ITMI941006A1

ITMI941006A1 - Procedimento ed apparecchiatura per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino

Info

Publication number: ITMI941006A1
Application number: IT001006A
Authority: IT
Inventors: Guido Motolese
Original assignee: Pluristandard Guido Motolese S R L
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1995-11-18
Also published as: IT1269793B; ITMI941006A0; EP0683395A3; EP0683395A2

Description

DESCRIZIONE

Il presente trovato ha come oggetto un procedimento ed un'apparecchiatura per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino.

Come è noto, uno dei parametri tenuti costantemente sotto controllo in tutti i Paesi più avanzati dalle società distributrici o trasformatrici di latte vaccino è il numero di cellule somatiche presenti per unità di volume. Tale numero è soggetto a precisi limiti di legge, dato che un eccesso di cellule somatiche, specie se di derivazione ematica (leucociti, macrofagi, linfociti), comporta indesiderate modificazioni della struttura chimico-fisica del latte.

L'interesse degli allevatori al controllo del contenuto cellulare nel latte crudo è però dettato, non soltanto e non tanto dalla penalizzazione economica che subiscono da parte delle società acquirenti in funzione del numero di cellule per millilitro, ancorché inferiore ai limiti ammessi, ma anche e soprattutto dal fatto che un abnorme aumento di cellule somatiche nel latte di una bovina è indicativo della presenza di un'infezione della mammella che, ove non tempestivamente curata, riduce temporaneamente o permanentemente la produttività della bovina stessa. L'insorgenza di una mastite clinica in un animale da latte costringe l'allevatore a curarla con antibiotici e quindi a perderne la produzione per tutto il periodo della cura, fino al ritorno del contenuto di antibiotici nel latte al di sotto dei valori stabiliti dalla legge. Normalmente l'allevatore che noti in qualche bovina sintomi della malattia preleva un campione di latte e lo fa pervenire al più vicino laboratorio di analisi. Il costo diretto dell'analisi è modesto, mentre elevati sono i costi indiretti, come ad esempio i costi derivanti dal tempo richiesto, dal trasporto ed altro.

E' quindi sempre più sentita, ed auspicata negli ambienti veterinari, nel quadro delle azioni volte a migliorare le qualità nelle attività agroindustriali, la necessità di disporre di apparecchi analizzatori che possano far parte della normale attrezzatura di stalla.

Attualmente, per eseguire il controllo del numero di cellule somatiche nel latte vaccino, tralasciando il metodo classico di conteggio diretto al microscopio, eseguibile solo da operatori specializzati, con notevole impiego di tempo, esistono due metodi rapidi che danno risultati che sono riconosciuti accettabili dall'autorità responsabile: un metodo impedenziometrico ed un metodo citofluorimetrico.

Il metodo impedenziometrico consiste essenzialmente nel far passare il campione in misura attraverso uno stretto canale (diametro circa 100 pm), su due lati del quale sono affacciati gli elettrodi della cella di un misuratore di impedenza. L'apparecchio conta un impulso per ogni variazione di impedenza tra i due elettrodi conseguente al passaggio di una cellula. Di questo tipo di strumentazione esiste oggi un solo modello validato in ambito CEE.

Il metodo citofluorimetrico consiste invece nel marcare innanzitutto le cellule contenute nel campione con una sostanza fluorescente e poi nel far fluire il campione attraverso un passaggio obbligato sul quale è focalizzata un'ottica di eccitazione della sostanza marcante legata ad ogni singola cellula. Il segnale fluorescente di risposta è raccolto dalla stessa ottica o da un'ottica distinta a seconda della geometria dell'apparecchio e, convertito in segnale elettrico da un opportuno sensore, viene quindi inviato ad un'elettronica di trattamento e di conteggio.

Uno dei problemi fondamentali che si oppone all'adozione di queste strumentazioni direttamente in stalla è costituito dall'alto costo di tali apparecchiature che dipende soprattutto dalla necessità di impedire la contaminazione del campione in misura da parte di quelli che lo hanno preceduto. Questo fatto rende indispensabile l'esecuzione di accurati lavaggi di tutte le parti che vengono per qualunque motivo a contatto con il campione (pompe, tubi, punto di misura).

Compito precipuo del presente trovato è quello di risolvere il problema sopra esposto escogitando un procedimento per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino, che possa essere eseguito da un'apparecchiatura che presenti un'elevata robustezza e che risulti di semplice impiego in modo tale da poter essere utilizzata anche in stalla.

