ITMI931954A1

ITMI931954A1 - METHOD FOR PRODUCING 7-AMINOCEPHALOSPORANIC ACID BY DIRECT BIOCONVERSION THROUGH FREE ENZYMES RECOVERED BY ULTRAFILTRATION AND

Info

Publication number: ITMI931954A1
Application number: IT93MI001954A
Authority: IT
Inventors: Gianclaudio Masetto
Original assignee: Gianclaudio Masetto
Priority date: 1993-09-10
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 1995-03-10
Also published as: ITMI931954A0

Abstract

Metodo per produrre acido 7-amminocefalosporanico (7-ACA) per bioconversione, mediante enzimi liberi, di un substrato costituito dalla brodocoltura harvest di Cefalosporina C previa separazione, per ultrafiltrazione, dei microrganismi, degli enzimi e di altre sostanze presenti nella brodocoltura. Per aggiunta al permeato di enzima D-amminoacidossidasi libero, operando secondo corrette modalità, si ottiene glutaril 7-ACA. L'enzima è recuperato mediante ultra filtrazione e reimpiegato. Per aggiunta di enzima glutarilacilasi libero al permeato, operando con corrette modalità, si ottiene 7-ACA. Si recupera anche il secondo enzima per ultrafiltrazione. Il prodotto viene separato preferenzialmente con processi basati su assorbimento su resine a scambio ionico o adsorbenti, oppure per concentrazione termica e successiva cristallizzazione con acido o solvente. come substrato si può utilizzare direttamente la brodocoltura tal quale. Il metodo, basato sull'impiego di enzimi liberi poi recuperati mediante ultrafiltrazione e riutilizzati, è applicabile in altri processi di biotecnologia industriale.Method for producing 7-amino-cephalosporanic acid (7-ACA) by bioconversion, by free enzymes, of a substrate consisting of the harvested broth culture of Cephalosporin C after separation, by ultrafiltration, of microorganisms, enzymes and other substances present in broth culture. By addition to the free enzyme D-amino acid oxidase permeate, by operating in the correct manner, glutaryl 7-ACA is obtained. The enzyme is recovered by ultra filtration and reused. By adding free glutarylacylase enzyme to the permeate, operating in the correct way, 7-ACA is obtained. The second enzyme is also recovered by ultrafiltration. The product is preferably separated by processes based on absorption on ion exchange resins or adsorbents, or by thermal concentration and subsequent crystallization with acid or solvent. as a substrate, broth culture as such can be used directly. The method, based on the use of free enzymes then recovered by ultrafiltration and reused, is applicable in other industrial biotechnology processes.

Description

TITOLO: TITLE:

METODO PER PRODURRE ACIDO 7-AMMINOCEFALOSPORANICO PER BIOCONVERSIONE DIRETTA, MEDIANTE ENZIMI LIBE-RI RECUPERATI PER ULTRAFILTRAZIONE E REIMPIEGATI, DELLA SOLUZIONE PERMEATA DALL'ULTRAFILTRAZIONE DI BRODOCOLTURA HARVEST DI CEFALOSPORINA C. METHOD FOR PRODUCING 7-AMINOCEPHALOSPORANIC ACID BY DIRECT BIOCONVERSION, BY MEANS OF LIBE-RI ENZYMES RECOVERED BY ULTRAFILTRATION AND RE-USED, OF THE SOLUTION PERMEATED BY THE ULTRAFILTRATION OF HARVEST BRODOCULTURE OF CEPHALOSPORIN C.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE DESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invenzione ? un metodo ampiamente integrato per la produzione, nella sua applicazione pi? generale, di intermedi e di prodotti medicinali ottenuti per bioconversione enzimatica da substrati naturali o da sostanze precedentemente prodotte per biosintesi o per sintesi chimica e, nella sua applicazione specifica considerata dalla presente domanda di brevetto, per la preparazione di acido 7-amminocefalosporanico (7-ACA). Il metodo si applica a bioconversioni in unico stadio, con uno o pi? enzimi usati contemporaneamente come pure in pi? stadi con 1'impiego di pi? enzimi, sfruttando per ogni stadio di bioconversione la specificit? catalitica degli enzimi stessi. The present invention? a widely integrated method for the production, in its application pi? general, of intermediates and medicinal products obtained by enzymatic bioconversion from natural substrates or substances previously produced by biosynthesis or chemical synthesis and, in its specific application considered by this patent application, for the preparation of 7-aminocephalosporanic acid (7- ACA). The method applies to single-stage bioconversions, with one or more? enzymes used simultaneously as well as in pi? stadiums with the use of pi? enzymes, exploiting the specificity for each stage of bioconversion catalytic of the enzymes themselves.

