ITMI960033A1 - PROCEDURE FOR THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF B-LACTAM ANTIBIOTICS IN THE PRESENCE OF AN ENZYME INHIBITOR - Google Patents

PROCEDURE FOR THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF B-LACTAM ANTIBIOTICS IN THE PRESENCE OF AN ENZYME INHIBITOR Download PDF

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ITMI960033A1
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Auro Roberto Tagliani
Emiliano Cannas
Angelo Venturelli
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Abstract

Un procedimento per la produzione di penicilline e cefalosporine per reazione tra un nucleo ?-lattamico ed un'amide. La reazione è catalizzata da un enzima penicillina acilasi ed avviene in presenza di inibitori enzimatici.A process for the production of penicillins and cephalosporins by reaction between a lactam nucleus and an amide. The reaction is catalyzed by a penicillin acylase enzyme and occurs in the presence of enzyme inhibitors.

Description

Descrizione di un'invenzione industriale a nome: Description of an industrial invention in the name:

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento enzimatico migliorato per l'ottenimento di penicilline e cefalosporine di formula (I) e(II) The present invention relates to an improved enzymatic process for obtaining penicillins and cephalosporins of formula (I) and (II)

in cui X è S o CH.2 , R è un anello idrocarburico a 6 termini opzionalmente sostituito ed R1 è un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile, un gruppo metossile, un gruppo alchenile C1-C4 o un gruppo metilenico legato ad un radicale organico a mezzo di un atomo di ossigeno, zolfo o azoto. where X is S or CH.2, R is an optionally substituted 6-membered hydrocarbon ring and R1 is a hydrogen atom, a halogen atom, a methyl group, a methoxyl group, a C1-C4 alkenyl group or a methylene bonded to an organic radical by means of an oxygen, sulfur or nitrogen atom.

