ITMI972748A1

ITMI972748A1 - USE OF COMPLEXES BETWEEN CATIONIC LIPOSOMES AND POLYESOXYBONUCLEOTIDES AS MEDICATIONS

Info

Publication number: ITMI972748A1
Application number: IT97MI002748A
Authority: IT
Inventors: Roberto Porta; Laura Ferro; Fabio Trento; Claudio Nastruzzi; Elisabetta Esposito; Enea Menegatti
Original assignee: Crinos Industria Farmaco
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 1999-06-12
Also published as: IT1296957B1

Description

La presente invenzione riguarda l'uso come medicamenti di complessi formati da liposomi cationici e da polidesossiribonucleotidi. Più in particolare la presente invenzione riguarda l'uso dei suddetti complessi aventi elevata stabilità nel tempo come farmaci ad attività antiinfiammatoria. The present invention relates to the use as medicaments of complexes formed by cationic liposomes and polydeoxyribonucleotides. More particularly, the present invention relates to the use of the aforesaid complexes having high stability over time as drugs with anti-inflammatory activity.

E 'noto ormai da diversi anni che i liposomi possono venire impiegati come vettori per la somministrazione sistemica dei farmaci. La via di somministrazione é quella iniettiva, vale a dire endovena, sottocute, intramuscolo, o per infusione. It has been known for several years that liposomes can be used as vectors for the systemic administration of drugs. The route of administration is the injection route, i.e. intravenously, subcutaneously, intramuscularly, or by infusion.

Per quanto concerne in particolare la struttura di questi complessi tra liposomi e specie chimiche DNA-simili, é noto che oligodesossiribonucleotidi e DNA plasmidico possono legarsi con legame ionico alla superficie esterna di liposomi cationici (C.F. Bennet et Al. Mol. Pharmacol. 41,1023-1033,1992; Xiang Gao et Al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179,280-285, 1991). Tuttavia nessuna indicazione viene data sul loro uso come antiinfiammatori e soprattutto sulla stabilità nel tempo dei conplessi come farmaci ad attività antiinfiammatoria. As regards in particular the structure of these complexes between liposomes and DNA-like chemical species, it is known that oligodeoxyribonucleotides and plasmid DNA can bind with ionic bond to the external surface of cationic liposomes (C.F. Bennet et Al. Mol. Pharmacol. 41,1023 -1033,1992; Xiang Gao et Al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179,280-285, 1991). However, no indication is given on their use as anti-inflammatories and above all on the stability over time of the complexes as drugs with anti-inflammatory activity.

E' altresì noto dalla domanda di brevetto WO 97/04787 che gli oligonucleotidi aventi una lunghezza della catena conpresa tra 8 e 50 nucleotidi possono venire inglobati all'interno di un liposoma. Anche in questo caso nessuna informazione viene data sulla stabilità nel tempo di questi complessi. It is also known from patent application WO 97/04787 that oligonucleotides having a chain length comprised between 8 and 50 nucleotides can be incorporated within a liposome. Also in this case no information is given on the stability of these complexes over time.

Sono stati descritti conplessi con liposomi e polidesossiribonucleotidi, ottenuti per depolimerizzazione di acidi nucleici, in cui questi polimeri sono contenuti all'interno della vescicola lipidica ( Gursoy et Alii, Pharmazie 48, (1993)H. Complexes with liposomes and polydeoxyribonucleotides, obtained by depolymerization of nucleic acids, in which these polymers are contained within the lipid vesicle have been described (Gursoy et Alii, Pharmazie 48, (1993) H.

7, 559-560 ). Anche per questa referenza vale quanto sopra si é detto. 7, 559-560). The above is also valid for this reference.

E' altresì noto che i complessi dei liposomi con oligonucleotidi e polidesossiribonucleotidi hanno la proprietà di aumentare notevolmente le attività farmacologiche di queste sostanze (Bennet et Al, Gursoy et Al., vedi sopra; A. Colige, Biochemistry 1993, 32, 7-11). Tuttavia prove effettuate dalla Richiedente hanno evidenziato che i complessi descritti in questa pubblicazione (polidesossiribonucleotidi con peso molecolare compreso tra 15000 e 60000 contenuti all'interno dei liposomi) non sono utilizzabili come antiinfiammatori in quanto mostrano una attività che decade rapidamente nel tempo. In più nelle preparazioni di questi complessi, che vengono solitamente realizzate in mezzo acquoso, si trovano i componenti cationici del liposoma come ad es. stearilammina e tensioattivi ammonici quaternari, che sono sostanze riconosciute come potenzialmente tossiche per l'organismo e che possono provocare effetti collaterali. La degradazione del complesso risulta ' evidente anche dal fatto che alla fine l'aspetto fisico della fase acquosa contenente il 1iposoma cambia, diventando da opalescente (emulsione iniziale) a limpido con formazione di un corpo di fondo, costituito da alcune delle sostanze che fanno parte della vescicola del liposoma. Questo processo é irreversibile e non é più possibile ripristinare il complesso iniziale . It is also known that liposome complexes with oligonucleotides and polydeoxyribonucleotides have the property of significantly increasing the pharmacological activities of these substances (Bennet et Al, Gursoy et Al., See above; A. Colige, Biochemistry 1993, 32, 7-11 ). However, tests carried out by the Applicant have shown that the complexes described in this publication (polydeoxyribonucleotides with a molecular weight between 15000 and 60000 contained within the liposomes) are not usable as anti-inflammatories as they show an activity that rapidly decays over time. In addition, in the preparations of these complexes, which are usually made in an aqueous medium, the cationic components of the liposome are found, such as e.g. stearylamine and quaternary ammonium surfactants, which are substances recognized as potentially toxic to the body and which can cause side effects. The degradation of the complex is also evident from the fact that in the end the physical appearance of the aqueous phase containing the hyposome changes, becoming from opalescent (initial emulsion) to limpid with the formation of a background body, consisting of some of the substances that are part of the liposome vesicle. This process is irreversible and it is no longer possible to restore the initial complex.

I polidesossiribonucleotidi e in particolare il defibrotide, sono noti come farmaci ad attività profibrinolitica (R. Pescador et al., Thromb. Res. 30: l-ll, 1983), antitromboticatrombolitica (R. Niada et Al., Pharmacol. Res. Commun. 14 (10), 949-9571982) antiipertensiva (F. Trento et Al., XXVII Congr. Naz. Soc. It. Farmacol. Torino 25-29 Settembre 1994, Abstract Book pag. 703), antiischemica, citoprotettiva (G.Rossoni et Al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 680-6851986) e antiinfiammatoria ( R. Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. Polydeoxyribonucleotides and in particular defibrotide, are known as drugs with profibrinolytic activity (R. Pescador et al., Thromb. Res. 30: l-ll, 1983), antithrombotic thrombolytic (R. Niada et Al., Pharmacol. Res. Commun . 14 (10), 949-9571982) antihypertensive (F. Trento et Al., XXVII Congr. Naz. Soc. It. Farmacol. Turin 25-29 September 1994, Abstract Book pag. 703), anti-ischemic, cytoprotective (G. Rossoni et Al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 680-6851986) and anti-inflammatory (R. Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol.

18(10) 669-676 1996). Le dosi giornaliere variano da 600 a 1200 mg. Tutte queste attività farmacologiche della sostanza sono essenzialmente riconducibili alla loro proprietà di rilasciare localmente quantità terapeuticamente efficaci di prostaciclina endogena dall'endotelio vascolare (rif. R. Niada et alii, sopra, C. Thiemermann et Alii, Am. j. Cardiol. 56978-982 1985). 18 (10) 669-676 1996). Daily doses range from 600 to 1200 mg. All these pharmacological activities of the substance are essentially attributable to their property of locally releasing therapeutically effective quantities of endogenous prostacyclin from the vascular endothelium (ref. R. Niada et alii, above, C. Thiemermann et Alii, Am. J. Cardiol. 56978- 982 1985).

E' stato ora sorprendentemente e inaspettatamente trovato dalla Richiedente che é possibile preparare complessi tra lipdsomi e polidesossiribonucleotidi con peso molecolare compreso tra 15.000 e 60.000 con elevata attività nel tempo quando vengono utilizzati come farmaci antiinfiammatori e senza la produzione di sostanze tossiche per l'organismo e quindi senza avere effetti collaterali. It has now been surprisingly and unexpectedly found by the Applicant that it is possible to prepare complexes between lipdsomes and polydeoxyribonucleotides with molecular weight between 15,000 and 60,000 with high activity over time when used as anti-inflammatory drugs and without the production of toxic substances for the body and therefore without having side effects.