Nell'ambito di questo compito, uno scopo del trovato è quello di realizzare un'apparecchiatura che presenti un costo contenuto rispetto alle apparecchiature per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino attualmente in commercio.

Un altro scopo del trovato è quello di realizzare un'apparecchiatura che offra le massime garanzie contro la possibilità di contaminazioni dei campioni di latte sottoposti ad analisi.

Questo compito, nonché questi ed altri scopi che meglio appariranno in seguito, sono raggiunti da un procedimento per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino, caratterizzato dal fatto di consistere nel prelevare un campione del liquido da analizzare, nello stendere in modo uniforme un velo del liquido del campione prelevato su un elemento a nastro traslabile lungo un percorso prefissato, nell'analizzare il velo di liquido posto su detto elemento a nastro mediante un microscopio disposto lungo detto percorso a valle della stazione di stesura di detto liquido sull'elemento a nastro, secondo il senso di traslazione di detto elemento a nastro.

Per l'esecuzione del procedimento secondo il trovato viene preferibilmente impiegata un'apparecchiatura, caratterizzata dal fatto di comprendere: mezzi di prelievo di un campione del liquido da analizzare, un elemento a nastro sviluppantesi lungo un percorso prefissato, mezzi di traslazione di detto elemento a nastro lungo detto percorso, mezzi di erogazione di un velo del liquido di detto campione su una faccia di detto elemento a nastro, detti mezzi di erogazione essendo affacciati a detto elemento a nastro, essendo inoltre previsti mezzi di analisi ottica del velo di liquido del campione steso su detto elemento a nastro disposti a valle di detti mezzi di erogazione, secondo il senso di traslazione di detto elemento a nastro lungo detto percorso.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del trovato risulteranno maggiormente dalla descrizione di una forma di esecuzione preferita, ma non esclusiva, del procedimento, nonché dell'apparecchiatura per la sua esecuzione, secondo il trovato, illustrata a titolo indicativo e non limitativo negli uniti disegni, in cui:

la figura 1 illustra schematicamente l'apparecchiatura per l'esecuzione del procedimento secondo il trovato;

la figura 2 è una sezione ingrandita di un particolare della figura 1 eseguita lungo l'asse II-II della figura 1;

la figura 3 illustra schematicamente, in alzato laterale parzialmente sezionato, i mezzi di prelievo di un campione del liquido da analizzare durante il prelievo;

la figura 4 illustra, in una vista eseguita similmente alla figura 3, i mezzi di prelievo dopo il prelievo di un campione del liquido da analizzare;

la figura 5 illustra schematicamente un dispositivo per la marcatura con liquido fluorescente del campione di liquido da analizzare.

Con riferimento alle figure citate, l'apparecchiatura per l'esecuzione del procedimento secondo il trovato, indicata globalmente con il numero di riferimento 1, comprende: mezzi di prelievo 2 di un campione del liquido da analizzare, un elemento a nastro 3, che si sviluppa lungo un percorso prefissato, mezzi di traslazione 4 dell'elemento a nastro 3 lungo il suo percorso, mezzi di erogazione 5 di un velo del liquido del campione su una faccia dell'elemento a nastro 3 e mezzi di analisi ottica 6 del velo di liquido del campione steso sull'elemento a nastro 3.

I mezzi di prelievo 2 comprendono un dispositivo porta-pipetta 7 che è costituito sostanzialmente da un corpo cilindrico cavo che presenta, in corrispondenza di una sua estremità longitudinale, una sede 8 all'interno della quale è destinata ad essere disposta una pipetta monouso 9 mediante la quale viene eseguito il prelievo di una quantità prefissata del liquido da analizzare. Internamente al corpo cilindrico cavo del dispositivo porta-pipetta 7, è alloggiato un elemento a pistone 10 che fuoriesce con una sua porzione a pulsante 11 dall'estremità assiale opposta rispetto alla sede 8. All’interno del dispositivo porta-pipetta 7 è previsto un riscontro fisso 12 e, tra tale riscontro fisso 12 e l'estremità longitudinale dell’elemento a pistone 10 opposta rispetto alla porzione a pulsante 11, è disposta una molla 13 che si oppone elasticamente all'avanzamento dell'elemento a pistone 10 in direzione della sede 8. L'elemento a pistone 10 è provvisto, sulla sua estremità rivolta verso la sede 8, di un prolungamento 14 che attraversa il riscontro fisso 12 e che agisce su una molla a lamina 15 che è applicata ad una parete laterale della sede 8 e che riscontra con la pipetta 9 inserita in tale sede 8.

