ITMI970080A1 - Metodo per il mantenimento di colture di cellule dendritiche per un tempo illimitato e sue applicazioni - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "METODO PER IL ΜAΝΤΕΝIMENTO DI COLTURE DI CELLULE DENDRITICHE PER UN TEMPO ILLIMITATO E SUE APPLICAZIONI"

L'invenzione riguarda un metodo generale per mantenere in vitro cellule dendritiche immature e mature per un tempo illimitato mediante l'utilizzo di un terreno di coltura condizionato, ove il termine "mantenere" comprende la generazione e la propagazione di tali cellule.

Le cellule dendritiche sono cellule professionista nella funzione di presentazione degli antigeni e sono responsabili dell'innesco di una risposta immunitaria primaria antigene-specifica e MHC-ristretta e quindi dell'attivazione di linfociti T vergini. Al fine di esercitare queste funzioni, le cellule dendritiche devono andare incontro ad un processo di maturazione caratterizzato da cambiamenti nella espressione e localizzazione delle molecole MHC di classe II, delle molecole costinolatorie e di adesione, oltre all'acquisizione di proprietà migratorie verso gli organi linfoidi. Una volta terminato il processo maturativo, le cellule dendritiche differenziate terminalmente muoiono per apoptosi.

In vivo, questo processo di maturazione delle cellule dendritiche è controllato da segnali del microambiente che per lo più consistono in segnali di pericolo quali la presenza di microorganismi, il danno necrotico tissutale, l'adesione cellulare e l'azione di diverse citochine e chemochine, fattori di crescita e di differenziamento.

In vitro, le cellule dendritiche purificate da tessuti linfoidi o non-linfoidi o da sangue periferico, anche se iramature, vanno incontro ad un processo di maturazione spontaneo terminale differenziativo che non permette di mantenerle in vitro come cellule dendritiche immature nè di propagarle a tempo indeterminato. Una eccezione è costituita dalla possibilità, descritta in WO 94/28113, di immortalizzare le cellule dendritiche con un vettore retrovirale capace di trasdurre l' oncogene v-myc MH2 che conferisce alle cellule dendritiche una capacità illimitata di crescita in vitro. Tuttavia le cellule dendritiche così immortalizzate , anche se funzionali, non sono in grado di maturare terminalmente perché indotte a continua proliferazione.

Con la presente invenzione si è potuto mettere a punto un nuovo protocollo di coltura in vitro di cellule dendritiche immature e mature, da qualsiasi tipo di tessuto (incluso sangue periferico e di cordone ombelicale) di mammifero, che permette di mantenerle e propagarle in maniera illimitata, per almeno sei mesi fino a oltre due anni, mediante l ' utilizzo di un terreno di coltura condizionato . Il terreno condizionato è preparato a partire da linee cellulari quali fibroblasti primari o immortalizzati , per esempio la linea cellulare NIH/3T3, che vengono trattati con la citochina ricombinante GM-CSF ( 20 ng/ml ) o transfettati con il gene del GM-CSF.

Una realizzazione preferita dell ' invenzione è la seguente: i fibroblasti, piastrati in piastre di Petri di 10 cm di diametro ad una concentrazione di 1x10<6 >per Petri e incubati in terreno di coltura standard (RFMI 1640 o IMDM Iscove medium contenente 5% v/v di siero bovino fetale inattivato al calore, 2 mM di L-glutammina, 50 μM di 2-βmercaptoetanolo, 100 lU/ml penicillina e 100 μg/ml streptomicina) vengono trattati per 3 giorni con GM-CSF (20 ng/ml) in un incubatore a 37°C umidificato e con 5% di CO2. Dopo il trattamento, il terreno viene cambiato con terreno di coltura standard fresco e i fibroblasti coltivati per altre 24 ore. Il supernatante di coltura (terreno condizionato o RI) viene filtrato su filtri raillipore di 0,2 μm e utilizzato fresco (oppure viene congelato). Per coltivare e fare proliferare le cellule dendritiche, il terreno condizionato RI viene aggiunto in una percentuale del 30% (v/v)al terreno di coltura standard sopra descritto (RFMI 1640 o IMDM completo). Sempre secondo la realizzazione preferita, le colture di cellule dendritiche di qualsiasi origine, vengono piastrate a una concentrazione di 5x10<5 >cellule/ml e mantenute in incubatore al 5% di CO2 a 37°C umidificato e ogni 3-4 giorni il terreno condizionato esaurito viene cambiato con terreno condizionato completo fresco. Dopo due settimane dall'inizio della coltura primaria le cellule dendritiche iniziano a proliferare attivamente e le colture vengono sub-coltivate staccando tutte le cellule con una soluzione tampone PBS contenente 3 mM EDTA eppure contente 0,2 mg/ml di tripsina e ripiastrandole nelle condizioni di coltura iniziali.