Pertanto si può utilizzare la medesima soluzione, opportunamente formulata, per un intero ciclo terapeutico, vale a dire una o più volte al giorno per una - tre settimane. Questo non era possibile con il complesso dell'arte nota. Therefore the same solution, suitably formulated, can be used for a whole therapeutic cycle, that is to say one or more times a day for one to three weeks. This was not possible with the complex of the prior art.

Pertanto costituisce oggetto dell'invenzione l'uso come medicamenti, in particolare come antiinfiammatori, di complessi formati da liposomi cationici e da polidesossiribo-nucleotidi con peso molecolare conpreso tra 15.000 e 60.000 Da ottenibili per depolimerizzazione di acidi nucleici, in cui i legami ionici tra i due conponenti del complesso si trovano sulla parete esterna del liposoma. Therefore, the object of the invention is the use as medicaments, in particular as anti-inflammatories, of complexes formed by cationic liposomes and polydeoxyribo-nucleotides with molecular weight between 15,000 and 60,000 Da obtainable by depolymerization of nucleic acids, in which the ionic bonds between the two components of the complex are located on the outer wall of the liposome.

In una realizzazione preferita dell'invenzione il polidesossiribonucleotide inpiegato é quello noto come defibrotide. In a preferred embodiment of the invention the polydeoxyribonucleotide used is that known as defibrotide.

Di conseguenza secondo la presente invenzione risulta possibile ridurre la dose giornaliera da somministrare al paziente, senza influire sull'efficacia del trattamento antiinfiammatorio. Consequently, according to the present invention, it is possible to reduce the daily dose to be administered to the patient, without affecting the effectiveness of the anti-inflammatory treatment.

I liposomi sono vescicole lipidiche che si formano in fase acquosa e sono generalmente conposti da fosfolipidi, i quali a contatto con il solvente si dispongono su un doppio strato, con la porzione polare (idrofilica) della molecola rivolta sul lato esterno del liposoma e la porzione lipidica (idrofobica) all'interno del doppio strato. La vescicola in questo caso viene detta monolamellare. Esistono anche liposomi plurilamellari , che sono composti da più strati lipidici. Liposomes are lipid vesicles that form in the aqueous phase and are generally composed of phospholipids, which in contact with the solvent are arranged on a double layer, with the polar (hydrophilic) portion of the molecule facing the external side of the liposome and the lipid (hydrophobic) inside the bilayer. The vesicle in this case is called monolamellar. There are also multilamellar liposomes, which are composed of multiple lipid layers.

I polidesossiribonucleotidi aventi peso molecolare compreso tra 15.000 e 60.000 che vengono utilizzati nei complessi con liposomi secondo la presente invenzione sono ottenibili per estrazione e successiva depolimerizzazione degli acidi nucleici ad elevato peso molecolare. The polydeoxyribonucleotides having a molecular weight between 15,000 and 60,000 which are used in the complexes with liposomes according to the present invention can be obtained by extraction and subsequent depolymerization of the high molecular weight nucleic acids.

L'estrazione degli acidi nucleici ad elevato peso molecolare può essere effettuata, ad esempio, come si insegna nel brevetto USP 3.770.720 qui incorporato integralmente per riferimento. E' possibile ottenere polidesossiribonucleotidi con peso molecolare compreso tra 15.000 e 30.000 effettuando la depolimerizzazione deigli acidi nucleici ad elevato peso molecolare come descritto nel brevetto americano USP n. 4.985.552 qui incorporato integralmente per riferimento. Con il processo di questo brevetto la Richiedente ha verificato che é possibile ottenere anche polimeri con peso molecolare compreso tra 30.0000 e 60.0000 utilizzando le medesime condizioni ed interrompendo il processo quando il parametro h (ipercromicità reversibile, rif. Methods in Enzymol. voi. Ili pag. 708-712), con cui si segue il procedere della depolimerizzazione, é compreso tra il 20 e 40% (con riferimento al valore di assorbanza del campione non denaturato). The extraction of the high molecular weight nucleic acids can be carried out, for example, as taught in USP 3,770,720, incorporated herein by reference. It is possible to obtain polydeoxyribonucleotides with a molecular weight between 15,000 and 30,000 by depolymerizing the high molecular weight nucleic acids as described in the American patent USP n. 4,985,552 incorporated herein in full by reference. With the process of this patent, the Applicant has verified that it is also possible to obtain polymers with molecular weight between 30.0000 and 60.0000 using the same conditions and interrupting the process when the parameter h (reversible hyperchromicity, ref. Methods in Enzymol. Vol. III p. 708-712), with which the depolymerization proceeding is followed, is comprised between 20 and 40% (with reference to the absorbance value of the non-denatured sample).

I polidesossiribonucleotidi preferiti per formare il complesso con il liposoma cationico sono quelli noti con il nome di defibrotide, (D.C.I.), aventi un peso molecolare compreso tra 15.000 e 30.000 (Informations Pharmaceutiques O.M.S. n. 4, voi. 1/1987 pag. 272). The preferred polydeoxyribonucleotides to form the complex with the cationic liposome are those known as defibrotide, (D.C.I.), having a molecular weight between 15,000 and 30,000 (Informations Pharmaceutiques O.M.S. n. 4, vol. 1/1987 p. 272) .

I costituenti lipidici principali dei liposomi che vengono impiegati come antiinfiammatori secondo la presente invenzione sono fosfatidilcolina o fosfatidiletanolammina, che possono essere associate ad altri lipidi come si insegna nel volume di R.R.C. New "Liposomes/ a practical approach" IRL Press 1994, qui integralmente incorporato per riferimento. I lipidi associati preferiti sono ergosterolo e colesterolo. The main lipid constituents of the liposomes which are used as anti-inflammatories according to the present invention are phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, which can be associated with other lipids as taught in the volume of R.R.C. New "Liposomes / a practical approach" IRL Press 1994, incorporated herein by reference in its entirety. The preferred associated lipids are ergosterol and cholesterol.

Alla composizione possono essere aggiunti uno o più antiossidanti, scelti tra quelli noti e che sono elencati nella medesima referenza da ultimo indicata. Il preferito é alfatocoferolo. One or more antioxidants can be added to the composition, selected from those known and listed in the same reference last indicated. The preferred is alpha tocopherol.

Ai liposomi, per ancorare i polidesossiribonucleotidi secondo la presente invenzione, vengono aggiunti tensioattivi cationici, che contengono uno o più gruppi amminici mono,-disostituiti, oppure gruppi ammonici quaternari. Detti gruppi recano una o più catene alifatiche con numero di atomi di carbonio variante da 8 a 22. To the liposomes, in order to anchor the polydeoxyribonucleotides according to the present invention, cationic surfactants are added, which contain one or more mono, disubstituted amino groups, or quaternary ammonium groups. Said groups bear one or more aliphatic chains with a number of carbon atoms ranging from 8 to 22.

Preferiti sono i tensioattivi ammonici quaternari aventi catene alifatiche con 18 atomi di carbonio. Quaternary ammonium surfactants having aliphatic chains with 18 carbon atoms are preferred.

Il rapporto molare tra la quantità totale di lip wide/i~de~l~ liposoma e tensioattivo cationico varia da 10:0,05 a 10:3, essendo preferibilmente 10:1. Nel caso in cui, assieme alla fosfatidilcolina (o fosfatidiletanolammina) vi sia un secondo e diverso lipide, i rapporti molari interni tra ciascuno dei due lipidi e il tensioattivo (fosfatiditilcolina (o fosfatidileta nolammina) : secondo lipide: tensioattivo) variano da 9:1:0,05 a 7:3:3, preferibilmente 8:2:1. The molar ratio between the total amount of lip wide / i of the liposome and cationic surfactant ranges from 10: 0.05 to 10: 3, preferably being 10: 1. In the event that, together with phosphatidylcholine (or phosphatidylethanolamine) there is a second and different lipid, the internal molar ratios between each of the two lipids and the surfactant (phosphatiditylcholine (or phosphatidyleta nolamine): second lipid: surfactant) vary from 9: 1 : 0.05 to 7: 3: 3, preferably 8: 2: 1.

Il rapporto ponderale tra la quantità del liposoma e quella del principio attivo (polidesossiribonucleotidi) varia da 10:2 a 10:0,1, preferibilmente é 10:1. The weight ratio between the quantity of the liposome and that of the active principle (polydeoxyribonucleotides) varies from 10: 2 to 10: 0.1, preferably 10: 1.