Non importa quali siano i microrganismi a loro volta impiegati per la produzione degli enzimi per via fermentativa, o la tecnica di recupero e isolamento degli stessi dalle brodoculture. Condizione essenziale ? ovviamente l'utilizzo di enzimi specifici adatti per ogni bioconversione che si intende realizzare, preparati con le migliori tecniche note per ottenerli quanto pi? possibile puri, fisicamente e chimicamente integri, cos? che ne sia salvaguardata l'attivit? catalitica e ogni altra loro peculiare caratteristica (selettivit?, ecc). It does not matter which microorganisms are in turn used for the production of enzymes by fermentation, or the technique of recovery and isolation of the same from brothocultures. Essential condition? obviously the use of specific enzymes suitable for each bioconversion to be carried out, prepared with the best known techniques to obtain them as much as possible? possible pure, physically and chemically intact, cos? that the activity is safeguarded? catalytic and all their other peculiar characteristics (selectivity, etc.).

Caratteristica del presente metodo ? l?uso di enzimi liberi, in forma di soluzione, che vengono aggiunti nelle giuste quantit? ai substrati da bioconvertire . Feature of this method? the use of free enzymes, in the form of a solution, which are added in the right quantities? to the substrates to be bioconverted.

Effettuata la bioconversione nelle condizioni chimico-fisiche ottimali e con le modalit? operative previste, si procede al recupero dell'enzima utilizzato mediante ultrafiltrazione della soluzione. Cos? l'enzima, ottenuto ancora in forma di soluzione, pu? essere successivamente reiropiegato per la stessa bioconversione, eventualmente integrato con enzima fresco per mantenere inalterata la cinetica di bioconversione. E' necessario che in ogni fase delle attivit? di recupero e stoccaggio dell'enzima vengano mantenute condizioni ottimali per la conservazione della sua attivit?. Il riutilizzo pu? essere ripetuto per pi? cicli, finch? l'attivit? si mantiene a livelli tollerabili e sussiste la convenienza economica per il reimpiego dell'enzima. Carried out the bioconversion in the optimal chemical-physical conditions and with the modalities? operational foreseen, the enzyme used is recovered by ultrafiltration of the solution. What? the enzyme, still obtained in the form of a solution, can? be subsequently re-folded for the same bioconversion, possibly integrated with fresh enzyme to maintain the bioconversion kinetics unaltered. It is necessary that in every phase of the activities? optimal conditions for the conservation of its activity are maintained for the recovery and storage of the enzyme. The reuse can? be repeated for more? cycles, until? the activity? it remains at tolerable levels and there is an economic advantage for the reuse of the enzyme.

La procedura di ultrafiltrazione consente di rimuovere , dalla soluzione contenente il principio attivo, gli enzimi stessi e altre sostanze ad elevato peso molecolare che potenzialmente costituiscono dei pirogeni di difficile eliminazione nelle successive fasi di isolamento e separazione del principio attivo. Le membrane per l'ultrafiltrazione vengono selezionate per un taglio molecolare pari a 10.000. The ultrafiltration procedure allows to remove, from the solution containing the active ingredient, the enzymes themselves and other substances with a high molecular weight that potentially constitute pyrogens that are difficult to eliminate in the subsequent phases of isolation and separation of the active ingredient. Membranes for ultrafiltration are selected for a molecular cut of 10,000.

Il metodo pu? essere applicato in modo particolarmente vantaggioso per la produzione di acido 7-amminocefalosporanico (7-ACA), intermedio essenziale per la produzione di cefalosporine, che costituiscono una delle pi? importanti famiglie di antibiotici. The method can? be applied in a particularly advantageous way for the production of 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), an essential intermediate for the production of cephalosporins, which constitute one of the most? important families of antibiotics.

Esistono numerosi brevetti per ottenere per via enzimatica tale prodotto, partendo da substrati costituiti da soluzioni di Cefalosporina C, e composti derivati, preventivamente sottoposta a processi di purificazione e isolamento a vari gradi di severit? ed efficacia con tecniche note quali l'assorbimento su resine, l'osmosi inversa, la concentrazione e precipitazione in solvente, l'estrazione con solvente ecc. There are numerous patents to obtain this product by enzymatic way, starting from substrates consisting of solutions of Cephalosporin C, and derived compounds, previously subjected to purification and isolation processes at various degrees of severity. and effectiveness with known techniques such as absorption on resins, reverse osmosis, concentration and precipitation in solvent, extraction with solvent, etc.

