela con un veicolo accettabile.
- 8. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 7 contenenti inoltre inibitori della proteasi e/o inibitori della trascrittasi inversa adatta alla somministrazione separata, contemporanea o sequenziale.
- 9. Uso dei peptidi delle rivendicazioni 1-6 per la preparazione di un medicamento ad attività anti-HIV.
- 10. Una sequenza nucleotidica che codifica per un polipeptide delle rivendicazioni 1-6.
- 11. Un vettore di espressione comprendente la sequenza della rivendicazione 10.
- 12. Una cellula trasformata con il vettore della rivendicazione 11.
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