ITMI941073A1

ITMI941073A1 - STRAINS OF LATTOBACILLI OF HUMAN ORIGIN AND THEIR USES

Info

Publication number: ITMI941073A1
Application number: IT001073A
Authority: IT
Inventors: Vittorio Bottazzi; Haen Christoph De; Luigia Gozzini; Stella Lisa Lonigro
Original assignee: Bracco Spa
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1994-05-26
Publication date: 1995-11-26
Also published as: IT1269838B; ITMI941073A0

Description

Descrizione dell' invenzione industriale avente per titolo: "CEPPI DI LATTOBACILLI DI ORIGINE UMANA E LORO USI" Description of the industrial invention entitled: "STRAINS OF MILK BACILLI OF HUMAN ORIGIN AND THEIR USES"

La presente invenzione ha per oggetto ceppi di lattobacilli e composizioni farmaceutiche che li contengono . The present invention relates to strains of lactobacilli and pharmaceutical compositions containing them.

Più particolarmente , l'invenzione riguarda i due nuovi ceppi di Lactobacillus di origine umana siglati CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 e CNCM 1-1392, depositati ai sensi del Trattato di Budapest presso la Collezione CNCM dell' Institut Pasteur il 13.01.1994. More particularly, the invention concerns the two new Lactobacillus strains of human origin signed CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 and CNCM 1-1392, deposited under the Budapest Treaty in the CNCM Collection of the Institut Pasteur on 13.01. 1994.

L'utilizzazione dei fermenti lattici in terapia ha una lunga e consolidata tradizione, che risedè agli inizi di questo secolo ed agli studi che mettevano in evidenza i benefici effetti dell'uso di latte fermentato sulle condizioni di salute dei consumatori (Rif 1-5). The use of lactic ferments in therapy has a long and consolidated tradition, which dates back to the beginning of this century and to the studies that highlighted the beneficial effects of the use of fermented milk on the health conditions of consumers (Ref 1-5) .

Da allora i fermenti lattici sono stati largamente utilizzati nell’industria farmaceutica e costituiscono il principio attivo di numerose formulazioni per la cura di malattie intestinali dovute per esempio alla presenza di patogeni e come coadiuvanti al termine di trattamenti con antibiotici (Rif 6-9). Since then, lactic ferments have been widely used in the pharmaceutical industry and constitute the active ingredient of numerous formulations for the treatment of intestinal diseases due, for example, to the presence of pathogens and as adjuvants at the end of treatments with antibiotics (Ref 6-9).

Nel corso di questi decenni, però, la ricerca microbiologica ha approfondito le conoscenze relative ai fermenti lattici in generale e ai lattobacilli in particolare, ottenendo una massa di informazioni di notevole entità. In the course of these decades, however, microbiological research has deepened the knowledge relating to lactic ferments in general and to lactobacilli in particular, obtaining a mass of information of considerable entity.

I prodotti attualmente in commercio, infatti, non risultano aver recepito le acquisizioni della più recente ricerca scientifica (Rif 10-11). The products currently on the market, in fact, do not appear to have incorporated the acquisitions of the most recent scientific research (Ref 10-11).

In particolare conviene sottolineare come da diversi anni numerose ricerche abbiano chiarito che: In particular, it should be emphasized that for several years numerous researches have clarified that:

i bacilli lattici svolgono un ruolo peculiare nella regolazione della microflora intestinale, sia mediante la produzione di acido lattico che mediante la produzione di specifiche sostanze antibatteriche (Rif 12-16); lactic bacilli play a particular role in the regulation of intestinal microflora, both through the production of lactic acid and through the production of specific antibacterial substances (Ref 12-16);

questi batteri devono essere provenienti dall ' ambiente intestinale in cui si pensa poi di reinserirli (ad es. , isolati dal sistema intestinale umano per essere utilizzato in essere umani ecc. ) al fine di garantire l'insediamento, che rispetta le condizioni di "specificità d'ospite" (Rif 17); these bacteria must come from the intestinal environment in which it is then thought of reinserting them (eg, isolated from the human intestinal system to be used in humans, etc.) in order to ensure settlement, which respects the conditions of "specificity guest "(Ref 17);

i bacilli lattici sono coinvolti in numerose attività metaboliche di particolare interesse per il mantenimento di buone condizioni di salute e per la prevenzione dell'insorgenza di diversi stati patologici; si possono citare in particolare la deconiugazione degli acidi biliari, la degradazione delle nitrosoamine, la neutralizzazione di tossine batteriche, l'attività anticancerogenica (Rif 18); lactic bacilli are involved in numerous metabolic activities of particular interest for the maintenance of good health conditions and for the prevention of the onset of various pathological states; in particular we can mention the deconjugation of bile acids, the degradation of nitrosamines, the neutralization of bacterial toxins, the anticarcinogenic activity (Ref 18);

