ITMI940779A1

ITMI940779A1 - MUTANTS OF THE NEUTRAL PROTEASIS AND MEANS AND METHODS FOR THEIR PREPARATION

Info

Publication number: ITMI940779A1
Application number: IT000779A
Authority: IT
Inventors: Giovanna Carpani; Gianni Frascotti; Francesco Frigerio; Y Ros Immaculada Margarit; Renzo Nogarotto
Original assignee: Mini Ricerca Scient Tecnolog
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 1995-10-22
Also published as: ITMI940779A0; IT1269570B

Description

MINISTERO DELL’UNIVERSITÀ’ E DELLA RICERCA SCIEN-TIFICA E TECNOLOGICA. MINISTRY OF UNIVERSITY AND SCIENIFIC AND TECHNOLOGICAL RESEARCH.

DESCRIZIONE DESCRIPTION

La presente invenzione riguarda mutanti della protessi neutra che esibiscono profili di attività/pH modificati rispetto alla proteasi neutra wild type, mezzi e metodi per la loro preparazione e loro impiego. The present invention relates to mutants of the neutral protease exhibiting modified activity / pH profiles with respect to the wild type neutral protease, means and methods for their preparation and their use.

Le proteasi batteriche sono enzimi che catalizzano la scissione dei legami peptidici delle proteine. Dette proteasi possono essere classificate, in base all'optimum di pH, in due grandi categorie: proteasi alcaline e proteasi neutre. Tipicamente, le prime vengono utilizzate nel campo della detergenza come additivi, mentre le seconde trovano una utilizzazione in tecnologie alimentari, soprattutto nella produzione di prodotti da forno, in birrificazione, nei processi di intenerimento delle carni, nel recupero delle proteine dai sottoprodotti della macellazione e dell'industria ittica, e preparazione di idrolizzati proteici. Bacterial proteases are enzymes that catalyze the cleavage of peptide bonds in proteins. These proteases can be classified, on the basis of the optimum pH, in two broad categories: alkaline proteases and neutral proteases. Typically, the former are used in the field of detergency as additives, while the latter are used in food technologies, especially in the production of bakery products, in brewing, in meat softening processes, in the recovery of proteins from slaughtering by-products and of the fishing industry, and preparation of protein hydrolysates.

In generale i fattori che limitano l’uso industriale di un enzima sono dovuti non solo ai possibili elevati costi di produzione e purificazione, ma anche al fatto che le caratteristiche degli enzimi presenti in natura (wild type), caratteristiche quali stabilità all'ossidazione, temperatura, al pH e simili, non sono necessariamente ottimizzate per la loro utilizzazione in un ambiente diverso da quello originale. Infatti, l'industria richiede enzimi particolarmente "robusti" in quanto i substrati e/o i prodotti desiderati, così come le condizioni di reazione, sono spesso differenti da quelli fisiologici . In general, the factors that limit the industrial use of an enzyme are due not only to the possible high production and purification costs, but also to the fact that the characteristics of the enzymes present in nature (wild type), characteristics such as oxidation stability, temperature, pH and the like, are not necessarily optimized for their use in an environment other than the original one. In fact, industry requires particularly "robust" enzymes since the desired substrates and / or products, as well as the reaction conditions, are often different from the physiological ones.

Può essere quindi desiderabile alterare una o più caratteristiche naturali dell'enzima per uno specifico impiego o per un uso in uno specifico ambiente . It may therefore be desirable to alter one or more natural characteristics of the enzyme for a specific use or for use in a specific environment.

Sono stati descritti nella tecnica mutanti delle protessi in cui uno o più siti della struttura primaria dell'enzima naturale sono stati alterati, intervenendo a livello di DNA, in modo tale da ottenere un prodotto con caratteristiche più adatte al processo di interesse. Protected mutants have been described in the technique in which one or more sites of the primary structure of the natural enzyme have been altered, intervening at the DNA level, in such a way as to obtain a product with characteristics more suited to the process of interest.

Così, ad esempio sono stati costruiti mutanti delle proteasi con una elevata stabilità agli agenti ossidanti (Estell, D.A. et al., (1985), J. Biol. Chem: 260, 6518-21), alla temperatura (Imanaka, T. et al., (1986), Nature, 324, 695-697) ed alla denaturazione da parte di detergenti (US 4,760,025) . Thus, for example, protease mutants with high stability to oxidizing agents were constructed (Estell, D.A. et al., (1985), J. Biol. Chem: 260, 6518-21), at temperature (Imanaka, T. et al., al., (1986), Nature, 324, 695-697) and denaturation by detergents (US 4,760,025).

Per quanto riguarda in particolare la proteasi neutra sono stati descritti dei mutanti termostabili, ottenuti mediante sostituzione nella proteina wild type di uno o più residui amminoacidici in determinate posizioni ( JP-5146292 , JP0S199873). As regards in particular the neutral protease, thermostable mutants have been described, obtained by substitution in the wild type protein of one or more amino acid residues in certain positions (JP-5146292, JP0S199873).

Considerata l'importanza industriale che riveste questo enzima, la disponibilità di mutanti con una attività enzimatica in un intervallo di pH più ampio rispetto a quello della proteasi neutra wild type, potrebbe essere particolarmente vantaggiosa per una loro utilizzazione in diversi settori, compreso quello della detergenza. Considering the industrial importance of this enzyme, the availability of mutants with enzymatic activity in a pH range wider than that of the wild type neutral protease, could be particularly advantageous for their use in various sectors, including that of detergency. .

Tra questi vantaggi non va trascurato il fatto che le proteasi alcaline più usate appartengono alla classe delle proteine seriniche. Queste proteasi sono inibite, generalmente in modo irreversibile, dalla presenza di agenti quali PSMF (Fenilmetilsulfonilfluorurato) e DFP (Diisopropilfosforofluoridrato). La proteasi neutra secondo la presente invenzione, invece, essendo un metallo-enzima, non risulta influenzato dagli inibitori delle proteasi seriniche. Among these advantages it should not be overlooked that the most used alkaline proteases belong to the class of serine proteins. These proteases are generally irreversibly inhibited by the presence of agents such as PSMF (Phenylmethylsulfonyl fluorinated) and DFP (Diisopropylphosphorofluorohydrate). The neutral protease according to the present invention, on the other hand, being a metallo-enzyme, is not affected by the inhibitors of the serine proteases.