La preparazione dei complessi dei liposomi cationici utilizzati nella presente invenzione può essere effettuata come descritto nel lavoro di D.C. Litzinger, Biochim. Biophys. Acta 1281 139-149, 1996, oppure nel volume di R.R.C. New sopra menzionato. in particolare un processo utilizzabile per preparare il complesso della presenta invenzione conprende le seguenti fasi: The preparation of the cationic liposome complexes used in the present invention can be carried out as described in the work of D.C. Litzinger, Biochim. Biophys. Acta 1281 139-149, 1996, or in the volume of R.R.C. New mentioned above. in particular a process which can be used to prepare the complex of the present invention comprises the following steps:

a. preparazione del liposoma mediante il metodo di evaporazione del solvente in fase inversa ("reverse phase evaporation" rif. Szoka P. et Alii. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 754194 1978) . Si parte da una emulsione di acqua in olio costituita da 4 parti di fase organica, che può essere polare (es. alcoli alifatici inferiori Ci-C^ lineari o ramificati) o apolare {es. dialchileteri C^-C, lineari 0 ramificati, come ad es. dietiletere, idrocarburi C^-Ca parzialmente clorurati, preferibilmente cloroformio), e una parte di acqua. Nella fase organica si solubilizzano 1 lipidi, il tensioattivo cationico e l'antiossidante, il sistema bifasico ottenuto viene sottoposto a sonicazione a 0°C per 5-20 minuti. Si evapora a tenperatura ambiente e a pressione ridotta la fase organica, to. preparation of the liposome by means of the reverse phase evaporation method (ref. Szoka P. et Alii. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 754194 1978). It starts from an emulsion of water in oil consisting of 4 parts of organic phase, which can be polar (eg lower aliphatic alcohols C-C ^ linear or branched) or apolar (eg. C ^ -C, linear 0 branched dialkyl ethers, such as e.g. diethyl ether, partially chlorinated C ^ -Ca hydrocarbons, preferably chloroform), and a part of water. In the organic phase the lipids, the cationic surfactant and the antioxidant are solubilized, the resulting biphasic system is subjected to sonication at 0 ° C for 5-20 minutes. The organic phase is evaporated at room temperature and at reduced pressure,

b. la fase acquosa viene fatta passare, secondo la tecnica che viene descritta a pag. 52-54 del volume di R.R.C. New, attraverso una membrana di policarbonato con diametro dei pori variabile da 100 a 600 nm, preferibilmente 400 nm, per almeno tre volte, allo scopo di ottenere un diametro medio delle vescicole confrontabile con quello dei pori della membrana, b. the aqueous phase is passed, according to the technique described on page. 52-54 of the volume of R.R.C. New, through a polycarbonate membrane with a pore diameter ranging from 100 to 600 nm, preferably 400 nm, at least three times, in order to obtain an average diameter of the vesicles comparable to that of the pores of the membrane,

c. liofilizzazione della sospensione acquosa, o più propriamente l'emulsione dei liposomi, dopo aggiunta di una soluzione acquosa di un coadiuvante di liofilizzazione, come ad es. monosaccaridi quali saccarosio, sorbitolo, mannitolo, fruttosio, oppure polisaccaridi quali destrano, maltodestrine a diverso peso molecolare, in modo che la quantità di coadiuvante sia in eccesso di almeno 7 volte rispetto a quella dei lipidi. Preferibilmente l'eccesso é conpreso tra 10 e 15 volte, c. lyophilization of the aqueous suspension, or more properly the emulsion of the liposomes, after addition of an aqueous solution of a lyophilization aid, such as e.g. monosaccharides such as sucrose, sorbitol, mannitol, fructose, or polysaccharides such as dextran, maltodextrins of different molecular weight, so that the amount of adjuvant is at least 7 times in excess of that of lipids. Preferably the excess is included between 10 and 15 times,

d. preparazione dell'emulsione finale per 1'inpiego farmaceutico (somministrazione parenterale) aggiungendo sterilmente sotto agitazione una soluzione acquosa isotonica sterile diluita di polidesossiribonucleotidi al recipiente contenente il liofilizzato. Si forma una emulsione nella quale la fase sospesa é il conplesso formato da polidesossiribonucleotidi ancorati con legame ionico alla parete esterna del liposoma. In alternativa, una soluzione isotonica sterile viene aggiunta al recipiente contenente il liposoma liofilizzato e l'emulsione ottenuta mescolata sterilmente con la soluzione del principio attivo . d. preparation of the final emulsion for pharmaceutical use (parenteral administration) by sterile adding under stirring a dilute sterile isotonic aqueous solution of polydeoxyribonucleotides to the container containing the lyophilisate. An emulsion is formed in which the suspended phase is the complex formed by polydeoxyribonucleotides anchored with ionic bond to the external wall of the liposome. Alternatively, a sterile isotonic solution is added to the container containing the lyophilized liposome and the obtained emulsion mixed sterile with the solution of the active principle.

La stabilità dei liposomi usati come antiinfiammatori é stata valutata dosando l'attività farmacologica subito dopo la preparazione dell'emulsione e dopo 30 giorni di condizionamento in condizioni sterili a 25°C al riparo dalla luce. The stability of the liposomes used as anti-inflammatories was evaluated by measuring the pharmacological activity immediately after the preparation of the emulsion and after 30 days of conditioning in sterile conditions at 25 ° C away from light.

Come formulazione di confronto é stata utilizzata l'emulsione contenete il complesso di inclusione dei polidesossiribonucleotidi nel liposoma (Gursoy et al, vedi sopra). The emulsion containing the polydeoxyribonucleotide inclusion complex in the liposome was used as the comparative formulation (Gursoy et al, see above).

La Richiedente ha altresì trovato che i complessi della presente invenzione sono anche utilizzabili come antiipertensivi ed antitrombotici ad elevata attività nel tempo senza effetti tossici collaterali. The Applicant has also found that the complexes of the present invention can also be used as antihypertensive and antithrombotic agents with high activity over time without toxic side effects.

L'attività farmacologica é stata determinata nei seguenti modelli sperimentali : Pharmacological activity was determined in the following experimental models:

Attività antiinfiammatoria (Miyasaka et al., Eur. J. Pharmacol. 77229-236 1982) . Anti-inflammatory activity (Miyasaka et al., Eur. J. Pharmacol. 77229-236 1982).

- Ipertensione arteriosa (F. Trento et Al . , vedi sopra) . Attività antitrombotica (R. Niada et alii, Thromb. Res. - Arterial hypertension (F. Trento et Al., See above). Antithrombotic activity (R. Niada et alii, Thromb. Res.

23 233-246. 1981). 23 233-246. 1981).

Nell'esperimento relativo all'attività antiinfiammatoria si é dosata la quantità di mieloperossidasi presente nei polimorfonucleati ottenuti dell'essudato pleurico degli animali. La quantità dell'enzima é direttamente proporzionale all'infiammazione indotta. I risultati sono espressi come variazione % della quantità di mieloperossidasi (MPO) rispetto a quella dei controlli, calcolata con la formula: In the experiment relating to the anti-inflammatory activity, the quantity of myeloperoxidase present in the polymorphonuclear cells obtained from the pleural exudate of the animals was measured. The amount of the enzyme is directly proportional to the induced inflammation. The results are expressed as a% change in the amount of myeloperoxidase (MPO) compared to that of the controls, calculated with the formula:

Nell'ipertensione arteriosa il parametro usato per determinare l'attività é.stata la pressione sanguigna che é stata monitorata fino a 30 minuti dal trattamento con 1'inibitore del rilascio dell'ossido nitrico endogeno. Nell'attività antitrombotica si é monitorata la temperatura carotidea fino a 60 minuti dopo l'induzione della lesione endoteliale. Per entrambi gli esperimenti sono stati riportati in un grafico (tempo in ascisse) i relativi valori. I risultati sono stati espressi come variazione % dell'area sotto la curva (AAUC %) ottenuta con il campione in esame rispetto a quella dei controlli, mediante il seguente rapporto: In arterial hypertension the parameter used to determine activity was blood pressure which was monitored up to 30 minutes after treatment with the endogenous nitric oxide release inhibitor. In the antithrombotic activity the carotid temperature was monitored up to 60 minutes after the induction of the endothelial lesion. For both experiments the relative values were reported in a graph (time in abscissa). The results were expressed as% variation of the area under the curve (AAUC%) obtained with the sample under examination compared to that of the controls, using the following ratio:

Essendo l'area ottenuta inferiore nel caso degli animali trattati rispetto ai controlli, in ciascuno dei due esperimenti le variazioni AAUC % sono negative, ed in valore assoluto sono direttamente proporzionali all'attività farmacologica. Since the area obtained is lower in the case of the treated animals than in the controls, in each of the two experiments the AAUC% variations are negative, and in absolute value they are directly proportional to the pharmacological activity.

