ITMI971693A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BACTERIAL ESOPOLISACCHARIDES BY AEROBIC FERMENTATION ON SOLID SUBSTRATE - Google Patents
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Landscapes
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Description
Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal ti tolo : "Processo per la produzione di esopolisaccaridi batterici mediante fermentazione aerobica su substrato solido" . Patent application for Industrial Invention entitled: "Process for the production of bacterial exopolysaccharides by aerobic fermentation on solid substrate".
Titolare: SOCIETÀ’ COOPERATIVA CENTRO RICERCHE POLYTECH A RESPONSABILITÀ' LIMITATA Owner: POLYTECH RESEARCH CENTER COOPERATIVE COMPANY WITH LIMITED LIABILITY
CAMPO DELL’INVENZIONE FIELD OF THE INVENTION
La presente invenzione riguarda un nuovo procedimento per la produzione di esopolisaccaridi comprendente la fermentazione aerobica di opportuni microorganismi su substrati solidi costituiti da materiali di scarto agricoli, residui di processi dell'industria alimentare o prodotti secondari di processi industriali. The present invention relates to a new process for the production of exopolysaccharides comprising the aerobic fermentation of suitable microorganisms on solid substrates consisting of agricultural waste materials, residues of food industry processes or secondary products of industrial processes.
STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE
Nello stato dell'arte è stata da molti sottolineata l'importanza di svariate specie di microorganismi come fonti alternative di polisaccaridi naturali, che presentano notevoli vantaggi rispetto alle tradizionali fonti vegetali ed animali. Tuttavia, solo poche specie batteriche vengono impiegate a livello industriale per la produzione di polimeri, in particolare esopolisaccaridi (I.W. Sutherland, "Microbial Polysaccharides-Biotechnological products of current and future potential", Biotechno logicai advances in industria i polysaccharides. Gordon & Breach Science Publishers, fiag. 123-132. 1988). In the state of the art, the importance of various species of microorganisms as alternative sources of natural polysaccharides has been underlined by many, which have considerable advantages over traditional plant and animal sources. However, only a few bacterial species are used industrially for the production of polymers, in particular exopolysaccharides (I.W. Sutherland, "Microbial Polysaccharides-Biotechnological products of current and future potential", Biotechno logical advances in industry i polysaccharides. Gordon & Breach Science Publishers , fiag. 123-132. 1988).
Tra i polimeri di interesse economico emerge lo xantano. che può venire prodotto in alte rese da colture di Kanthomonas campestris e viene usualmente utilizzato sia nell'industria alimentare e cosmetica, che come agente viscosizzante nell'estrazione del petrolio. In alternativa allo xantano, nel recupero terziario del petrolio, è stato proposto il succinoglicano, prodotto dai ceppi batterici delle specie Rhizobium. Agrobacterium ed A lcaligenes . Un altro polisaccaride microbico di utilizzo commerciale è il destrano, prodotto industrialmente da colture di Leuconostoc mesenteroides ed impiegato principalmente nella separazione di prodotti biologici. Inoltre, è stato recentemente autorizzato l'uso nel settore alimentare del gellano. prodotto da varie specie di batteri Gram-negativi. Among the polymers of economic interest, xanthan stands out. which can be produced in high yields from Kanthomonas campestris cultures and is usually used both in the food and cosmetic industry, and as a viscosifying agent in oil extraction. As an alternative to xanthan, in the tertiary recovery of oil, succinoglycan has been proposed, produced by bacterial strains of the Rhizobium species. Agrobacterium and A lcaligenes. Another microbial polysaccharide of commercial use is dextran, produced industrially from cultures of Leuconostoc mesenteroides and mainly used in the separation of biological products. Furthermore, the use of gellan in the food sector has recently been authorized. produced by various species of Gram-negative bacteria.
La competitività sul mercato dei polisaccaridi di origine microbica rispetto a quelli di origine vegetale o animale, aventi caratteristiche strutturali ed impiego analoghi, è dovuta essenzialmente ai vantaggi economici di produzione. Inoltre, le fonti microbiche rispetto a quelle vegetali presentano il vantaggio di dare polisaccaridi che non subiscono influenze stagionali (temperatura, umidità, ciclo vegetativo); ciò assicura quindi una produzione costante durante tutto l'anno solare. The competitiveness on the market of polysaccharides of microbial origin compared to those of vegetable or animal origin, having similar structural characteristics and use, is essentially due to the economic advantages of production. Furthermore, the microbial sources compared to the vegetable ones have the advantage of giving polysaccharides that do not undergo seasonal influences (temperature, humidity, vegetative cycle); this therefore ensures constant production throughout the calendar year.
Gli esopolisaccaridi microbici di interesse commerciale vengono usualmente prodotti da microorganismi aerobici in colture liquide (si veda ad esempio il brevetto americano USP 4,282,321), mediante fermentazione in batch o Fed-batch; la produzione in continuo viene utilizzata solo raramente. Microbial exopolysaccharides of commercial interest are usually produced by aerobic microorganisms in liquid cultures (see for example the American patent USP 4,282,321), by batch or Fed-batch fermentation; continuous production is rarely used.
L’inconveniente principale nelle fermentazioni su scala industriale in fase liquida per la produzione di polisaccaridi consiste nell'aumento della viscosità del brodo di coltura dovuto all'accumulo del polimero prodotto. L'aumento della viscosità porta infatti ad una drastica riduzione dell'efficacia dei sistemi di agitazione e di conseguenza ad un'insufficiente distribuzione di ossigeno, calore e massa nel brodo di fermentazione; da ciò deriva una drastica riduzione dell'attività del metabolismo dei microorganismi produttori di esopolisaccaridi. The main drawback in fermentations on an industrial scale in the liquid phase for the production of polysaccharides is the increase in the viscosity of the culture broth due to the accumulation of the polymer produced. The increase in viscosity in fact leads to a drastic reduction in the effectiveness of the stirring systems and consequently to an insufficient distribution of oxygen, heat and mass in the fermentation broth; from this derives a drastic reduction of the metabolism activity of exopolysaccharide-producing microorganisms.
E' noto infatti che, per la maggior parte dei microorganismi, la disponibilità di ossigeno è un fattore essenziale per promuovere la sintesi di polimero in alte rese (H.U. Peters et al., "The Influence of Agitation Rate on Xanthan Production by Xanthomonas campestris", Biotechnology and Bioengineering, 34:1393-1397. In fact, it is known that, for most microorganisms, the availability of oxygen is an essential factor to promote polymer synthesis in high yields (H.U. Peters et al., "The Influence of Agitation Rate on Xanthan Production by Xanthomonas campestris" , Biotechnology and Bioengineering, 34: 1393-1397.
1989). Nel caso di fermentazioni con brodi molto viscosi, è possibile ottenere un adeguato rifornimento di ossigeno solo a costo di elevati dispendi energetici, necessari ad azionare meccanismi di agitazione sufficientemente potenti; inoltre, è richiesto l'utilizzo di bioreattori dal design molto sofisticato. Recentemente, la necessità di superare gli inconvenienti dei processi di fermentazione in mezzo liquido e di migliorarne le rese ha spinto i ricercatori ad esplorare nuove strategie. Un'interessante alternativa alla classica produzione in coltura Liquida prevede metodiche di fermentazione in sistemi a due fasi, <iuali emulsioni e dispersioni. Lu-Kwang Ju et al. ( "Xanthan fermenta tions in water/oil dispersions ", Biotechnology Techniques. 7: 463-468, 1993) descrivono un processo fermentativo per la produzione di xantano in mezzo liquido che utilizza dispersioni acqua/olio, riducendo i problemi causati dall'elevata viscosità dei brodi. Restano tuttavia irrisolti i problemi relativi all'isolamento del polisaccaride prodotto in presenza di surfaitanti . 1989). In the case of fermentations with very viscous broths, it is possible to obtain an adequate supply of oxygen only at the cost of high energy expenditure, necessary to activate sufficiently powerful stirring mechanisms; in addition, the use of very sophisticated design bioreactors is required. Recently, the need to overcome the drawbacks of fermentation processes in liquid medium and to improve yields has prompted researchers to explore new strategies. An interesting alternative to the classic production in liquid culture provides fermentation methods in two-phase systems, the same emulsions and dispersions. Lu-Kwang Ju et al. ("Xanthan fermenta tions in water / oil dispersions", Biotechnology Techniques. 7: 463-468, 1993) describe a fermentation process for the production of xanthan in liquid medium that uses water / oil dispersions, reducing the problems caused by high viscosity broths. However, the problems relating to the isolation of the polysaccharide produced in the presence of surfaitants remain unsolved.