Tali soluzioni di Cefalosporina C purificata, o di sali alcalini di Cefalosporina C, a vari livelli di concentrazione, vengono portate a contatto di enzimi (catalasi, D-amminoacidossidasi, deacilasi, amidasi, D-amminoacidotransaminasi , deidrogenasi, idrolasi ecc. in funzione del processo applicato) preparati partendo da microrganismi di varia specie e secondo varie tecniche di isolamento e precipitazione. Tali enzimi, se usati liberi, vengono aggiunti al substrato, utilizzati nella bioconversione e non vengono recuperati. In alternativa gli enzimi vengono usati dopo averli fissati su supporto di varia forma e natura per poterTi riutilizzare in pi? batch di bioconversione. Nel primo caso il costo di produzione dell'enzima incide in modo significativo sul costo del 7-ACA, nel secondo caso deve essere sostenuto il costo del1'iromobilizzazione, particolarmente significativo per il prezzo del supporto, e per il decadimento dell'attivit? enzimatica al 15 ? 20% dell'attivit? originaria a seguito dell'operazione di immobilizzazione. Such solutions of purified Cephalosporin C, or alkaline salts of Cephalosporin C, at various concentration levels, are brought into contact with enzymes (catalase, D-aminoacidoxidase, deacylase, amidase, D-aminoacidotransaminase, dehydrogenase, hydrolase etc. applied process) prepared starting from microorganisms of various species and according to various techniques of isolation and precipitation. These enzymes, if used free, are added to the substrate, used in bioconversion and are not recovered. Alternatively, the enzymes are used after having fixed them on a support of various shapes and nature to be able to reuse them in more? bioconversion batch. In the first case, the production cost of the enzyme significantly affects the cost of 7-ACA, in the second case the cost of iromobilization must be borne, particularly significant for the price of the support, and for the decay of the activity. enzymatic at 15? 20% of the activity original following the immobilization operation.

Una volta ottenuto il 7-ACA con bioconversione in una sola fase o in due fasi, il prodotto viene recuperato e isolato per concentrazione e successiva precipitazione al punto isoelettrico , infine ridisciolto e ricristallizzato per ottenere la purezza prescritta per la sua commercializzazione. Once 7-ACA is obtained with bioconversion in one or two phases, the product is recovered and isolated by concentration and subsequent precipitation at the isoelectric point, finally redissolved and recrystallized to obtain the purity required for its marketing.

A differenza di quanto sopra descritto, il metodo oggetto della presente domanda di brevetto prevede: Unlike what has been described above, the method object of this patent application provides:

a) l?utilizzazione di un substrato costituito dalla soluzione di Cefalosporina C gual'? contenuta nella brodocoltura harvest, previa semplice separazione di microrganismi e macromo1eco 1e mediante la tecnica nota dell 'ultrafiltrafiltrazione, oppure l'utilizzo, come substrato, della stessa brodocoltura integrale (nel qual caso per? si perde la possibilit? di recuperare gli enzimi liberi utilizzati nella bioconversione); a) the use of a substrate consisting of the Cephalosporin C gual 'solution? contained in the harvest broth culture, after simple separation of microorganisms and macromo1eco 1e using the known technique of ultrafiltrafiltration, or the use, as substrate, of the same integral broth culture (in which case, however, the possibility of recovering the free enzymes used is lost in bioconversion);

b) l'effettuazione delle bioconversioni mediante enzimi liberi, che vengono recuperati con processi di ultrafiltrazione mediante membrane di taglio molecolare appropriato (escono nella fase ritenuta), e riutilizzati ripetutamente finch? ne sussista la convenienza economica, da valutare in funzione del progressivo decadimento dell'attivit? enzimatica. b) the carrying out of bioconversions using free enzymes, which are recovered with ultrafiltration processes using membranes of appropriate molecular cutting (they exit in the retained phase), and repeatedly reused until? there is the economic convenience, to be evaluated according to the progressive decay of the activity? enzymatic.

Ovviamente le rese di bioconversione non vengono alterate, n? i tempi di bioconversione si dilatano, n? si presentano problemi di qualit? o di maggiori consumi energetici o di reattivi. I costi connessi con i processi di separazione introdotti sono ampiamente compensati dai risparmi legati al recupero degli enzimi; c) il recupero del 7-ACA effettuato con tecnologie di assorbimento su resine, sia di adsorbimento che a scambio ionico cationico forte e anionico forte, e successiva singola cristallizzazione al punto isoelettrico; d) il recupero del 7-ACA effettuato con precipitazione in adatto solvente di minima solubilit? per il prodotto, previa concentrazione della soluzione permeata. Obviously the bioconversion yields are not altered, n? the times of bioconversion expand, n? quality problems arise? or greater energy consumption or reagents. The costs associated with the separation processes introduced are amply offset by the savings associated with the recovery of enzymes; c) 7-ACA recovery carried out with absorption technologies on resins, both adsorption and strong cationic and strong anionic ion exchange, and subsequent single crystallization at the isoelectric point; d) the recovery of 7-ACA carried out with precipitation in a suitable solvent of minimum solubility? for the product, after concentration of the permeated solution.

Sono evidenti i vantaggi offerti dal presente metodo: The advantages offered by this method are evident:

1) il substrato per le bioconversioni ha un costo nettamente pi? basso di quello normalmente utilizzato nei processi attuali (circa la met?); 1) the substrate for bioconversions has a significantly higher cost? lower than that normally used in current processes (about half?);

2) ? ridotto il costo di produzione e utilizzo degli enzimi; 2) ? reduced the cost of production and use of enzymes;

3) le rese globali di processo aumentano, anche perch? si riduce la degradazione della Cefalosporina C, inevitabile, nei processi attuali, a causa delle lunghe fasi di recupero e parziale purificazione di questa sostanza prima di essere sottoposta alla bioconversione enzimatica (la Cefalosporina C ? estremamente termolabile); 3) the global process yields increase, also why? the degradation of Cephalosporin C is reduced, which is inevitable in current processes, due to the long recovery and partial purification phases of this substance before undergoing enzymatic bioconversion (Cephalosporin C is extremely thermolabile);