In pratica, premendo sul pulsante 11, si provoca la traslazione dell'elemento a pistone 10 che va ad agire con il prolungamento 14 sulla molla a lamina 15 provocandone la flessione. Tale flessione della molla a lamina 15 provoca la compressione della pipetta 9. Il rilascio del pulsante 11 ottiene il ritorno nella posizione di partenza dell'elemento a pistone 10, per effetto della molla 13, e va a scaricare la molla a lamina 15 che, tornando in posizione di riposo, consente alla pipetta 9 di tornare nelle condizioni di riposo in modo tale da provocare un'aspirazione all'interno della pipetta 9 di una quantità prefissata di liquido 50 da analizzare.

L'elemento a nastro 3 è supportato da una cartuccia 16, sostituibile, che è supportata, in modo amovibile, all'interno di un vano definito dalla struttura di supporto 52 dell'apparecchiatura.

Più particolarmente, la cartuccia 16 si compone di un involucro 17 all'interno del quale è supportata, in modo girevole attorno al suo asse 18a, una bobina 18 dell'elemento a nastro 3. Sempre internamente all'involucro 17 è disposto un tamburo di riavvolgimento 19 per l'elemento a nastro che è disposto con il suo asse 19a parallelo all'asse 18a della bobina 18. L'elemento a nastro 3 si svolge dalla bobina 18 al tamburo di riavvolgimento 19 lungo un percorso che è definito da rullini 20 che sono supportati, in modo folle attorno ai rispettivi assi disposti parallelamente agli assi 19a e 18a, dall'involucro 17. Come si può rilevare in particolare dalla figura 2, l'involucro 17 è provvisto, al suo interno, di sporgenze 21 che supportano, in modo folle attorno ai rispettivi assi, i rullini 20. Tali rullini 20 sono attraversati da un foro assiale 20a che è irapegnabile, in modo folle, con alberini 22 portati dalla struttura di supporto 52 dell'apparecchiatura internamente all'alloggiamento destinato a contenere la cartuccia sostituibile 16, in modo tale da consentire il corretto posizionamento della cartuccia 16 all'interno della struttura di supporto 52 dell'apparecchiatura. La cartuccia 16 è inoltre fissata, in modo di per sè noto, all'interno dell'alloggiamento della struttura di supporto 52, ad esempio mediante viti rimovibili 43, godroni, o simili.

L'involucro 17 della cartuccia presenta, lungo lo sviluppo dell'elemento a nastro 3, almeno una prima apertura 23 che è disposta in corrispondenza dei mezzi di erogazione 5 ed almeno una seconda apertura 24 che è disposta in corrispondenza dei mezzi di analisi 6.

I mezzi di traslazione 4 per l'elemento a nastro 3 lungo il percorso definito dai rullini 20 comprendono un capstan 25, o cabestano, con relativa rotella di pressione 26, che si impegna con l'elemento a nastro 3. Il capstan 25 è azionato con moto rotatorio attorno al suo asse mediante un motore elettrico, non illustrato per semplicità, che è anche collegato, attraverso un’opportuna frizione, al tamburo di riavvolgimento 19 in modo tale da operare progressivamente lo svolgimento dell'elemento a nastro 3 dalla bobina 18 e da ottenere il suo riavvolgimento sul tamburo 19 provocando la traslazione dell'elemento a nastro 3 lungo il percorso definito dai rullini 20.

L'elemento a nastro 3 è costituito preferibilmente da un nastro in materiale sintetico non fluorescente.

L'apparecchiatura comprende anche mezzi di dosatura 27 di un liquido di marcatura fluorescente all'interno della pipetta 9. Tali mezzi di dosatura sono costituiti da una pompetta volumetrica 28 che pesca in un contenitore 29 del liquido di marcatura fluorescente 30 e che è collegata con il suo condotto di mandata 28a ad un condotto 31 che alimenta un ugello di erogazione 32 in corrispondenza del quale viene posizionato l'imbocco della pipetta 9 utilizzando lo stesso dispositivo porta-pipetta 7.

La pompetta volumetrica 28, che è azionabile manualmente mediante un pulsante di pressione 33 posto sulla struttura di supporto 52, eroga una quantità dosata del liquido di marcatura 30 all'interno della pipetta 9.