In questo terreno di coltura le cellule dendritiche mantengono il loro fenotipo immaturo per un tempo illimitato, ma possono anche essere indotte a maturazione terminale mediante segnali fisiologici; tali segnali, quali ad esempio componenti della parete batterica (lipopolisaccaridi, LPS) oppure citochine quali il TNFa o IL-1β , inducono nelle cellule dendritiche immature un processo maturativo che mima quello che normalmente si osserva in vivo.

Le cellule dendritiche mantenute in coltura secondo il metodo della presente invenzione, sono in grado, tra l'altro, di attivare linfociti T sia in vivo che in vitro, in maniera antigene specifica. Una applicazione per esempio consiste nel prelevare linfociti T dall'organismo e stimolare quelli specifici per un certo antigene per poi reintrodurli nell'organismo stesso rendendolo cosi capace di generare ima risposta immunitaria a quell 'antigene.

Inoltre, le capacità le capacità mostrate dalle cellule dendritiche, generate ed espanse in vitro con il terreno condizionato oggetto dell'invenzione, di presentare antigeni proteici in associazione con molecole di MHC, a linfociti T antigene specifici, e di sensibilizzarsi con un determinato antigene per poi essere introdotte in un organismo avente un MHC conpatibile, si sono dimostrate particolarmente utili in quei casi dove la purificazione dell 'antigene da utilizzare, ad esempio nelle vaccinazioni, è difficile, costosa o pericolosa, oppure quando l' antigene non è identificato (antigeni tumorali) ma fisicamente manipolabile come gli estratti di lisati di cellule tumorali, o ancora in tutti quei casi dove risulta difficile generare in vivo una risposta immunitaria efficace o stabile nel tempo.

Oltre che per la preparazione di vaccini o agenti immunostimolanti, più in generale le cellule dendritiche mature o immature mantenute in coltura secondo il metodo della presente invenzione, possano essere utilizzate cane mezzo di "bio-screening (bio-assays)", su piccola e larga scala, per molecole di interesse farmaceutico, per sistemi terapeutici o diagnostici inclusi protocolli di immunoterapia adottiva terapeutici dei tumori e delle malattie infettive virali e batteriche,e protocolli di terapia per il trapianto di tessuti o per la terapia delle malattie autoimmunitarie, così come per molecole o librerie di molecole naturali o di sintesi che abbiano attività regolatrice (inibitoria o stimolatoria) di alcune funzioni caratteristiche delle cellule dendritiche. Tali molecole per esempio potrebbero inibire o aumentare dette funzioni, cane ad esenpio la up-regolazione delle molecole di MHC di classe II o di molecole co-stimolatorie B7.2 o CD40 e costituire dei nuovi farmaci capaci di modulare la risposta inniunitaria.

Descrizione delle Figure

La Figura 1 illustra la curva di crescita in vitro di cellule dendritiche mantenute in coltura per 6 mesi nel terreno di coltura condizionato (R1) o in un terreno di coltura standard. Le cellule dendritiche (vitalità 90%) vengono piastrate a una concentrazione di 0,5x10<6 >e contate ogni giorno per sette giorni. Il tempo di duplicazione delle cellule dendritiche mantenute nel terreno di coltura condizionato è di circa 2 giorni.