Inoltre, l'uso delle proteasi seriniche nell'impasto di prodotti da forno è limitato dalla presenza di alcuni inibitori presenti naturalmente nei cereali, che peraltro non hanno effetto sull'attività della proteasi neutra. Furthermore, the use of serine proteases in the dough of bakery products is limited by the presence of some inhibitors naturally present in cereals, which however have no effect on the activity of the neutral protease.

E' stato ora trovato, secondo la presente invenzione, che mutanti della proteasi neutra con profili di attività/pH modificati rispetto alla proteasi neutra wild type possono essere ottenuti sostituendo con un differente amminoacido, il residuo in posizione 226, corrispondente ad un acido Aspartico (Asp), della sequenza amminoacidica della proteasi neutra di Bacillus subtilis. It has now been found, according to the present invention, that mutants of the neutral protease with activity / pH profiles modified with respect to the wild type neutral protease can be obtained by replacing with a different amino acid, the residue in position 226, corresponding to an Aspartic acid ( Asp), of the amino acid sequence of the neutral protease of Bacillus subtilis.

In accordo con ciò, in un suo primo aspetto la presente invenzione riguarda mutanti della proteasi neutra dotati di una attività enzimatica in un ampio intervallo di pH e caratterizzati dal fatto che il residuo amminoacidico Asp226 è sostituito con un residuo amminoacidico differente scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali. In accordance with this, in a first aspect, the present invention relates to mutants of the neutral protease endowed with enzymatic activity in a wide pH range and characterized by the fact that the amino acid residue Asp226 is substituted with a different amino acid residue selected from the group of amino acids. natural.

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un gene mutagenizzato che codifica un mutante della proteasi neutra con una attività enzimatica in un ampio intervallo di pH. Another object of the present invention is a mutagenized gene encoding a mutant of the neutral protease with enzymatic activity in a wide pH range.

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un vettore replicabile ad espressione in Bacillus comprendente detto gene mutagenizzato. Another object of the present invention is a replicable vector with expression in Bacillus comprising said mutagenized gene.

Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un ceppo di Bacillus trasformato con detto vettore. A further object of the present invention is a Bacillus strain transformed with said vector.

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un procedimento per la produzione di un mutante della proteasi neutra con una attività enzimatica in un ampio intervallo di pH che comprende, il coltivare in un ambiente di coltura adatto un ceppo di Bacillus trasformato con un vettore replicabile ad espressione comprendente il gene mutagenizzato codificante per detto mutante, il separare e purificare dal mezzo di coltura l'enzima mutato così ottenuto. Another object of the present invention is a process for the production of a mutant of the neutral protease with an enzymatic activity in a wide range of pH which includes, the cultivation in a suitable culture medium a strain of Bacillus transformed with a replicable vector to expression comprising the mutagenized gene coding for said mutant, separating and purifying the mutated enzyme thus obtained from the culture medium.

Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione l'uso di detti mutanti della proteasi neutra nel settore alimentare e della detergenza. A further object of the present invention is the use of said mutants of the neutral protease in the food and detergent sector.

Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura del testo e dagli esempi che seguono. Further objects of the present invention will become evident from a reading of the text and from the following examples.

In particolare, mutanti della proteasi neutra secondo la presente invenzione sono caratterizzati dal fatto che il residuo amminoacidico Asp in posizione 226 della sequenza amminoacidica della protessi neutra è sostituito con un residuo differente scelto tra gli amminoacidi naturali. In particular, mutants of the neutral protease according to the present invention are characterized in that the amino acid residue Asp in position 226 of the amino acid sequence of the neutral protease is substituted with a different residue selected from the natural amino acids.

Preferiti secondo la presente invenzione sono i mutanti della protessi neutra in cui il residuo amminoacidico Asp226 è sostituito con il residuo amminoacidico Asparagina (Asn). Preferred according to the present invention are the mutants of the neutral protect in which the amino acid residue Asp226 is replaced with the amino acid residue Asparagine (Asn).

In accordo con la presente invenzione la numerazione adottata è quella della termolisina, enzima prodotto da B .thermoproteoliticus molto simile alla protessi neutra, mediante allineamento delle sequenze amminoacidiche (Toma, S. et al., (1989), Pro. Eng., 12: 359-364). In accordance with the present invention, the numbering adopted is that of thermolysin, an enzyme produced by B.thermoproteoliticus very similar to the neutral protessi, by aligning the amino acid sequences (Toma, S. et al., (1989), Pro. Eng., 12 : 359-364).

Mutanti della protessi neutra in accordo con la presente invenzione vengono preparati mediante un procedimento che comprende: Mutants of the neutral protect according to the present invention are prepared by a process which comprises:

a) l'introdurre una mutazione in un sito specifico del gene codificante la proteasi neutra utilizzando la tecnica di mutagenesi in vitro; a) introducing a mutation in a specific site of the gene encoding the neutral protease using the in vitro mutagenesis technique;

b) il clonare il gene mutagenizzato ottenuto nello stadio a) in un vettore di clonaggio ad espressione e secrezione in Bacillus; b) cloning the mutagenized gene obtained in step a) in a cloning vector with expression and secretion in Bacillus;

c) il trasformare un ceppo di Bacillus con il vettore ricombinante ottenuto nello stadio b); c) transforming a Bacillus strain with the recombinant vector obtained in step b);

d) il coltivare in ambiente di coltura adatto il ceppo di Bacillus trasformato come nello stadio c); ed infine d) the cultivation of the Bacillus strain transformed as in step c) in a suitable culture medium; and finally

e) il separare e purificare dal mezzo di coltura il mutante della proteasi neutra ottenuto. Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione, la mutazione in un sito ben determinato del gene può essere introdotta utilizzando una delle tecniche note di mutagenesi in vitro. Fra le diverse tecniche che producono modificazioni mirate su una sequenza di DNA, le più diffuse sono quelle che impiegano oligonucleotidi sintetici a singola elica. e) separating and purifying the obtained neutral protease mutant from the culture medium. In step a) of the process of the present invention, the mutation in a well determined site of the gene can be introduced using one of the known techniques of in vitro mutagenesis. Among the different techniques that produce targeted modifications on a DNA sequence, the most common are those that use single-stranded synthetic oligonucleotides.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione è stato impiegato il metodo descritto da Zoller, M.J. e Smith, M.,(1982), Nucl.Acid.Res., H3, 6487-6500) che comprende: According to an embodiment of the present invention, the method described by Zoller, M.J. and Smith, M., (1982), Nucl.Acid.Res., H3, 6487-6500) which includes:

1) l'inserire il gene della proteasi neutra o parte di questo (sequenza bersaglio) in un fago tipo M13 o in un plasmide da esso derivato e prepararlo nella forma a singolo filamento utile come "stampo" (templato) per la sintesi di quello mutato; 1) insert the neutral protease gene or part of it (target sequence) in a phage type M13 or in a plasmid derived from it and prepare it in the single-stranded form useful as a "template" for the synthesis of that changed;

2) il sintetizzare un oligonucleotide complementare alla sequenza da mutagenizzare ad eccezione di una porzione interna che determina la mutazione; 2) synthesizing an oligonucleotide complementary to the sequence to be mutagenized with the exception of an internal portion that determines the mutation;

3) il procedere all'accoppiamento ( "annealing") dell 'oligonucleotide sintetico allo "stampo". Esso farà da "primer" per la sintesi del secondo filamento modificato; 3) proceeding with the coupling ("annealing") of the synthetic oligonucleotide to the "mold". It will act as a "primer" for the synthesis of the second modified strand;

4) il ricostituire, mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica, di cui un filamento è quello parentale, mentre l'altro porta la mutazione desiderata; 4) reconstituting, by means of a step of polymerization and ligation in vitro, the circular double helix structure, of which one filament is the parental one, while the other carries the desired mutation;

5) l'impiegare la forma a doppia elica per trasformare cellule ospiti rese competenti ottenendo una popolazione di cloni mutanti e wild type; 5) the use of the double helix form to transform host cells made competent by obtaining a population of mutant and wild type clones;

6) il selezionare i cloni mutanti mediante ibridizzazione con oligonucleotidi specifici, sequenziamento dei cloni ottenuti o analisi di restrizione. 6) the selection of the mutant clones by hybridization with specific oligonucleotides, sequencing of the obtained clones or restriction analysis.

Per quanto riguarda il gene della protessi neutra da mutagenizzare, questo può essere isolato da specie differenti di Bacillus. As for the neutral protected gene to be mutagenized, this can be isolated from different Bacillus species.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione il gene della proteasì neutra e le sequenze che ne regolano la sua espressione e secrezione viene isolato da un ceppo di B.subtilis overproduttore di proteasi neutra e clonato nel plasmide pSM127. Tale plasmide, depositato come B.subtilis SMS108 NRRL B-15900, comprende il replicone di B.subtilis ed il gene che codifica per la resistenza alla kanamicina come marcante per la selezione dei trasformanti. According to a preferred embodiment of the present invention, the neutral protease gene and the sequences that regulate its expression and secretion are isolated from a strain of B.subtilis overproducing neutral protease and cloned in the pSM127 plasmid. This plasmid, deposited as B.subtilis SMS108 NRRL B-15900, includes the replicon of B.subtilis and the gene that codes for resistance to kanamycin as a marker for the selection of transformants.

In accordo con la presente invenzione il frammento BamHI-HindlII di circa 1550 coppie di basi, comprendente la sequenza nucleotidica che codifica la proteasi neutra matura e parte della regione pro del gene della proteasi neutra, viene isolato dal plasmide pSM127 NRRL B-15900 mediante digestione con gli enzimi di restrizione BamHI e HindiII. According to the present invention, the BamHI-HindlII fragment of about 1550 base pairs, comprising the nucleotide sequence encoding the mature neutral protease and part of the pro region of the neutral protease gene, is isolated from the pSM127 NRRL B-15900 plasmid by digestion with the restriction enzymes BamHI and HindiII.

Quindi il frammento è introdotto nel fago M13mp8, previamente digerito con gli enzimi di restrizione sopra riportati, mediante ligazione in miscela dì ligasi operando secondo tecniche note. The fragment is then introduced into the phage M13mp8, previously digested with the restriction enzymes reported above, by ligation in a mixture of ligases operating according to known techniques.

La miscela viene impiegata per trasformare cellule di Escherichia coli (E.coli) rese competenti come descritto da Dagert, M. e Ehrlich (1979), (Gene, 6: 23) ed i trasformanti sono poi selezionati su terreno di coltura adatto. The mixture is used to transform Escherichia coli (E.coli) cells made competent as described by Dagert, M. and Ehrlich (1979), (Gene, 6: 23) and the transformants are then selected on suitable culture medium.

Dopo aver preparato il filamento a singola elica da una delle placche positive, questo è utilizzato come templato per introdurre la mutazione desiderata. In particolare per introdurre la sostituzione Asp — > Asn in posizione 226 viene impiegato il seguente oligonucleotide sintetico: After preparing the single helix strand from one of the positive plates, this is used as a template to introduce the desired mutation. In particular, the following synthetic oligonucleotide is used to introduce the Asp -> Asn substitution in position 226:

La sintesi di tale oligonucleotide è condotta secondo metodiche note utilizzando un sintetizzatore automatico. The synthesis of this oligonucleotide is carried out according to known methods using an automatic synthesizer.

Si procede quindi all ' "annealing" della singola elica all'oligonucleotide sintetico che farà da "primer" per la sintesi del secondo filamento modificato. We then proceed with the "annealing" of the single helix to the synthetic oligonucleotide which will act as a "primer" for the synthesis of the second modified strand.

Dopo aver effettuato la mutazione desiderata si ricostituisce, mediante un passaggio di polimerizzazione e ligazione in vitro, la struttura circolare a doppia elica della sequenza bersaglio, di cui un filamento è quello parentale, mentre l'altro porta la mutazione desiderata. After carrying out the desired mutation, the circular double-helix structure of the target sequence is reconstituted by means of an in vitro polymerization and ligation step, of which one strand is the parental one, while the other carries the desired mutation.

In accordo con la presente invenzione i geni mutagenizzati come sopra riportato possono quindi essere introdotti in un vettore di clonaggio ad espressione e secrezione in Bacillus posizionando correttamente detto gene sotto il controllo di sequenze che ne regolano l’espressione e secrezione nel ceppo ospite. In accordance with the present invention, the mutagenized genes as reported above can then be introduced into a cloning vector with expression and secretion in Bacillus by correctly positioning said gene under the control of sequences that regulate its expression and secretion in the host strain.