la capacità di aderire agli epiteli intestinali conferisce un forte vantaggio ai batteri intestinali (basti ricordare che diversi batteri patogeni perdono la loro virulenza in concomitanza con la perdita della capacità di aderire alle mucosé); anche per i batteri lattici la possibilità di colonizzare gli epiteli può quindi rivelarsi di particolare importanza, in particolare per conferire quella resistenza alla colonizzazione che tanta parte ha nel proteggere l'individuo dall'insediamento di batteri patogeni (Rii 10, 19); the ability to adhere to intestinal epithelia gives a strong advantage to intestinal bacteria (just remember that various pathogenic bacteria lose their virulence in conjunction with the loss of the ability to adhere to mucosé); also for lactic bacteria the possibility of colonizing the epithelia can therefore prove to be of particular importance, in particular to confer that resistance to colonization which plays a great part in protecting the individual from the settlement of pathogenic bacteria (Rii 10, 19);

la collocazione tassonomica dei ceppi di origine intestinale é stata sottoposta a profonda revisione, non solo con il riconoscimento di nuove specie batteriche caratteristiche di quell'ecosistema, ma anche con la differenziazione di biotipi particolari all'interno di ogni specie (Rii 20); the taxonomic location of intestinal strains has undergone a profound revision, not only with the recognition of new bacterial species characteristic of that ecosystem, but also with the differentiation of particular biotypes within each species (Rii 20);

le proprietà "tecnologiche" dei ceppi (prima fra tutte la capacità di resistere ai trattamenti di crio-conservazione) rivestono un particolare significato nel determinare una positiva utilizzazione dei ceppi di batteri lattici; i ceppi di lattobacilli usati a scopo probiotico sono infatti, generalmente, poco resistenti alla liofilizzazione (Rif 21). La capacità di adesione deve essere mantenuta dopo liofilizzazione (cosa che non sempre avviene). the "technological" properties of the strains (first of all the ability to resist cryopreservation treatments) have a particular significance in determining a positive use of the strains of lactic bacteria; the strains of lactobacilli used for probiotic purposes are in fact generally not very resistant to lyophilization (Ref 21). The adhesion capacity must be maintained after freeze-drying (which is not always the case).

In particolare, nel tentativo di isolare ceppi di lattobacilli che presentino un'elevata capacità adesiva alle cellule della mucosa intestinale, sono state descritte strategie di isolamento da fonti che possono essere definite "omologhe", quali feci di individui sani. In particular, in the attempt to isolate strains of lactobacilli that have a high adhesive capacity to the cells of the intestinal mucosa, isolation strategies have been described from sources that can be defined as "homologous", such as feces of healthy individuals.

Ad esempio US 4839281, EP-A-199535 e US 5032399 descrivono ceppi di Lactobacillus acidophilus isolati da individui adulti e caratterizzati da elevate caratteristiche di adesione, quantificate come numero di cellule batteriche che aderiscono a una cellula di mucosa intestinale umana, in confronto a un ceppo di riferimento. For example US 4839281, EP-A-199535 and US 5032399 describe Lactobacillus acidophilus strains isolated from adults and characterized by high adhesion characteristics, quantified as the number of bacterial cells adhering to a human intestinal mucosal cell, compared to a reference strain.

Reniero et al., in Letters in Applied Microbiology 1991, 13:3-6 hanno isolato da feci di lattanti due ceppi di Lactobacillus casei la cui permanenza nell’intestino per diversi giorni porta gli autori ad attribuirne caratteristiche adesive particolarmente spiccate. Nessun cenno é stato riportato circa le altre proprietà tecnologiche o biologiche sopra riportate, la cui presenza nei ceppi di Lactobacillus rivendicati costituisce una caratteristica distintiva della presente invenzione. Reniero et al., In Letters in Applied Microbiology 1991, 13: 3-6 isolated from the feces of infants two strains of Lactobacillus casei whose permanence in the intestine for several days leads the authors to attribute particularly strong adhesive characteristics. No mention has been made of the other technological or biological properties reported above, the presence of which in the claimed Lactobacillus strains constitutes a distinctive feature of the present invention.