La Figura 2 illustra il profilo feliotipico delle cellule dendritiche mantenute in coltura per 6 mesi, ottenuto mediante immunofluorescenza e analisi citofluorimetrica al citofluorimetro FACScan. Circa 1x 10<6 >cellule dendritiche sono incubate con anticorpi monoclonali marcati COTI fluorocromo e specifici per determinanti espressi sulla membrana di cellule dendritiche (N418, NLDC145) e macrofagiche (2,4G2, F4/80) , per molecole co-stimolatorie (B7.1, B7.2, CD40) e per molecole del complesso maggiore di ìstocorrpatibilìtà , MHC di classe I (H-2K e H-2D) e di classe II(I-A) . Inoltre come controlli negativi sono utilizzati anticorpi monoclonali anti-CD4 (linfociti T), e anti B220 (linfociti B) mentre come controllo positivo è utilizzato 1' anticorpo anti leucocitario specifico per la molecola CD45. Infine sono stati utilizzati anticorpi anti-molecole di adesione quali LFA-1, Mac1, ICAM-1 e VLA4.

La Figura 3 illustra un’analisi di immunofluorescenza al citof luorimetro (FACScan) su cellule dendritiche mantenute in coltura per 6 mesi nel terreno condizionato. Circa 1x 10<6 >cellule dendritiche sono incubate con anticorpi monoclonali specifici per determinanti espressi sulla membrana di cellule dendritiche quali le molecole I-A di classe II dell' MHC e quelle di co-stimolazione B7.2, e CD40 e molecole di adesione quali ICAM-1, marcate con fluorocromo. Dopo trattamento delle cellule dendritiche con una serie di induttori di maturazione (quali il TNFa, o l'LPS o la citochina IL-Ιβ), si osserva una significativa maturazione fenotipica delle cellule immature con un aumento della positività nell'espressione di tutte le molecole esaminate. Come controllo negativo è stata usata un'altra citochina, l'IL-6 che non induce maturazione nelle cellule dendritiche: come dimostrato dal risultato non vi è alcun aumento nell'espressione delle molecole di classe II, di B7.2 e CD40 dopo trattamento con l'IL-6.

La Figura 4a illustra la diversa capacità da parte delle cellule dendritiche generate e preservate per oltre 6 mesi nel terreno condizionato di attivare linfociti T vergini in una coltura linfocitaria allogenica mista (MLR). Le cellule dendritiche immature che esprimono livelli intermedi di molecole di MHC di classe II (I-A int.) non sono molto efficienti nello stimolare linfociti T in una coltura linfocitaria mista (MLR) mentre se indotte a maturare e selezionate per alta espressione di molecole di MHC di classe II (I-A "bright ") diventano estremamente efficienti nella capacità stimolatoria di linfociti T (misurata come incorporazione di timidina triziata in un saggio standard di proliferazione cellulare).

Le Figure 4b e 4c illustrano invece la diversa capacità da parte delle cellule dendritiche generate e preservate per oltre 6 mesi nel terreno condizionato di coltura di presentare antigeni proteici nominali (ovalbumina, OVA) in associazione con molecole di MHC di classe II, a ibridomi T antigene (OVA)-specifici. In questo caso le cellule dendritiche immature sono le più efficienti nell'internalizzare la proteina antigenica solubile (OVA) e nel presentarla mentre le cellule dendritiche terminalmente maturate in vitro, mediante trattamento con TNFa, sono meno efficienti nella presentazione di antigeni proteici. Entrambe le popolazioni di cellule dendritiche (mature e immature) sono invece ugualmente capaci di presentare con pari efficienza il peptide 327-339 di OVA (Fig. 4c) in quanto in questo caso non c'è necessità di cattura e di "processing" della proteina all'interno della cellula perché il peptide si lega alle molecole di MHC direttamente dall'esterno. Questo esperimento è quindi un controllo positivo dell'esperimento di presentazione della proteina OVA e rivela il buon stato funzionale sia delle cellule dendritiche immature che di quelle mature.

Esempi

Negli esempi che seguono, se non indicato altrimenti, i terreni per le colture cellulari, le soluzioni tampone e di lavaggio, e le altre tecniche immunologiche impiegate sono state eseguite in accordo con quanto riportato in Coligan J. E et al. , "Current protocol s in Immunology" 1994 e aggiornamenti (J. Wiley and sona, Ine; Media PA-USA), da qui in poi definito "Coligan et al. '. Quando non indicato diversamente il materiale da laboratorio è preparato e conservato come indicato nella stessa referenza.

Esempio 1: Generazione di un terreno di coltura condizionato.