Un'altra alternativa alla produzione microbiologica in mezzo liquido prevede la produzione di esopolisaccaridi mediante fermentazione con cellule immobilizzate. Secondo la metodica realizzata da L. Lebrun et al. { "Exopolysaccharide production by free and immobilized microbial cultures". Enzyme flicrob. Technol. Another alternative to microbiological production in liquid medium involves the production of exopolysaccharides by fermentation with immobilized cells. According to the method developed by L. Lebrun et al. {"Exopolysaccharide production by free and immobilized microbial cultures". Enzyme flicrob. Technol.
16:1048-1054, 1994), opportuni microorganismi vengono immobilizzati ed intrappolati in una struttura composita a base rii dischi di agar e di filtri di esteri di cellulosa. Tale tecnica presenta la limitazione di non essere adatta a tutti i tipi di microorganismi produttori di esopolisaccaridi. Un ulteriore svantaggio è legato all'occlusione dei pori delle membrane da parte del polisaccaride prodotto, che impedisce un adeguato trasporto di nutrienti ed ossigeno alle cellule batteriche. 16: 1048-1054, 1994), suitable microorganisms are immobilized and trapped in a composite structure based on agar discs and cellulose ester filters. This technique has the limitation of not being suitable for all types of exopolysaccharide producing microorganisms. A further disadvantage is linked to the occlusion of the pores of the membranes by the polysaccharide produced, which prevents adequate transport of nutrients and oxygen to the bacterial cells.
Allo scopo di ridurre i costi dei processi di fermentazione in mezzo liquido per la produzione di polisaccaridi, sono stati utilizzati nello stato dell'arte dei mezzi di coltura comprendenti estratti di scarti agricoli o di derivati di processi dell'industria alimentare, substrati largamente disponibili a basso costo. Detti estratti contengono elevate quantità di zuccheri ed altre fonti di carbonio, in grado di sostenere la crescita microbica e la produzione di polimeri in fermentazioni in mezzo liquido. Ad esempio, T. Roukas et al. ("Evaluation of Carob Pod as a Substrate for Pullulan Production by Aurebasidium pullulane", Appi. Biochem. Biotechnol. 55:27-43, 1995) descrivono l’utilizzo di estratti acquosi di baccello di carrube come terreni di fermentazione per la produzione di glucano. Tuttavia, la produzione di esopolisaccaridi su tali substrati non conduce a risultati soddisfacenti in termine di rese finali. In order to reduce the costs of fermentation processes in liquid medium for the production of polysaccharides, in the state of the art culture media have been used including extracts of agricultural waste or derivatives of food industry processes, substrates widely available in low cost. Said extracts contain high quantities of sugars and other carbon sources, capable of supporting microbial growth and the production of polymers in fermentation in liquid medium. For example, T. Roukas et al. ("Evaluation of Carob Pod as a Substrate for Pullulan Production by Aurebasidium pullulane", Appi. Biochem. Biotechnol. 55: 27-43, 1995) describe the use of aqueous extracts of carob pod as fermentation media for the production of glucan. However, the production of exopolysaccharides on such substrates does not lead to satisfactory results in terms of final yields.
E' inoltre noto nello stato dell'arte l'utilizzò di residui della lavorazione di agrumi nella produzione di xantano (D. Bilanovic et al., "Xanthan fermentation of citrus waste", B ioresource Techno logy . 48:169-172, 1994); tali residui, che vengono direttamente aggiunti al terreno liquido di crescita, contengono valide fonti di carbonio per il metabolismo dei microorganismi, quali carboidrati semplici ed acidi organici. Tuttavia, tali tecniche presentano gli stessi inconvenienti sopra riportati per le classiche tecniche di fermentazione in terreno liquido, ed in particolare il drastico aumento della viscosità del brodo di fermentazione dovuto all'accunfulo degli esopolisaccaridi prodotti, con la conseguente riduzione del trasferimento di ossigeno, calore e massa nel brodo di fermentazione stesso. It is also known in the state of the art the use of residues from the processing of citrus fruits in the production of xanthan (D. Bilanovic et al., "Xanthan fermentation of citrus waste", B ioresource Techno logy. 48: 169-172, 1994 ); these residues, which are directly added to the liquid growth medium, contain valid sources of carbon for the metabolism of microorganisms, such as simple carbohydrates and organic acids. However, these techniques have the same drawbacks reported above for the classic fermentation techniques in liquid medium, and in particular the drastic increase in the viscosity of the fermentation broth due to the accumulation of the exopolysaccharides produced, with the consequent reduction of the transfer of oxygen, heat. and mass in the fermentation broth itself.
Inoltre, come sarà ampiamente dimostrato dalla Richiedente nel corso della successiva descrizione dettagliata, utilizzando tali substrati liquidi, le rese di esopolisaccaridi finali non si dimostrano del tutto soddisfacenti. Furthermore, as will be amply demonstrated by the Applicant in the course of the following detailed description, using such liquid substrates, the yields of final exopolysaccharides are not entirely satisfactory.
Sono stati descritti in letteratura (A. Pandey, "Recent Process Developments in Solid-State Fermentation", Process Biochemistry, 27:109-117. 1992) diversi processi di fermentazione su substrato solido per la produzione di biomassa proteica, alcoli, aldeidi, chetoni, acidi organici, enzimi ed altri metaboliti secondari, oltre che per la produzione di concimi mediante fermentazione anaerobica. Tuttavia, tali processi di fermentazione su substrato solido vengono utilizzati nella produzione di sostanze a basso peso molecolare, quali etanolo, penicilline, cefalosporine ed aromi, oppure nella produzione di proteine, che non modificano in modo sostanziale le proprietà reologiche dei brodi di fermentazione. ed in particolare, non conducono ad un aumento della viscosità di soluzioni acquose. Several fermentation processes on solid substrates for the production of protein biomass, alcohols, aldehydes, have been described in the literature (A. Pandey, "Recent Process Developments in Solid-State Fermentation", Process Biochemistry, 27: 109-117. 1992). ketones, organic acids, enzymes and other secondary metabolites, as well as for the production of fertilizers by anaerobic fermentation. However, these fermentation processes on solid substrate are used in the production of low molecular weight substances, such as ethanol, penicillins, cephalosporins and flavors, or in the production of proteins, which do not substantially modify the rheological properties of the fermentation broths. and in particular, they do not lead to an increase in the viscosity of aqueous solutions.
SOMMARIO SUMMARY
La presente invenzione riguarda un nuovo processo per la produzione di esopolisaccaridi batterici , comprendente la fermentazione aerobica di opportuni batteri su un substrato solido costituito da almeno un materiale solido inerte scelto tra scarti agricoli, residui di processi dell'industria alimentare e prodotti secondari di processi industriali; detto substrato solido presenta un contenuto di acqua compreso tra il 40 e l ' 85% in peso ed il processo avviene in assenza di acqua libera. The present invention relates to a new process for the production of bacterial exopolysaccharides, comprising the aerobic fermentation of suitable bacteria on a solid substrate consisting of at least one solid inert material chosen from agricultural waste, residues from food industry processes and secondary products from industrial processes. ; said solid substrate has a water content between 40 and 85% by weight and the process takes place in the absence of free water.
Secondo un primo modo di realizzazione dell'invenzione, detto materiale solido inerte viene utilizzato in associazione con una soluzione contenente un'opportuna fonte di carbonio, assimilabile dal batterio produttore, nonché altri nutrienti, quali ad esempio delle opportune fonti di azoto e di sali minerali. According to a first embodiment of the invention, said solid inert material is used in association with a solution containing a suitable source of carbon, assimilable by the producer bacterium, as well as other nutrients, such as suitable sources of nitrogen and mineral salts .