Si é infatti trovato che i ceppi CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 e CNCM I-1392, oltre a caratteristiche di adesività a cellule della mucosa intestinale e buccale spesso superiori a quelle dei ceppi finora noti, presentano anche le seguenti proprietà : In fact, it has been found that the CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 and CNCM I-1392 strains, in addition to characteristics of adhesion to intestinal and buccal mucosa cells often superior to those of the so far known strains, also have the following properties:

capacità di inibire la crescita di patogeni intestinali umani; capacità di crescita in diverse condizioni sia in aerobiosi sia in anaerobiosi e a differenti 01, tali da conferire la possibilità di un buon adattamento a situazioni, sia fisiologiche che patologiche, che si possono verificare durante il transito nell'apparato gastrointestinale ; ability to inhibit the growth of human intestinal pathogens; growth capacity in different conditions both in aerobiosis and in anaerobiosis and at different 01, such as to give the possibility of a good adaptation to situations, both physiological and pathological, which can occur during transit in the gastrointestinal tract;

produzione di acido lattico in elevata quantità; production of lactic acid in high quantities;

resistenza alla bile; resistance to bile;

resistenza alla liofilizzazione, con conservazione della capacità di aderire a cellule intestinali e buccali. resistance to freeze-drying, with preservation of the ability to adhere to intestinal and buccal cells.

L'invenzione fornisce pertanto conposizioni farmaceutiche o veterinarie contenenti almeno uno dei ceppi CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 e CNCM 1-1392 preferibilmente in forma liofilizzata, in miscela con un veicolo convenzionale. Tali composizioni possono essere somministrate per via orale, eventualmente in miscela con prodotti alimentari quali latte, yogurt o latticini, per il trattamento o la profilassi di patologie gastroenteriche in cui sia desiderabile la somministrazione di lattobacilli, quali ad esempio dismicrobismo intestinale, diarrea di varia origine, colite ulcerativa e patologie correlate. Le conposizioni dell'invenzione possono inoltre essere somministrate in concomitanza a trattamenti antibiotici, allo scopo di preservare la flora batterica intestinale non patologica. The invention therefore provides pharmaceutical or veterinary compositions containing at least one of the CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 and CNCM 1-1392 strains preferably in lyophilized form, in admixture with a conventional vehicle. These compositions can be administered orally, optionally in a mixture with food products such as milk, yogurt or dairy products, for the treatment or prophylaxis of gastrointestinal diseases in which the administration of lactobacilli is desirable, such as intestinal dysmicrobism, diarrhea of various origins. , ulcerative colitis and related diseases. The compositions of the invention can also be administered concomitantly with antibiotic treatments, in order to preserve the non-pathological intestinal bacterial flora.

Un’altra importante caratteristica dei ceppi della presente invenzione è che sono stati isolati dalle feci di neonati e bambini svezzati sani. E' infatti noto che il tratto gastrointestinale dei marmiferi alla nascita è sterile; viene rapidamente colonizzato generalmente con la flora materna vaginale e perianale. Questa via naturale di trasferimento di microorganismi benefici manca in bambini nati attraverso taglio cesareo e questi sono ih genere più soggetti a colonizzazioni di microorganismi meno favorevoli. Questo rischio può essere ridotto somministrando i ceppi della presente invenzione. Another important feature of the strains of the present invention is that they have been isolated from the feces of healthy weaned babies and children. In fact, it is known that the gastrointestinal tract of marble at birth is sterile; it is rapidly colonized generally with the vaginal and perianal maternal flora. This natural route of transfer of beneficial microorganisms is lacking in children born by caesarean section and these are generally more prone to colonization by less favorable microorganisms. This risk can be reduced by administering the strains of the present invention.

Preferibilmente le composizioni dell’invenzione conterranno più di un ceppo e ancora più preferibilmente tutti e due i ceppi oggetto dell'invenzione, al fine di fornire un bilancio ottimale delle caratteristiche probiotiche e tecnologiche sopra riportate. Preferably the compositions of the invention will contain more than one strain and even more preferably both strains object of the invention, in order to provide an optimal balance of the probiotic and technological characteristics reported above.

Ogni dose unitaria, tipicamente in forma di capsule, soluzioni o sospensioni bevibili, polvere in bustine e simili, conterrà generalmente da IO6 a IO10 cellule di ogni singolo ceppo. Each unit dose, typically in the form of drinkable capsules, solutions or suspensions, powder in sachets and the like, will generally contain 10 to 10 cells of each individual strain.

Si descrivono di seguito l'isolamento dei ceppi e la loro caratterizzazione . The isolation of the strains and their characterization are described below.

Isolamento dei ceppi Isolation of the logs

I ceppi sono stati isolati a partire da 16 soggetti neonati, dal primo giorno di vita fino al sesto. Si sono inoltre effettuati campionamenti da tre soggetti durante il periodo di svezzamento. The strains were isolated from 16 newborn subjects, from the first day of life to the sixth day. Samples were also taken from three subjects during the weaning period.