Brevemente, il terreno condizionato è cosi preparato: fibroblasti primari o fibroblasti immortalizzati, come ad esempio la linea cellulare ΝIΗ/3Τ3 , vengono trattati con la citochìna ricombinante GM-CSF ( 20 ng/ml) per tre giorni o transfettati con il gene del GM-CSF secondo protocolli standard riportati in "Coligan et ad.". La citochina ricombinante GM-CSF è ottenibile commercialmente così come il gene del GM-CSF. Le cellule descritte sono ottenibili commercialmente o sono state precedentemente descritte e sono generalmente coltivate in terreno IMDM Iscove medium contenente il 5% v/v di siero bovino fetale inattivato al calore, 2 mM di L-glutammina, 50 μΜ di 2-βmercaptoetanolo, 100 IU/ml penicillina e 100 μg/m streptomicina). I fibroblasti , piastrati in piastre di Petri di 10 cm di diametro ad una concentrazione di 1x10<6 >per Petri e incubati in terreno di coltura standard (RPMI 1640 o IMDM Iscove medium contenente il 5% v/v di siero bovino fetale inattivato al calore,2 mM di L-glutamina, 50 μΜ di 2-βmercaptoetanolo, 100 IU/ml penicillina e 100 μg/m streptomicina) vengono trattati per 3 giorni con GM-CSF (20 ng/ml)e mantenute a 37C° in atmosfera umidificata in un incubatore contenente il 5% di CO2· Dopo il trattamento, il terreno viene cambiato con terreno di coltura standard fresco e i fibroblasti coltivati per altre 24 ore. Il supernatante di coltura (terreno condizionato o RI) viene filtrato su filtri millipore di porosità 0,2 pμ di diametro e utilizzato fresco (eppure congelato). Per coltivare e fare proliferare le cellule dendritiche (vedi esempio 2), il terreno condizionato RI viene aggiunto, in una percentuale pari al 30% (v/v) del volume finale, al terreno di coltura standard sopra descritto (RPMI 1640 o IMDM completo).

Esempio 2: Generazione di linee cellulari a crescita illimitata di cellule dendritiche.

Una preparazione di cellule dendritiche di qualsiasi origine e tessuto, incluso il sangue periferico o quello di cordone ombelicale, può essere ottenuta mediante protocolli noti (Romani et al. J. Immunol . Methods 196:137-151,1996 e Bender et al. J. Immunol.Methods 196:121-135,1996); nell'esempio riportato una preparazione di cellule di milza di topi C57BL/6 (Charles River, Italia) è stata trattata con una soluzione di cloruro d'ammonio per Usare ed eliminare gli eritrociti secondo un protocollo standard in "Coligan et al.". Le rimanenti cellule, senza necessità di ulteriore purificazione sono piastrate ad ima concentrazione di 5x10<5 >cellule/ml in fiasche per coltura cellulare e mantenute a 37C° in atmosfera umidificata in un incubatore contenete il 5% di CO2 in un terreno di cultura IMDM Iscove contenente il 10% v/v di siero bovino fetale inattivato al calore, 2 mM di L-glutammina, 50 yM di 2-βmercaptoetanolo, 100 IU/ml penicillina e 100 yg/m streptomicina.A questo terreno di coltura viene sempre aggiunto il terreno condizionato (RI, descritto nell'esempio 1) in quantità pari al 30% del volume finale. Ogni 3-4 giorni, il terreno di coltura completo (contenente il 30% di RI) è esaurito e viene cambiato con terreno completo fresco (contenente il 30% di RI).Dopo due settimane dall'inizio della coltura primaria, le cellule dendritiche iniziano a proliferare, come dimostrato dalla curva di crescita (Fig.1)ottenuta contando al microscopio ottico in contrasto di fase il numero di cellule vive, secondo un protocollo descritto in "Coligan et al.". Dopo circa un mese le colture vengono sub-coltivate ogni 4-5 giorni, staccando tutte le cellule della coltura con una soluzione tampone di lavaggio, PBS contenente 3 mM EDTA (oppure con 0,2 mg/ml tripsina) e ripiastrandoe nelle condizioni di coltura precedenti e comunque con terreno di coltura contenente il 30% (v/v)del terreno condizionato. La privazione di questo terreno condizionato induce l'immediato blocco della proliferazione delle cellule dendritiche e la loro rapida morte cellulare (Fig. 1). L'aggiunta del terreno condizionato permette invece la proliferazione illimitata delle cellule dendritiche che si mantengono vitali per almeno un periodo di due anni (tempo di osservazione).