Secondo un ulteriore modo di realizzazione del processo dell'invenzione, detto materiale solido inerte viene utilizzato in associazione con un materiale particolato contenente una fonte di carbonio endogena (preferibilmente mono e disaccaridi). scelto tra scarti agricoli o prodotti secondari dell'industria alimentare. According to a further embodiment of the process of the invention, said solid inert material is used in association with a particulate material containing an endogenous carbon source (preferably mono and disaccharides). chosen from agricultural waste or secondary products of the food industry.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Le caratteristiche ed i vantaggi del nuovo processo di produzione eli polisaccaridi batterici secondo la presente invenzione vengono illustrati nella seguente descrizione dettagliata. The characteristics and advantages of the new bacterial polysaccharide production process according to the present invention are illustrated in the following detailed description.
La Richiedente ha inaspettatamente trovato che gli esopolisaccaridi batterici possono venire prodotti in alte rese mediante un processo di fermentazione su substrato solido, semplice ed economico, in cui vengono utilizzati terreni solidi costituiti da almeno un materiale solido inerte scelto tra scarti agricoli, residui di processi dell'industria alimentare e prodotti secondari di processi industriali, materie prime largamente disponibili a basso costo. The Applicant has unexpectedly found that bacterial exopolysaccharides can be produced in high yields by means of a fermentation process on a solid substrate, simple and inexpensive, in which solid soils are used consisting of at least one solid inert material selected from agricultural waste, residues from processes of the food industry and by-products of industrial processes, raw materials widely available at low cost.
Il substrato solido di fermentazione presenta un contenuto di acqua compreso tra il 40% e l'85% in peso, e preferibilmente compreso tra il 60% e l'80% in peso. Il processo dell'invenzione avviene quindi in assenza di acqua libera, dove per acqua libera si intende la porzione di acqua in eccesso rispetto alla massima capacità di assorbimento del substrato solido. The solid fermentation substrate has a water content between 40% and 85% by weight, and preferably between 60% and 80% by weight. The process of the invention therefore takes place in the absence of free water, where free water means the portion of water in excess of the maximum absorption capacity of the solid substrate.
Tale processo di fermentazione porta ad un significativo aumento della resa in esopolisaccaridi; inoltre, essendo condotto in assenza di acqua libera, consente di superare gli inconvenienti dei procedimenti di fermentazione in mezzo liquido sopra esposti. Infatti, come sopra visto, nelle colture liquide dello stato dell'arte, la quantità di ossigeno disponibile è spesso il fattore limitante per la crescita dei microorganismi e per la conseguente produzione dei polisaccaridi, a causa della sua scarsa solubilità in acqua e, nel caso di colture viscose, a causa della difficoltà di trasferimento ai microorganismi. This fermentation process leads to a significant increase in exopolysaccharide yield; moreover, since it is carried out in the absence of free water, it allows to overcome the drawbacks of the fermentation processes in liquid medium described above. In fact, as seen above, in state-of-the-art liquid cultures, the amount of oxygen available is often the limiting factor for the growth of microorganisms and for the consequent production of polysaccharides, due to its poor solubility in water and, in the case viscous cultures, due to the difficulty of transfer to microorganisms.
Nella fermentazione su substrato solido, invece, i batteri crescono sulla superficie delle particelle di substrato, mentre il materiale polisaccaridico escreto viene in gran parte assorbito all'interno del supporto poroso. Pertanto, l'ossigeno può diffondere liberamente attraverso gli spazi interparticellari e rendersi disponibile per le cellule attraverso il sottile strato di fluido viscoso che le avvolge. Le rese di esopolisaccaride ottenute con il processo dell'invenzione risultano superiori o uguali a quelle ottenute con le tecniche di fermentazione in colture liquide. In fermentation on solid substrate, on the other hand, bacteria grow on the surface of the substrate particles, while the excreted polysaccharide material is largely absorbed into the porous support. Therefore, oxygen can diffuse freely through the interparticle spaces and become available to the cells through the thin layer of viscous fluid that surrounds them. The exopolysaccharide yields obtained with the process of the invention are higher or equal to those obtained with the fermentation techniques in liquid cultures.
Inoltre, con il processo secondo la presente invenzione si evita di incorrere nell'eccessivo dispendio energetico generalmente richiesto per fornire adeguati gradi di aereazione ed agitazione al brodo di coltura in terreno liquido. Furthermore, with the process according to the present invention it is avoided to incur the excessive energy expenditure generally required to provide adequate degrees of aeration and agitation to the culture broth in liquid medium.
Nel procedimento dell'invenzione, possono essere vantaggiosamente utilizzati i batteri scelti nel gruppo costituito da Rhizobium, Xanthomonas, Agrobacterium. Alcaligenes. Pseudomonas . Azotobacter, Streptococcus e Acinetobacter. Con il processo dell'invenzione possono venire prodotti in alte rese esopolisaccaridi quali alginato, xantano, succinoglicano, gellano, curdlano. glucani, fruttani, levani, emulsano, wellano, ramsano, galattoglucano ed acido ialuronico: detti polisaccaridi sono preferibilmente scelti nel gruppo costituito da alginato, xantano. succinoglicano e pullulano. Nella presente descrizione, con esopolisaccaridi si intende sostanze glicosidiche che possono venire ottenute come prodotto esogeno da processi di fermentazione microbica. In the process of the invention, the bacteria selected from the group consisting of Rhizobium, Xanthomonas, Agrobacterium can be advantageously used. Alcaligenes. Pseudomonas. Azotobacter, Streptococcus and Acinetobacter. With the process of the invention, exopolysaccharides such as alginate, xanthan, succinoglycan, gellan, curdlane can be produced in high yields. glucans, fructans, levanes, emulsan, wellan, ramsan, galactoglucan and hyaluronic acid: said polysaccharides are preferably selected from the group consisting of alginate, xanthan. succinoglycan and teem. In the present description, with exopolysaccharides we mean glycosidic substances which can be obtained as an exogenous product from microbial fermentation processes.
Detto substrato solido, utilizzato nel processo dell'invenzione, è costituito da almeno un materiale solido inerte scelto tra scarti agricoli, residui di processi dell'industria alimentare e prodotti secondari di processi industriali; detto materiale solido inerte è preferibilmente scelto nel gruppo costituito da tnebbie di malto, crusca, paglia, segatura, cortecce, pelatura di semi, pelatura di avorio vegetale (ottenuto ad esempio dai semi di Tagua. appartenente ai generi Palandra e Phytelephas . ed in particolare della specie Palandra macrocarpa ) e buccia e pellicola di chicchi di caffè. Said solid substrate, used in the process of the invention, consists of at least one solid inert material selected from agricultural waste, residues from food industry processes and secondary products from industrial processes; said solid inert material is preferably selected from the group consisting of malt mists, bran, straw, sawdust, bark, seed peeling, vegetable ivory peeling (obtained for example from the seeds of Tagua. belonging to the genera Palandra and Phytelephas. and in particular of the species Palandra macrocarpa) and peel and film of coffee beans.
Nella presente descrizione, con l'espressione "materiale solido inerte" viene indicato un materiale solido che non interagisce chimicamente o biochimicamente con la fermentazione. Detto materiale solido inerte è preferibilmente costituito da particelle di dimensioni comprese tra 1 e 20 mi, ed ancora più preferibilmente tra 1 e 10 un. In the present description, the expression "inert solid material" indicates a solid material which does not chemically or biochemically interact with fermentation. Said inert solid material is preferably constituted by particles having a size ranging from 1 to 20 ml, and even more preferably from 1 to 10 ml.
Secondo un primo modo di realizzazione dell'invenzione, le particelle di tale materiale solido inerte vengono impregnate con opportune soluzioni di nutrienti, necessari a sostenere la crescita batterica. Il substrato, solido per la fermentazione viene preparato impregnando il suddetto materiale solido inerte con una soluzione acquosa, in modo da ottenere un contenuto di acqua compreso tra il 40 e l ' 85% in peso, e preferibilmente tra il 60 e l'80% in peso; il processo avviene quindi in assenza di acqua libera. According to a first embodiment of the invention, the particles of this inert solid material are impregnated with suitable solutions of nutrients, necessary to support bacterial growth. The substrate, solid for fermentation, is prepared by impregnating the aforementioned inert solid material with an aqueous solution, so as to obtain a water content between 40 and 85% by weight, and preferably between 60 and 80% by weight. weight; the process therefore takes place in the absence of free water.
Tale contenuto d'acqua dipende dalla capacità di assorbimento del materiale solido inerte impiegato e dalle caratteristiche di crescita e produzione del particolare microorganismo utilizzato; generalmente, un eccesso di acqua fa assumere al substrato la consistenza di un impasto semiliquido, inadatto alla produzione rii esopolisaccaridi. This water content depends on the absorption capacity of the inert solid material used and on the growth and production characteristics of the particular microorganism used; generally, an excess of water causes the substrate to assume the consistency of a semi-liquid mixture, unsuitable for the production of exopolysaccharides.