II campionamento veniva effettuato sulle feci dei soggetti, prelevate due volte al giorno dalla clinica, dove erano conservati in swabs sterili in condizioni anaerobiche. Le semine per l' evidenziazione della presenza di lattobacilli venivano effettuate in terreno selettivo LBSTM (Lactobacillus Selection Agar, Oxoid) e successiva incubazione anaerobica (sistema Gas Pack, BBL) per 48 ore a 37’C. Le colonie cosi ottenute venivano isolate in terreno liquido MRS (de Man - Rogosa -Sharpe broth, Oxoid) e sottoposte alla prima serie di reisolamenti per ottenere una coltura pura (strisci successivi su terreno selettivo agarizzato e isolamento di singole colonie). Queste procedure rispecchiano la metodologia proposta da Sharpe (Rif 22). Sampling was performed on the subjects' faeces, collected twice a day from the clinic, where they were stored in sterile swabs under anaerobic conditions. Sowing to highlight the presence of lactobacilli was carried out in LBSTM selective medium (Lactobacillus Selection Agar, Oxoid) and subsequent anaerobic incubation (Gas Pack system, BBL) for 48 hours at 37'C. The colonies thus obtained were isolated in liquid MRS medium (de Man - Rogosa -Sharpe broth, Oxoid) and subjected to the first series of re-isolations to obtain a pure culture (subsequent smears on selective agar medium and isolation of single colonies). These procedures mirror the methodology proposed by Sharpe (Ref 22).

Caratterizzazione primaria Primary characterization

Dopo aver effettuato la procedura per la purificazione degli isolati, si é proceduto alla prima sommaria caratterizzazione dei ceppi cosi ottenuti, al fine di ritenere per lo studio solo quelli appartenenti al genere Lactobacillus. After carrying out the procedure for the purification of the isolates, the first summary characterization of the strains thus obtained was carried out, in order to consider for the study only those belonging to the genus Lactobacillus.

Sono stati quindi esaminati la morfologia (esame al microscopio ottico a contrasto di fase), la reazione alla colorazione di Gram (positiva per tutti i lattobacilli), la reazione per la presenza di catalasi (negativa in tutti i lattobacilli) e la determinazione della quantità dei due stereoisomeri di acido lattico presenti nel brodo di coltura dei singoli ceppi dopo 24 ore di incubazione (determinazione enzimatica con kit Boehringer). Questi teste consentono di assegnare al genere Lactobacillus gli isolati ottenuti dai terreni di selezione specifici e incubati come sopra descritto (Rif 22). The morphology (phase contrast optical microscope examination), the Gram stain reaction (positive for all lactobacilli), the reaction for the presence of catalase (negative in all lactobacilli) and the determination of the quantity were then examined. of the two stereoisomers of lactic acid present in the culture broth of the single strains after 24 hours of incubation (enzymatic determination with Boehringer kit). These heads allow to assign to the genus Lactobacillus the isolates obtained from the specific selection media and incubated as described above (Ref 22).

Identificazione singoli ceppi Identification of individual strains

L'analisi del profilo dei plasmidi, realizzato mediante una tecnica di estrazione alcalina (Rif 23), é stata quindi effettuata su tutti i ceppi identificati al punto precedente come lattobacilli; questa analisi permette di discriminare l'identità di isolati batterici (Rif 24). Inoltre é stato controllato il profilo delle proteine solùbili citoplasmatiche (Rif 25), nonché il pattern delle antibiotico resistenze (Rif 26). The analysis of the plasmid profile, carried out by means of an alkaline extraction technique (Ref 23), was then carried out on all the strains identified in the previous point as lactobacilli; this analysis allows to discriminate the identity of bacterial isolates (Ref 24). Furthermore, the profile of cytoplasmic soluble proteins was checked (Ref 25), as well as the pattern of antibiotic resistance (Ref 26).

Caratterizzazione tassonomica f eliotipica Pheliotypical taxonomic characterization

1 ceppi rappresentativi di tutti gli isolati sono stati quindi analizzati per la loro collocazione tassonomica mediante i teste f eliotipici standard, come la fermentazione degli zuccheri ( sistema gallerie API CH 50, Biomerieux) . The representative strains of all isolates were then analyzed for their taxonomic location using standard pheliotypic heads, such as sugar fermentation (API CH 50 tunnel system, Biomerieux).

Si riportano di seguito la tassonomia e le caratteristiche dei ceppi dell'invenzione: The taxonomy and characteristics of the strains of the invention are reported below:

Identificativo del ceppo: CNCM 1-1390 Log identifier: CNCM 1-1390

2. Tassonomia e caratteristiche 2. Taxonomy and characteristics

Identificativo del ceppo: CNCM 1-1391 Log identifier: CNCM 1-1391

Identificativo del ceppo: CNCM 1-1392 Log identifier: CNCM 1-1392

I ceppi dell'invenzione CNCM 1-1390 e CNCM 1-1391 sono stati paragonati a ceppi di riferimento per quanto riguarda la capacità di adesione a diversi tipi di cellule, la capacità di crescita a diverse condizioni di pH, di concentrazione di bile e di incubazione, la capacità di influire sulla crescita di patogeni intestinali. The inventive strains CNCM 1-1390 and CNCM 1-1391 have been compared to reference strains with regard to their ability to adhere to different cell types, their ability to grow under different conditions of pH, bile concentration and incubation, the ability to affect the growth of intestinal pathogens.