I mezzi di erogazione 5 comprendono un supporto 34 del dispositivo porta-pipetta 7 che è opportunamente provvisto, in prossimità della sede 8 di un'apertura laterale 35 che viene posizionata, disponendo il dispositivo porta-pipetta 7 sul supporto 34, in corrispondenza di un organo pressore 36. L'organo pressore 36 è comandato da una camma 37 che viene azionata a comando con moto rotatorio attorno ad un asse di rotazione 37a. Il pròfilo della camma 37 agisce su un elemento seguicamma 38 che, attraverso una leva 39, è collegato all'organo pressore 36, in modo tale da provocare lo spostamento dell'organo pressore 36 lungo una direzione trasversale all'asse della pipetta 9 per operare il suo progressivo schiacciamento ottenendo così l'erogazione di una quantità prefissata del liquido contenuto all'interno di tale pipetta. Con il dispositivo porta-pipetta 7 posizionato sul supporto 34, la bocca della pipetta 9 è affacciata all'apertura 23 e, in corrispondenza di tale apertura, il percorso dell'elemento a nastro 3 si sviluppa opportunamente lungo un piano che è inclinato rispetto ad un piano teorico orizzontale, in modo tale da ottenere, con lo schiacciamento della pipetta 9, l'erogazione di un velo uniforme di liquido sulla faccia dell'elemento a nastro 3 rivolta verso l'esterno della cartuccia 16.

I mezzi di analisi ottica comprendono un microscopio di fluorescenza 40, di tipo noto, che è affacciato alla seconda apertura 24, disposta a valle dell'apertura 23 secondo il senso di traslazione dell'elemento a nastro 3 lungo il suo percorso.

L'impiego dell'apparecchiatura nell'esecuzione del procedimento secondo il trovato è il seguente.

Mediante la pipetta monouso 9, posizionata nel dispositivo porta-pipetta 7, l'operatore preleva una quantità prefissata del liquido da analizzare e porta poi la pipetta 9 con la sua bocca in corrispondenza dell'ugello 32 iniettando all'interno della pipetta una quantità prefissata del liquido di marcatura 30 mediante l'azionamento della pompetta 28. La pipetta monouso 9 viene poi posizionata, con il dispositivo porta-pipetta 7, sul supporto 34 in modo tale che la bocca della pipetta risulti affacciata all'elemento a nastro 3 in corrispondenza dell’apertura 23.

Il successivo azionamento della camma 37 provoca l'erogazione del liquido campione, così marcato, sull'elemento a nastro 3 durante la sua traslazione dalla bobina 18 al tamburo di riavvolgimento 19. Grazie all'inclinazione dell'elemento a nastro 3 in corrispondenza dell'apertura 23, si ottiene una distribuzione uniforme del liquido lungo l'elemento a nastro 3 che, durante la sua traslazione dalla bobina 18 al tamburo di riavvolgimento 19, porta il liquido a passare davanti al microscopio 40 che opera l'analisi di tale liquido.

Dopo l'analisi, la pipetta 9 può essere sostituita con una nuova pipetta per eseguire una nuova analisi finché non viene ad esaurirsi la bobina 18. Una volta esaurita la bobina 18, si esegue la sostituzione della cartuccia 16 con una nuova cartuccia provvista di un nuovo elemento a nastro 3 per eseguire nuove analisi.

Per il fatto che la pipetta 9 non viene manipolata direttamente dall'operatore, bensì sempre con l'ausilio del dispositivo porta-pipetta 7, unitamente al fatto che la pipetta 9 viene sostituita ad ogni analisi, viene esclusa con sicurezza la possibilità di contaminazione del campione di liquido prelevato.

Inoltre, per il fatto che l'elemento a nastro 3 viene svolto dalla bobina 18 ed avvolto sul tamburo 19 durante l'esecuzione delle analisi, si ottiene un'ulteriore garanzia contro il pericolo di contaminazione del campione senza richiedere alcun lavaggio dell'apparecchiatura.

Si è in pratica constatato come il procedimento secondo il trovato e l'apparecchiatura per la sua esecuzione assolvano pienamente il compito prefissato in quanto consentono di eseguire l'analisi del latte direttamente in stalla con costi notevolmente ridotti rispetto ai costi richiesti dalle apparecchiature e dai metodi di analisi di tipo tradizionale.

Benché il procedimento, nonché l'apparecchiatura per la sua esecuzione, siano stati concepiti in particolare per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vicino, potranno comunque essere utilizzati con vantaggio anche per eseguire l'analisi di altri liquidi eterogenei.

Il procedimento, nonché l'apparecchiatura, così concepiti, sono suscettibili di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell'ambito del concetto inventivo; inoltre, tutti i dettagli potranno essere sostituiti da altri elementi tecnicamente equivalenti.