L 'US-A-3816253 descrive un procedimento per l'ottenimento di penicilline o cefalosporine per reazione di un α-aminoacido a -sostituito con un composto derivante dall'acido 7-aminocefalosporanico o 7-aminodesacetossicefalosporanico in presenza di un microrganismo attivo o enzima, in soluzione acquosa, ad una temperatura compresa tra 5*C e 50°C, preferibilmente tra 20°C e 40°C. E' stato trovato che, operando come descritto nell'USP precedentemente citato, la resa del prodotto finale desiderato viene fortemente diminuita a causa di reazioni concomitanti parallele con formazione di sottoprodotti che sono difficilmente separabili dalla miscela di reazione. ;Per eliminare o perlomeno ridurre gli inconvenienti sovracitati, 1'EP-A-0473008 propone un metodo per produrre penicilline e cefalosporine di formula (I) o (II). Secondo detto metodo l'acido 6-amino penicillanico o 7-amino cefalosporanico viene fatto reagire con un α-aminoacido otsostituito di formula R-CH(NH2 )-COOH o con un derivato reattivo degli stessi, in presenza di una penicillina acilasi immobilizzata, effettuando la reazione in mezzo acquoso ad una temperatura compresa tra -5°C e 20eC, preferibilmente a circa 4°C. ;Le condizioni di reazione sono fornite chiaramente nell'EP-A-0473008 che riporta anche, in dettaglio, 25 esempi di realizzazione con rese molto buone (90% e più) del prodotto finale desiderato. ;A questo proposito è necessario notare che un procedimento è industrialmente realizzabile solo quando le rese sono sufficientemente elevate (circa 90%) ed il prodotto finale è facilmente purificabile. ;L 'EP-A-0473008 menziona in termini generici gli α-aminoacidi α-sostituiti di formula R-CH(NH2)~ COOH o i loro derivati reattivi che possono essere usati come sostanze di partenza. Pur tuttavia l'unico aminoacido specificatamente esemplificato è solo il metil estere della D-fenilglicina. ;I presenti richiedenti hanno effettuato molte ed accurate prove sperimentali seguendo il procedimento descritto negli esempi riportati nell 'EP-A-0473008: i risultati ottenuti sono stati però tutti scoraggianti. ;E1 stato infatti verificato che, qualora nel mezzo di reazione il rapporto molare del citato aminoacido è inferiore a 4 moli per 1 mole di acido 6-amino penicillanico o 7-amino cefalosporanico usato, la resa del prodotto finale desiderato è molto bassa (inferiore a circa il 60%) e, come tale, non è industrialmente accettabile. ;Buone rese, industrialmente accettabili, sono invece ottenute solo se il numero di moli della D-fenilglicina metilestere in reazione è in un rapporto compreso tra 4 e 6 rispetto ad 1 mole di acido 6--amino-penicillanico o 7-aminocefalosporanico usato. ;In questo caso, tuttavia, si verifica non solo un aumento non accettabile dei costi (il prezzo della D-fenilglicina metilestere è molto elevato), ma si formano anche dei sottoprodotti difficilmente o del tutto ineliminabili dalle desiderate penicilline o cefalosporine finali della reazione. ;Tentativi sono stati effettuati usando diversi esteri della D-feniglicina o di differenti aminoacidi: tutti questi tentativi sono stati infruttuosi . ;Uguali risultati negativi sono stati ottenuti usando numerosi derivati reattivi degli aminoacidi. ;La domanda tedesca di brevetto DOS 2214444 riporta una sintesi enzimatica di cefalosporine (in particolare della cefalexina) per reazione del 7-ADCA con fenilglicina amide in presenza dell'enzima penicillina acilasi: le rese ottenute sono molto basse. ;PCT/DK91/00188 (W092/01061) e PCT/DK92/00388 (WO93/12250) riportano metodi per la preparazione di antibiotici β-lattamici a mezzo di acilazione enzimatica, secondi i quali una amide di formula ;; ;; viene fatta reagire con acido 6-amino-penicillanico o 7-amino-cefalosporanico in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato. ;Tali metodi si dimostrano attuabili : è stato però trovato che un apprezzabile quantitativo di amide (III) viene idrolizzato dall'enzima medesimo, aumentando in tal modo il numero delle impurezze dei prodotti finali desiderati: anche una discreta quantità del prodotto finale viene idrolizzata dallo stesso enzima. ;Fin dalle prime applicazioni della Penicillina Acilasi (E.C. 3.5..1.11) è noto che questo enzima è inibito dalla presenza di acido fenilacetico, acido fenossiacetico e/o di altri inibitori, in presenza dei quali l'enzima perde attività e la catalisi tende a fermarsi.Ciò costituisce un problema quando si affronta l'acilazione di nuclei β-lattamici che possono contenere tracce di acido fenilacetico o acido fenossiacetico o altri inibitori. ;Questo problema è stato da molti affrontato cercando enzimi che non manifestino questo tipo di inibizione (rif. D.D.Y. Ryu ed altri, Biotechnology and Bioengineering 1985, Voi XXVII pag. 953-960. A.M. Blinkowsky ed altri, Enzyme Microbial Technology 1993, Voi 15, pag. 965-973): sono stati selezionati enzimi (spesso denominati Ampicillina Acilasi o Amidasi, Cefalosporina Acilasi o Amidasi, enzima sintetizzante la Cefalessina ecc.) provenieneti da verie fonti microbiche (Acetobacter spp., Xantomonas spp.). Nessuno di questi enzimi è tuttavia disponibile commercialmente nè viene preparato su larga scala com'è necessario per impieghi industriali; questo approccio è quindi sfavorito dal fatto di richiedere notevoli investimenti in ricerca per mettere a punto un catalizzatore specifico per la sintesi degli antibiotici β-lattamici. ;Un altro modo per superare l’inibizione dell'enzima è quello di eliminare i suddetti inibitori prima di effettuare l'acilazione enzimatica, per esempio mediante estrazione con solvente organico come descritto in PCT/DK91/00188. Lo svantaggio principale di questo metodo consiste appunto nell'utilizzo di solventi organici; poiché le acilazioni enzimatiche dei nuclei β-lattamici sono state introdotte espressamente per eliminare l'utilizzo di detti solventi ed ottenere quindi dei processi ad elevata compatibilità ambientale, ne consegue che anche questo approccio non ha finora portato a risultati soddisfacenti. ;I richiedenti hanno sorprendentemente scoperto, durante lo svolgimento di studi specifici sulle reazioni catalizzate da Penicilline Acilasi, che la suddetta inibizione può essere aggirata, ottenendo quindi la sintesi di antibiotici βlattamici in presenza di quantità anche rilevanti degli