I risultati ottenuti e che sono riportati, rispettivamente, nelle tabelle I, II e III, indicano che il complesso tra liposomi e polidesossiribonucìeotidi secondo la presente invenzione é stabile nel tempo, a differenza di quello preso a confronto, in diversi modelli sperimentali farmacologici. The results obtained and which are reported, respectively, in Tables I, II and III, indicate that the complex between liposomes and polydeoxyribonucineotides according to the present invention is stable over time, unlike that taken for comparison, in various pharmacological experimental models.

Secondo la presente invenzione risulta pertanto possibile somministrare al paziente una quantità minore di principio attivo, in questo caso i polidesossiribonucìeotidi, mantenendo inalterato l'effetto terapeutico per gli usi sopra indicati. According to the present invention it is therefore possible to administer to the patient a smaller quantity of active ingredient, in this case the polydeoxyribonucineotides, while maintaining the therapeutic effect for the above indicated uses unaltered.

Oltre al normale impiego per somministrazione singola, é possibile utilizzare anche una stessa emulsione del complesso, opportunamente formulata e a .concentrazione idonea del principio attivo, per un intero ciclo di terapia come richiesto nelle patologie sopra indicate. In addition to the normal use for single administration, it is also possible to use the same emulsion of the complex, suitably formulated and with a suitable concentration of the active principle, for a whole cycle of therapy as required in the pathologies indicated above.

E' anche noto che i polideossiribonucleotidi noti come defibrotide hanno attività antitrombotica (R. Niada, Pharmacol. res. Comm., vedi sopra), antiischemica, citoprotettiva (C. Thiermemann, vedi sopra), antiinfiammatoria (G. Rossoni, J. Cardiovasc. Pharmacol., vedi sopra) e nell'aterosclerosi (P. Lobel et Al. Atherosclerosis 80, 69-791989). Dette attività sono riconducibili al rilascio locale nel torrente sanguigno di prostaciclina endoteliale in quantità te nrapeu<ticamente efficaci. It is also known that polideoxyribonucleotides known as defibrotides have antithrombotic (R. Niada, Pharmacol. Res. Comm., See above), antiischemic, cytoprotective (C. Thiermemann, see above), anti-inflammatory (G. Rossoni, J. Cardiovasc) activity . Pharmacol., See above) and in atherosclerosis (P. Lobel et Al. Atherosclerosis 80, 69-791989). Said activities are attributable to the local release into the blood stream of endothelial prostacyclin in technically effective quantities.

E' stato trovato dalla Richiedente che i complessi liposoma-polidesossiribonucleotidi descritti nella presente invenzione possono venire utilmente impiegati per la terapia di patologie il cui trattamento richieda il rilascio di prostaciclina endoteliale aventi elevata attività nel tempo. It has been found by the Applicant that the liposome-polydeoxyribonucleotide complexes described in the present invention can be usefully used for the therapy of pathologies whose treatment requires the release of endothelial prostacyclin having high activity over time.

Questo é sorprendente in quanto nell'arte nota non vi era nessuna indicazione che i complessi dell'invenzione potessero permettere il rilascio di prostaciclina per tempi molto superiori a quelli riportati nell'arte nota, senza provocare effetti tossici collaterali. This is surprising since in the known art there was no indication that the complexes of the invention could allow the release of prostacyclin for times much longer than those reported in the known art, without causing toxic side effects.

Le formulazioni farmaceutiche contenenti i complessi liposoma cationico-polidesossiribonucleotidi contengono gli usuali veicoli ed eccipienti. Possono essere nella forma di emulsioni sterili e apirogene, oppure di liofilizzati conservati in adatti flaconi e da sciogliere estemporaneamente in solventi acquosi sterili. In quest'ultimo caso é preferito che i polidesossiribonucleotidi si trovino già in soluzione nella fiala o flacone contenente il solvente. The pharmaceutical formulations containing the cationic liposome-polydeoxyribonucleotide complexes contain the usual carriers and excipients. They can be in the form of sterile and apyrogenic emulsions, or of lyophilisates preserved in suitable bottles and to be dissolved extemporaneously in sterile aqueous solvents. In the latter case it is preferred that the polydeoxyribonucleotides are already in solution in the vial or bottle containing the solvent.

Come solventi acquosi possono venire usate usate soluzioni isotoniche sterili contenenti tamponi convenzionali (citrati, fosfati) assieme ai conservanti noti. Sterile isotonic solutions containing conventional buffers (citrates, phosphates) together with known preservatives can be used as aqueous solvents.

Le vie di somministrazione dell'emulsione contenente il complesso sono quelle per via parenterale, vale a dire endoverta, intramuscolo, sottocute e per infusione. The routes of administration of the emulsion containing the complex are those by parenteral route, i.e. endoverta, intramuscular, subcutaneously and by infusion.

La quantità di principio attivo contenuto nella preparazione varia da 1 a 20 mg/ml di polidesossiribonucleotide. The amount of active ingredient contained in the preparation varies from 1 to 20 mg / ml of polydeoxyribonucleotide.

Le dosi giornaliere di polidesossiribonucleotidi somministrati attraverso i liposomi variano da 10 a 200 mg, preferibilmente da 20 a 120 mg. The daily doses of polydeoxyribonucleotides administered through the liposomes vary from 10 to 200 mg, preferably from 20 to 120 mg.

I seguenti esempi hanno lo scopo di chiarire il contenuto della presente invenzione e non debbono venire interpretati come una limitazione dell'ambito della medesima. The following examples are intended to clarify the content of the present invention and should not be interpreted as a limitation of the scope of the same.

ESEMPIO 1 EXAMPLE 1

Preparazione dei liposomi dei polidesossiribonucleotidi per gli usi terapeutici secondo la presente invenzione. Preparation of the liposomes of the polydeoxyribonucleotides for the therapeutic uses according to the present invention.

La preparazione dei liposomi usati nella presente invenzione viene effettuata secondo il metodo di evaporazione del solvente ("reverse phase evaporation"). The preparation of the liposomes used in the present invention is carried out according to the method of evaporation of the solvent ("reverse phase evaporation").

In dietiletere vengono sciolti 100 mg di fosfatidilcolina di soia (Phospholipon® 90- Natterman Phospholipid GmbH), dioactadecildimetil ammonio bromuro (abbr. DIDAB -Fluka Chemie AG) e 0,1% p/p di alfa-tocoferolo (Fluka Chemie AG). Fosfatidilcolina e tensioattivo cationico vengono miscelati in rapporto molare 10:1. 100 mg of soy phosphatidylcholine (Phospholipon® 90- Natterman Phospholipid GmbH), dioactadecyldimethyl ammonium bromide (abbr. DIDAB -Fluka Chemie AG) and 0.1% w / w alpha-tocopherol (Fluka Chemie AG) are dissolved in diethylether. Phosphatidylcholine and cationic surfactant are mixed in a molar ratio of 10: 1.

Alla fase organica viene aggiunta acqua bidistillata nel rapporto 4 parti di fase organica/l parte di acqua, ottenendo una emulsione acqua in olio. Double-distilled water is added to the organic phase in the ratio of 4 parts of organic phase / l part of water, obtaining a water-in-oil emulsion.

Si effettua su questa emulsione una sonicazione a 0°C per l'O minuti utilizzando un "bath sonicator" Branson 2200. Si allontana l'etere per evaporazione a pressione ridotta fino ad ottenere una sospensione liposomiale acquosa, che viene sottoposta in apposita apparecchiatura ad estrusione attraverso membrane di policarbonato (Nucleopore) con diametro dei pori di 0,4 μνα. A sonication at 0 ° C for 1 minute is carried out on this emulsion using a Branson 2200 "bath sonicator". The ether is removed by evaporation under reduced pressure until an aqueous liposomal suspension is obtained, which is subjected in a special apparatus to extrusion through polycarbonate membranes (Nucleopore) with a pore diameter of 0.4 μνα.

Si aggiunge una quantità di mannitolo pari a 10 volte il peso dei lipidi e si liofilizza la sospensione. A quantity of mannitol equal to 10 times the weight of the lipids is added and the suspension is lyophilized.