4) sono ridotti i tempi globali di produzione; 5) il recupero del 7-ACA, effettuato con tecnologie di assorbimento su resina, consente di ottenere soluzioni di cefalosporine varie non bioconvertite che possono essere o riciclate a monte o isolate e processate separatamente per una valorizzazione merceologica; 4) overall production times are reduced; 5) the recovery of 7-ACA, carried out with resin absorption technologies, makes it possible to obtain solutions of various non-bioconverted cephalosporins that can be either recycled upstream or isolated and processed separately for a product valorisation;

6) la prima e la seconda bioco<'>nversione possono essere effettuate, come si vedr? in dettaglio negli esempi, addirittura nei fermentatori, richiedendo semplicemente un minimo adeguamento di questi alle condizioni di bioconversione (in particolare la possibilit? di alimentare ossigeno alla base del fermentatore) e l'utilizzo degli stessi anche per i processi di bioconversione (circa 4h+ 6h che si aggiungono ai tempi di fermentazione, 144 168h). 6) the first and second bioco <'> nversion can be carried out, as will be seen? in detail in the examples, even in the fermenters, simply requiring a minimum adaptation of these to the bioconversion conditions (in particular the possibility of feeding oxygen to the base of the fermenter) and the use of the same also for the bioconversion processes (about 4h + 6h which are added to the fermentation times, 144 168h).

ESEMPI EXAMPLES

Negli esempi che seguono vengono riportati diversi procedimenti alternativi che utilizzano i criteri metodologici sopra descritti, come differenti casi di applicazione relativi tutti alla produzione di 7-ACA. In the following examples different alternative procedures are reported that use the methodological criteria described above, as different application cases all relating to the production of 7-ACA.

ESEMPIO 1 EXAMPLE 1

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 1. Proceed according to the block diagram shown in Figure 1.

Al termine del processo di fermentazione (fase 0) si hanno una concentrazione di cefalosporina C nella brodocoltura nel campo 25 g/1 -?- 30 g/1, e gli altri parametri chimico-fisici come indicato nello schema. Rapidamente si raffredda la brodocoltura trasferendola nel serbatoio di deposito (fase 1) dal quale essa viene con continuit? alimentata all'unit? di ultrafiltrazione (fase 3) previa eventuale separazione preliminare dei microrganismi con filtri o centrifughe decantatrici (fase 2). In tutte le fasi suddette vengono rigorosamente mantenute le condizioni di T e pH indicate nello schema. At the end of the fermentation process (phase 0) there is a concentration of cephalosporin C in the broth culture in the range 25 g / 1 -? - 30 g / 1, and the other chemical-physical parameters as indicated in the diagram. Quickly the broth is cooled by transferring it to the storage tank (phase 1) from which it comes continuously. powered to the unit? ultrafiltration (phase 3) after any preliminary separation of the microorganisms with filters or decanter centrifuges (phase 2). In all the above steps, the T and pH conditions indicated in the diagram are strictly maintained.

Il permeato dell'ultrafiltrazione, contenente il substrato di cefalosporina C da bioconvertire oltre a varie sostanze organiche e inorganiche in forma disciolta, 'privo per? di microrganismi ed enzimi, via via che si forma viene raccolto in un adatto bioconvertitore batch (fase 4). Formato un batch , di volume prefissato, rapidamente si modificano le condizioni chimico-fisiche come indicato nello schema,impiegando una soluzione ammoniacale e un tampone di fosfato alcalino. The ultrafiltration permeate, containing the cephalosporin C substrate to be bioconverted as well as various organic and inorganic substances in dissolved form, is free for? of microorganisms and enzymes, as it forms it is collected in a suitable batch bioconverter (phase 4). Once a batch has been formed, with a predetermined volume, the chemical-physical conditions are rapidly modified as indicated in the diagram, using an ammonia solution and an alkaline phosphate buffer.

Si ottiene una concentrazione del substrato di cefalosporina C nel campo 16 g/1 -+-20 g/1. A substrate concentration of cephalosporin C in the range of 16 g / 1 - + - 20 g / 1 is obtained.

Si aggiunge una soluzione dell'enzima A solution of the enzyme is added

D-amminoacidossidasi nel rapporto di 1500 unit? di enzimi per litro di substrato. Si alimenta, dallo sparger al fondo del bioconvertitore, ossigeno puro mantenendo il recipiente sotto agitazione, sotto controllo di T, di ph (mediante aggiunta di soluzione di ammoniaca), di P e di portata di ossigeno (25 301/1 x h). D-amino acid oxidase in the ratio of 1500 units? of enzymes per liter of substrate. Pure oxygen is fed from the sparger to the bottom of the bioconverter while keeping the vessel under agitation, under control of T, ph (by adding ammonia solution), P and oxygen flow rate (25 301/1 x h).