inibitori sopra menzionati. In alcuni casi è anche possibile sfruttare l'inibizione dell'enzima in termini utili alla sintesi, come descritto oltre, introducendo determinate quantità di un inibitore inizialmente non presente o presente in piccole quantità. ;Come conseguenza, la presente invenzione si riferisce ad un procedimento enzimatico migliorato per produrre penicilline e cefalosporine di formula rispettivamente (I) e (II) come sopra specificato in cui un acido 6-amino-penicillanico o 7-amino cefalosporanico di formula (IV) o (V) ;; ;; in cui X e R1 hanno il significato detto sopra viene fatto reagire ad una temperatura compresa tra -50C e 35’C, in presenza di un enzima Penicillina Acilasi in forma libera o immobilizzata, con un amide di formula (III) ;;; ;;; dove R è come sopra specificato, R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico lineare ramificato da 1 a 3 atomi di carbonio, i loro sali, in un rapporto molare da 1 a 6 moli di amide (III) per mole di acido (IV) o (V), caratterizzato dal fatto che ;nella miscela di reazione è presente un inibitore enzimatico di formula (VI): ;;dove : ; R4 è un gruppo alchilico C1-C8 lineare o ramificato, un anello aromatico sostituito o non, un alogeno, un protone, Y può essere assente o, se presente, è 0,S CH2, fenile o alogeno; ;R5 è un carbossile o estere C1-C4 lineare o ramificato oppure un gruppo -CONH2; ;R6 è H, OH OCHO, CH3; ;tale inibitore essendo presente in concentrazioni da 0,0001 a 0,5 molare. ;In particolare detto inibitore (VI) è presente in una concentrazione da 0,0005 a 0,2 molare ed è scelto tra l'acido fenilacetico, l'acido fenossiacetico, l'acido mandelico o gli esteri e le amidi C1-C9 (lineari o ramificati) di questi acidi. ;L'invenzione si riferisce anche a composizioni farmaceutiche comprendenti penicilline o cefalosporine preparate a mezzo del procedimento descritto nella presente invenzione, come pure a diluenti o veicolanti farmaceuticamente accettabili. ;Le composizioni farmaceutiche contenenti le penicilline o cefalosporine vengono comunemente preparate secondo metodi convenzionali e sono somministrate in adatta forma farmaceutica. ;Con riferimento alle formula (I) e (II), R può essere ad esempio un gruppo fenile, cicloesadienile, cicloesenile non sostituito o sostituito con un ossidrile, alogeno, alchile, alcossi, carbossile, nitro o animino. ;Ri può essere un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile o inetilenico legato ad un gruppo organico ed in particolare ad un gruppo alcossi, alcossicarbonile o un gruppo eterociclico a cinque o sei termini contenente da 1 a 4 eteroatomi scelti fra 0, S ed N legati al gruppo inetilenico a mezzo di un atomo di 0, S, N e opzionalmente sostituiti con uno o più gruppi scelti tra un idrossile, alogeno, alchile, alcossi, carbonile, carbossi, ciano, amino e simili. ;I termini alchile ed alcossi qui usati si riferiscono a gruppi aventi da 1 a 6 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 4 atomi di carbonio. ;Con riferimento agli α-aminoacidi le cui amidi hanno formula (III), si possono citare come esempio la D-fenilglicina, D-p-idrossifenilglicina e la D-1,4-cicloesadien-l-il-glicina. ;Sali adatti dell'amide sono quelli con un acido inorganico quali l’acido cloridrico, fluoridrico, bromidrico, solforico o nitrico, oppure con un acido organico, ad esempio l'acido acetico, formico o maleico. ;I seguenti acidi sono di particolare interesse tra i composti di formula (IV) e (V): ;il 6-amino-penicillanico (6-APA), il 7-aminodesacetossicefalosporanico (7-ADCA), il 7-aminocefalosporanico, il 7-amino-3-cloro-cefalosporanico, il 7-amino-3-metossicefalosporanico, il 7-aminofenacetildesacetossicefalosporanico, il 7-aminofenosiacetildesacetossicefalosporanico, il 7-amino-3-cloro-carbacefem, la penicillina G e la penicillina V. ;La penicillina G o V e l'acido 7-aminofenacetil-desacetoseicefalosporanico sono comunemente utilizzati come materie prime per la preparazione di 6-APA e di 7-ADCA rispettivamente, a loro volta utilizzati per produrre Ampicillina ed Amoxicillina, Cefalessina e Cefadroxil: fino ad ora è stato necessario purificare dall'acido fenilacetico o fenossiacetico questi intermedi (6APA e 7-ADCA) per poterli utilizzare nelle reazioni di acilazione enzimatica, come descritto in PCT/DK91/00188 . La possibilità di effettuare la sintesi di questi composti anche in presenza di inibitori comporta quindi il vantaggio di effettuare la sintesi senza necessità di purificazione degli intermedi, con un notevole risparmio di lavoro ed evitando l'utilizzo di solventi organici. ;L 'inibitore enzimatico può essere presente nella miscela di reazione fin dall'inizio della sintesi oppure può essere aggiunto in un qualunque momento durante il decorso della reazione; detto inibitore può essere aggiunto anche alla fine della reazione enzimatica per facilitare l'isolamento del prodotto ed i successivi trattamenti in generale. ;L'enzima utilizzato come catalizzatore nel presente procedimento è una Penicillina Amidoidrolasi classificato E.C. 3.5.1.11 (altrimenti denominato anche penicillina acilasi, penicillina idrolasi, ampicillina acilasi ecc.) proveniente da una qualsiasi fonte microbiologica ed in particolare da ceppi di Xantomonas, Pseudomonas, Arthrobacter, Kluyvera, Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Acromonas. Particolarmente preferiti sono gli enzimi derivanti da ceppi naturali o ingenierizzati di Escherichia coli: alcuni di questi sono disponibili in commercio in larga quantità ed anche in forma immobilizzata. ;L'enzima può essere utilizzato in forma libera (ossia solubile) oppure può essere immobilizzato su una matrice solida: tra queste ultime sono particolarmente preferiti i supporti espressamente dedicati all'immobilizzazione di biomolecole come ad esempio le resine sintetiche epossidiche o azlattoniche. ;ESEMPIO 1 ;Sintesi di Cefalessina mediante acilazione enzimatica del 7-ADCA con D(- )fenilglicinamide ;9 g (42 mmoli) di acido 7-aminodesacetossicefalosporanico e 15,7 g (100 mmoli) di D(-)fenilglicinamide sono sati sciolti in acqua (volume finale 300 mi). La soluzione è stata raffreddata a circa 4°C e portata a pH=6,8, quindi trasferita in un reattore refrigerato collegato ad un sistema di controllo (denominato in seguito pH-stat) che provvede