La soluzione acquosa impiegata per impregnare il materiale solido inerte può essere acqua o una soluzione acquosa di sali e composti organici assimilabili dai batteri, ed è preferibilmente uno dei terreni liquidi descritti in letteratura per la coltivazione di diversi microorganismi. In particolare, tale soluzione acquosa può contenere delle fonti di carbonio (quali zuccheri ed altri composti organici), delle fonti di azoto (quali composti organici o inorganici azotati), sali minerali (quali sali di potassio e magnesio), vitamine ed altri nutrienti noti nello stato della tecnica. The aqueous solution used to impregnate the inert solid material can be water or an aqueous solution of salts and organic compounds assimilable by bacteria, and is preferably one of the liquid media described in the literature for the cultivation of various microorganisms. In particular, this aqueous solution may contain sources of carbon (such as sugars and other organic compounds), sources of nitrogen (such as organic or inorganic nitrogen compounds), mineral salts (such as potassium and magnesium salts), vitamins and other known nutrients. in the state of the art.
Tra i composti organici azotati, è particolarmente vantaggioso l'uso di glutammato di sodio che. esercitando un certo potere tamponante, consente anche il controllo del pH. Among the organic nitrogenous compounds, the use of sodium glutamate is particularly advantageous. exercising a certain buffering power, it also allows pH control.
Detti composti organici azotati possono anche essere composti complessi, quali l'estratto di lievito, e possono venire vantaggiosamente utilizzati in associazione con il glutammato di sodio. Said organic nitrogenous compounds can also be complex compounds, such as yeast extract, and can be advantageously used in association with sodium glutamate.
II substrato solido cosi ottenuto contiene preferibilmente una fonte di carbonio in quantità pari al 2-40% in peso rispetto al peso del materiale solido inerte, ed una fonte di azoto in quantità pari a 0.05-0,5% in peso rispetto al peso del materiale solido inerte. The solid substrate thus obtained preferably contains a carbon source in an amount equal to 2-40% by weight with respect to the weight of the inert solid material, and a nitrogen source in an amount equal to 0.05-0.5% by weight with respect to the weight of the inert solid material.
In un secondo modo di realizzazione del processo dell'invenzione, il substrato solido di fermentazione è costituito da detto materiale solido inerte in associazione con un materiale particolato contenente una fonte endogena di carbonio, preferibilmente mono o disaccaridi. Detto materiale particolato può essere costituito da scarti o prodotti secondari di processi dell'industria alimentare, che tuttavia non sono inerti ossia, contenendo fonti di carbonio ed altre sostanze nutrienti, sono in grado di interagire chimicamente o biochimicamente con il metabolismo dei batteri produttori. In a second embodiment of the process of the invention, the solid fermentation substrate is constituted by said solid inert material in association with a particulate material containing an endogenous source of carbon, preferably mono or disaccharides. Said particulate material can be made up of waste or secondary products of food industry processes, which however are not inert, that is, as they contain sources of carbon and other nutrients, they are able to chemically or biochemically interact with the metabolism of the producing bacteria.
Detto materiale particolato è scelto preferibilmente nel gruppo costituito da pressatura di mele e di agrumi, residui della lavorazione della barbabietola da zucchero e della canna da zucchero, residui della lavorazione di ortaggi e frutta ecc. Said particulate material is preferably selected from the group consisting of pressing of apples and citrus fruits, residues from processing sugar beet and sugar cane, residues from processing vegetables and fruit, etc.
Nella miscela costituita dal supporto solido inerte e dal materiale particolato, la concentrazione di detto supporto solido inerte è compresa preferibilmente tra il 20 ed il 90% in peso rispetto al peso della miscela secca totale, ed ancora più preferibilmente tra il 35 e l'80% in peso. In the mixture consisting of the inert solid support and the particulate material, the concentration of said inert solid support is preferably between 20 and 90% by weight with respect to the weight of the total dry mixture, and even more preferably between 35 and 80. % by weight.
Detto materiale particolato contenente una fonte endogena di carbonio può venire utilizzato direttamente, dopo essere stato impregnato di acqua e dopo averne eventualmente corretto il pH. La correzione del pH è spesso necessaria nel caso di prodotti di scarto derivanti dalla pressatura di frutti, che presentano normalmente un elevato contenuto di acidi organici; la neutralizzazione può essere ottenuta mediante l'aggiunta di opportune quantità di basi, preferibilmente scelte nel gruppo costituito da NaOH, KOH e carbonati di metalli alcalini o alcalino terrosi·. Said particulate material containing an endogenous source of carbon can be used directly, after having been impregnated with water and after having possibly corrected its pH. Correction of the pH is often necessary in the case of waste products deriving from fruit pressing, which normally have a high content of organic acids; neutralization can be obtained by adding suitable quantities of bases, preferably selected from the group consisting of NaOH, KOH and carbonates of alkali or alkaline earth metals.
Anche in questo caso, il substrato solido ottenuto presenta un contenuto di acqua compreso tra il 40 e 1'85% in peso, e preferibilmente tra il 60 e l'80% in peso. Tale contenuto di acqua può venire ottenuto mediante l'aggiunta di acqua; il processo dell'invenzione avviene sempre in assenza di acqua libera. Also in this case, the solid substrate obtained has a water content between 40 and 85% by weight, and preferably between 60 and 80% by weight. This water content can be obtained by adding water; the process of the invention always takes place in the absence of free water.
Alla miscela di supporto solido inerte e materiale particolato può venire eventualmente addizionata una soluzione acquosa contenente fonti di carbonio quali zuccheri ed altri composti organici, composti organici ed inorganici azotati, sali minerali quali sali di potassio e magnesio, vitamine ed altri nutrienti noti nello stato della tecnica. Secondo un modo preferito di realizzazione, al substrato solido viene addizionato glutammato di sodio, eventualmente in associazione con composti organici azotati complessi quale l'estratto di lievito. An aqueous solution containing carbon sources such as sugars and other organic compounds, organic and inorganic nitrogen compounds, mineral salts such as potassium and magnesium salts, vitamins and other nutrients known in the state of technique. According to a preferred embodiment, sodium glutamate is added to the solid substrate, optionally in association with complex nitrogenous organic compounds such as yeast extract.
La fermentazione del procedimento dell'invenzione viene condotta secondo le procedure e le modalità note nello stato dell'arte, adattate al tipo di microorganismo utilizzato. In particolare, vengono utilizzati opportuni valori di areazione, agitazione, umidificazione, temperatura, pH e tempo di fermentazione. The fermentation of the process of the invention is carried out according to the procedures and methods known in the state of the art, adapted to the type of microorganism used. In particular, suitable values of aeration, agitation, humidification, temperature, pH and fermentation time are used.
La fermentazione viene condotta in condizioni aerobiche. Fermentation is carried out in aerobic conditions.
regolando opportunamente 1'areazione della coltura, importante per l'ottenimento di prodotti di qualità ed in alte rese; detta areazione può essere migliorata insufflando aria sterile nel contenitore di fermentazione. A seconda del microorganismo utilizzato, la fermentazione può essere condotta in forma statica o con un opportuno sistema di mescolamento. Le colture statiche sono condotte in beuta o in bioreattori a vassoio o a letto impaccato. Per le fermentazioni che prevedono mescolamento del substrato. possono essere vantaggiosamente utilizzate apparecchiature note nello stato dell'arte, quali fiasche o tamburi rotanti, od altri tipi di bioreattori generalmente utilizzati per le fermentazioni in stato solido. appropriately regulating the aeration of the crop, which is important for obtaining quality products and high yields; said aeration can be improved by blowing sterile air into the fermentation container. Depending on the microorganism used, fermentation can be carried out in a static form or with an appropriate mixing system. Static cultures are conducted in flasks or in tray or packed bed bioreactors. For fermentations involving mixing of the substrate. equipment known in the state of the art, such as flasks or rotating drums, or other types of bioreactors generally used for solid state fermentations, can be advantageously used.