50 mg di un polidesossiribonucleotide avente peso molecolare 28.000, ottenuto per depolimerizzazione di acidi nucleici ad elevato peso molecolare secondo il brevetto USP 4.985.552, vengono sciolti in 5 mi di soluzione fisiologica isotonica. Il liofilizzato viene aggiunto di 5 mi di acqua bidistillata. Si mescolano le due fasi acquose e si agita brevemente. Nella sospensione così ottenuta la concentrazione di fosfatidiicolina é di 10 mg/ml e quella del polidesossiribonucleotide é di 5 mg/ml. 50 mg of a polydeoxyribonucleotide having a molecular weight of 28,000, obtained by depolymerization of high molecular weight nucleic acids according to USP 4,985,552, are dissolved in 5 ml of isotonic physiological solution. The lyophilisate is added with 5 ml of double distilled water. The two aqueous phases are mixed and stirred briefly. In the suspension thus obtained the concentration of phosphatidiicoline is 10 mg / ml and that of the polydeoxyribonucleotide is 5 mg / ml.

ESEMPIO 2 EXAMPLE 2

Preparazione dei liposomi dei polidesossiribonucleotidi secondo l'arte nota (Gursoy et alii, Pharmazie 48 (1993) H 7 559-560) . Preparation of the liposomes of the polydeoxyribonucleotides according to the known art (Gursoy et alii, Pharmazie 48 (1993) H 7 559-560).

La medesima fase organica dell'esempio l, con gli stessi componenti sopra indicati, viene separatamente portata a secco in un recipiente. Si aggiunge una soluzione acquosa del medesimo polidesossiribonucleotide usato nella preparazione precedènte, solubilizzando 50 mg del composto in 10 mi di τsolνuzione fisiologica. Mediante sonicazione si ottiene la formazione delle vescicole liposomiali inglobanti il principio attivo. Le concentrazioni di fosfatidilcolina e del polidesossiribonur.cleotide sono le medesime del complesso ottenuto in precedenza . The same organic phase of example 1, with the same components indicated above, is separately brought to dryness in a container. An aqueous solution of the same polydeoxyribonucleotide used in the previous preparation is added, solubilizing 50 mg of the compound in 10 ml of physiological solution. The formation of liposomal vesicles incorporating the active principle is obtained by means of sonication. The concentrations of phosphatidylcholine and of the polydeoxyribonur.cleotide are the same as in the complex obtained previously.

ESEMPIO 3 EXAMPLE 3

Dimostrazione della formazione del complesso polidesossiribonucleotide-liposoma dell'esempio 1 mediante la tecnica elettroforetica . Demonstration of the formation of the polydeoxyribonucleotide-liposome complex of Example 1 by means of the electrophoretic technique.

L'elettroforesi viene effettuata in un gel di agarosio al 3% contenente 0,5 //g/ml di etidio bromuro come agente di fluorescenza. Il sistema elettroforetico é costituito da una vaschetta contenente il gel, alla quale viene applicato un campo elettrico di 50 mV. In questo modo il polidesossiribonucleotide migra dalla zona di semina verso il polo positivo. Electrophoresis is carried out in a 3% agarose gel containing 0.5 // g / ml of ethidium bromide as a fluorescing agent. The electrophoretic system consists of a tray containing the gel, to which an electric field of 50 mV is applied. In this way the polydeoxyribonucleotide migrates from the sowing area towards the positive pole.

Nel gel vengono seminati 20 μΐ di una soluzione del complesso dell'esempio 1, nella quale la concentrazione del polidesossiribonucleotide é di 5 mg/ml, e di una soluzione in acqua della medesima sostanza a concentrazioni scalari da 5 a 0,5 mg/ml. 20 μΐ of a solution of the complex of Example 1 are sown in the gel, in which the concentration of the polydeoxyribonucleotide is 5 mg / ml, and of a solution in water of the same substance at scalar concentrations from 5 to 0.5 mg / ml. .

il campo elettrico viene applicato per 40 minuti. Alla fine della corsa elettroforetica il gel di agarosio nel quale é stato seminato il conplesso liposoma-polidesossiribonucleotide non mostra alcuna colorazione, il gel nel quale é stato seminato solo il polidesossiribonucleotide mostra una banda allungata di intensità proporzionale alla quantità seminata. ESEMPIO 4 the electric field is applied for 40 minutes. At the end of the electrophoretic run, the agarose gel in which the liposome-polydeoxyribonucleotide complex has been sown does not show any color, the gel in which only the polydeoxyribonucleotide has been sown shows an elongated band of intensity proportional to the quantity sown. EXAMPLE 4

Confronto della stabilità del complesso 1iposoma-polidesossiribonucleotide ottenuto secondo l'esempio 1 con quella del complesso nel quale il polidesossiribonucleotide é contenuto all'interno del liposoma (esempio 2) mediante la valutazione dell'attività antiinfiammatoria al tempo zero e dopo 30 giorni di condizionamento delle soluzioni dei liposomi a 25°C. Comparison of the stability of the hyposome-polydeoxyribonucleotide complex obtained according to example 1 with that of the complex in which the polydeoxyribonucleotide is contained within the liposome (example 2) by evaluating the anti-inflammatory activity at time zero and after 30 days of conditioning of the liposome solutions at 25 ° C.

Sono stati utilizzati ratti maschi ceppo Sprague Dawley del peso di 250-270 g. Male Sprague Dawley strain rats weighing 250-270 g were used.

venivano costituiti 3 gruppi di 18 animali ciascuno e in ogni gruppo si procedeva alla somministrazione per via endovena di una delle seguenti soluzioni: 3 groups of 18 animals each were constituted and in each group one of the following solutions was administered intravenously:

1. Gruppo controllo: soluzione fisiologica 2 ml/Kg. 1. Control group: physiological solution 2 ml / Kg.

2. Gruppo trattato con il complesso liposoma-polidesossiribonucleotide (rif. es. i): soluzione fisiologica contenente il complesso in quantità pari ad una concentrazione di polidesossiribonucleotide (rif. es. 1) di 1 mg/ml alla dose di 2 mg/Kg. 2. Group treated with the liposome-polydeoxyribonucleotide complex (ref. Ex. I): physiological solution containing the complex in a quantity equal to a concentration of polydeoxyribonucleotide (ref. Ex. 1) of 1 mg / ml at a dose of 2 mg / kg .

3. Gruppo trattato con il complesso liposoma-polidesossiribonucleotide secondo A. Gursoy et alii (vedi sopra): soluzione fisiologica contenente il complesso in quantità pari ad una concentrazione di polidesossiribonucleotide di 1 mg/ml alla dose di 2 mg/Kg. 3. Group treated with the liposome-polydeoxyribonucleotide complex according to A. Gursoy et alii (see above): physiological solution containing the complex in a quantity equal to a concentration of polydeoxyribonucleotide of 1 mg / ml at a dose of 2 mg / kg.

30 minuti dopo il trattamento, sotto blanda anestesia eterea, negli animali veniva indotta la pleurite per somministrazione per via intrapleurica di 0,5 mi di una soluzione in fisiologica di carragenina 1% p/v e 5 mi di acqua per via orale. 30 minutes after treatment, under mild ethereal anesthesia, pleurisy was induced in animals by intrapleural administration of 0.5 ml of a saline solution of carrageenan 1% w / v and 5 ml of water orally.

Dopo 6 ore gli animali venivano sacrificati mediante dissanguamento per recisione delle carotidi. Tramite adatta siringa veniva recuperato l'essudato pleurico, di cui si determinava il contenuto in leucociti polimorfonucleati neutrofili (PMN) attraverso il dosaggio dell'enzima mieloperossidasi {MPO), che é l'enzima peculiare di queste cellule. After 6 hours the animals were sacrificed by bleeding by cutting the carotids. The pleural exudate was recovered by means of a suitable syringe, the content of which was determined in neutrophil polymorphonuclear leukocytes (PMN) through the dosage of the enzyme myeloperoxidase (MPO), which is the peculiar enzyme of these cells.

I campioni di essudato venivano agitati, in modo da disperdere uniformemente le cellule presenti e quindi si prelevavano 0,2 mi a cui si aggiungevano 4,8 mi di soluzione tamponata di HTAB (esadeciltrimetilammonio bromuro) allo 0,5% p/v. Le sospensioni erano poi congelate e raffreddate a -80°C in modo da provocare la rottura delle cellule, quindi scongelate prima di venire sottoposte a sonicazione a 80 watt per l minuto. I preparati venivano poi portati a 60°C per due ore allo scopo di degradare gli inibitori della mieloperossidasi e successivamente centrifugati a 11800 g per 5 minuti a 4°C. The exudate samples were stirred, so as to uniformly disperse the cells present and then 0.2 ml was taken to which 4.8 ml of buffered solution of HTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) at 0.5% w / v was added. The suspensions were then frozen and cooled to -80 ° C to cause the cells to rupture, then thawed before being sonicated at 80 watts per minute. The preparations were then brought to 60 ° C for two hours in order to degrade the myeloperoxidase inhibitors and subsequently centrifuged at 11800 g for 5 minutes at 4 ° C.