a mantenere costante il pH aggiungendo automaticamente acido solforico 4 N. ;Alla soluzione di cui sopra sono state aggiunte 5400 UI di enzima penicillina amidoidrolasi in forma immobilizzata (su resina azlatonica o epossidica), incubando a 4*C e pH=6,8 costanti. US-A-3816253 describes a process for obtaining penicillins or cephalosporins by reacting an a-substituted α-amino acid with a compound deriving from 7-aminocephalosporanic or 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid in the presence of an active microorganism or enzyme , in aqueous solution, at a temperature between 5 ° C and 50 ° C, preferably between 20 ° C and 40 ° C. It has been found that, by operating as described in the previously mentioned USP, the yield of the desired final product is strongly decreased due to concomitant parallel reactions with the formation of by-products which are difficult to separate from the reaction mixture. To eliminate or at least reduce the aforementioned drawbacks, EP-A-0473008 proposes a method for producing penicillins and cephalosporins of formula (I) or (II). According to said method, the 6-amino penicillanic acid or 7-amino cephalosporanic acid is reacted with an α-amino acid or substituted with the formula R-CH (NH2) -COOH or with a reactive derivative of the same, in the presence of an immobilized penicillin acylase, carrying out the reaction in an aqueous medium at a temperature between -5 ° C and 20eC, preferably at about 4 ° C. The reaction conditions are clearly provided in EP-A-0473008 which also reports, in detail, 25 embodiments with very good yields (90% and more) of the desired final product. In this regard, it should be noted that a process is industrially feasible only when the yields are sufficiently high (about 90%) and the final product is easily purifiable. ; EP-A-0473008 mentions in generic terms the α-substituted α-amino acids of the formula R-CH (NH2) ~ COOH or their reactive derivatives which can be used as starting substances. However, the only amino acid specifically exemplified is only the methyl ester of D-phenylglycine. The present applicants have carried out many and accurate experimental tests following the procedure described in the examples reported in EP-A-0473008: the results obtained, however, were all discouraging. ; It has in fact been verified that, if in the reaction medium the molar ratio of the aforementioned amino acid is less than 4 moles per 1 mol of 6-amino penicillanic or 7-amino cephalosporanic acid used, the yield of the desired final product is very low (lower about 60%) and, as such, it is not industrially acceptable. Good yields, industrially acceptable, are instead obtained only if the number of moles of the D-phenylglycine methyl ester in reaction is in a ratio between 4 and 6 with respect to 1 mol of 6 - amino-penicillanic or 7-aminocephalosporanic acid used. In this case, however, not only an unacceptable increase in costs occurs (the price of D-phenylglycine methyl ester is very high), but also by-products that are difficult or completely unavailable to eliminate from the desired final penicillins or cephalosporins of the reaction. Attempts have been made using different esters of D-pheniglycine or different amino acids: all these attempts have been unsuccessful. Equal negative results were obtained using numerous reactive amino acid derivatives. ; The German patent application DOS 2214444 reports an enzymatic synthesis of cephalosporins (in particular of cephalexin) by reaction of 7-ADCA with phenylglycine amide in the presence of the enzyme penicillin acylase: the yields obtained are very low. ; PCT / DK91 / 00188 (W092 / 01061) and PCT / DK92 / 00388 (WO93 / 12250) report methods for the preparation of β-lactam antibiotics by means of enzymatic acylation, according to which an amide of formula ;; ;; it is reacted with 6-amino-penicillanic or 7-amino-cephalosporanic acid in the presence of an immobilized penicillin acylase enzyme. ; These methods prove to be feasible: however, it has been found that an appreciable amount of amide (III) is hydrolyzed by the enzyme itself, thus increasing the number of impurities of the desired final products: even a fair amount of the final product is hydrolyzed by the same enzyme. ; Since the first applications of Penicillin Acylase (E.C. 3.5..1.11) it is known that this enzyme is inhibited by the presence of phenylacetic acid, phenoxyacetic acid and / or other inhibitors, in the presence of which the enzyme loses its activity and catalysis tends This is a problem when addressing the acylation of β-lactam nuclei which may contain traces of phenylacetic acid or phenoxyacetic acid or other inhibitors. ; This problem has been addressed by many by looking for enzymes that do not show this type of inhibition (ref. D.D.Y. Ryu et al., Biotechnology and Bioengineering 1985, Voi XXVII pp. 953-960. A.M. Blinkowsky et al., Enzyme Microbial Technology 1993, Vol 15 , pages 965-973): enzymes have been selected (often called Ampicillin Acylase or Amidase, Cephalosporin Acylase or Amidase, enzyme synthesizing Cephalessin etc.) coming from various microbial sources (Acetobacter spp., Xantomonas spp.). However, none of these enzymes are commercially available nor are they prepared on a large scale as is necessary for industrial uses; this approach is therefore disadvantaged by the fact that it requires considerable investments in research to develop a specific catalyst for the synthesis of β-lactam antibiotics. ; Another way to overcome the inhibition of the enzyme is to eliminate the aforementioned inhibitors before carrying out enzymatic acylation, for example by extraction with organic solvent as described in PCT / DK91 / 00188. The main disadvantage of this method consists precisely in the use of organic solvents; since the enzymatic acylations of the β-lactam nuclei have been introduced expressly to eliminate the use of said solvents and therefore obtain processes with high environmental compatibility, it follows that even this approach has not so far led to satisfactory results. ; The applicants have surprisingly discovered, while carrying out specific studies on the reactions catalyzed by Penicillin Acylase, that the aforementioned inhibition can be circumvented, thus obtaining the synthesis of βlactam