Esempio 3: Analisi immunof eliotipica delle cellule dendritiche mantenute in coltura a lungo termine.

Le cellule dendritiche generate ed espanse in vitro con il terreno condizionato oggetto dell'invenzione, sono state caratterizzate in dettaglio mediante l'uso di anticorpi monoclonali specifici per marcatori di membrana. Il profilo fenotipico delle cellule dendritiche mantenute in coltura per sei mesi, ottenuto mediante imnunof luorescenza e analisi al citofluorimetro FACScan è mostrato nelle Fig. 2. Circa lx 10<6 >cellule dendritiche sono incubate con anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo e specifici per determinanti espressi sulla membrana di cellule dendritiche (N418, NLDC145), macrofagiche (2,4G2, F4/80), per molecole co-stimolatorie (B7.1, B7.2, CD40), per molecole del complesso maggiore di istocompatibilità, MHC di classe I (H-2K e H-2D) e di classe II(I-A) . Inoltre cane controlli negativi sono utilizzati anticorpi monoclonali anti-CD4 (linfociti T) , e anti B220 (linfociti B) mentre come controllo positivo è utilizzato l' anticorpo anti-leucocitario specifico per la molecola CD45. Infine sono stati utilizzati anticorpi anti-molecole di adesione quali LFA-1, Mac1, ICAM-1 e VLA4. Tutti gli anticorpi primari utilizzati sono in commercio e per lo più marcati con biotina. Come reagente di rilevazione si usa streptoavidina ficoeritrinata o fluorescinata anch'essa in commercio. Per gli anticorpi non biotinilati a secondo della specie animale in cui era originato l' anticorpo primario sono stati usati come anticorpi secondari anticorpi anti-ratto o anti-coniglio o anti-criceto o anti-topo, tutti fluorescinati o ficoeritrinati. Anticorpi di controllo di uguale isotipo sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. La tecnica immunologica di immunofluorescenza è stata eseguita come in "Coligan et al." con una pre-incubazione delle cellule prima dell ' immnof luorescenza con l' anticorpo 24G2 (anti-CD32) per bloccare i recettori FcR. I risultati ottenuti indicano che le cellule mantenute e cresciute in vitro con il metodo oggetto dell'invenzione hanno le caratteristiche feliotipiche di cellule dendritiche immature (Fig. 2).

Esempio 4: Analisi immunof eliotipica di cellule dendritiche mantenute in coltura a lungo termine e indotte a maturare in vitro.

Le cellule dendritiche generate ed espanse in vitro con il terreno condizionato oggetto dell'invenzione, sono per lo più cellule dendritiche immature. Tuttavia è possibile indurre la loro maturazione feliotipica mediante l'uso di citochine (TNFa o IL-Ιβ) o mediante trattamento con lipopolisaccaridi(LPS) . Circa 1x10<6 >cellule dendritiche per gruppo sperimentale sono state pretrattate con 100 U/ml di TNFa o con 1 μg/ml di LPS o con 10 ng/ml di IL-1β o di IL-6 per 24 ore a 37°C in incubatore a 5% di CO2. Dopo il trattamento le cellule venivano esaminate per eventuali modificazioni f eliotipiche nell'espressione di molecole di membrana, quali ad esempio quelle relative all'espressione di molecole co-st imolator ie o dell'MHC (necessarie per esplicare la funzione di presentazione antigenica) . Mediante la tecnica di immunof luorescenza (come in "Coligan et al.") le cellule dendritiche trattate e non con i prodotti sopra riportati, venivano incubate con anticorpi monoclonali specifici per molecole (I-A) di classe II dell'MHC e quelle di co-stimolazione B7.2 e CD40 oltre alle molecole di adesione quali ICAM-1. Tali anticorpi, tutti commerciali, venivano usati come descritto nel precedente esempio e seguendo un protocollo standard di immunofluorescenza come indicato in "Coligan et al.". Il trattamento delle cellule dendritiche mantenute in coltura a lungo termine con induttori noti della maturazione dendritica, quali il TNFa, LPS o l’IL-1β, induce, come dimostrato nella Fig. 3 una chiara maturazione fenotipica con "up-regolazione" sia delle molecole I-A di MHC di classe II sia di molecole co-stimolatorie B7.2 e CD40. Il pre-trattamento di controllo con IL-6 (che non attiva le cellule dendritiche) non induce invece alcuna maturazione fenotipica.