Vettori adatti allo scopo possono essere scelti tra plasmidi disponibili commercialmente o presso centri di raccolta autorizzati. Vectors suitable for this purpose can be chosen from plasmids available commercially or at authorized collection centers.

Preferibilmente viene impiegato il plasmide pSM127 NRRL B-15900. The pSM127 NRRL B-15900 plasmid is preferably used.

Detto plasmide viene digerito con gli enzimi di restrizione BamHI e HindlII, ed il frammento di DNA plasmidico di 6131 coppie di basi, contenente le sequenze di regolazione dell'espressione della protessi neutra e quella di secrezione, viene ligato al frammento di 1550 coppie di basi contenente il gene mutagenizzato. Said plasmid is digested with the restriction enzymes BamHI and HindlII, and the plasmid DNA fragment of 6131 base pairs, containing the regulating sequences of the expression of the neutral protect and that of secretion, is ligated to the fragment of 1550 base pairs containing the mutagenized gene.

I plasmidi ricombinanti risultanti vengono poi introdotti in un microorganismo ospite selezionato nel gruppo di B.subtills. The resulting recombinant plasmids are then introduced into a host microorganism selected in the B.subtills group.

Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione viene impiegato il ceppo B.subtilis SMS108 NRRL B-15898 che non esprime la protessi neutra wild type per la presenza di mutazioni che inattivano il gene cromosomale che codifica per questa. According to a preferred embodiment of the present invention, the B.subtilis SMS108 NRRL B-15898 strain is used, which does not express the neutral wild type protection due to the presence of mutations that inactivate the chromosomal gene that codes for it.

Nello stadio d) del procedimento della presente invenzione, si procede alla coltura di detti ceppi in un terreno adatto contenente fonti di carbonio, azoto e sali minerali ad una temperatura pari o circa pari a 37°C e per un periodo di tempo necessario ad ottenere il prodotto desiderato . In step d) of the process of the present invention, one proceeds to the culture of said strains in a suitable medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts at a temperature equal to or approximately equal to 37 ° C and for a period of time necessary to obtain the desired product.

Tipicamente i ceppi di B.subtilis SMS108 trasformati con il plasmide pSM127 (controllo), e con quelli contenenti il gene della protessi neutra mutagenizzato sono coltivati in terreno Veal Infusion (DIFCO), ad una temperatura di 37°C per 16 ore. Typically, strains of B.subtilis SMS108 transformed with the plasmid pSM127 (control), and with those containing the mutagenized neutral protein gene are cultured in Veal Infusion medium (DIFCO), at a temperature of 37 ° C for 16 hours.

I surnatanti, ottenuti dopo centrifugazione delle colture, hanno mostrato all'analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide (Laemmli, U.K.,(Nature,227, 680-685, 1970) un contenuto in protessi neutra da 50 a 100 mg/1, che rappresenta più dell'80% delle proteine totali secrete. The supernatants, obtained after centrifugation of the cultures, showed by electrophoretic analysis on polyacrylamide gel (Laemmli, U.K., (Nature, 227, 680-685, 1970) a content of neutral proteins from 50 to 100 mg / 1, which represents more than 80% of the total proteins secreted.

Mutanti secondo la presente invenzione possono essere purificati impiegando una o più tecniche cromatografiche convenzionali. Mutants according to the present invention can be purified using one or more conventional chromatographic techniques.

In accordo con la presente invenzione, operando come riportato nell'esempio 3 che segue si ottiene una purificazione dei mutanti superiore al 95%. In accordance with the present invention, by operating as reported in the following Example 3, a purification of the mutants higher than 95% is obtained.

L'attività enzimatica del mutante secondo la presente invenzione è stata determinata monitorando l’idrolisi del substrato aspecifico caseina, in accordo con il metodo descritto da Kunitz, M., (1947), J. Gen. Physiol., 30, 291. The enzymatic activity of the mutant according to the present invention was determined by monitoring the hydrolysis of the non-specific casein substrate, in accordance with the method described by Kunitz, M., (1947), J. Gen. Physiol., 30, 291.

Gli studi di attività enzimatica condotti a differenti pH, hanno evidenziato per il mutante valori di attività, a pH tra 7,5 e 10, da 2 a 5 volte superiori a quelli della protessi neutra wild type. The enzymatic activity studies carried out at different pHs, showed activity values for the mutant, at pH between 7.5 and 10, 2 to 5 times higher than those of the neutral wild type protected.

Sebbene l'invenzione venga descritta relativamente alla produzione di mutanti della proteasì neutra di B.subtilis, è evidente che essa può essere applicata alla modifica di proteasi neutre omologhe ottenute da altri microorganismi ed, in particolare, da altri ceppi di Bacillus. Although the invention is described in relation to the production of mutants of the B.subtilis neutral protease, it is evident that it can be applied to the modification of homologous neutral proteases obtained from other microorganisms and, in particular, from other Bacillus strains.

In accordo con la presente invenzione il plasmide pSM492 contenente la singola mutazione Asp226-Asn226 è stato depositato il 15.2.1994 presso il Central Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Olanda) come B.subtilis SMS369 CBS 125.94. According to the present invention, the pSM492 plasmid containing the single Asp226-Asn226 mutation was deposited on 02.15.1994 at the Central Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Holland) as B.subtilis SMS369 CBS 125.94.

Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare. The following experimental examples have the purpose of better illustrating the present invention without wanting to limit it.