Prima di procedere al dosaggio spettrofotometrico dell'enzima, si diluiva il campione con la soluzione di HTAB allo scopo di portare i valori di lettura ΔΕ/min sulla retta di taratura spettrofotometrica tracciata usando MPO standard. Before proceeding to the spectrophotometric assay of the enzyme, the sample was diluted with the HTAB solution in order to bring the reading values ΔΕ / min on the spectrophotometric calibration line drawn using standard MPO.

La mieloperossidasi veniva dosata in presenza di una quantità standard di acqua ossigenata in funzione della velocità di ossidazione del cromogeno 3,3', 5,5' tetrametilbenzidina, il quale nella forma ossidata assume una colorazione blu, la cui intensità viene determinata alla lunghezza d'onda di 650 nm. Myeloperoxidase was measured in the presence of a standard quantity of hydrogen peroxide as a function of the oxidation rate of the chromogen 3,3 ', 5,5' tetramethylbenzidine, which in the oxidized form assumes a blue color, the intensity of which is determined at the length d 'wave of 650 nm.

I risultati sono espressi come variazione percentuale rispetto alla quantità di MPO trovata nei controlli e vengono riportati nella seguente Tabella III. The results are expressed as a percentage change with respect to the amount of MPO found in the controls and are reported in the following Table III.

Dalla tabella si desume che mentre l'attività antiinfiammatoria delle due preparazioni al tempo zero é sostanzialmente uguale, dopo 30 giorni quella dei liposomi dell'esempio 1 non si discosta in maniera significativa dal valore iniziale, mentre la preparazione contenente i liposomi secondo Gursoy et Al. evidenzia un calo di attività del 70% rispetto al valore AAUC % iniziale. Parallelamente si notava che la fase acquosa era divenuta limpida ed era presente un corpo di fondo non risospendibile. From the table it can be deduced that while the anti-inflammatory activity of the two preparations at time zero is substantially equal, after 30 days that of the liposomes of Example 1 does not differ significantly from the initial value, while the preparation containing the liposomes according to Gursoy et Al shows a decrease in activity of 70% compared to the initial AAUC% value. At the same time it was noted that the aqueous phase had become clear and there was a bottom body which was not resuspendable.

Contemporaneamente gli animali trattati con questa preparazione mostravano evidenti segni di sofferenza con dispnea pronunciata. At the same time, the animals treated with this preparation showed evident signs of suffering with pronounced dyspnea.

ESEMPIO 5 EXAMPLE 5

Valutazione della stabilità del complesso dell'esempio 1 a confronto con quella del complesso nel quale il polidesossiribonucleotide é contenuto all'interno del liposoma (esempio 2‘): effetto farmacologico (attività antiipertensiva) in ratti con ipertensione indotta da inibizione del rilascio di ossido nitrico (NO) endogeno) al tempo zero e dopo 30 giorni di condizionamento delle soluzioni dei liposomo a 25°C. Evaluation of the stability of the complex of example 1 in comparison with that of the complex in which the polydeoxyribonucleotide is contained within the liposome (example 2 '): pharmacological effect (antihypertensive activity) in rats with hypertension induced by inhibition of the release of nitric oxide (NO) endogenous) at time zero and after 30 days of conditioning the liposome solutions at 25 ° C.

Ratti maschi ceppo Sprague Dawley dal peso di 250 20 g, non a digiuno al momento della sperimentazione, vengono anestetizzati con etiluretano. Due cateteri vengono inseriti rispettivamente nell'arteria carotide sinistra per la registrazione della pressione arteriosa sistemica media (MABP) e nella vena giugulare destra per la somministrazione delle sostanze in esame. La trachea viene incannulata per facilitare la respirazione spontanea e la temperatura corporea degli animali é mantenuta a 37°C. La MABP viene registrata in continuo per tutta la durata dell'esperimento, viene somministrata eparina (500 u.l./Kg i.v.) per evitare la coagulazione del sangue nel sistema di registrazione. Male Sprague Dawley strain rats weighing 250-20 g, not fasting at the time of testing, are anesthetized with ethyl urethane. Two catheters are inserted respectively into the left carotid artery for recording the mean systemic arterial pressure (MABP) and into the right jugular vein for administration of the test substances. The trachea is cannulated to facilitate spontaneous breathing and the body temperature of the animals is kept at 37 ° C. The MABP is recorded continuously for the duration of the experiment, heparin (500 u.l./Kg i.v.) is administered to avoid blood clotting in the recording system.

Dopo 30 minuti i ratti vengono randomizzati in gruppi omogenei . After 30 minutes the rats are randomized into homogeneous groups.

Il trattamento con le sostanze o il veicolo viene effettuato con bolo rapido seguito immediatamente da una perfusione. Un'ora dopo l'inizio della perfusione tutti gli animali ricevono per bolo endovenoso L-NAME (IO mg/Kg). La perfusione prosegue fino a 30 minuti dopo l'iniezione del composto. Treatment with the substances or vehicle is done with a rapid bolus followed immediately by a perfusion. One hour after the start of perfusion, all animals receive L-NAME (10 mg / kg) by intravenous bolus. Perfusion continues for up to 30 minutes after the compound is injected.

Le variazioni pressorie indotte dai vari trattamenti sono espresse come area sotto la curva (AUC) relativa ai 30 minuti di osservazione dopo il trattamento con L-NAME. The pressure changes induced by the various treatments are expressed as the area under the curve (AUC) relating to the 30 minutes of observation after treatment with L-NAME.

L'area sotto la curva in valore assoluto risulta direttamente correlata all'attività farmacologica, il parametro AUC permette quindi di effettuare un confronto interno di attività tra i campioni in esame. The area under the curve in absolute value is directly correlated to the pharmacological activity, the AUC parameter therefore allows to carry out an internal comparison of activity between the samples under examination.

Nel modello sperimentale in questione gli animali venivano suddivisi in quattro gruppi (6 animali per gruppo), ognuno dei quali veniva trattato con una somministrazione in bolo rapido iniziale <1 ml/Kg), subito seguita da una perfusione di 2 ml/Kg/h, come qui di seguito spiegato: In the experimental model in question, the animals were divided into four groups (6 animals per group), each of which was treated with an initial rapid bolus administration <1 ml / kg), immediately followed by a perfusion of 2 ml / kg / h , as explained below:

1. Gruppo controllo (CTR): soluzione fisiologica 1 ml/Kg bolo 2 ml/Kg/ora in perfusione. 1. Control group (CTR): physiological solution 1 ml / kg bolus 2 ml / kg / hour in perfusion.

2. Gruppo polidesossiribonucleotide p. mol. 28.000 (rif. 2. Polydeoxyribonucleotide group p. mol. 28,000 (ref.

es. 1): soluzione fisiologica contenente la sostanza alla concentrazione di 10 mg/ml alla dose di 10 mg/Kg bolo 20 mg/Kg/h in perfusione. ex. 1): physiological solution containing the substance at a concentration of 10 mg / ml at a dose of 10 mg / kg bolus 20 mg / kg / h in perfusion.

3. Gruppo trattato con il complesso liposoma-polidesossiribonucleotide (rif. es. 1): soluzione fisiologica contenente il complesso in quantità pari ad una concentrazione di polidesossiribonucleotide (rif. es. 1) di 5 mg/ml alla dose di 5 mg/Kg bolo 10 mg/Kg/h in perfusione. 3. Group treated with the liposome-polydeoxyribonucleotide complex (ref. Ex. 1): physiological solution containing the complex in a quantity equal to a concentration of polydeoxyribonucleotide (ref. Ex. 1) of 5 mg / ml at a dose of 5 mg / kg bolus 10 mg / kg / h in perfusion.

4. Gruppo trattato con il complesso liposoma-polidesossiribonucleotide secondo A. Gursoy et alii (vedi,sopra): soluzione fisiologica contenente il complesso in quantità pari ad una concentrazione di polidesossiribonucleotide di 5 rag/ml alla dose di 5 mg/Kg bolo 10 mg/Kg/h in perfusione. 4. Group treated with the liposome-polydeoxyribonucleotide complex according to A. Gursoy et alii (see, above): physiological solution containing the complex in a quantity equal to a concentration of polydeoxyribonucleotide of 5 rag / ml at a dose of 5 mg / kg bolus 10 mg / Kg / h in perfusion.

L'attività farmacologica, espressa come Δ% AUC rispetto al gruppo controllo (gruppo 1), determinata al momento della preparazione dei due complessi e dopo 30 giorni di invecchiamento in termostato a 25°C in ambiente mantenuto sterile, é riportata nella Tabella I. The pharmacological activity, expressed as Δ% AUC compared to the control group (group 1), determined at the time of preparation of the two complexes and after 30 days of aging in a thermostat at 25 ° C in a sterile environment, is reported in Table I.