Il grado di umidità dell'atmosfera nel recipiente di coltura varia a seconda del microorganismo produttore e della composizione del terreno di coltura; preferibilmente si opera alla massima attività relativa, avendo cura di impedire la perdita di acqua dal substrato. The degree of humidity of the atmosphere in the culture vessel varies according to the producer microorganism and the composition of the culture medium; preferably one operates at maximum relative activity, taking care to prevent the loss of water from the substrate.
La temperatura di fermentazione varia a seconda del microorganismo utilizzato per la produzione di esopolisaccaridi; nel caso di ceppi batterici quali Xanthomonas , Rhizobium e Pseudomonas. la temperatura varia preferibilmente da 20 a 40°C, ed ancora più preferibilmente è di circa 30°C. The fermentation temperature varies according to the microorganism used for the production of exopolysaccharides; in the case of bacterial strains such as Xanthomonas, Rhizobium and Pseudomonas. the temperature preferably ranges from 20 to 40 ° C, and even more preferably it is about 30 ° C.
Il processo dell'invenzione presenta inoltre il vantaggio di consentire un agevole controllo dei valori di pH, generalmente superiori rispetto a quelli utilizzati per colture liquide; il pH varia a seconda del microorganismo utilizzato ed è compreso preferibilmente tra 6 e 8, ed ancora più preferibilmente è 7· Per l'ottenimento di valori neutri di pH è sufficiente in alcuni casi l'aggiunta di un substrato azotato, quale peptoni, estratto di lievito, aminoacidi e sali inorganici di ammonio (solfati, cloruri e nitrati). Secondo un metodo preferito di realizzazione dell'invenzione, vengono utilizzate fonti azotate con proprietà tamponanti, quali nitrati alcalini o glutammato di sodio, che portano a migliori rese. Il glutammato di sodio è particolarmente preferito nel processo dell'invenzione, in quanto viene assimilato attivamente dalle cellule batteriche. The process of the invention also has the advantage of allowing easy control of pH values, which are generally higher than those used for liquid cultures; the pH varies according to the microorganism used and is preferably between 6 and 8, and even more preferably it is 7. To obtain neutral pH values it is sufficient in some cases the addition of a nitrogenous substrate, such as peptones, extract yeast, amino acids and inorganic ammonium salts (sulphates, chlorides and nitrates). According to a preferred method of carrying out the invention, nitrogen sources with buffering properties are used, such as alkaline nitrates or sodium glutamate, which lead to better yields. Sodium glutamate is particularly preferred in the process of the invention, as it is actively assimilated by bacterial cells.
Il tempo di fermentazione dipende dal microorganismo utilizzato per la produzione dell'esopolisaccaride e dalla quantità di substrato carbonioso fornita; tale tempo varia preferibilmente da 2 a 8 giorni. The fermentation time depends on the microorganism used for the exopolysaccharide production and on the quantity of carbonaceous substrate supplied; this time preferably varies from 2 to 8 days.
Al termine della fermentazione, la massa solida viene trattata secondo metodologie di purificazione note nello stato della tecnica, allo scopo di isolare 1'esopolisaccaride prodotto. At the end of the fermentation, the solid mass is treated according to purification methods known in the state of the art, in order to isolate the exopolysaccharide produced.
I vantaggi del processo dell'invenzione verranno meglio illustrati nei seguenti esempi, riportati a scopo illustrativo ma non limitativo. The advantages of the process of the invention will be better illustrated in the following examples, reported for illustrative but not limitative purposes.
15SEMPI01 15SAMPS01
1 batteri Agrcbacteviwn tumefaciens PD51 (Dep. Microbiology, IJniv. Wagenihgen, Paesi Bassi) che producono 1'esopolisaccaride succinoglicano sono stati mantenuti in colture stock in agar slants alla temperatura di 4°C. Il terreno agarizzato aveva la seguente composizione: mannitolo 10 g/1, estratto di lievito 0,1 g/1. NaCl 0.1M. K2HP040.5 g/1. MgS04'7H202 g/1 ed agar 20 g/1. I batteri sono stati raccolti con ansa da batteriologia dalla superficie della coltura stock in agar slants ed il materiale raccolto è stato stemperato in beute Erlenraeyer R da 100 mi, contenenti 25 mi di un terreno di coltura, previamente sterilizzato in autoclave a 121°C per 15 minuti, avente la seguente composizione: The bacteria Agrcbacteviwn tumefaciens PD51 (Dep. Microbiology, IJniv. Wagenihgen, The Netherlands) producing succinoglycan exopolysaccharide were maintained in agar slants stock cultures at 4 ° C. The agar medium had the following composition: mannitol 10 g / 1, yeast extract 0.1 g / 1. 0.1M NaCl. K2HP040.5 g / 1. MgS04'7H202 g / 1 and agar 20 g / 1. The bacteria were collected with a bacteriological loop from the surface of the stock culture in agar slants and the collected material was diluted in 100 ml Erlenraeyer R flasks, containing 25 ml of a culture medium, previously sterilized in an autoclave at 121 ° C for 15 minutes, having the following composition:
Dopo tre giorni di incubazione a 30°C, sotto la cos tante agitazione di 150 rpm. 2 mi di questa coltura sono stati inoculati in beute Erlenmeyer R da 500 mi, contenenti il substrato solido preparato come riportato di seguito. After three days of incubation at 30 ° C, under the so many agitation of 150 rpm. 2 ml of this culture was inoculated into 500 ml Erlenmeyer R flasks containing the solid substrate prepared as follows.
14 g di trebbia di malto secca (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italia) sono stati impregnati con 40 mi di un terreno di fermentazione analogo al terreno di coltura sopra descritto, ma senza CaCO3 e contenente 2,0 g/1 di glutammato di sodio al posto della L-lisina; detto terreno di fermentazione è stato addizionato di saccarosio alle concentrazioni di 30, 60 e 80 g/1, ed il substrato solido cosi ottenuto è stato sterilizzato in autoclave a 121 “C, per 15 minuti. 14 g of dry malt thresher (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italy) were impregnated with 40 ml of a fermentation medium similar to the culture medium described above, but without CaCO3 and containing 2.0 g / 1 of sodium glutamate instead of L-lysine; said fermentation medium was added with sucrose at concentrations of 30, 60 and 80 g / l, and the solid substrate thus obtained was sterilized in an autoclave at 121 ° C for 15 minutes.
Le colture cellulari sopra riportate sono state incubate in detto substrato solido, in condizione statica, alla temperatura di 30°C in atmosfera umidificata, per un tempo di 5 giorni. The cell cultures reported above were incubated in said solid substrate, in static condition, at a temperature of 30 ° C in a humidified atmosphere, for a period of 5 days.
Al termine di tale periodo, il succinoglicano prodotto è stato estratto dalla massa di fermentazione con 240 mi di acqua, agitando le beute per 1 ora a 30°C. Il liquido di estrazione è stato separato dalle particelle più grosse di substrato con un setaccio a maglia fine, e da quelle più fini per ultracentrifugazione a 25000xg per 20 minuti. Infine, il succinoglicano è stato precipitato dal surnatante limpido mediante l'aggiunta graduale di 2 volumi di acetone freddo. Il precipitato è stato quindi sciolto in acqua distillata e riprecipitato con 2 volumi di acetone freddo. Il precipitato così ottenuto è stato infine asciugato in stufa a 80°C, per 5 ore. At the end of this period, the succinoglycan produced was extracted from the fermentation mass with 240 ml of water, shaking the flasks for 1 hour at 30 ° C. The extraction liquid was separated from the larger substrate particles with a fine mesh sieve, and from the finer ones by ultracentrifugation at 25000xg for 20 minutes. Finally, the succinoglycan was precipitated from the clear supernatant by the gradual addition of 2 volumes of cold acetone. The precipitate was then dissolved in distilled water and re-precipitated with 2 volumes of cold acetone. The precipitate thus obtained was finally dried in an oven at 80 ° C for 5 hours.
In Tabella 1 vengono riportate le rese di succinoglicano prodotto come sopra descritto , somminis trando diverse quanti tà di saccarosio . Table 1 shows the yields of succinoglycan produced as described above, by administering different amounts of sucrose.