antibiotics in the presence of even significant quantities of the inhibitors mentioned above. In some cases it is also possible to exploit the inhibition of the enzyme in terms useful for the synthesis, as described below, by introducing certain quantities of an inhibitor not initially present or present in small quantities. As a consequence, the present invention relates to an improved enzymatic process for producing penicillins and cephalosporins of formula (I) and (II) respectively as specified above in which a 6-amino-penicillanic or 7-amino cephalosporanic acid of formula (IV ) or (V) ;; ;; in which X and R1 have the meaning mentioned above, it is reacted at a temperature between -50C and 35'C, in the presence of a Penicillin Acylase enzyme in free or immobilized form, with an amide of formula (III) ;;; ;;; where R is as specified above, R2 and R3 are each independently a hydrogen atom or a linear branched alkyl group of 1 to 3 carbon atoms, their salts, in a molar ratio of 1 to 6 moles of amide (III) per mole of acid (IV) or (V), characterized in that; in the reaction mixture there is an enzymatic inhibitor of formula (VI): ;; where:; R4 is a linear or branched C1-C8 alkyl group, a substituted or unsubstituted aromatic ring, a halogen, a proton, Y can be absent or, if present, is 0, S CH2, phenyl or halogen; ; R5 is a linear or branched C1-C4 carboxyl or ester or a -CONH2 group; ; R6 is H, OH OCHO, CH3; ; this inhibitor being present in concentrations from 0.0001 to 0.5 molar. ; In particular, said inhibitor (VI) is present in a concentration ranging from 0.0005 to 0.2 molar and is chosen from phenylacetic acid, phenoxyacetic acid, mandelic acid or C1-C9 esters and starches ( linear or branched) of these acids. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising penicillins or cephalosporins prepared by means of the process described in the present invention, as well as to pharmaceutically acceptable diluents or carriers. The pharmaceutical compositions containing the penicillins or cephalosporins are commonly prepared according to conventional methods and are administered in suitable pharmaceutical form. With reference to formulas (I) and (II), R can be for example a phenyl, cyclohexadienyl, cyclohexenyl group not substituted or substituted with a hydroxyl, halogen, alkyl, alkoxy, carboxyl, nitro or amino group. ; Ri can be a hydrogen atom, a halogen atom, a methyl or inethylene group bonded to an organic group and in particular to an alkoxy, alkoxycarbonyl group or a five- or six-membered heterocyclic group containing from 1 to 4 heteroatoms selected from 0, S and N bonded to the inethylene group by means of an atom of 0, S, N and optionally substituted with one or more groups selected from a hydroxyl, halogen, alkyl, alkoxy, carbonyl, carboxy, cyano, amino and the like. The terms alkyl and alkoxy used herein refer to groups having from 1 to 6 carbon atoms, preferably from 1 to 4 carbon atoms. With reference to the α-amino acids whose starches have formula (III), D-phenylglycine, D-p-hydroxyphenylglycine and D-1,4-cyclohexadien-1-yl-glycine can be mentioned as examples. ; Suitable salts of the amide are those with an inorganic acid such as hydrochloric, hydrofluoric, hydrobromic, sulfuric or nitric acid, or with an organic acid, for example acetic, formic or maleic acid. ; The following acids are of particular interest among the compounds of formula (IV) and (V):; 6-amino-penicillanic (6-APA), 7-aminodesacetoxycephalosporanic (7-ADCA), 7-aminocephalosporanic, 7-amino-3-chloro-cephalosporan, 7-amino-3-methoxycephalosporan, 7-aminophenacetylhexacetoxycephalosporan, 7-aminophenosiacethyldhexacetoxycephalosporan, 7-amino-3-chloro-carbacefem, penicillin G and penicillin V. penicillin G or V and 7-aminophenacetyl-desacetoseicefalosporanic acid are commonly used as raw materials for the preparation of 6-APA and 7-ADCA respectively, in turn used to produce Ampicillin and Amoxicillin, Cefalexin and Cefadroxil: up to now these intermediates (6APA and 7-ADCA) had to be purified from phenylacetic or phenoxyacetic acid in order to use them in enzymatic acylation reactions, as described in PCT / DK91 / 00188. The possibility of carrying out the synthesis of these compounds even in the presence of inhibitors therefore entails the advantage of carrying out the synthesis without the need for purification of the intermediates, with a considerable saving of work and avoiding the use of organic solvents. The enzyme inhibitor can be present in the reaction mixture from the beginning of the synthesis or it can be added at any time during the course of the reaction; said inhibitor can also be added at the end of the enzymatic reaction to facilitate the isolation of the product and the subsequent treatments in general. ; The enzyme used as a catalyst in this process is a Penicillin Amidohydrolase classified E.C. 3.5.1.11 (otherwise also called penicillin acylase, penicillin hydrolase, ampicillin acylase etc.) coming from any microbiological source and in particular from Xantomonas, Pseudomonas, Arthrobacter, Kluyvera, Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Acromonas strains. Particularly preferred are enzymes deriving from natural or engineered strains of Escherichia coli: some of these are commercially available in large quantities and also in immobilized form. ; The enzyme can be used in free form (i.e. soluble) or it can be immobilized on a solid matrix: among the latter the supports expressly dedicated to the immobilization of biomolecules such as synthetic epoxy or azlattonic resins are particularly preferred. ; EXAMPLE 1; Synthesis of Cephalexin by enzymatic acylation of 7-ADCA with D (-) phenylglycinamide; 9 g (42 mmol) of 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid and 15.7 g (100 mmol) of D (-) phenylglycinamide are dissolved in water (final volume 300 ml). The solution was cooled to about 4 ° C and brought to pH = 6.8, then transferred to a refrigerated reactor connected to a control system (hereinafter called pH-stat) which maintains the pH constant by automatically adding sulfuric acid. 4 N.; To the above solution, 5400 IU of penicillin amidohydrolase enzyme were added in immobilized form (on azlatonic or epoxy resin), incubating at constant 4 * C and pH = 6.8.