I valori AAUC % che sono stati osservati al tempo zero e dopo 30 giorni nei gruppi 3 e 4, indicano che queste preparazioni posseggono una attività antiipertensiva significativa alle dosi somministrate. The AAUC% values that were observed at time zero and after 30 days in groups 3 and 4 indicate that these preparations possess significant antihypertensive activity at the administered doses.

Mentre l'attività antiipertensiva dei liposomi dell'esempio 1 varia in modo non significativo e al tempo zero é sostanzialmente uguale a quella evidenziata dalla preparazione contenente i liposomi secondo Gursoy et Al., dopo 30 giorni l'attività di quest'ultima scende al 70% rispetto al corrispondente valore &AUC % iniziale, e parallelamente la fase acquosa al termine della prova si presenta limpida con un corpo di fondo. While the antihypertensive activity of the liposomes of example 1 varies in an insignificant way and at time zero is substantially equal to that highlighted by the preparation containing the liposomes according to Gursoy et Al., After 30 days the activity of the latter drops to 70 % with respect to the corresponding initial value & AUC%, and at the same time the aqueous phase at the end of the test is clear with a bottom body.

Contemporaneamente gli animali trattati con questa preparazione mostravano evidenti segni di sofferenza con dispnea pronunciata . At the same time, the animals treated with this preparation showed evident signs of suffering with pronounced dyspnea.

ESEMPIO 6 EXAMPLE 6

Confronto della stabilità del complesso liposoma-polidesossiribonucleotide ottenuto secondo l'esempio 1 con quella del complesso nel quale il polidesossiribonucleotide é contenuto all'interno del liposoma (esempio 2) mediante la valutazione dell'attività antitrombotica al tempo zero e dopo 30 giorni di.condizionamento delle soluzioni dei liposomi a 25°C. Comparison of the stability of the liposome-polydeoxyribonucleotide complex obtained according to example 1 with that of the complex in which the polydeoxyribonucleotide is contained within the liposome (example 2) by evaluating the antithrombotic activity at time zero and after 30 days of conditioning. of the liposome solutions at 25 ° C.

Si sono utilizzati ratti maschi ceppo Sprague Dawley del peso di 200-230 g, tenuti a digiuno per 16 ore prima di venire anestetizzati con uretano (1,25 g/Kg i.p.) come richiesto dal modello sperimentale. Male Sprague Dawley strain rats weighing 200-230 g were used, fasted for 16 hours before being anesthetized with urethane (1.25 g / kg i.p.) as required by the experimental model.

Dopo aver isolato l'arteria carotide destra e la vena giugulare sinistra degli animali, sull'arteria sono stati posizionati un elettrodo bipolare (Lesion Producing Device 3500 Ugo Basile - Comerio, Varese) e, a 0,5 cm di distanza, una sonda termosensibile collegata a un poligrafo. Nella vena viene inserito un catetere per la somministrazione delle preparazioni . After having isolated the right carotid artery and the left jugular vein of the animals, a bipolar electrode (Lesion Producing Device 3500 Ugo Basile - Comerio, Varese) and, 0.5 cm away, a thermosensitive probe were placed on the artery. connected to a polygraph. A catheter is inserted into the vein for administration of the preparations.

Dopo 15 minuti di stabilizzazione del preparato, la temperatura carotidea é stata registrata, in continuo, da 5 minuti prima a 60 minuti dopo l'induzione della lesione endoteliale ad opera dell'elettrodo. Ciò ha consentito di determinare indirettamente la formazione di trombi endoluminali per correlazione tra il raffreddamento del vaso e la riduzione del flusso ematico. La lesione endoteliale é stata provocata mediante una serie di 5 stimoli elettrici in corrente continua, il primo della durata di 30 secondi e di un minuto quelli successivi. Gli stimoli intervallati di un minuto l'uno dall'altro, erano tali che l'impedenza misurata sull'arteria lesionata risultava di 10 mA. L'impedenza é stata misurata con un tester e veniva regolata per ciascun animale durante i primi 30 secondi di stimolazione e ha richiesto d.d.p. applicate di circa 30 Volt. After 15 minutes of stabilization of the preparation, the carotid temperature was recorded continuously from 5 minutes before to 60 minutes after the induction of the endothelial lesion by the electrode. This allowed to indirectly determine the formation of intraluminal thrombi due to the correlation between the cooling of the vessel and the reduction of blood flow. The endothelial lesion was caused by a series of 5 electrical stimuli in direct current, the first lasting 30 seconds and the following one minute. The stimuli spaced one minute apart from each other were such that the impedance measured on the injured artery was 10 mA. Impedance was measured with a tester and was adjusted for each animal during the first 30 seconds of stimulation and required d.d.p. applied of about 30 Volts.

E' stata determinata la temperatura carotidea immediatamente prima della stimolazione elettrica (valore basale) e ad intervalli di tempo costanti (5, 10, 15, 30, 45 e 60 minuti) dopo la stimolazione. The carotid temperature was determined immediately before the electrical stimulation (basal value) and at constant time intervals (5, 10, 15, 30, 45 and 60 minutes) after the stimulation.

L'attività antitrombotica é stata valutata come variazione Δ% AUC % dell'area sotto la curva (AUC) rispetto a quella dei controlli. Antithrombotic activity was evaluated as the Δ% AUC% change in the area under the curve (AUC) compared to that of the controls.

I gruppi erano costituiti da 10-12 ratti ciascuno. The groups consisted of 10-12 rats each.

Tutti i trattamenti sono stati eseguiti come bolo endovenoso, che é stato somministrato 5 minuti prima dell'inizio della stimolazione elettrica. All treatments were performed as an intravenous bolus, which was administered 5 minutes before the start of electrical stimulation.

I gruppi formati sono stati i seguenti: The groups formed were the following:

1. Gruppo controllo SHAM, in cui gli animali venivano operati e monitorati come si é qui sopra descritto, ma non sono stati esposti alla stimolazione elettrica. Il tracciato A°c/minuti ottenuto con questo gruppo é stato utilizzato come linea di base di riferimento per il calcolo di AUC. 1. SHAM control group, in which the animals were operated and monitored as described above, but were not exposed to electrical stimulation. The A ° c / minutes trace obtained with this group was used as a reference baseline for the calculation of AUC.

2. Gruppo controllo, trattato con soluzione fisiologica (1,5 mi /Kg i . v. ) . 2. Control group, treated with physiological solution (1.5 ml / kg i. V.).

3. Gruppo trattato con il complesso liposoma-polidesossiribonucleotide (rif. es. 1): soluzione fisiologica contenente il complesso in quantità pari ad .una concentrazione di polidesossiribonucleotide {rif. es. 1) di 5 mg/ml; dose somministrata: 7,5 mg/Kg. 3. Group treated with the liposome-polydeoxyribonucleotide complex (ref. Example 1): physiological solution containing the complex in a quantity equal to a concentration of polydeoxyribonucleotide {ref. ex. 1) of 5 mg / ml; dose administered: 7.5 mg / kg.

4. Gruppo trattato con il complesso liposoma-polidesossiribonucleotide secondo A. Gursoy et alii {vedi sopra): soluzione fisiologica contenente il complesso in quantità pari ad una concentrazione di polidesossiribonucleotide di 5 mg/ml; dose somministrata: 7,5 mg/Kg. 4. Group treated with the liposome-polydeoxyribonucleotide complex according to A. Gursoy et alii (see above): physiological solution containing the complex in a quantity equal to a concentration of polydeoxyribonucleotide of 5 mg / ml; dose administered: 7.5 mg / kg.

L'attività é stata determinata al momento della preparazione dei due conplessi e dopo 30 giorni di condizionamento in termostato a 25°C in condizioni sterili. The activity was determined at the time of preparation of the two complexes and after 30 days of conditioning in a thermostat at 25 ° C under sterile conditions.

I risultati sono riportati in Tabella II. The results are reported in Table II.

Dalla tabella si osserva che mentre l'attività antitrombotica delle due preparazioni al tempo zero é sostanzialmente uguale, dopo 30 giorni quella dei liposomi dell'esempio l non si discosta in maniera significativa dal valore iniziale, mentre la preparazione contenente i liposomi secondo Gursoy et Al. evidenzia un calo di attività del 70% rispetto al valore AAUC % iniziale. Parallelamente si notava che la fase acquosa era divenuta limpida ed era presente un corpo di fondo non risospendibile . From the table it is observed that while the antithrombotic activity of the two preparations at time zero is substantially the same, after 30 days that of the liposomes of example 1 does not differ significantly from the initial value, while the preparation containing the liposomes according to Gursoy et Al shows a decrease in activity of 70% compared to the initial AAUC% value. At the same time it was noted that the aqueous phase had become clear and there was a bottom body which was not resuspendable.