Durante la bioconversione della cefalosporina C a glutaril 7-ACA, si ha formazione di un intermedio, chetoderivato , con sviluppo di ammoniaca e acqua ossigenata, e successivamente per azione dell'acqua ossigenata sul chetoderivato, formazione del glutaril 7-ACA con sviluppo di C02. Per compensare la perdita dell'acqua ossigenata nel flusso gassoso uscente, essa viene attentamente reintegrata nelle quantit? minime necessarie per mantenere le proporzioni stechiometriche di trasformazione del chetoderivato in glutaril 7-ACA. La pressione di esercizio viene mantenuta per tutto il periodo di bioconversione - circa During the bioconversion of cephalosporin C to glutaryl 7-ACA, there is the formation of an intermediate, ketoderivative, with the development of ammonia and hydrogen peroxide, and subsequently by the action of hydrogen peroxide on the ketoderivato, formation of glutaryl 7-ACA with the development of C02 . To compensate for the loss of hydrogen peroxide in the outgoing gaseous flow, it is carefully reintegrated in the quantities? minimum necessary to maintain the stoichiometric proportions of transformation of the ketoderivative into glutaryl 7-ACA. The working pressure is maintained throughout the bioconversion period - approx

1 1,5 ore - al valore di 3 ATE. 1 1.5 hours - at the value of 3 ATE.

La resa della prima bioconversione, valutata su quella stechiometrica varia nel campo 92 95%. Al termine viene aggiunto, se necessario, potassio metabisolfito, per eliminare eventuali residui di acqua ossigenata. The yield of the first bioconversion, evaluated on the stoichiometric one, varies in the range 92 95%. At the end, potassium metabisulphite is added, if necessary, to eliminate any residues of hydrogen peroxide.

Si procede al recupero del primo enzima per ultrafiltrazione (fase 5) ottenendolo come soluzione ritenuta dalle membrane , dopo averlo lavato in diafiltrazione con acqua demineralizzata adeguatamente tamponata. Disciolto in un adatto tampone, l'enzima pu? essere conservato e reimpiegato nelle successive bioconversioni per The first enzyme is recovered by ultrafiltration (step 5), obtaining it as a solution retained by the membranes, after washing it in diafiltration with suitably buffered demineralized water. Dissolved in a suitable buffer, the enzyme can? be stored and reused in subsequent bioconversions for

D-amminossidazione . Si utilizzano membrane di taglio molecolare atto a separare, insieme al micelio e alle altre specie microbiche eventualmente presenti, residui organici e inorganici di dimensioni superiori a 200 300 Angstrom, e soprattutto gli enzimi, con peso molecolare superiore a ca 15.000, che potrebbero interferire con bioconversioni competitive comunque nocive alla purezza del 7-ACA. D-aminoxidation. Molecular cleavage membranes are used to separate, together with the mycelium and any other microbial species present, organic and inorganic residues larger than 200 300 Angstroms, and above all enzymes, with a molecular weight greater than 15,000, which could interfere with competitive bioconversions which are however harmful to the purity of 7-ACA.

Il permeato, che contiene il glutaril 7-ACA, viene reimmesso nello stesso bioconvertitore, o in altro reattore agitato e si procede all'effettuazione della seconda bioconversione (fase 6). A tale scopo si modifica preliminarmente il pH con soluzione ammoniacale elevandolo al valore indicato nello schema. Si aggiunge una soluzione dell'enzima glutaril acilasi nel rapporto di 1500 unit? di enzima per litro di substrato. Si mantiene in agitazione, a pressione atmosferica, sotto controllo di T e pH con soluzione ammoniacale, per il tempo di 15 20 ore necessario al completamento della bioconversione, che avviene con produzione, all?equilibrio, di 7-ACA e di acido glutarico equimolecolari con il glutaril derivato. The permeate, which contains glutaryl 7-ACA, is reintroduced into the same bioconverter, or into another stirred reactor and the second bioconversion is carried out (phase 6). For this purpose, the pH is preliminarily modified with ammonia solution, raising it to the value indicated in the diagram. A solution of the enzyme glutaryl acylase is added in the ratio of 1500 units? of enzyme per liter of substrate. It is kept stirred, at atmospheric pressure, under control of T and pH with ammonia solution, for the time of 15-20 hours necessary to complete the bioconversion, which takes place with the production, in equilibrium, of 7-ACA and equimolecular glutaric acid. with the glutaryl derivative.

La resa che si riscontra per la seconda bioconversione ? pari a circa 91 ? 93%. Si procede al recupero del secondo enzima (fase 7) operando analogaroente a quanto sopra descritto per il primo enzima (ultrafiltrazione). La resa complessiva riscontrata nelle fasi di produzione del 7-ACA varia pertanto nel campo 83 87%. The yield that is found for the second bioconversion? equal to about 91? 93%. The second enzyme is recovered (step 7) by operating analogously to what has been described above for the first enzyme (ultrafiltration). The overall yield found in the 7-ACA production stages therefore varies in the 83-87% range.

Da questo punto iniziano le fasi di recupero del prodotto . From this point the product recovery phases begin.