Dopo circa 75 minuti l'enzima è stato separato dalla soluzione mediante filtrazione; alla soluzione sono stati aggiunti circa 4 g di b-naftolo sciolto in soda diluita. Sono stati recuperati 16.6 g di prodotto sotto forma di complesso Cefalessina b-naftolo, con una resa molare rispetto al nucleo di partenza del 74%. Dal complesso con b-naftolo è stata poi ottenuta (con procedure note) la forma di Cefalessina monoidrato con buone caratteristiche di qualità. After about 75 minutes the enzyme was separated from the solution by filtration; about 4 g of b-naphthol dissolved in dilute soda were added to the solution. 16.6 g of product were recovered in the form of the cephalexin b-naphthol complex, with a molar yield with respect to the starting nucleus of 74%. From the complex with b-naphthol the form of Cephalexin monohydrate with good quality characteristics was then obtained (with known procedures).

ESEMPIO 2 EXAMPLE 2

Sintesi di Cefalessina in presenza di acido fenilacetico Synthesis of Cephalexin in the presence of phenylacetic acid

17 g (0,077 mmoli) di acido 7-amino-desacetossicefalosporanico grezzo contenente come impurezze 1,18% di acido fenilacetico e 1,63% di acido 7-aminofenacetil-desacetossicefalosporanico e 42.68 g (0,28 mmoli) di D(-)-fenilglicinamide vengono sciolti in acqua ottenendo un volume finale di 600 mi. 17 g (0.077 mmol) of crude 7-amino-deacetoxycephalosporanic acid containing 1.18% of phenylacetic acid and 1.63% of 7-aminophenacetyl-desacetoxycephalosporanic acid as impurities and 42.68 g (0.28 mmol) of D (-) -phenylglycinamide are dissolved in water obtaining a final volume of 600 ml.

Il pH-stat viene regolato a pH=7,6, il termostato a 2°C, si utilizzano 7560 UI di enzima immobilizzato e quindi la reazione viene condotta come descritto nell'esempio 1. Dopo 5 ore e 30 minuti si interrompe la reazione filtrando la penicillina Acilasi e si precipita il prodotto con 6 g di b-naftolo ottenendo una resa molare del 87.5%. Si ottiene in seguito la Cefalessina monoidrato come già descritto nell'Esempio 1. The pH-stat is adjusted to pH = 7.6, the thermostat at 2 ° C, 7560 IU of immobilized enzyme are used and then the reaction is carried out as described in example 1. After 5 hours and 30 minutes the reaction is stopped filtering the penicillin Acylase and the product is precipitated with 6 g of b-naphthol obtaining a molar yield of 87.5%. Cephalexin monohydrate is then obtained as already described in Example 1.

ESEMPIO 3 EXAMPLE 3

Sintesi della Cefalessina da acido 7-aminofenacetil-desacetossicefalosporanico e D(-)fenilglicinamide Synthesis of cephalexin from 7-aminophenacetyl-desacetoxycephalosporanic acid and D (-) phenylglycinamide

16 g (0,048 moli) di acido 7-aminofenacetildesacetossicefalosporanico sono stati sciolti in acqua aggiungendo NaOH diluita quanto basta a raggiungere pH=8,0 quindi la soluzione è stata scaldata a 28°C e diluita con acqua quanto basta a 320 mi e quindi trasferita in un reattore opportuno, collegato ad un sistema pH-stat ed immerso in un bagno termostatico. 16 g (0.048 moles) of 7-aminophenacetylhexacetoxycephalosporanic acid were dissolved in water by adding diluted NaOH as needed to reach pH = 8.0 then the solution was heated to 28 ° C and diluted with water as required to 320 ml and then transferred in a suitable reactor, connected to a pH-stat system and immersed in a thermostatic bath.

A questa soluzione (soluzione A) sono state aggiunte circa 14000 UI di enzima penicillina acilasi in forma immobilizzata e quindi sono state mantenute costanti le condizioni di pH (aggiungendo NaOH 2 N) e di temperatura. About 14000 IU of penicillin acylase enzyme in immobilized form were added to this solution (solution A) and therefore the pH (by adding NaOH 2 N) and temperature conditions were kept constant.

A parte è stata preparata una soluzione acquosa di D(-)feniglicinamide ad una concentrazione di circa 180 g/1 (soluzione B). Separately, an aqueous solution of D (-) pheniglycinamide was prepared at a concentration of about 180 g / 1 (solution B).