ESEMPIO 7 EXAMPLE 7

Formulazione farmaceutica, contenente i liposomi che vengono utilizzati nella presente invenzione, per somministrazione monodose. Pharmaceutical formulation, containing the liposomes that are used in the present invention, for single-dose administration.

- flacone sterile da 3 mi contenente il liposoma liofilizzato: - 3 ml sterile bottle containing the lyophilized liposome:

phospholipon 90 mg 100 phospholipon 90 mg 100

DIDAB mg 10 DIDAB mg 10

alfa -tocoferolo mg 0,l alpha-tocopherol mg 0, l

saccarosio g 1 sucrose g 1

Riprendere prima dell'uso con l mi di acqua bidistillata sterile per preparazioni iniettabili. Aggiungere poi sterilmente la seguente soluzione sterile già pronta, preconfezionata in siringa monouso da 1 mi: Resume before use with 1 ml of sterile double distilled water for injections. Then sterile add the following ready-made sterile solution, prepackaged in a 1 ml disposable syringe:

polidesossiribonucleotide (rif. es. 1} mg io citrato trisodico biidrato mg 2,5 acqua per preparazioni iniettabili e polydeoxyribonucleotide (ref. e.g. 1} mg i trisodium citrate dihydrate 2.5 mg water for injections and

conservanti q.b.a. mi 1 ESEMPIO 8 preservatives q.b.a. mi 1 EXAMPLE 8

Formulazione farmaceutica estemporanea da utilizzarsi per un ciclo terapeutico. Extemporaneous pharmaceutical formulation to be used for a therapeutic cycle.

- flacone sterile da.30 mi contenente il liposoma liofilizzato.· - 30 ml sterile bottle containing the lyophilized liposome.

- phospholipon 90 g l - phospholipon 90 g l

DIDAB mg 100 DIDAB mg 100

alfa-tocoferolo mg l alpha-tocopherol mg l

saccarosio g 10 sucrose g 10

Prima dell'uso si aggiungono sterilmente nel flacone 10 mi di acqua bidistillata sterile per preparazioni iniettabili. Before use, 10 ml of sterile double distilled water for injections are added sterile to the bottle.

All'emulsione così preparata si aggiunge sterilmente la seguente soluzione sterile già pronta, contenuta in un flacone da 15 mi, oppure in una siringa monouso preconfezionata da 10 mi : The following ready-made sterile solution, contained in a 15 ml bottle, or in a 10 ml pre-packaged disposable syringe, is sterile added to the emulsion thus prepared:

polidesossiribonucleotide (rif. es. 1) mg 100 citrato trisodico biidrato mg 25 acqua per preparazioni iniettabili e polydeoxyribonucleotide (ref.ex. 1) mg 100 trisodium citrate dihydrate mg 25 water for injections and

conservanti q.b.a. mi 10 preservatives q.b.a. me 10

La preparazione é sufficiente per 5 giorni di terapia alla dose di 20 mg/die. The preparation is sufficient for 5 days of therapy at a dose of 20 mg / day.

TABELLA I TABLE I

Stabilità a 30 giorni del complesso secondo l'esempio 1 a confronto con quella del complesso liposoma-polidesossiribonucleotide secondo Gursoy et Al., valutata tramite l'attività antiinfiammatoria dei polidesossiribonucleotidi (riduzione dell'attività mieloperossidasica nell'essudato pleurico di ratti con pleurite indotta da carragenina). Stability at 30 days of the complex according to example 1 compared with that of the liposome-polydeoxyribonucleotide complex according to Gursoy et Al., Evaluated through the anti-inflammatory activity of the polydeoxyribonucleotides (reduction of myeloperoxidase activity in the pleural exudate of rats with pleurisy induced by carrageenan).

TABELLA II TABLE II

Stabilità a 30 giorni del complesso secondo l'esempio 1 a confronto con quella del complesso liposoma-polidesossiribonucleotide secondo Gursoy et Al., valutata tramite l'attività antiipertensiva dei polidesossiribonucleotidi. Stability at 30 days of the complex according to example 1 compared with that of the liposome-polydeoxyribonucleotide complex according to Gursoy et Al., Evaluated by the antihypertensive activity of the polydeoxyribonucleotides.

* La dose somministrata di„.polidesossiribonucleotide (10 mg/Kg 20 mg/Kg/h) é troppo bassa per dar luogo a una significativa attività antiipertensiva rispetto ai controlli. * The administered dose of polydexoxyribonucleotide (10 mg / kg 20 mg / kg / h) is too low to give rise to significant antihypertensive activity compared to controls.

TABELLA III TABLE III

Stabilità a 30 giorni del complesso secondo l'esempio 1 a confronto con quella del complesso liposoma-polidesossiribonucleotide secondo Gursoy et Al., valutata tramite l'attività antitrombotica dei polidesossiribonucleotidi. Stability at 30 days of the complex according to example 1 compared with that of the liposome-polydeoxyribonucleotide complex according to Gursoy et Al., Evaluated by the antithrombotic activity of the polydeoxyribonucleotides.

Claims

CLAIMS 1. Complexes formed by cationic liposomes and polydeoxyribonucleotides with molecular weight between 15,000 and 60,000 Da obtainable by depolymerization of nucleic acids, in which the ionic bonds between the two components of the complex are found on the outer wall of the liposome, for use as a medicament.

2. Complexes according to claim 1 for preparing drugs with anti-inflammatory activity.

3. Complexes according to claim 1 for preparing drugs with antithrombotic activity.

4. Complexes according to claim 1 for preparing drugs with antihypertensive activity.

5. Complexes according to claim 1 for preparing drugs for the therapy of diseases whose treatment requires the release of endothelial prostacyclin.

6. Complexes according to claims 1 to 5 wherein the polydeoxyribonucleotide used is the defibrotide.

7. Complexes according to claim 6 wherein polydeoxyribonucleotide has a molecular weight comprised between 15,000 and 30,000.

8. Complexes according to claims 1 to 7 in which one or more antioxidants, preferably alpha-tocopherol, are added.

9. Complexes according to claims 1 to 8 in which cationic surfactants are present which contain one or more mono-, di-substituted amino groups, or quaternary ammonium groups, said groups carry one or more aliphatic chains with varying number of carbon atoms 8 to 22, preferably quaternary ammonium surfactants having aliphatic chains with 18 carbon atoms. .

Complexes according to claims 1 to 9 wherein the molar ratio between the total amount of lipid / s of the liposome and cationic surfactant varies from 10: 0.05 to 10: 3, preferably being 10: 1. .

Complexes according to claim 10 in which, together with phosphatidylcholine (or phosphatidylethanolamine) a second and different lipid is present and the internal molar ratios between each of the two lipids and the surfactant (phosphatiditylcholine (or phosphatidylethanolamine): second lipid: surfactant) vary from 9: 1: 0.05 to 7: 3: 3, preferably 8: 2: 1. .

Complexes according to claims 1 to 11 in which the weight ratio between the amount of the liposome and that of the active principle varies from 10: 2 to 10: 0.1, preferably being 10: 1. .

Complexes according to claims 1 to 12 obtainable with a process comprising the following steps: preparation of the liposome by the method of evaporation of the solvent in reverse phase, starting from an emulsion of water in oil consisting of 4 parts of polar or apolar organic phase and a part of water, solubilizing the lipids, the cationic surfactant and the antioxidant in the organic phase, subjecting the obtained biphasic system to sonication at 0 ° C for 5-20 minutes, and evaporating the organic phase at room temperature under reduced pressure, b. the aqueous phase is passed through a polycarbonate membrane with a pore diameter ranging from 100 to 600 nm, preferably 400 nm, at least three times, c. lyophilization of the aqueous suspension after addition of an aqueous solution of a lyophilization adjuvant, so that the quantity of adjuvant is at least 7 times in excess of that of the lipids, the excess being preferably between 10 and 15 times, d. preparation of the final emulsion for pharmaceutical use by adding, under stirring, sterile, a diluted sterile isotonic aqueous solution of polydeoxyribonucleotides to the container containing the lyophilisate; alternatively, a sterile isotonic solution is added to the container containing the lyophilized liposome and the emulsion obtained sterile mixed with the solution of the active principle.

14. Complexes according to claims 1 to 12 contained in pharmaceutical formulations for parenteral administration.