In pratica, i materiali impiegati, nonché le dimensioni, potranno essere qualsiasi secondo le esigenze e lo stato della tecnica.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino, caratterizzato dal fatto di consistere nel prelevare un campione del liquido da analizzare, nello stendere in modo uniforme un velo del liquido del campione prelevato su un elemento a nastro traslabile lungo un percorso prefissato, nell'analizzare il velo di liquido posto su detto elemento a nastro mediante un microscopio disposto lungo detto percorso a valle della stazione di stesura di detto liquido sull'elemento a nastro, secondo il senso di traslazione di detto elemento a nastro.
2. Procedimento, secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto elemento a nastro è in materiale non fluorescente, dal fatto che detto liquido del campione prelevato viene marcato con sostanze fluorescenti prima di pervenire a detto microscopio e dal fatto che detto microscopio è costituito da un microscopio di fluorescenza.
3. Procedimento, secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto campione di liquido viene prelevato mediante una pipetta monouso.
4. Procedimento, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto elemento a nastro è monouso.
5. Apparecchiatura per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino, caratterizzata dal fatto di comprendere: mezzi di prelievo di un campione del liquido da analizzare, un elemento a nastro sviluppantesi lungo un percorso prefissato, mezzi di traslazione di detto elemento a nastro lungo detto percorso, mezzi di erogazione di un velo del liquido di detto campione su una faccia di detto elemento a nastro, detti mezzi di erogazione essendo affacciati a detto elemento a nastro, essendo inoltre previsti mezzi di analisi ottica del velo di liquido del campione steso su detto elemento a nastro disposti a valle di detti mezzi di erogazione, secondo il senso di traslazione di detto elemento a nastro lungo detto percorso.
6. Apparecchiatura, secondo la rivendicazione 5, caratterizzata dal fatto che detto elemento a nastro è supportato da una cartuccia sostituibile supportata amovibilmente in un vano di alloggiamento di una struttura di supporto dell'apparecchiatura.
7. Apparecchiatura, secondo le rivendicazioni 5 e 6, caratterizzata dal fatto che detta cartuccia comprende un involucro supportante, al suo interno, una bobina di detto elemento a nastro ed un tamburo di riavvolgimento di detto elemento a nastro, detto elemento a nastro svolgendosi da detta bobina a detto tamburo di riavvolgimento lungo un percorso definito da rullini, aventi assi paralleli agli assi di detta bobina e di detto tamburo di riavvolgimento, supportati in modo folle attorno ai rispettivi assi da detto involucro, in detto involucro essendo definita almeno una prima apertura di accesso a detto elemento a nastro affacciantesi a detti mezzi di erogazione ed almeno una seconda apertura di accesso affacciata a detti mezzi di analisi.
8. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di traslazione di detto elemento a nastro comprendono un capstan impegnantesi con detto elemento a nastro lungo detto percorso e mezzi motori collegati a detto capstan e a detto tamburo di riavvolgimento per il loro azionamento.
9. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di prelievo comprendono un dispositivo porta-pipetta provvisto di una sede per una pipetta di prelievo monouso e di mezzi di compressione di detta pipetta per il prelievo da parte di detta pipetta di una quantità prefissata di liquido da analizzare.
10. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto di comprendere mezzi di dosatura di un liquido di marcatura fluorescente in detta pipetta.
11. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di erogazione comprendono un supporto di detto dispositivo porta-pipetta posizionato in corrispondenza di detta prima apertura dell'involucro di detta cartuccia e i mezzi pressori agenti su detta pipetta per l'erogazione di un velo di liquido, del campione prelevato, su una faccia di detto elemento a nastro.
12. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di analisi ottica comprendono un microscopio di fluorescenza affacciato a detta seconda apertura dell'involucro di detta cartuccia.
13. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detto elemento a nastro, in corrispondenza di detti mezzi di erogazione, si sviluppa secondo un piano inclinato rispetto ad un piano teorico orizzontale.
14. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detta struttura di supporto presenta, internamente a detto alloggiamento, alberini accoppiabili in modo folle con una sede definita coassialmente in detti rullini.
15. Apparecchiatura, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detto elemento a nastro è realizzato in materiale sintetico non fluorescente.
16. Procedimento ed apparecchiatura per l'analisi di liquidi eterogenei, particolarmente per il conteggio delle cellule somatiche nel latte vaccino, caratterizzati dal fatto di comprendere una o più delle caratteristiche descritte e/o illustrate.