Dopo circa due ore di reazione, 190 mi circa della soluzione B sono stati aggiunti alla soluzione A, correggendo il pH e la temperatura se necessario; il pH venne mantenuto costante mediante aggiunta di acido solforico 4 N. After about two hours of reaction, about 190 ml of solution B were added to solution A, correcting the pH and temperature if necessary; the pH was kept constant by adding 4 N sulfuric acid.

Dopo sette ore è stato rimosso 1'enzima per filtrazione sotto vuoto; dalla soluzione risultante è stata recuperata la Cefalessina mediante precipitazione del complesso Cefalessina bnaftolato in quantità corrispondente ad una resa molare del 80.8%. Dal complesso Cefalessina bnaftolato è stata ottenuta, mediante procedure note, la Cefalessina mono-idrato avente qualità soddisfacente per la commercializzazione. After seven hours the enzyme was removed by vacuum filtration; Cephalexin was recovered from the resulting solution by precipitation of the Cephalexin bnaphtholate complex in a quantity corresponding to a molar yield of 80.8%. Cephalessin monohydrate having a satisfactory quality for marketing was obtained from the Cefalexin bnaphtolate complex by means of known procedures.

ESEMPIO 4 EXAMPLE 4

Utilizzo ài inibitori nell'acilazione enzimatica dell'acido 7-amino-3-clorocefalosporanico Use of inhibitors in the enzymatic acylation of 7-amino-3-chlorocephalosporanic acid

La reazione viene condotta come nell'Esempio 1, utilizzando però 9,85 g (0,042 mmoli) di acido 7-amino-3-clorocefalosporanico. A fine reazione si aggiungono 1,5 g di acido fenilacetico sciolto in NaOH diluita, quindi si precipita il Cefaclor bnaftolato come già descritto negli Esempi 1-3 a proposito della Cefalessina. The reaction is carried out as in Example 1, but using 9.85 g (0.042 mmoles) of 7-amino-3-chlorocephalosporanic acid. At the end of the reaction, 1.5 g of phenylacetic acid dissolved in dilute NaOH are added, then the Cefaclor bnaftolato is precipitated as already described in Examples 1-3 with regard to Cephalexin.

La resa molare da acido 7-amino-3-clorocefalosporanico è stata del 70%. Per decomposizione (con tecniche note) del complesso Cefaclor b-naftolato si ottiene il Cefaclor monoidrato . The molar yield from 7-amino-3-chlorocephalosporanic acid was 70%. Cefaclor monohydrate is obtained by decomposition (with known techniques) of the Cefaclor b-naphtholate complex.

ESEMPIO 5 EXAMPLE 5

Acilazione enzimatica dell'acido 6-aminopenicillanico in presenza di inibitori Enzymatic acylation of 6-aminopenicillanic acid in the presence of inhibitors

Mediante procedimenti noti, dalla Penicillina G si ottiene per idrolisi enzimatica l'acido 6-aminopenicillanico (denominato in seguito 6-APA), isolandolo dalla soluzione acquosa per precipitazione con acidi: il prodotto così ottenuto presenta impurezze di acido fenilacetico. By means of known processes, 6-aminopenicillanic acid (hereinafter referred to as 6-APA) is obtained from Penicillin G by enzymatic hydrolysis, isolating it from the aqueous solution by precipitation with acids: the product thus obtained has phenylacetic acid impurities.

20,8 g di 6-APA grezzo umido avente titolo 80% (0.077 moli) vengono sciolti in acqua e mescolati con D-(-)fenilglicinamide come descritto nell'esempio 2, ottenendo una soluzione contenente circa 0,7 g/1 di acido fenilacetico. Si aggiungono 6670 unità di penicillina acilasi e la reazione viene condotta analogamente a quanto descritto nell'Esempio 2: si ottiene una conversione del 6-APA del 82,4%. 20.8 g of crude wet 6-APA having 80% titre (0.077 moles) are dissolved in water and mixed with D - (-) phenylglycinamide as described in Example 2, obtaining a solution containing about 0.7 g / 1 of phenylacetic acid. 6670 units of penicillin acylase are added and the reaction is carried out analogously to that described in Example 2: a conversion of 6-APA of 82.4% is obtained.

ESEMPIO 6 EXAMPLE 6

Inibizione idrolitica della penicillina G acilasi durante la sintesi di cefalessina. in presenza di acido fenilacetico. Hydrolytic inhibition of penicillin G acylase during the synthesis of cefalexin. in the presence of phenylacetic acid.

13 g (60.75 mmoli) di acido 7-aminodesacetossicefalosporanico (7-ADCA), 46.5 g (230,84 mmoli) di D-fenilglicina metilestere.HCl e 140 mg (1,03 mmoli) di acido fenilacetico furono sciolti in Ha0 per un volume totale di 1000 mi. 13 g (60.75 mmol) of 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA), 46.5 g (230.84 mmol) of D-phenylglycine methyl ester. HCl and 140 mg (1.03 mmol) of phenylacetic acid were dissolved in Ha0 for one total volume of 1000 ml.