Tabella 1 Table 1
ESEMPIO 2 EXAMPLE 2
15 g di trebbia.di malto secca (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro, Italia) e 15 g di pelatura di avorio vegetale (proveniente dall’Equador) sono stati posti separatamente in flaconi da 500 mi e sono stati quindi impregnati con 45 mi del terreno di fermentazione descritto nell'Esempio 1, avente una concentrazione di saccarosio pari a 30 g/1. I substrati solidi cosi ottenuti sono stati sterilizzati in autoclave alla temperatura di 121°C, per 15 minuti, ed inoculati'con 5 mi di una coltura liquida di Agvobacterium tumefaciens, preparata come descritto all'Esempio 1. La fermentazione è stata condotta su un sistema rotante a 30 rivoluzioni per ora, alla temperatura di 30 °C per 4 giorni . 15 g of dry malt thresher (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro, Italy) and 15 g of vegetable ivory peeling (from Ecuador) were placed separately in 500 ml bottles and then impregnated with 45 ml of the fermentation medium described in Example 1, having a sucrose concentration equal to 30 g / 1. The solid substrates thus obtained were sterilized in an autoclave at the temperature of 121 ° C, for 15 minutes, and inoculated with 5 ml of a liquid culture of Agvobacterium tumefaciens, prepared as described in Example 1. The fermentation was carried out on a rotating system at 30 revolutions per hour, at a temperature of 30 ° C for 4 days.
Il succinoglicano prodotto è stato infine estratto ed isolato come riportato all'Es. 1, con i risultati riportati in Tabella 2. The succinoglycan produced was finally extracted and isolated as reported in Ex. 1, with the results reported in Table 2.
Tabella 2 Table 2
ESEMPIO 3 EXAMPLE 3
Cellule di Rhizobium meli loti SU47 (Dep. Microbiology, Univ. Wageningen, Paesi Bassi), ceppo produttore di succinoglicano, sono state trasferite da agar slants in beute Erlenmeyer R da 100 mi, contenenti 25 mi del terreno di coltura descritto all’Esempio 1, e le beute sono state incubate per 4 giorni, alla temperatura di 30°C a 150 rpm. Cells of Rhizobium meli loti SU47 (Dep. Microbiology, Univ. Wageningen, The Netherlands), a succinoglycan producing strain, were transferred from agar slants into 100 ml Erlenmeyer R flasks containing 25 ml of the culture medium described in Example 1 , and the flasks were incubated for 4 days, at a temperature of 30 ° C at 150 rpm.
10 g di trebbia di malto secca (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italia) sono stati'impregnati con 30 mi di un terreno di fermentazione avente composizione analoga a quella del terreno di fermentazione descritto all'Esempio 1, ma contenente 30 g/1 di mannitolo e , come substrato azotato, 0,9 g/1 di lisina oppure 2.25 g/1 di glutammato di sodio. 10 g of dry malt thresher (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italy) were impregnated with 30 ml of a fermentation medium having a composition similar to that of the fermentation medium described in Example 1, but containing 30 g / 1 of mannitol and, as nitrogenous substrate, 0.9 g / 1 of lysine or 2.25 g / 1 of sodium glutamate.
Il substrato solido così ottenuto è stato posto in beute da 250 mi ed inoculato con 1 , 5 mi della coltura cellulare ottenuta come sopra descritto. Le colture sono state quindi incubate in condizioni statiche, a 30°0 in atmosfera umidificata, per 3 giorni. Il succinoglicano prodotto è stato infine estratto con l80 mi di acqua e purificato secondo la procedura descritta all'Esempio 1, ottenendo i risultati riportati in Tabella 3-Tabella 3 The solid substrate thus obtained was placed in 250 ml flasks and inoculated with 1.5 ml of the cell culture obtained as described above. The cultures were then incubated in static conditions, at 30 ° 0 in a humidified atmosphere, for 3 days. The succinoglycan produced was finally extracted with 180 ml of water and purified according to the procedure described in Example 1, obtaining the results reported in Table 3-Table 3
ESEMPIO 4 EXAMPLE 4
Cellule di Xanthomonas campestris PD656 (Culture Collection of Plant Protection Service. Wageningen, Paesi Bassi), ceppo produttore di xantano, sono state trasferite da .agar slants in beute Erlenmeyer R da 100 mi, contenenti 25 mi del terreno di coltura descritto all'Esempio 1. Dopo 1 giorno di incubazione a 29°C a 170 rpm. 2 mi di questa coltura sono stati inoculati nel substrato solido preparato come segue. Cells of Xanthomonas campestris PD656 (Culture Collection of Plant Protection Service. Wageningen, The Netherlands), xanthan producing strain, were transferred from .agar slants into 100 ml Erlenmeyer R flasks, containing 25 ml of the culture medium described in Example 1. After 1 day of incubation at 29 ° C at 170 rpm. 2 ml of this culture was inoculated into the solid substrate prepared as follows.
14 g di trebbia di malto secca (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italia), posti in beute Erlenmeyer da 500 mi, sono stati impregnati con 40 mi di un terreno di fermentazione con pH = 7.1. avente la seguente composizione: 14 g of dry malt thresher (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italy), placed in 500 ml Erlenmeyer flasks, were impregnated with 40 ml of a fermentation medium with pH = 7.1. having the following composition:
Dopo 7 giorni di incubazione statica alla temperatura di 29°C. in atmosfera umidifica , lo xantano prodotto è stato estratto dalla massa di fermentazione con 280 mi di acqua, purificato e pesato come descritto all'Esempio 1. ottenendo una resa in xantano pari Ά 43.4 g/kg di substrato solido, corrispondente a 57,9 g/1 di fase liquida, a l4l,9 g/kg di massa di fermentazione secca ed a 0.579 g/g di saccarosio iniziale. After 7 days of static incubation at a temperature of 29 ° C. in a humidified atmosphere, the xanthan produced was extracted from the fermentation mass with 280 ml of water, purified and weighed as described in Example 1. obtaining a xanthan yield equal to Ά 43.4 g / kg of solid substrate, corresponding to 57.9 g / 1 of liquid phase, at 14l, 9 g / kg of dry fermentation mass and at 0.579 g / g of initial sucrose.
ESEMPIO 5 EXAMPLE 5
Colture cellulari di Xanthomonas campestris , preparate come descritto all'Esempio 4, sono state inoculate in un substrato solido ottenuto con miscele di trebbie di malto secche (Moretti S.p.A.. S. Giorgio di Nogaro, Italia) e pressatura di mele secche (ERSA, Italia), contenute in diversi rapporti ponderali. Cell cultures of Xanthomonas campestris, prepared as described in Example 4, were inoculated in a solid substrate obtained with mixtures of dry malt grains (Moretti S.p.A .. S. Giorgio di Nogaro, Italy) and pressing of dried apples (ERSA, Italy ), contained in various weight ratios.
Detto substrato solido è stato ottenuto impregnando 16, 12 e 8 g di pressatura di mele, in beute Erlenmeyer R da 500 mi. con 40 mi di una soluzione acquosa contenente KOH a diverse concentrazioni ed inoltre contenente 0.2 g di sodio glutammato e 0.02 g di Κ2ΗΡΟ4. Alla pressatura cosi ottenuta sono stati quindi aggiunti, sotto agitazione. 0. 4 e 12 g di trebbie di malto. Il substrato solido cosi ottenuto è stato sterilizzato in autoclave a 121<>C, per 15 minuti, ed inoculato con 2 mi della suddetta coltura cellulare, dopo un giorno di crescita. Dopo 5 giorni di incubazione alla temperatura di 30“C, lo xantano è stato estratto con 280 mi di acqua.,purificato e pesato come descritto Said solid substrate was obtained by impregnating 16, 12 and 8 g of apple pressing, in 500 ml Erlenmeyer R flasks. with 40 ml of an aqueous solution containing KOH at different concentrations and also containing 0.2 g of sodium glutamate and 0.02 g of Κ2ΗΡΟ4. They were then added to the thus obtained pressing, under stirring. 0. 4 and 12 g of malt grains. The solid substrate thus obtained was sterilized in an autoclave at 121 <> C, for 15 minutes, and inoculated with 2 ml of the above cell culture, after one day of growth. After 5 days of incubation at a temperature of 30 ° C, the xanthan was extracted with 280 ml of water, purified and weighed as described.
nell'Esempio 1 ottenendo i risultati in Tabella 4. in Example 1 obtaining the results in Table 4.