Esempio 1 Example 1

Clonagglo del frammento BamHI-HindiII del gene codificante la proteasl neutra di B.subtilis nella forma replicativa del fago M13mp8 Cloning of the BamHI-HindiII fragment of the gene encoding the neutral proteasl of B.subtilis in the replicative form of the phage M13mp8

Il plasmide pSM127 NRRLB-15.900 (3 Mg), contenente il gene che codifica la proteasi neutra, viene digerito con 5 unità degli enzimi di restrizione BamHI e HindiII (Boehringer) a 37°C per 60 minuti. Dopo aver bloccato la reazione enzimatica a 65°C per 10 minuti, la miscela di reazione è caricata su gel di agarosio allo 0.8% e corsa a 100 volta per 2 ore. Quindi la banda BamHI-Hindi11 di 1500 coppie di basi (bp), comprendente la sequenza codificante la porzione matura della proteasi neutra e parte della regione Pro, viene elettroeluita utilizzando un apparecchio IBI modello UEA operando secondo le istruzioni del produttore. The plasmid pSM127 NRRLB-15.900 (3 Mg), containing the gene encoding the neutral protease, is digested with 5 units of the restriction enzymes BamHI and HindiII (Boehringer) at 37 ° C for 60 minutes. After stopping the enzymatic reaction at 65 ° C for 10 minutes, the reaction mixture is loaded onto 0.8% agarose gel and run at 100 times for 2 hours. Then the BamHI-Hindi11 band of 1500 base pairs (bp), comprising the sequence encoding the mature portion of the neutral protease and part of the Pro region, is electroeluted using a UEA model IBI apparatus operating according to the manufacturer's instructions.

500 ng del frammento di DNA corrispondente a questa banda sono ligati al vettore M13mp8 (750 ng) previamente digerito con gli enzimi di restrizione BamHI e HindlII (5 U). La reazione di ligasi è condotta in 50 μΐ di miscela contenente 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATF, 10 mM MgCl2, 10 mM Ditiotreitolo (DTT), in presenza di 4 U di T4 DNA ligasi, a 14°C per una notte. 500 ng of the DNA fragment corresponding to this band are ligated to the vector M13mp8 (750 ng) previously digested with the restriction enzymes BamHI and HindlII (5 U). The ligase reaction is carried out in 50 μΐ of a mixture containing 66 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM ATF, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol (DTT), in the presence of 4 U of T4 DNA ligase, at 14 ° C for one night.

Quindi la miscela di ligasi è impiegata per trasformare cellule di E.coli JM101 (BRL) rese competenti con 50 mM CaCl (Dagert, M. e Ehrlich (1979), Gene, 6:23). Then the ligase mixture is employed to transform E.coli JM101 (BRL) cells made competent with 50 mM CaCl (Dagert, M. and Ehrlich (1979), Gene, 6:23).

Successivamente i trasformanti sono selezionati su piastre di YT agar (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl) contenenti 40 μg/ml di X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolii- D-tiogaiactopiranoside) e 125 μg/ml di IPTG (isopropi1-beta-D-tiogalactopiranoside ). The transformants are then selected on YT agar plates (8 g / 1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g / 1 NaCl) containing 40 μg / ml of X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indole- D -thiogaiactopiranoside) and 125 μg / ml of IPTG (isopropi1-beta-D-thiogalactopiranoside).

Operando come sopra riportato si ottengono numerose placche ricombinanti positive (bianche) facilmente distinguibili da quelle non ricombinanti (blù). By operating as reported above, numerous positive (white) recombinant plaques are obtained, easily distinguishable from non-recombinant (blue) ones.

Allo scopo di verificare se l'inserimento del frammento BamHI-HindIII è avvenuto nell'orientamento desiderato, il DNA fagico a doppia elica (forma replicativa o RF) è isolato da alcune placche positive e digerito con l'enzima Bg1II (Boehringer). In order to verify if the insertion of the BamHI-HindIII fragment took place in the desired orientation, the double-stranded phage DNA (replicative form or RF) is isolated from some positive plaques and digested with the enzyme Bg1II (Boehringer).

Da una delle placche positive, che mostrava l'esatto inserimento, viene quindi preparato il DNA fagico a singola elica (SS) da utilizzare come templato nella fase di mutagenesi sito specifica. Esempio 2 Single-stranded phage DNA (SS) is then prepared from one of the positive plaques, showing correct insertion, to be used as a template in the site-specific mutagenesis step. Example 2

Mutaqenesi sito-specifica Site-specific mutating

Per la mutagenesi si utilizza il sistema "Oligonucleotide - directed in vitro mutagenesis version 2" (Amersham), basato sulla metodologia descritta da Zoller e Smith (1983, Methods in Enzymol ., 100: 468-500), operando secondo le indicazioni del produttore. For mutagenesis, the "Oligonucleotide - directed in vitro mutagenesis version 2" (Amersham) system is used, based on the methodology described by Zoller and Smith (1983, Methods in Enzymol., 100: 468-500), operating according to the manufacturer's instructions .

L*oligonucleotide impiegato per introdurre la mutazione Asp226 --> Asn226, ha la sequenza The oligonucleotide used to introduce the Asp226 -> Asn226 mutation, has the sequence

5' ACA GAT GAA GGC AAT TAT GGC GGT GTA 3' e viene sintetizzato mediante metodiche note utilizzando il sintetizzatore DNA Synthesizer Oligo 1000 (Beckman) . 5 'ACA GAT GAA GGC AAT TAT GGC GGT GTA 3' and is synthesized by known methods using the DNA Synthesizer Oligo 1000 (Beckman).

La selezione delle placche contenenti la mutazione Asp226Asn viene effettuata, previa preparazione del DNA a singola elica, mediante sequenza utilizzando come primer 1'oligonucleotide 5'TTA CGC CAA TTA CAG A 3'. Il metodo utilizzato per sequenziare il DNA è contenuto nel kit "Sequenase" (USB) ed è basato sulla metodologia descritta da Sanger et al. (Sanger, F. e Coulson, A.R., (1975), J.Mol.Biol., 94 =441-443). The selection of the plaques containing the Asp226Asn mutation is carried out, after preparation of the single-stranded DNA, by sequence using the 5'TTA CGC CAA TTA CAG A 3 'oligonucleotide as primer. The method used to sequence DNA is contained in the "Sequenase" kit (USB) and is based on the methodology described by Sanger et al. (Sanger, F. and Coulson, A.R., (1975), J.Mol.Biol., 94 = 441-443).

Esempio 3 Example 3

Clonagqio del frammento BamHI-HindIII mutato nel plasmide p5M127 Cloning of the mutated BamHI-HindIII fragment in the p5M127 plasmid

Il plasmide pSM127 (10 μg) viene digerito con gli enzimi di restrizione BamHI e HindlII (5 U) a 37°C per 1 ora. The pSM127 plasmid (10 μg) is digested with the restriction enzymes BamHI and HindlII (5 U) at 37 ° C for 1 hour.