Esempio 5: Analisi della capacità stimolatoria dei linfociti T e di presentazione dell'antigene da parte delle cellule dendritiche mantenute in coltura a lungo termine.

La capacità da parte delle cellule dendritiche generate e mantenute nel terreno condizionato di attivare linfociti T vergini in una coltura linfocitaria allogenica mista (MLR) è stata saggiata secondo un protocollo sperimentale standard di "Coligan et al.". In breve una sospensione cellulare di 2x105 di cellule di linfonodi di topi BALB/c è stata trattata per 20 min. con 50 μg/ml di mitoraicina (Sigma) a 37°C, lavata e piastrata in terreno completo in piastre da 96 pozzetti in un volume di 200 μΐ. A queste colture sono state aggiunte nello stesso pozzetto quantità scalari di cellule dendritiche stimolatrici (in quanto allogeniche) sia del tipo immaturo, perché selezionate mediante "sorting" con citofluorimetria a flusso per l'espressione di livelli intermedi di molecole di MHC di classe II (I-A int.), sia del tipo maturo per alta espressione di molecole di MHC di classe II (I-A bright).Come rappresentato nella ?ig. 4a, le cellule dendritiche (APC) immature (I-A int.) non sono molto efficienti nello stimolare linfociti T in una coltura linfocitaria mista (MLR)mentre se indotte a maturare e selezionate per alta espressione di molecole di MHC di classe II (I-A bright)diventano estremamente efficienti nella capacità stimolatoria di linfociti T (misurata come incorporazione di timidina triziata in un saggio standard di proliferazione cellulare come descritto in "Coligan et al.").

E' anche stata dimostrata la capacità delle cellule dendritiche, generate ed espanse in vitro con il terreno condizionato oggetto dell'invenzione, di presentare antigeni proteici nominali (ovalbumina, OVA) in associazione con molecole di MHC, a ibridomi T antigene (OVA)-specifici.

Per fare questo abbiamo seguito un protocollo di presentazione antigene-specifico come in "Coligan et al.". In breve, cellule dendritiche trattate con TNFa (100 U/ml) o non trattate sono state piastrate a una concentrazione di 10<4 >cellule/pozzetto di piastre microtiter a 96 pozzetti con fondo piatto (Corning). Alle cellule è stato aggiunto l'antigene OVA (Sigma,grado III di purezza)e le cellule sono state co-coltivate con l'ibridala BO97.10 (50000 cellule) che è specifico per un epitopo di OVA in associazione con le molecole I-A<b >(Ishioka G.Y. et al. J. Immunol. 152:4310-4316, 1994) in terreno IMDM completo e in un volume finale di 200 μΐ/pozzetto.Le piastre sono state incubate per 24 ore a 37°C in incubatore al 5% di CO2. Aliquote dei supernatanti sono state raccolte e congelate prima di misurare il contenuto di IL-2. Le cellule CTLL-2 sono IL-2 dipendenti (crescono in presenza di 100 U/ml di IL-2 ricombinante) e sono in commerciò. 10<4 >/pozzetto di CTLL-2 sono state incubate per 24 ore a 37°C in incubatore al 5% di CO2 con 50 μl dei supernatanti in un volume finale di 150 μl/ pozzetto e marcate con 1 μCi/pozzetto di <3>H-timidina (triziata) ad attività specifica di 5 Ci/mmol (Amersham) per 6 ore. L'incorporazione di timidina è stata misurata con liquido di scintillazione e analizzata con un "β-plate reader" (Wallach).Ogni punto della curva rappresenta la media in cpm di triplicati. Come controllo positivo dell'esperimento è stato utilizzato il peptide 327-339 di OVA a varie concentrazioni che viene riconosciuto dall'ibridoma B097.10 ed è stato usato nello stesso tipo di esperimento di presentazione antigenica sopra riportato. I risultati mostrati nelle Fig. 4b e 4c mostrano che le cellule dendritiche immature sono le più efficienti nell'internalizzare la proteina antigenica solubile (OVA) e nel presentarla mentre le cellule dendritiche terminalmente maturate in vitro mediante TNFa sono meno efficienti nella presentazione di antigeni proteici. Il peptide OVA è sempre presentato con alta efficienza.