Si passa la soluzione contenente il 7-ACA su letto di resina a scambio ionico del tipo cationico forte, disponibile in commercio, che ritiene quasi quantitativamente il 7-ACA (fase 8). Questo viene eluito con adatto tampone. L'eluato viene passato su letto di resine decoloranti, che trattengono le sostanze con gruppi cromofori (fase 9) e successivamente concentrato per osmosi inversa (fase 10), con la quale operazione il volume viene ridotto a valori ottimali per la successiva cristallizzazione (fase 11) che avviene per acidificazione al punto isoelettrico. Il prodotto viene separato per filtrazione (fase 12) e successivamente essiccato (fase 13). The solution containing the 7-ACA is passed on a bed of commercially available strong cationic ion exchange resin, which retains almost quantitatively the 7-ACA (phase 8). This is eluted with a suitable buffer. The eluate is passed on a bed of bleaching resins, which retain the substances with chromophores groups (phase 9) and subsequently concentrated by reverse osmosis (phase 10), with which the volume is reduced to optimal values for the subsequent crystallization (phase 11) which occurs by acidification at the isoelectric point. The product is separated by filtration (phase 12) and subsequently dried (phase 13).

ESEMPIO 2 EXAMPLE 2

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 2. Proceed according to the block diagram shown in Figure 2.

Il processo^ fino alla fase 7, ? identico a quello dell'esempio 1, e differisce per le fasi di recupero del prodotto. The process ^ up to stage 7,? identical to that of example 1, and differs in the product recovery phases.

Si passa la soluzione contenente il 7-ACA su letto di resina a scambio ionico del tipo anionico forte, disponibile in commercio, che ritiene in modo preferenziale e pi? selettivo il 7-ACA (fase 8). Questo viene eluito con tampone adattato alle nuove condizioni di processo. Le fasi successive, da 9 a 13,sono sostanzialmente identiche al caso 1. The solution containing the 7-ACA is passed on a bed of ion exchange resin of the strong anionic type, available on the market, which it considers preferentially and more? selective 7-ACA (phase 8). This is eluted with buffer adapted to the new process conditions. The subsequent steps, from 9 to 13, are substantially identical to case 1.

ESEMPIO 3 EXAMPLE 3

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 3. Proceed according to the block diagram shown in Figure 3.

Il processo, fino alla fase 7, ? identico a quello dell'esempio 1, e differisce per le fasi di recupero del prodotto. The process, up to stage 7,? identical to that of example 1, and differs in the product recovery phases.

Si passa la soluzione contenente il 7-ACA su doppio letto di resine adsorbenti, disponibili in commercio, che ritengono quasi quantitativamente il 7-ACA e le cefalosporine non reagite nel primo letto, e selettivamente il 7-ACA nel secondo letto (fase 8). Il prodotto viene eluito con tampone adatto. Le fasi successive, da 9 a 13, sono sostanzialmente identiche al caso 1. The solution containing the 7-ACA is passed on a double bed of adsorbent resins, available on the market, which retain almost quantitatively the 7-ACA and the unreacted cephalosporins in the first bed, and selectively the 7-ACA in the second bed (phase 8) . The product is eluted with a suitable buffer. The subsequent steps, from 9 to 13, are substantially identical to case 1.

ESEMPIO 4 EXAMPLE 4

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 4. Proceed according to the block diagram shown in figure 4.

Il processo, fino alla fase 7, ? identico a quello _dell'esempio 1, e differisce per le fasi di recupero del prodotto. The process, up to stage 7,? identical to that of example 1, and differs in the product recovery phases.

Si concentra termicamente la soluzione contenente il 7-ACA, lavorando a bassa temperatura per evitare le degradazioni termiche (fase 8). Si precipita il 7-ACA al punto isoelettrico (fase 9) e si separa per filtrazione o centrifugazione (fase 10).. Ridisciolti i cristalli umidi in soluzione ammoniacale, si adsorbono su carbone attivo in polvere le impurezze con gruppi cromofori (fase 11). Si ricristallizza una seconda volta (fase 12) al punto isoelettrico per ottenere 7-ACA di adeguata purezza. Si separa per filtrazione o centrifugazione (fase 13) e si essicca (fase 14). The solution containing 7-ACA is thermally concentrated, working at low temperature to avoid thermal degradation (step 8). The 7-ACA is precipitated at the isoelectric point (phase 9) and separated by filtration or centrifugation (phase 10). Once the humid crystals are redissolved in ammonia solution, the impurities with chromophores groups are adsorbed on activated carbon in powder form (phase 11) . It is recrystallized a second time (phase 12) at the isoelectric point to obtain 7-ACA of adequate purity. It is separated by filtration or centrifugation (phase 13) and dried (phase 14).

ESEMPIO 5 EXAMPLE 5

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 5. Proceed according to the block diagram shown in figure 5.

Il<' >processo, fino alla fase 7, ? identico a quello dell'esempio 1, e varia per le fasi di recupero del prodotto. The <'> process, up to stage 7,? identical to that of example 1, and varies for the product recovery phases.