Dopo aver bloccato la reazione incubando per 10 minuti a 65°C, il DNA viene trattato con fenolo - cloroformio (1:1), precipitato da EtOH come già descritto precedentemente e quindi risospeso in 200 μΐ del tampone di corsa per i gradienti di saccarosio (30 mM Tris - HC1 pH8, 10 mM EDTA ed 1M NaCl) al fine di allontanare il frammento di DNA contenente il gene della protessi w.t.. After stopping the reaction by incubating for 10 minutes at 65 ° C, the DNA is treated with phenol - chloroform (1: 1), precipitated from EtOH as previously described and then resuspended in 200 μΐ of the running buffer for sucrose gradients. (30 mM Tris - HC1 pH8, 10 mM EDTA and 1M NaCl) in order to remove the DNA fragment containing the protein w.t ..

I gradienti vengono preparati utilizzando soluzioni al 5% ed al 20% di saccarosio nel tampone di corsa, mediante un formatore di gradienti (Buchler Auto Densi - Flow IIC). Il volume totale del gradiente è di 16 ml. Il campione viene applicato alla superficie dei gradienti e corso per 20 ore nel rotore SW28 a 25.000 rpm, ad una temperatura di 20°C, in una ultracentrifuga L8 - M (Beckman). Dopo la corsa il gradiente viene frazionato prelevando dalla superficie 40 frazioni da 400 μΐ ciascuna. Un decimo del volume di ogni frazione viene caricato su gel di agarosio e, separatamente, si raccolgono le frazioni contenenti il solo vettore proveniente dal pSM127. Dette frazioni vengono poi diluite 1:1 con H2O e precipitate da EtOH. The gradients are prepared using 5% and 20% sucrose solutions in the running buffer, using a gradient former (Buchler Auto Densi - Flow IIC). The total volume of the gradient is 16 ml. The sample is applied to the surface of the gradients and run for 20 hours in the SW28 rotor at 25,000 rpm, at a temperature of 20 ° C, in an L8 - M ultracentrifuge (Beckman). After the run, the gradient is fractionated by taking 40 fractions of 400 μΐ each from the surface. One tenth of the volume of each fraction is loaded onto agarose gel and, separately, the fractions containing only the vector coming from pSM127 are collected. Said fractions are then diluted 1: 1 with H2O and precipitated by EtOH.

Dopo aver risospeao i frammenti in H2O, si effettua una reazione di ligasi utilizzando 500 ng del vettore pSM127 e 1,5 pg del DNA fagico mutato previamente digerito con gli enzimi di restrizione Hindi II e BamHI. La reazione di ligasi è condotta in 20 μl di tampone di ligasi, in presenza di T4 DNA ligasi (2 U), a 16°C per 16 ore. After resospecting the fragments in H2O, a ligase reaction is carried out using 500 ng of the pSM127 vector and 1.5 µg of the mutated phage DNA previously digested with the restriction enzymes Hindi II and BamHI. The ligase reaction is carried out in 20 μl of ligase buffer, in the presence of T4 DNA ligase (2 U), at 16 ° C for 16 hours.

Quindi, la miscela di ligasi viene impiegata per trasformare cellule di B.subtilis SMS108 NRRLB-15.898 rese competenti secondo il metodo descritto da S. Bron ( "Molecular and biological methods for Bacillus" ed by C.R. Harwood and S.M. Cutting, John Wiley and Sons, 1990). Then, the ligase mixture is used to transform B.subtilis SMS108 NRRLB-15,898 cells made competent according to the method described by S. Bron ("Molecular and biological methods for Bacillus" ed by C.R. Harwood and S.M. Cutting, John Wiley and Sons , 1990).

I trasformanti vengono poi selezionati su piastre di terreno VY (0,8% Bacto triptone, 0,5% Estratto di lievito, 0,5% NaCl, agar 18 g/1) contenenti 1% di caseina e 5 Mg/ml di Kanamicina (Km). The transformants are then selected on plates of VY medium (0.8% Bacto tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 18 g / 1 agar) containing 1% casein and 5 Mg / ml of Kanamycin. (Km).

La selezione dei cloni contenenti la mutazione in pSM127 viene effettuata mediante sequenza del DNA utilizzado il kit "Sequenase". Il nuovo plasmide mutato è stato denominato pSM492 ed il ceppo di B.subtilis che lo contiene SMS369. The selection of the clones containing the mutation in pSM127 is carried out by DNA sequence using the "Sequenase" kit. The new mutated plasmid was named pSM492 and the B.subtilis strain containing it SMS369.

Esempio 4 Example 4

Espressione e secrezione della protessi neutra mutata . Expression and secretion of the mutated neutral protessi.

Il ceppo di B.subtilis SMS369 viene coltivato, per 16 ore a 37°C, in 11 di terreno avente la seguente composizione: 2,5 % Veal Infusion Broth (DIFCO), 0,5 % Estratto di lievito, 5 μg/ml di Km. Quindi la coltura viene centrifugata a 5000 rpm per 10 minuti (rotore SJ14, Beckman) ed una aliquota del supernatante acellulare viene analizzata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (Laemmli, U.K., (1970), Nature 227: 680-685) per determinare il contenuto proteico. The strain of B.subtilis SMS369 is cultivated, for 16 hours at 37 ° C, in 11 of medium having the following composition: 2.5% Veal Infusion Broth (DIFCO), 0.5% Yeast extract, 5 μg / ml of Km. Then the culture is centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes (SJ14 rotor, Beckman) and an aliquot of the acellular supernatant is analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli, U.K., (1970), Nature 227: 680-685) to determine the protein content.

Si ottengono concentrazioni di 50-100 mg/1 di protessi mutata, che rappresentano più dell'80% delle proteine totali extracellulari. Concentrations of 50-100 mg / 1 of mutated protein are obtained, which represent more than 80% of the total extracellular proteins.

Esempio 5 Example 5

Purificazione degli enzimi Purification of enzymes

La protessi neutra mutata ottenuta come riportato nell'Esempio 4 viene purificata mediante due passaggi cromatografici: cromatografia di scambio ionico su S-SepharoseR e cromatografia di affinità su Gly-D-Phe-Sepharose, operando a 4°C e con flussi di 30 ml/cm/ora. The mutated neutral protein obtained as reported in Example 4 is purified by means of two chromatographic steps: ion exchange chromatography on S-SepharoseR and affinity chromatography on Gly-D-Phe-Sepharose, operating at 4 ° C and with flows of 30 ml / cm / hour.