I ceppi di riferimento utilizzati in questi studi sono stati: The reference strains used in these studies were:

Lactobacillus acidophilus ATCC 53103 Lactobacillus acidophilus ATCC 53103

Lactobacillus acidophilus ATCC 4357 Lactobacillus acidophilus ATCC 4357

Lactobacillus delbrueckii ATCC 7994 Lactobacillus delbrueckii ATCC 7994

Salmonella enteritidis IMM2 Salmonella enteritidis IMM2

Escherichia coli ATCC 35401 Escherichia coli ATCC 35401

Test di adesione a cellule epiteliali umane Human epithelial cell adhesion test

I tests di adesività sono stati effettuati "in vitro" su due tipi di cellule epiteliali: The adhesiveness tests were performed "in vitro" on two types of epithelial cells:

cellule buccali umane isolate di fresco; freshly isolated human buccal cells;

linea cellulare intestinale di collezione, Intestine 407 (cellule di intestino embrionale ottenute dall'Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Brescia). collection intestinal cell line, Intestine 407 (embryonic intestine cells obtained from the Experimental Zooprophylactic Institute of Brescia).

Le Intestine 407 sono state fatte crescere in Eagle's Basai Medium in Hanks BSS contenente 10% di siero fetale bovino ed incubate a 37 *C in atmosfera at 5% di C02 per 48 ore. I monostrati formatasi sono stati tripsinizzati secondo le metodiche tradizionali (eliminazione del terreno di crescita, lavaggio del substrato con soluzione PBS (Phosphate Buffer ed Saline), addizione di 2 mL di tripsina-versene alla concentrazione dello 0,25%). La sospensione ottenuta é stata successivamente centrifugata a 1700 g per 10 min e lavata 2 volte in PBS. Le cellule sono state quindi diluite con soluzione PBS fino ad ottenere una concentrazione di 100 cellule/mL. Intestines 407 were grown in Eagle's Basai Medium in Hanks BSS containing 10% fetal bovine serum and incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% C02 for 48 hours. The monolayers formed were trypsinized according to traditional methods (elimination of the growth medium, washing of the substrate with PBS solution (Phosphate Buffer and Saline), addition of 2 mL of trypsin-versene at a concentration of 0.25%). The suspension obtained was subsequently centrifuged at 1700 g for 10 min and washed twice in PBS. The cells were then diluted with PBS solution to obtain a concentration of 100 cells / mL.

Le cellule buccali sono state isolate di fresco da soggetti sani non fumatori. Il prelievo è stato eseguito raschiando la superificie interna delle guance con un abbassalingua di legno. Le cellule della mucosa orale sono state quindi lavate mediante successive centrifugazioni con PBS. Buccal cells were freshly isolated from healthy non-smoking subjects. The sample was taken by scraping the inner surface of the cheeks with a wooden tongue depressor. The cells of the oral mucosa were then washed by successive centrifugations with PBS.

II test di adesività è stato eseguito aggiungendo 107 batteri cresciuti nelle condizioni idonee a 105 cellule epiteliali (buccali o intestinali) in PBS. La miscela ò stata incubata per 30 minuti a 37 *C in agitazione continua. Successivamente i batteri non adesi sono stati eliminati filtrando la sospensione attraverso un filtro di policar boriato (Sartorius) con pori di 5 μm di diametro. Dopo ripetuti lavaggi, le membrane sono state poste su vetrino, asciugate all'aria, fissate con metanolo e colorate con cristalvioletto al fine di evidenziare il numero di batteri adesi. La media di batteri adesi per cellula (X) ò stata determinata contando il numero di batteri adesi per 100 cellule. The adhesiveness test was performed by adding 107 bacteria grown under suitable conditions to 105 epithelial cells (buccal or intestinal) in PBS. The mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C with continuous stirring. Subsequently, the non-adherent bacteria were eliminated by filtering the suspension through a polycarbonate filter (Sartorius) with pores of 5 μm in diameter. After repeated washing, the membranes were placed on a slide, dried in the air, fixed with methanol and stained with crystal violet in order to highlight the number of attached bacteria. The average of attached bacteria per cell (X) was determined by counting the number of attached bacteria per 100 cells.