Si concentra termicamente la soluzione con il 7-ACA (fase 8), indi si adsorbono su carbone attivo le impurezze colorate (fase 9). Si effettua la cristallizzazione per insolubilizzazione del 7-ACA in solvente organico (fase 10). Si separa per filtrazione o centrifugazione (fase 11) e si essicca (fase 12). The solution is thermally concentrated with 7-ACA (phase 8), then the colored impurities are adsorbed on activated carbon (phase 9). The 7-ACA crystallization is carried out by insolubilization in organic solvent (step 10). It is separated by filtration or centrifugation (phase 11) and dried (phase 12).

NOTA NOTE

I processi di recovery descritti negli esempi da 1 a 5 presentano rese e qualit? finali del prodotto variabili caso per caso, cos? come avviene anche per i costi unitari di produzione. Le ampie possibilit? di variazione sono consentite dalla qualit? del 7-ACA ottenuto a monte con le tecniche sopra descritte. The recovery processes described in examples 1 to 5 have yields and quality? variable endings of the product on a case-by-case basis, cos? as is also the case for unit production costs. The wide possibilities? of variation are allowed by the quality? of the 7-ACA obtained upstream with the techniques described above.

ESEMPIO 6 EXAMPLE 6

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 6. Proceed according to the block diagram shown in figure 6.

Terminata la fermentazione (fase 0) si prosegue il processo nello stesso fermentatore, impegnandolo globalmente per un periodo di 5 6 ore. Raffreddata debolmente la brodocoltura, si aggiunge tampone fosfatico bipotassico, ed una eventuale modesta quantit? di soluzione ammoniacale, fino a raggiungere un pH nel campo 7 ? 7,2. Si aggiunge l'enzima 1, D-araminoacidossidasi libero, nel rapporto di 1800 unit? di enzima per litro, e si eroga ossigeno gassoso dal fondo del fermentatore, in agitazione. Si effettua cos? la prima bioconversione (fase 1), senza effetti negativi connessi all?attivit? enzimatica eterogenea della brodocoltura, se si esclude un maggior consumo di ossigeno collegato all'attivit? respiratoria del micelio presente. At the end of the fermentation (phase 0) the process continues in the same fermenter, engaging it globally for a period of 5 6 hours. Weakly cooled the broth culture, is added by -potassic phosphate buffer, and a possible modest quantity? of ammonia solution, until reaching a pH in the 7 range? 7.2. The enzyme 1, free D-araminoacidoxidase, is added in the ratio of 1800 units? of enzyme per liter, and gaseous oxygen is delivered from the bottom of the fermenter, while stirring. Is it done so? the first bioconversion (phase 1), without negative effects connected to the activity? heterogeneous enzymatic of the broth culture, if we exclude a greater oxygen consumption linked to the activity? respiratory system of the mycelium present.

Per spostare decisamente l'equilibrio di reazione verso la produzione voluta, viene aggiunta con estrema accuratezza acqua ossigenata per reintegrare la perdita di quella prodottasi nella bioconversione. Si opera in agitazione, sotto controllo di T, di pH, di P (3 ATE) e di portata di ossigeno . To decisively shift the reaction equilibrium towards the desired production, hydrogen peroxide is added with extreme accuracy to reintegrate the loss of that produced in the bioconversion. It is operated under agitation, under control of T, pH, P (3 ATE) and oxygen flow.

Il processo che si svolge, e le modalit? operative, sono gli stessi descritti nell'esempio 1. The process that takes place, and the modalities? operational, are the same as described in example 1.

La resa della prima bioconversione, valutata su quella stechiometrica, varia nel campo 91 94%. Al termine viene corretto, se necessario, il potenziale di redox mediante potassio metabisolfito e si eleva il pH al valore indicato nello schema. The yield of the first bioconversion, evaluated on the stoichiometric one, varies in the range 91 94%. At the end, if necessary, the redox potential is corrected by means of potassium metabisulphite and the pH is raised to the value indicated in the diagram.

per effettuare la seconda bioconversione (fase 2). Si introduce a questo punto l'enzima 2, to carry out the second bioconversion (phase 2). At this point, enzyme 2 is introduced,

glutarilacilasi, nel rapporto di 1800 unit? di enzima per litro di substrato. Il processo che si svolge, e le modalit? operative, sono identici a quanto descritto nell'esempio 1 per la seconda bioconversione, come risulta dalla figura 6. glutarylacylase, in the ratio of 1800 units? of enzyme per liter of substrate. The process that takes place, and the modalities? operative, are identical to what is described in example 1 for the second bioconversion, as shown in figure 6.

La resa riscontrata per la seconda bioconversione varia nel campo 90 92%. The yield found for the second bioconversion varies in the 90-92% range.

La resa risultante delle due bioconversioni, per produrre la soluzione di 7-ACA, varia pertanto nel campo 82 -+ 86%. The resulting yield of the two bioconversions, to produce the 7-ACA solution, therefore varies in the range 82 - + 86%.