Tabella 4 Table 4
Dai dati sopra riportati è facilmente osservabile che in assenza di supporto solido inerte ( trebbie di malto) , utilizzando come subs trato solido esclusivamente il materiale particolato contenente una fonte di carbonio endogena , le rese di esopolisaccaride (succinoglicano) risultano dimezzate. From the above data it is easy to observe that in the absence of inert solid support (malt grains), using only the particulate material containing an endogenous carbon source as solid substrate, the yields of exopolysaccharide (succinoglycan) are halved.
ESEMPIO 6 EXAMPLE 6
30 g di pelatura di carote crude {peso secco = 10% del peso totale) sono state mescolate con 11 g di trebbie di malto secche (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro . Italia) in beute Erlenmeyer da 500 mi. e sono state quindi impregnate con 13 mi di soluzione nutriente avente la seguente composizione: 30 g of raw carrot peeling (dry weight = 10% of the total weight) was mixed with 11 g of dry malt grains (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italy) in 500 ml Erlenmeyer flasks. and were then impregnated with 13 ml of nutrient solution having the following composition:
Il substrato solido così preparato è stato sterilizzato in autoclave a 121°C, per 15 minuti, ed inoculato con 2 mi di una coltura di Agrobacterium tumefaciens , ottenuta come descritto nell'Esempio 1. The solid substrate thus prepared was sterilized in an autoclave at 121 ° C, for 15 minutes, and inoculated with 2 ml of a culture of Agrobacterium tumefaciens, obtained as described in Example 1.
Dopo 4 giorni di fermentazione alla temperatura di 30°C, il succinoglicano prodotto è stato estratto ed isolato come descritto nell’Esempio 1. La resa in succinoglicano è stata pari a 30.4 g/kg di substrato umido, equivalente a 47,8 g/1 di fase liquida impregnante e pari all'11,9?* in peso rispetto al peso secco della massa fermentata. After 4 days of fermentation at a temperature of 30 ° C, the succinoglycan produced was extracted and isolated as described in Example 1. The yield in succinoglycan was equal to 30.4 g / kg of humid substrate, equivalent to 47.8 g / 1 of the impregnating liquid phase is equal to 11.9% by weight with respect to the dry weight of the fermented mass.
ESEMPIO 7 EXAMPLE 7
8 g di buccia di agrumi freschi (aranci, mandarini, clementine; peso secco = 3l% peso totale) sono stati tagliati a quadretti di circa 5 mm di lato ed impregnati con 8 mi di una soluzione acquosa contenente glutammato di sodio (8 g/1) e K2HPO4 (4 g/1). Il substrato solido cosi ottenuto, dopo essere stato mescolato con 2 g di trebbie di malto secche (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italia), è stato posto in beute Erlenmeyer R da 100 mi ed è stato quindi sterilizzato in autoclave, alla temperatura di 121°C per 15 minuti; 8 g of fresh citrus peel (oranges, mandarins, clementines; dry weight = 3l% total weight) were cut into squares of about 5 mm per side and impregnated with 8 ml of an aqueous solution containing sodium glutamate (8 g / 1) and K2HPO4 (4 g / 1). The solid substrate thus obtained, after being mixed with 2 g of dry malt grains (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro. Italy), was placed in 100 ml Erlenmeyer R flasks and was then sterilized in an autoclave, at temperature of 121 ° C for 15 minutes;
II substrato solido è stato inoculato con 0,5 mi di una coltura di Xanthomonas campestvis, preparata come descritto nell'Esempio 4. Dopo 4 giorni di incubazione a 30°C, sono stati aggiunti 5 mi di acqua distillata sterile. Dopo due ulteriori giorni di incubazione, lo xantano prodotto è stato isolato dalla massa di Fermentazione con 110 mi di acqua, secondo la procedura riportata all'Esempio 1. Dopo due ore di agitazione, il residuo solido è stato rimosso dal liquido di estrazione per ultracentrifugazione, mentre il surnatante è stato trattato con pectinasi (Sigma, cod. P-9179) alla concentrazione finale di 2U/ml, allo scopo di idrolizzare le pectine coestratte. Dopo 3 ore di incubazione alla temperatura di 25°C, sotto continua agitazione, lo xantano è stato purificato e quantificato come descritto nell'Esempio 1. ottenendo una resa in xantano pari a 29,0 g/kg di substrato umido, corrispondente a 32,9 g/1 di fase acquosa ed a 245 g/kg di bucce secche. ESEMPIO 8 The solid substrate was inoculated with 0.5 ml of a culture of Xanthomonas campestvis, prepared as described in Example 4. After 4 days of incubation at 30 ° C, 5 ml of sterile distilled water was added. After two further days of incubation, the xanthan produced was isolated from the Fermentation mass with 110 ml of water, according to the procedure reported in Example 1. After two hours of stirring, the solid residue was removed from the extraction liquid by ultracentrifugation. , while the supernatant was treated with pectinase (Sigma, code P-9179) at the final concentration of 2U / ml, in order to hydrolyze the co-extracted pectins. After 3 hours of incubation at the temperature of 25 ° C, under continuous stirring, the xanthan was purified and quantified as described in Example 1. obtaining a xanthan yield equal to 29.0 g / kg of wet substrate, corresponding to 32 , 9 g / 1 of aqueous phase and 245 g / kg of dry skins. EXAMPLE 8
8 g di buccia di agrumi freschi (aranci, mandarini, clementine; peso secco = 31% in peso del totale) sono stati tagliati a quadretti di massimo 5 mm di lato ed impregnati con 8 mi di una soluzione acquosa contenente glutammato di sodio (8 g/1) e K2HPO4 (4 g/1). Il substrato solido così ottenuto, dopo essere stato mescolato con 2 g di trebbie di malto secche (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro, Italia), è stato posto in beute Erlenmeyer R da 100 mi ed è stato quindi sterilizzato in autoclave, alla temperatura di 121°C per 15 minuti. 8 g of fresh citrus peel (oranges, mandarins, clementines; dry weight = 31% by weight of the total) were cut into squares of maximum 5 mm per side and impregnated with 8 ml of an aqueous solution containing sodium glutamate (8 g / 1) and K2HPO4 (4 g / 1). The solid substrate thus obtained, after being mixed with 2 g of dry malt grains (Moretti S.p.A., S. Giorgio di Nogaro, Italy), was placed in 100 ml Erlenmeyer R flasks and was then sterilized in an autoclave, at temperature of 121 ° C for 15 minutes.
Il substrato solido è stato inoculato con 0,5 di una coltura liquida di Xanthomonas campestris PD 659 (Culture Collection of Plant Protection Service. Wageningen, Paesi Bassi), preparata carne descritto nell'Esempio 4. Dopo 4 giorni di incubazione a 30°C, sono stati aggiunti 5 mi di acqua distillata sterile. Dopo due ulteriori giorni di incubazione, lo xantano prodotto è stato isolato dalla massa di fermentazione con 110 mi di acqua, secondo la procedura riportata all'Esempio 1. Dopo due ore di agitazione, il residuo solido è stato rimosso dal liquido di estrazione per ultracentrifugazione, mentre il surnatante è stato trattato con pettinasi (Sigma, cod. P-9179) alla concentrazione finale di 2U/ml, allo scopo di idrolizzare le pectine coestratte. Dopo 3 ore di incubazione alla temperatura di 25°C, sotto continua agitazione, lo xantano è stato purificato e quantificato come descritto nell'Esempio 1. ottenendo una resa in xantano pari a 26.6 g/kg di substrato umido, corrispondente a 30.2 g/1 di fase acquosa ed a 225 g/kg di bucce secche. The solid substrate was inoculated with 0.5 of a liquid culture of Xanthomonas campestris PD 659 (Culture Collection of Plant Protection Service. Wageningen, The Netherlands), prepared meat described in Example 4. After 4 days of incubation at 30 ° C , 5 ml of sterile distilled water was added. After two further days of incubation, the xanthan produced was isolated from the fermentation mass with 110 ml of water, according to the procedure reported in Example 1. After two hours of stirring, the solid residue was removed from the extraction liquid by ultracentrifugation. , while the supernatant was treated with pettinase (Sigma, code P-9179) at the final concentration of 2U / ml, in order to hydrolyze the co-extracted pectins. After 3 hours of incubation at the temperature of 25 ° C, under continuous stirring, the xanthan was purified and quantified as described in Example 1. obtaining a yield in xanthan equal to 26.6 g / kg of wet substrate, corresponding to 30.2 g / 1 of aqueous phase and 225 g / kg of dry skins.