L'acilazione venne eseguita con 17.5 g (3000 I.U.) di penicillina G acilasi nelle seguenti condizioni: il pH iniziale era 7.25 ad una temperatura di 3°C. Dopo circa 3 ore, il 93% di 7-ADCA era trasformato in cefalessina. The acylation was performed with 17.5 g (3000 I.U.) of penicillin G acylase under the following conditions: the initial pH was 7.25 at a temperature of 3 ° C. After approximately 3 hours, 93% of 7-ADCA was transformed into cefalexin.

Dopo conversione del 93% di 7-ADCA in cefalessina, il rapporto molare tra produzione sintetica di cefalessina rispetto alla formazione idrolitica di D-fenilglicina era di 2,15 in confronto di 1,44 ottenuto senza inibitore. After 93% conversion of 7-ADCA to cefalexin, the molar ratio of synthetic cefalexin production to hydrolytic formation of D-phenylglycine was 2.15 compared to 1.44 obtained without inhibitor.

Claims (5)

RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per produrre una penicillina o cefalosporina di formula (I) o (II) CLAIMS 1. A process for producing a penicillin or cephalosporin of formula (I) or (II) in cui X è S o CH2, R è un anello idrocarburico a 6 termini opzionalmente sostituito ed R1 è un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile, un gruppo metossile, un gruppo alchenile C1-C4 o un gruppo metilenico legato ad un radicale organico a ezzo di un atomo di ossigeno, zolfo o azoto, in cui: un. acido 6-amino-penicillanico o 7-aminocefalosporanico di formula (IV) o (V) where X is S or CH2, R is an optionally substituted 6-membered hydrocarbon ring and R1 is a hydrogen atom, a halogen atom, a methyl group, a methoxyl group, a C1-C4 alkenyl group or a bonded methylene group to an organic radical by means of an oxygen, sulfur or nitrogen atom, wherein: a. 6-amino-penicillanic or 7-aminocephalosporanic acid of formula (IV) or (V) in cui X ed R1 sono come sopra definiti, viene fatto reagire in mezzo acquoso ad una temperatura tra -5°C e 35°C in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato od in forma solubile con una amide di formula (III) in which X and R1 are as defined above, it is reacted in an aqueous medium at a temperature between -5 ° C and 35 ° C in the presence of an immobilized penicillin acylase enzyme or in soluble form with an amide of formula (III) in cui R è come sopra definito, R2 ed Ra sono ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico lineare o ramificato da 1 a 3 atomi di carbonio o i loro sali, in rapporto molare da 1 a 6 moli di detta amide (III) per 1 mole di acido (IV) o (V), caratterizzato dal fatto che al mezzo di reazione viene aggiunto un inibitore enzimatico di formula (VI): dove: in which R is as defined above, R2 and Ra are each independently a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group of 1 to 3 carbon atoms or their salts, in a molar ratio of 1 to 6 moles of said amide (III) per 1 mole of acid (IV) or (V), characterized in that an enzymatic inhibitor of formula (VI) is added to the reaction medium: where is it: R4 è scelto da un gruppo costituito da un alchile C1-C5 lineare o ramificato, un anello aromatico sostituito o non, un alogeno, un protone; Y può essere assente o, se presente, è O, S, CH2, fenile o alogeno; R5 è scelto dal gruppo costituito da un carbossile, un estere C1-C4 lineare o ramificato oppure un gruppo -CONH2; R6 è scelto dal gruppo costituito da H, OH, OCHO, CH3, tale inibitore essendo presente in concentrazioni da 0,0001 a 0,5 molare. R4 is selected from a group consisting of a linear or branched C1-C5 alkyl, a substituted or non-substituted aromatic ring, a halogen, a proton; Y can be absent or, if present, is O, S, CH2, phenyl or halogen; R5 is selected from the group consisting of a carboxyl, a linear or branched C1-C4 ester or a -CONH2 group; R6 is selected from the group consisting of H, OH, OCHO, CH3, this inhibitor being present in concentrations from 0.0001 to 0.5 molar. 2. Un procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la concentrazione di detto inibitore è preferibilmente da 0,0005 a 0,2 molare. 2. A process according to claim 1, characterized in that the concentration of said inhibitor is preferably from 0.0005 to 0.2 molar. 3. Un procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che detto inibitore (VI) è scelto dal gruppo costituito da acido fenilacetico, acido fenossiacetico, acido mandelico o gli esteri e le amidi C1-C8 (lineari o ramificati) di questi acidi. 3. A process according to claims 1 and 2, characterized in that said inhibitor (VI) is selected from the group consisting of phenylacetic acid, phenoxyacetic acid, mandelic acid or the esters and starches C1-C8 (linear or branched) of these acids. 4. Un procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2 caratterizzato dal fatto che detta amide (III) è scelta dal gruppo costituito da D-feniglicina amide o un suo sale con un acido organico o inorganico. 4. A process according to claims 1 and 2 characterized in that said amide (III) is selected from the group consisting of D-pheniglycine amide or a salt thereof with an organic or inorganic acid. 5. Composizione farmaceutica contenente una penicillina o cefalosporina ottenuta secondo i procedimenti delle rivendicazioni da 1 a 4. 5. Pharmaceutical composition containing a penicillin or cephalosporin obtained according to the processes of claims 1 to 4.
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