Il prodotto viene recuperato secondo lo schema di processo descritto nella figura 6, fasi da 3 a 10, che corrispondono alle fasi 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12 e 13 descritte nell'esempio 1. The product is recovered according to the process scheme described in Figure 6, steps 3 to 10, which correspond to steps 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 described in example 1.

ESEMPIO 7 EXAMPLE 7

Il processo, fino alla fase 4, ? identico a quello nell'esempio 6, e differisce per le fasi di recupero del prodotto. The process, up to stage 4,? identical to that in example 6, and differs in the product recovery steps.

Tali fasi, da 5 a 10, corrispondono alle fasi da 8 a 13 gi? descritte nell'esempio 2. These phases, from 5 to 10, correspond to the phases from 8 to 13 already? described in example 2.

ESEMPIO 8 EXAMPLE 8

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 3. Il processo, fino alla fase 4, ? identico a quello dell?esempio 6, e differisce per le fasi di recupero del prodotto. Tali fasi, da 5 a 10, corrispondono alle fasi da 8 a 13 gi? descritte nell'esempio 3. Proceed according to the block diagram shown in Figure 3. The process, up to phase 4,? identical to that of example 6, and differs in the product recovery phases. These phases, from 5 to 10, correspond to the phases from 8 to 13 already? described in example 3.

ESEMPIO 9 EXAMPLE 9

Il processo, fino alla fase 4, ? identico a quello dell'esempio 6, e differisce per le fasi di recupero del prodotto. The process, up to stage 4,? identical to that of example 6, and differs in the product recovery steps.

Tali fasi, da 5 a 11, corrispondono alle fasi da 8 a 14 gi? descritte nell'esempio 4. These phases, from 5 to 11, correspond to the phases from 8 to 14 already? described in example 4.

ESEMPIO 10 EXAMPLE 10

Si procede secondo lo schema a blocchi rappresentato nella figura 10. Proceed according to the block diagram shown in figure 10.

Tali fasi, da 5 a 9, corrispondono alle fasi da 8 a 12 gi? descritte nell'esempio 5. These phases, from 5 to 9, correspond to the phases from 8 to 12 already? described in example 5.

Claims

CLAIMS 1. A method of producing acid 7-aminoacephalosporanic (7-ACA) which includes the phases of: a) contact free enzyme D-amino acid oxidase with solution of cephalosporin C what? contained in the harvest broth culture under conditions sufficient to cause the deammination of cephalosporin C, with the production of glutaryl 7-aminocephalosporanic acid; b) then put in contact glutarylacylase free enzyme with the solution coming from step a) in conditions sufficient to produce acid 7-aminocephalosporanic.

2 A method for producing 7-ACA which includes the steps of: a) contact free enzyme D-amino acid oxidase with solutions of cephalosporin C what ?? contained in the harvest broth culture after separation of mycelium, microorganisms, enzymes and macromolecules contained therein, by means of the known ultrafiltration technique, under conditions sufficient to cause the deaminination of cephalosporin C, with the production of glutaryl 7-ACA; b) separating by ultrafiltration and recovering the D-amino acid oxidase enzyme for re-use; c) subsequently contacting the glutarylacylase free enzyme with the permeated solution from step b) under conditions sufficient to produce 7-aminocephalosporanic acid; d) separating by ultrafiltration and recovering the glutarylacylase enzyme to reuse it.

A method for recovering 7-ACA from the solutions obtained by applying the method indicated in point 1. a) and b) or the method indicated in point 2. a) and b), which includes the steps of: a) absorb on ion exchange resins of the strong cationic type; b) elute; c) decoloring the eluate with activated carbon; d) concentrating the eluate by reverse osinosis; e) crystallize at the isoelectric point; f) filter; g) drying.

4. A method for recovering 7-ACA from the solutions obtained by applying the method indicated in point 1. a) and b) or the method indicated in point 2. a) and b), which includes the steps of: a) absorb on ion exchange resins of the strong anionic type; b) elute; c) decoloring the eluate with activated carbon; d) concentrating the eluate by reverse osmosis; e) crystallize at the isoelectric point; f) filter; g) drying.

5. A method for recovering 7-ACA from the solutions obtained by applying the method indicated in point 1. a) and b) or the method indicated in point 2. a) and b), which includes the steps of: a) absorb on adsorbent resins; b) elute; c) decoloring the eluate on bleaching resins; d) concentrating the eluate by reverse osinosis; e) crystallize at the isoelectric point; f) filter; g) drying. 6. A method for recovering 7-ACA from the solutions obtained by applying the method indicated in point 1. a) and b) or the method indicated in point 2. a) and b), which includes the steps of: a) thermally concentrate the solution; b) crystallize at the iso electric point; c) filter d) redissolve and decolorize the solution with activated carbon; e) recrystallize at the isoelectric point; f) filter; g) drying.

6. A method for recovering 7-ACA from the solutions obtained by applying the method indicated in point 1. a) and b) or the method indicated in point 2. a) and b), which includes the steps of: a) thermally concentrate the solution; . b) decolorize the concentrate; c) crystallizing in a suitable solvent; d) filter; e) drying.