ESEMPIO 9 EXAMPLE 9
8 g di buccia di agrumi freschi (aranci, mandarini, clementine; peso secco = 31% peso totale) sono stati tagliati.a quadretti di massimo 5 mm di lato ed impregnati con 8 mi di una soluzione acquosa contenente glutammato di sodio (8 g/1) e K2HPO4 (4 g/1). II substrato solido cosi ottenuto è stato posto in beute Erlenmeyer R da 100 mi ed è stato quindi sterilizzato in autoclave, alla temperatura di 121°C per 15 minuti. 8 g of fresh citrus peel (oranges, mandarins, clementines; dry weight = 31% total weight) were cut into squares of maximum 5 mm per side and impregnated with 8 ml of an aqueous solution containing sodium glutamate (8 g / 1) and K2HPO4 (4 g / 1). The solid substrate thus obtained was placed in 100 ml Erlenmeyer R flasks and was then sterilized in an autoclave at the temperature of 121 ° C for 15 minutes.
1.1 substrato solido è stato inoculato con 0,5 mi di..una coltura di Xanthomonas campestvis ,PD 656 (Culture Collection of Plant Ptrotection Service. Wageningen, Paesi Bassi), preparata come descritto nell'Esempio 4. Dopo 6 giorni di incubazione a 30°C, lo xantano prodotto è stato isolato dalla massa di fermentazione con 110 mi di acqua, secondo la procedura riportata all'Esempio 1. Dopo due ore di agitazione, il residuo solido è stato rimosso dal liquido di estrazione per ultracentrifugazione, mentre il surnatante è stato trattato con pectinasi (Sigma, cod. P-9179) alla concentrazione finale di 2CJ/ml, allo scopo di idrolizzare le pectine coestratte. Dopo 3 ore di incubazione a 25°C, sotto continua agitazione, lo xantano è stato purificato e quantificato come descritto nell'Esempio 1, ottenendo una resa in xantano pari a 20.9 g/kg di substrato umido, corrispondente a 24,8 g/1 di fase acquosa ed a 135 g/kg di bucce secche. 1.1 solid substrate was inoculated with 0.5 ml of a culture of Xanthomonas campestvis, PD 656 (Culture Collection of Plant Ptrotection Service. Wageningen, The Netherlands), prepared as described in Example 4. After 6 days of incubation a 30 ° C, the xanthan produced was isolated from the fermentation mass with 110 ml of water, according to the procedure reported in Example 1. After two hours of stirring, the solid residue was removed from the extraction liquid by ultracentrifugation, while the supernatant was treated with pectinase (Sigma, code P-9179) at the final concentration of 2CJ / ml, in order to hydrolyze the co-extracted pectins. After 3 hours of incubation at 25 ° C, under continuous stirring, the xanthan was purified and quantified as described in Example 1, obtaining a xanthan yield equal to 20.9 g / kg of wet substrate, corresponding to 24.8 g / 1 of aqueous phase and 135 g / kg of dry skins.
ESEMPIO 10 EXAMPLE 10
8 g di buccia di agrumi freschi (aranci, mandarini, clementine; peso secco = ^1% peso totale) sono stati tagliati a quadretti di massimo 5 min di lato ed impregnati con 8 mi di una soluzione acquosa contenente glutammato di sodio (8 g/1) e K2HPO4 (4 g/1). Il substrato solido cosi ottenuto è stato posto in beute Erlenmeyer R da 100 mi ed è stato quindi sterilizzato in autoclave, alla temperatura di 121°C per 15 minuti. 8 g of fresh citrus peel (oranges, mandarins, clementines; dry weight = ^ 1% total weight) were cut into squares of maximum 5 min per side and impregnated with 8 ml of an aqueous solution containing sodium glutamate (8 g / 1) and K2HPO4 (4 g / 1). The solid substrate thus obtained was placed in 100 ml Erlenmeyer R flasks and was then sterilized in an autoclave at the temperature of 121 ° C for 15 minutes.
Il substrato solido è stato inoculato con 0.5 mi di una coltura rii Kanthomonas campestris PD656 (Culture Collection of Plant Protection Service, Wageningen, Paesi Bassi). preparata come descritto nell'Esempio 4. Dopo 6 giorni di incubazione a 30°C. lo xantano prodotto è stato isolato dalla massa di fermentazione con 110 mi di acqua, secondo la procedura riportata all'Esempio 1. Dopo due ore di agitazione, il residuo solido è stato rimosso dal liquido di estrazione per ultracentrifugazione, mentre il surnatante è stato trattato con pectinasi (Sigma, cod. P-9179) alla concentrazione finale di 2U/ral, allo scopo di idrolizzare le pectine coestratte. Dopo 3 ore di incubazione a 25°C, sotto continua agitazione, lo xantano è stato purificato e quantificato come descritto nell'Esempio 1. ottenendo una resa in xantano pari a 19.4 g/kg di substrato umido, corrispondente a 22,9 g/1 di fase acquosa ed a 125 g/kg di bucce secche. Dagli esempi sopra riportati risulta chiaramente che la presenza del materiale solido inerte nel substrato solido del processo dell'invenzione è necessaria al fine di ottenere 1 'esopolisaccaride finale in rese elevate. In particolare, le prove comparative sopra riportate, condotte su substrati solidi costituiti rispettivamente da soli agrumi (Esempi 9 e 10) o da sola pressatura di mele (Esempio 5). ossia costituiti esclusivamente da materiale particolato contenente una fonte di carbonio endogena, dimostrano che, in assenza di materiale solido inerte nel substrato solido della fermentazione, vengono ottenuti risultati notevolmente inferiori, in termine di rese di prodotto finale. The solid substrate was inoculated with 0.5 ml of a rii culture Kanthomonas campestris PD656 (Culture Collection of Plant Protection Service, Wageningen, The Netherlands). prepared as described in Example 4. After 6 days of incubation at 30 ° C. the xanthan produced was isolated from the fermentation mass with 110 ml of water, according to the procedure reported in Example 1. After two hours of stirring, the solid residue was removed from the extraction liquid by ultracentrifugation, while the supernatant was treated with pectinase (Sigma, code P-9179) at the final concentration of 2U / ral, in order to hydrolyze the co-extracted pectins. After 3 hours of incubation at 25 ° C, under continuous stirring, the xanthan was purified and quantified as described in Example 1. obtaining a xanthan yield equal to 19.4 g / kg of wet substrate, corresponding to 22.9 g / 1 of aqueous phase and 125 g / kg of dry skins. From the above examples it is clear that the presence of the inert solid material in the solid substrate of the process of the invention is necessary in order to obtain the final exopolysaccharide in high yields. In particular, the comparative tests reported above, carried out on solid substrates constituted respectively by citrus fruits only (Examples 9 and 10) or by apple pressing alone (Example 5). ie consisting exclusively of particulate material containing an endogenous carbon source, they demonstrate that, in the absence of inert solid material in the solid substrate of fermentation, considerably lower results are obtained, in terms of yields of the final product.
Quanto sopra esposto risulta ancora più chiaramente dal prospetto riassuntivo riportato in Tabella 5· in cui vengono presentati i risultati ottenuti agli Esempi 5 e 7~10 The above is even clearer in the summary table shown in Table 5 in which the results obtained in Examples 5 and 7 ~ 10 are presented
Tabella 5 Table 5
Claims (20)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97MI001693 IT1293620B1 (en) | 1997-07-17 | 1997-07-17 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BACTERIAL EXOPOLYSACCHARIDES BY AEROBIC FERMENTATION ON SOLID SUBSTRATE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97MI001693 IT1293620B1 (en) | 1997-07-17 | 1997-07-17 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BACTERIAL EXOPOLYSACCHARIDES BY AEROBIC FERMENTATION ON SOLID SUBSTRATE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI971693A1 true ITMI971693A1 (en) | 1999-01-17 |
| IT1293620B1 IT1293620B1 (en) | 1999-03-08 |
Family
ID=11377572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT97MI001693 IT1293620B1 (en) | 1997-07-17 | 1997-07-17 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BACTERIAL EXOPOLYSACCHARIDES BY AEROBIC FERMENTATION ON SOLID SUBSTRATE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1293620B1 (en) |
-
1997
- 1997-07-17 IT IT97MI001693 patent/IT1293620B1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1293620B1 (en) | 1999-03-08 |
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