Esempio 6:Possibilità di ottenere delle varianti di cellule dendritiche MHC negative.

Cellule dendritiche in coltura sono state mutagenizzate mediante irradiazioni con dosi variabili da 300 a 1000 rad di una sorgente di Cesio e selezionate negativamente con anticorpi anti molecole MHC di classe I e II e successivo trattamento con Complemento. Seguendo la tecnica descritta da A. Moretta et al., (Proc. Nat.Acad.Sci. 84,1654-1658, 1987) è infatti possibile selezionare, mediante citofluorimetria, delle varianti negative (e doppie negative) per l'espressione dei geni dell'MHC che si generano dopo l'irradiazione.

Con questo approccio è possibile ottenere linee cellulari di cellule dendritiche MHC<- >(negative) che possono essere successivamente transfettate con i geni di classe I o di classe II (MHC) desiderati. Ad esempio è stato transfettato nelle cellule dendritiche un plasmide contenente il cDNA del gene neo mediante lipofectina: per questo, sono state piastrate in coltura 1x10<6 >cellule in 2 ml di terreno di coltura alle quali è stata aggiunta per 16 ore una soluzione contenente 5 mg di DNA in 50 ml di terreno di coltura. Dopo 16 ore vengono aggiunti altri 2 ml di terreno di coltura e l'incubazione continua per altre 48 ore prima di iniziare una selezione dei transfettanti.

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per mantenere in vitro cellule dendritiche mature o immature per un tempo illimitato che comprende la coltivazione di dette cellule in un terreno comprendente il surnatante o il mezzo di coltura (terreno condizionato)di linee cellulari trattate con GM-CSF o transfettate con il gene GM-CSF.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1,caratterizzato dal fatto che il terreno condizionato è quello utilizzato per la coltura di fibroblasti.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che i fibroblasti vengono trattati per tre giorni con GM-CSF.
4. 4. Metodo secondo le rivendicazioni 2-3, caratterizzato dal fatto che il GM-CSF è utilizzato ad una concentrazione di 20 ng/ml.
5. 5. Metodo secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto che il terreno condizionato viene aggiunto in una percentuale del 30% v/v al terreno di coltura delle cellule dendritiche e viene cambiato ogni 3 o 4 giorni.
6. 6. Metodo secondo le rivendicazioni 1-5, caratterizzato dal fatto che le colture di cellule dendritiche vengono mantenute per un periodo di almeno 6 mesi.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto periodo è superiore ai due anni.
8. 8. Metodo secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che le cellule dendritiche mantenute in coltura vengono indotte a maturazione con induttori di maturazione quali TNFa,LPS, IL-1b.
9. 9. Cellule dendritiche mantenute in coltura in un terreno comprendente il terreno condizionato delle rivendicazioni 1-7.
10. 10. Cellule dendritiche mature mantenute in coltura con il metodo della rivendicazione 8.
11. 11. Uso delle cellule dendritiche mantenute in coltura con il metodo delle rivendicazioni 1-8 in tutti i casi in cui è richiesta la presentazione degli antigeni in associazione con molecole di MHC.
12. 12. Uso delle cellule dendritiche secondo la rivendicazione 11, per attivare linfociti T in vivo o in vitro.
13. 13 Uso delle cellule dendritiche secondo la rivendicazione 11 per la preparazione di agenti immunostimolanti.
14. 14. Uso delle cellule dendritiche secondo la rivendicazioni 11-13 per la preparazione di vaccini.
15. 15. Uso di cellule dendritiche coltivate con il metodo delle rivendicazioni 1-8 come componenti di sistemi per lo studio dell'attività di sostanze terapeutiche, diagnostiche, per la ricerca biomedica.
16. 16. Terreno condizionato ottenibile dalla coltura di linee cellulari di fibroblasti trattate con GM-CSF o transfettate con il gene GM-CSF.