A) Cromatografia a scambio cationico su SSepharose<R>A) Cation exchange chromatography on SSepharose <R>

100 mi del surnatante vengono portati ad una concentrazione di 1 mM PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro, inibitore delle proteasi seriniche) ed a pH 5 con Na-Acetato 3 M, pH 4,8. 100 ml of the supernatant are brought to a concentration of 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride, inhibitor of serine proteases) and to pH 5 with 3 M Na-Acetate, pH 4.8.

Si dializza estensivamente contro 10 mM Na-Acetato pH 5, 2,5 mM CaCl2 e si controlla la conduttività finale, che non deve superare i 3-4 mS/cm. Quindi la soluzione viene caricata su colonna S-Sepharose CIO (Pharmacia, 1 x 8 cm) equilibrata in tampone 20 mM Na-Acetato pH 6, 5 mM CaCl2 · Dopo lavaggio con 3 volumi di colonna, si eluisce l'enzima con 200 mM NaCl nello stesso tampone di equilibratura e si raccolgono le frazioni (5 mi ciascuna) che mostrano una attività enzimatica. Extensively dialyzes against 10 mM Na-Acetate pH 5, 2.5 mM CaCl2 and the final conductivity is checked, which must not exceed 3-4 mS / cm. The solution is then loaded onto the S-Sepharose CIO column (Pharmacia, 1 x 8 cm) equilibrated in 20 mM Na-Acetate pH 6, 5 mM CaCl2 buffer.After washing with 3 volumes of column, the enzyme is eluted with 200 mM NaCl in the same equilibration buffer and the fractions (5 ml each) which show enzymatic activity are collected.

b) Cromatografia di affinità su Gly-D-Phe b) Affinity chromatography on Gly-D-Phe

Si opera in accordo al metodo di Walsh e coll. (1974, Methods Enzymol., 3_4: 435-440) che si basa sull'alta affinità dell1inibitore competitivo Z-Gly-D-Phe (N-carbobenzossi-glicil-D-fenilalanina) verso le metalloproteasi. It works according to the method of Walsh et al. (1974, Methods Enzymol., 3_4: 435-440) which is based on the high affinity of the competitive inhibitor Z-Gly-D-Phe (N-carbobenzoxy-glycyl-D-phenylalanine) towards metalloproteases.

Le frazioni proteiche provenienti dallo stadio a) vengono caricate in una colonna cromatografica (1 x 2 cm) Sepharose<R >4B legata covalentemente al gruppo Gly-D-Phe e condizionata in tampone 20 mM Na-Acetato pH 6, contenente 10 mM CaCl2 e 10% (v/v) isopropanolo. Su 2 mi di resina vengono caricati da 7 a 10 ml di soluzione proteica. Dopo lavaggio della colonna con 30 mi dello stesso tampone, l'enzima viene eluito in 4-6 mi di 2,5 M NaCl in 20 mM Na-Acetato pH 6, 10 mM CaCl2, 10% v/v di isopropanolo. La protessi purificata viene conservata a -80°C nel tampone di eluizione. I risultati dell' anlaisi - riportat L'analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide al 12.5% (SDS-PAGE) degli enzimi purificati PN wild type (corsia 2) e mutante Asn226->Asp (corsia 3) mostra una purezza dei prodotti così ottenuti superiore al 95% ed una resa, rispetto al grezzo di partenza di circa il 70%, in corsia 1 sono riportati gli standard di pesi molecolari (figura 1). The protein fractions from step a) are loaded into a chromatographic column (1 x 2 cm) Sepharose <R> 4B covalently linked to the Gly-D-Phe group and conditioned in a 20 mM Na-Acetate pH 6 buffer, containing 10 mM CaCl2 and 10% (v / v) isopropanol. 7 to 10 ml of protein solution are loaded onto 2 ml of resin. After washing the column with 30 ml of the same buffer, the enzyme is eluted in 4-6 ml of 2.5 M NaCl in 20 mM Na-Acetate pH 6, 10 mM CaCl2, 10% v / v of isopropanol. The purified protein is stored at -80 ° C in the elution buffer. The results of the analysis - reported The electrophoretic analysis on 12.5% polyacrylamide gel (SDS-PAGE) of the purified enzymes PN wild type (lane 2) and mutant Asn226-> Asp (lane 3) shows a purity of the products thus obtained higher than 95% and a yield, with respect to the starting crude of about 70%, in lane 1 the molecular weight standards are reported (figure 1).

Esempio 6 Example 6

Determinazione dell'attività enzimatica su caseina L’attività enzimatica si determina monitorando l'idrolisi del substrato caseina come descritto da Kunitz, M., (1947), J. Gen. Phisiol., 30: 291 modificato da Fujii e coll. (Fujii,M. et al. (1983) J. Bacteriol.154; 831-837). Determination of enzymatic activity on casein The enzymatic activity is determined by monitoring the hydrolysis of the casein substrate as described by Kunitz, M., (1947), J. Gen. Phisiol., 30: 291 modified by Fujii and coll. (Fujii, M. Et al. (1983) J. Bacteriol. 154; 831-837).

Viene preparata una soluzione allo 0,8 % di caseina in tampone 50 mM Tris-HCl pH 7,1, 2,5 mM Ca-Acetato, 0,02% di Na3N. A 0.8% solution of casein in buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.1, 2.5 mM Ca-Acetate, 0.02% Na3N is prepared.

Quindi a 750 μΐ di detta soluzione vengono addizionati 100 μl di soluzione enzimatica purificata. Dopo 60 minuti di incubazione a 37°C la reazione viene bloccata aggiungendo 750 μΐ di una soluzione 220 mM Na-acetato, 1,63 % (w/v) di acido tricoloroacetico e 1,89% (v/v) di acido acetico. Then 100 μl of purified enzymatic solution are added to 750 μΐ of said solution. After 60 minutes of incubation at 37 ° C the reaction is stopped by adding 750 μΐ of a 220 mM Na-acetate solution, 1.63% (w / v) of trichloroacetic acid and 1.89% (v / v) of acetic acid .