E' stata inoltre calcolata l'adesività relativa dei ceppi in esame rispetto al ceppo ATCC 53103 preso come riferimento dalla seguente equazione: The relative adhesiveness of the strains under examination was also calculated with respect to the ATCC 53103 strain taken as a reference by the following equation:

I risultati di questi esperimenti sono riportati in Tabella 1. The results of these experiments are reported in Table 1.

I risultati mostrano l'eccellente capacità dei ceppi della presente invenzione di aderire alle cellule della mucosa intestinale e buccale, in alcuni casi ben maggiore di quella dei riferimenti. The results show the excellent ability of the strains of the present invention to adhere to the cells of the intestinal and buccal mucosa, in some cases much greater than that of the references.

Crescita a differenti pH Growth at different pHs

I lattobacilli sono stati fatti crescere in terreno liquido MRS (Oxoid) a valori di pH 3 (ottenuto con l’aggiunta di HCl), a pH 5 (normale valore del brodo) e a pH 8 (ottenuto con l'aggiunta di NaOH). Lactobacilli were grown in liquid MRS (Oxoid) medium at pH 3 (obtained with the addition of HCl), pH 5 (normal broth value) and pH 8 (obtained with the addition of NaOH).

I campioni sono stati incubati a 37°C in atmosfera al 5% di CO2 e a diversi intervalli di tempo (12 h, 24 h, 48 h) ó stata effettuata la conta batterica. I risultati di questi esperimenti sono riportati in The samples were incubated at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2 and at different time intervals (12 h, 24 h, 48 h) the bacterial count was carried out. The results of these experiments are reported in

I valori sono espressi in log CFU/raL.CPU = colony forming unit. Values are expressed in log CFU / raL.CPU = colony forming unit.

I risultati mostrano che i ceppi della presente invenzione CNCM I-1390 e CNCM 1-1391 sono in grado di crescere in diverse condizioni di pH. In particolare i ceppi mostrano una resistenza a pH acidi uguale o superiore a quella dei ceppi di riferimento. The results show that the strains of the present invention CNCM I-1390 and CNCM 1-1391 are capable of growing under different pH conditions. In particular, the strains show resistance to acid pH equal to or greater than that of the reference strains.

Stabilità in presenza di bile Stability in the presence of bile

I ceppi della presente invenzione e il ceppo di riferimento ATCC 53103 sono stati incubati per 48 h in terreno liquido MRS. Le brodocolture sono state diluite (IO-7 CFU/mL) e seminate su MRS agar in presenza di bile (1,5 g/L e 3 g/L). Dopo 48 h di incubazione a 37°C in anaerobiosi é stata effettuata una conta batterica per osservare l'eventuale resistenza alla bile. I risultati sono riportati in Tabella 3. The strains of the present invention and the reference strain ATCC 53103 were incubated for 48 h in liquid MRS medium. The broth cultures were diluted (10 -7 CFU / mL) and seeded on MRS agar in the presence of bile (1.5 g / L and 3 g / L). After 48 h of incubation at 37 ° C in anaerobiosis, a bacterial count was carried out to observe any resistance to bile. The results are reported in Table 3.

I risultati dimostrano che i nuovi ceppi posseggono una buona resistenza alla bile. The results show that the new strains have good resistance to bile.

Crescita in condizioni di anaerobiosi e di aerobiosi Growth in anaerobic and aerobic conditions

I lattobacilli sono stati inoculati in terreno liquido MRS a 37 *C in condizioni di anaerobiosi (anaerobio System - model 1024} e aerobiosi per una notte e quindi si è proceduto alla conta batterica su piastra. I risultati sono riportati in Tabella 4. Lactobacilli were inoculated in MRS liquid medium at 37 * C in conditions of anaerobiosis (anaerobic System - model 1024} and aerobic conditions for one night and then the bacterial count was carried out on a plate. The results are reported in Table 4.

Tabella 4. Crescita dei lattobacilli in condizioni di anaerobiosi ed aerobiosi Table 4. Growth of lactobacilli in anaerobic and aerobic conditions

Interferenza sulla crescita di patogeni intestinali Interference on the growth of intestinal pathogens

La capacità dei ceppi della presente invenzione di inibire la crescita di patogeni intestinali è stata valutata in esperimenti di cocoltura con Escherichia coli (ATCC 35401 enterotossigenico) e Salmonella enteritidis (IMM2). The ability of the strains of the present invention to inhibit the growth of intestinal pathogens was evaluated in co-culture experiments with Escherichia coli (enterotoxigenic ATCC 35401) and Salmonella enteritidis (IMM2).