Dopo aver centrifugato la miscela risultante per 10 minuti a 12.000 rpm, si effettua la lettura spettrofotometrica del surnatante a OD 275 nm contro un bianco costituito da caseina non idrolizzata dall'enzima. Si osserva linearità tra concentrazione enzimatica e densità ottica nell'intervallo di lettura compreso tra 0,45 e 0,7. After having centrifuged the resulting mixture for 10 minutes at 12,000 rpm, the spectrophotometric reading of the supernatant is carried out at OD 275 nm against a blank consisting of casein not hydrolyzed by the enzyme. Linearity is observed between enzymatic concentration and optical density in the reading range between 0.45 and 0.7.

Una unità (1 U) di enzima viene definita come la quantità che determina un aumento di OD di 0,001 per minuto. Le unità/ml si calcolano come Delta OD x 1000/volume di enzima in μl x 1/0,001 x l/tempo di incubazione. L'attività specifica viene espressa come Unità/mg (U/mg) di proteina. One unit (1 U) of enzyme is defined as the amount that causes an OD increase of 0.001 per minute. Units / mL are calculated as Delta OD x 1000 / enzyme volume in μl x 1 / 0.001 x L / incubation time. Specific activity is expressed as Units / mg (U / mg) of protein.

Esempio 7 Example 7

Effetto del pH sull'attività dell'enzima mutato Per questi esperimenti viene utilizzato il saggio su caseina sopra descritto. In questo caso vengono preparate più soluzioni di caseina allo 0,8% a pH diversi. I tamponi, che vengono usati alla concentrazione di 50 mM, sono: PIPES (Piperazina-1,4-bis(acido etansolfonico) per l'intervallo di pH compreso tra 5,4 e 7,2, Tris-HC1 per valori di pH da 7,2 a 9,4 e CAPS {acido 3 (cicloesilammino)-1-propansolfonico) per valori di pH da 9,4 a 11. Effect of pH on the activity of the mutated enzyme The casein assay described above is used for these experiments. In this case, several 0.8% casein solutions are prepared at different pHs. The buffers, which are used at a concentration of 50 mM, are: PIPES (Piperazine-1,4-bis (ethanesulfonic acid) for the pH range between 5.4 and 7.2, Tris-HC1 for pH values from 7.2 to 9.4 and CAPS (3 (cyclohexylamino) -1-propane sulfonic acid) for pH values from 9.4 to 11.

Gli enzimi wild type ed il mutante Asp226-Asn226 vengono saggiati, rispettivamente, alle concentrazioni di 1,73 e 4,21 μg/ml. Dai valori di OD ottenuti vengono calcolate le attività specifiche di ogni enzima nelle diverse condizioni di pH. Wild type enzymes and the Asp226-Asn226 mutant are tested at concentrations of 1.73 and 4.21 μg / ml, respectively. The specific activities of each enzyme under different pH conditions are calculated from the OD values obtained.

La tabella I mostra il percento dell'attività residua dell'enzima mutato a diversi valori di pH, confrontato con i dati relativi all'enzima wild type. Table I shows the percent of the residual activity of the mutated enzyme at different pH values, compared with the data for the wild type enzyme.

Tabella I Table I.

Come si può osservare, a pH 10, mentre l'enzima wild type mantiene il 3% della sua attività misurata a pH7,2, il mutante Asp226Asn conserva circa il 42% dell'attività. Tenendo conto che a pH 7,0 l'attività del wild type è circa 3 volte superiore a quella del mutante (80.000 U/mg contro 28.000 U/mg), il mutante Asp226Asn è circa 5 volte più attivo del wild type a pH 10. As can be seen, at pH 10, while the wild type enzyme maintains 3% of its activity measured at pH7.2, the Asp226Asn mutant retains about 42% of the activity. Taking into account that at pH 7.0 the activity of the wild type is about 3 times higher than that of the mutant (80,000 U / mg against 28,000 U / mg), the Asp226Asn mutant is about 5 times more active than the wild type at pH 10 .

Mentre la perdita di attività a pH 7,0 del mutante rispetto al wild type non è molto rilevante da un punto di vista applicativo (28.000 U/mg è infatti una attività specifica idonea a molte delle applicazioni dell'enzima), molto importante risulta il guadagno da 2.400 U/mg a 12.000 U/mg che si ottiene a pH 10 con l'enzima mutato. While the loss of activity at pH 7.0 of the mutant compared to the wild type is not very relevant from an application point of view (28,000 U / mg is in fact a specific activity suitable for many of the enzyme's applications), the gain from 2,400 U / mg to 12,000 U / mg obtained at pH 10 with the mutated enzyme.

Claims

CLAIMS 1. A mutant of the neutral protease with an enzymatic activity in a pH range between 6.0 and 10.0 characterized in that the amino acid residue Asp226 of the amino acid sequence of the wild type neutral protease is replaced with a different residue chosen in the group of natural amino acids.

2. The mutant of the neutral protease according to claim 1, wherein the natural amino acid residue is L-Asparagine

Mutagenized neutral protease gene encoding a neutral protease mutant according to claim 1.

4. The mutagenized neutral protease gene according to claim 3, which encodes the mutant of the neutral protease in which the amino acid residue Asp226 of the wild type neutral protease sequence is replaced with the amino acid residue L-Asparagine.

5. A plasmid with expression and secretion in Bacillus comprising the mutagenized gene according to claim 3, a marker for the selection of transformants and a replicon which allows its replication in Bacillus.

6. The pSM492 plasmid according to claim 5, characterized in that the mutagenized gene encodes the mutant of the neutral protease in which the amino acid residue Asp226 is replaced with the amino acid residue L-Asparagine.

7. The plasmid according to claim 6 deposited as CBS 125.94.

8. A microorganism selected from the Bacillus group transformed with a plasmid according to claim 5.

The microorganism according to claim 7, wherein Bacillus is Bacillus subtllis SMS108 NRRL B-15B98.

10. The microorganism according to claim 9, which is Bacillus subtilis SMS369 CBS 125.94.

11. Process for the preparation of a mutant of the neutral protease according to claim 1, which comprises: a) the cultivation of a Bacillus strain transformed with a plasmid according to claim 3, in a suitable culture medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts; And b) separating and purifying the mutant of the neutral protect thus obtained from the acellular culture medium.

12. The process according to claim 11, characterized in that the Bacillus strain is Bacillus subtilis SMS369 CBS 125.94.

13. Use of a mutant of the neutral protection according to claims 1 to 4 in the food and detergent sector.