In una prima serie di esperimenti, i ceppi della presente invenzione e i ceppi di riferimento sono stati fatti crescere per una notte, e quindi inoculati con i patogeni a 37 *C in atmosfera al 5% di CO2 un terreno di coltura costituito da una miscela 1 a 1 di terreno liquido MRS a doppia concentrazione e di terreno liquido Mueller-Hilton a doppia concentrazione. Dopo 24 h e 48 h sono state effettuate le conte batteriche sia dei patogeni che dei ceppi di lattobacilli in esame. I ceppi cresciuti da soli nelle stesse condizioni sono stati utilizzati come controlli. I risultati di questi esperimenti sono riportati nelle Tabelle 5 e 6. In a first series of experiments, the strains of the present invention and the reference strains were grown overnight, and then inoculated with the pathogens at 37 ° C in an atmosphere at 5% CO2 a culture medium consisting of a mixture 1 to 1 of double concentration MRS liquid medium and double concentration Mueller-Hilton liquid medium. After 24 h and 48 h, bacterial counts of both the pathogens and the lactobacilli strains under examination were carried out. Strains grown alone under the same conditions were used as controls. The results of these experiments are reported in Tables 5 and 6.

In un'altra serie di esperimenti, i ceppi della presente invenzione e i ceppi di riferimento sono stati inoculati contemporaneamente con i patogeni e sono stati fatti crescere nelle stesse condizioni indicate sopra. Dopo 24 h e 48 h di incubazione sono state effettuate le conte batteriche sia dei patogeni che dei ceppi di lattobacilli in esame. Come controlli sono stati utilizzati i ceppi cresciuti nelle stesse condizioni ma singolarmente. I risultati di questi esperimenti sono riportati nelle Tabelle 7 e 8. In another series of experiments, the strains of the present invention and the reference strains were inoculated simultaneously with the pathogens and were grown under the same conditions as indicated above. After 24 h and 48 h of incubation, bacterial counts of both the pathogens and the lactobacilli strains under examination were performed. Strains grown under the same conditions but individually were used as controls. The results of these experiments are reported in Tables 7 and 8.

I risultati degli esperimenti di crescita di patogeni in cocoltura con i lattobacilli mostrano sorprendentemente che i ceppi della presente invenzione sono efficaci nell 'inibire la crescita di microorganismi dannosi. Infatti come riportato nelle Tabelle 5 e 6, la crescita sia di Escher ichia coli che di Salmone Ila enteritidis è fortemente inibita quando una sufficiente quantità di lattobacilli viene inoculata con questi due patogeni (un valore <3, espresso come logaritmo decimale di CFU/mL , è stato trovato in tutti i casi ) . I ceppi sono in grado di inibire la crescita degli stessi patogeni anche quando vengono inoculati simultaneamente (Tabelle 7 e 8). In particolare, nel caso di Salmone Ila enteritidis si è osservato una inibizione uguale a quella che si verifica quando i lattobacilli vengono cresciuti per una notte e inoculati (confrontare Tabella 8 e Tabella 6). E' , inoltre, interessante notare che la crescita dei ceppi di lattobacilli non viene minimamente influenzata dalla contemporanea presenza del patogeno. In tutti gli esperimenti, i dati di crescita dei lattobacilli in cocoltura sono, infatti, paragonabili a quelli di crescita dei lattobacilli in coltura The results of the coculture pathogen growth experiments with lactobacilli show surprisingly that the strains of the present invention are effective in inhibiting the growth of harmful microorganisms. In fact, as reported in Tables 5 and 6, the growth of both Escher ichia coli and Salmon Ila enteritidis is strongly inhibited when a sufficient quantity of lactobacilli is inoculated with these two pathogens (a value <3, expressed as decimal log of CFU / mL , was found in all cases). The strains are able to inhibit the growth of the same pathogens even when they are inoculated simultaneously (Tables 7 and 8). In particular, in the case of Salmon Ila enteritidis an inhibition equal to that which occurs when the lactobacilli are grown overnight and inoculated was observed (compare Table 8 and Table 6). It is also interesting to note that the growth of lactobacilli strains is not minimally influenced by the simultaneous presence of the pathogen. In all experiments, the growth data of lactobacilli in coculture are, in fact, comparable to those of growth of lactobacilli in culture.

pura. pure.

C C.

I lattobacilli venivano cresciuti per una notte e quindi incubati con E. coli. Dopo 24 h e 48 h sono state effettuate le conte batteriche sia del patogeno che dei lattobacilli. CPU = colony forming unit. Lactobacilli were grown overnight and then incubated with E. coli. After 24 h and 48 h, bacterial counts of both the pathogen and the lactobacilli were carried out. CPU = colony forming unit.

I lattobacilli venivano cresciuti per una notte e quindi incubati con S.enteritidis.Dopo 24 h e 48 h sono state effettuate le conte batteriche sia del patogeno che dei lattobacilli. CFU = colony forming unit. Lactobacilli were grown overnight and then incubated with S.enteritidis. After 24 h and 48 h both pathogen and lactobacilli bacterial counts were performed. CFU = colony forming unit.

I lattobaccilli e E. coli sono stati inoculati simultaneamente e dopo 24 h e 48 h sono state effettuate le conte batteriche sia del patogeno che dei lattobacilli.CFU - colony forming unit. Lactobaccilli and E. coli were inoculated simultaneously and after 24 h and 48 h bacterial counts of both the pathogen and lactobacilli were performed. CFU - colony forming unit.

I lattobacilli e S. enteritidis sono stati inoculati simultaneamente e dopo 24 h e 48 h sono state effettuate le conte batteriche sia del patogeno che dei lattobacilli.CFU = colony forming unit. Lactobacilli and S. enteritidis were inoculated simultaneously and bacterial counts of both the pathogen and lactobacilli were performed after 24 h and 48 h. CFU = colony forming unit.

Dai risultati sopra riportati risulta evidente come i ceppi della presente invenzione siano dotati di una serie di caratteristiche che li rendono particolarmente idonei alla preparazione di medicamenti. I ceppi della presente invenzione posseggono capacità di aderire alle cellule epiteliali umane (caratteristica inportante per la colonizzazione), mostrano una buona resistenza alla bile e sono in grado di resistere e crescere a pH acidi, e di crescere in condizioni sia di anaerobiosi che di aerobiosi. From the results reported above it is evident that the strains of the present invention are endowed with a series of characteristics which make them particularly suitable for the preparation of medicaments. The strains of the present invention possess the ability to adhere to human epithelial cells (an important feature for colonization), show good resistance to bile and are able to resist and grow at acidic pH, and to grow in both anaerobic and aerobic conditions. .

Inoltre, i ceppi della presente invenzione mostrano una sorprendente capacità di inibire la crescita di patogeni del tratto gastrointestinale . Furthermore, the strains of the present invention show a surprising ability to inhibit the growth of pathogens of the gastrointestinal tract.

I ceppi dell'invenzione mantengono inoltre tali proprietà anche dopo liofilizzazione, con resistenze comprese fra 35 e 60% dopo 3 mesi a 4*C, presentano alta velocità di crescita, e assenza di lisogenia. The strains of the invention also maintain these properties even after lyophilization, with resistances ranging from 35 to 60% after 3 months at 4 ° C, they have a high growth rate and an absence of lysogenicity.

Queste proprietà rendono i ceppi particolarmente adatti per la profilassi e il trattamento di disturbi che possono risultare da ingestione di cibo o acqua contaminata o che sono conseguenti a trattamenti con antibiotici o a condizioni generali di stress. Inoltre, i ceppi sono particolarmente adatti per il trattamento di neonati in tutte quelle situazioni in cui si possono verificare condizioni di colonizzazione con microorganismi meno favorevoli (ad es. , taglio cesareo}. These properties make the strains particularly suitable for the prophylaxis and treatment of ailments that may result from the ingestion of contaminated food or water or which are consequent to treatments with antibiotics or general stressful conditions. Furthermore, the strains are particularly suitable for the treatment of newborns in all those situations in which colonization conditions with less favorable microorganisms may occur (eg, caesarean section}.

Claims

CLAIMS 1. Lactobacillus non acidophilus strains deposited in the CNCM collection of the Institut Pasteur under numbers 1-1390, 1-1391 and 1-1392.

2. Pharmaceutical or veterinary compositions containing at least one of the Lactobacillus 1-1390, 1-1391 and 1-1392 strains of claim 1 in admixture with a compatible vehicle.

3. Compositions according to claim 2 wherein the 1-1390 and / or 1-1391 and / or 1-1392 BOTO strains present in lyophilized form.

4. Compositions according to claim 2 or 3 containing all strains 1-1390, 1-1391 and 1-1392.

5. Conpositions according to any one of claims 2 to 4 in the form of drinkable capsules, solutions or suspensions, powder in sachets.

6. Compositions according to any one of claims 2 to 5 containing from 106 to 1010 cells of each single strain per unit dose.

7. Use of Lactobacillus 1-1390, 1-1391 and 1-1392 strains for the preparation of medicaments useful for the treatment or prophylaxis of gastrointestinal diseases in which the administration of lactobacilli is desirable.

Use according to claim 7 for the preparation of medicaments for the treatment or prevention of intestinal dysmicrobism, diarrhea of various origins, ulcerative colitis.

9. Use of Lactobacillus 1-1390, 1-1391 and 1-1392 strains for the preparation of medicaments useful for the treatment of newborns in all those situations of unfavorable colonization of the gastrointestinal tract.