ITMI20111905A1 - MULTILAYER TUBULAR PROSTHESIS FOR RECONSTRUCTIVE SURGERY - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Campo del invenzione Field of the invention
La presente invenzione riguarda il campo della ricostruzione o sostituzione in vivo di organi cavi o porzioni di essi; si descrivono protesi bioriassorbibili e biocompatibili tubulari a base di materiali polimerici di origine naturale, in particolare protesi tubulari multistrato, adatte alla adesione, proliferazione e colonizzazione cellulare, dotate di resistenza meccanica adeguata per la suturabilità chirurgica. The present invention relates to the field of in vivo reconstruction or replacement of hollow organs or portions thereof; bioresorbable and biocompatible tubular prostheses are described based on polymeric materials of natural origin, in particular multilayer tubular prostheses, suitable for cell adhesion, proliferation and colonization, with adequate mechanical resistance for surgical suturability.
STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE
Le protesi autologhe o eterologhe trovano largo impiego nella chirurgia riparativa e ricostruttiva sia in campo umano che veterinario. Nella maggior parte dei casi i prodotti attualmente disponibili sul mercato sono costituiti da polimeri sintetici tra i quali ad esempio siliconi, poliuterani, polimeri a base di acrilati amidici e politetrafluoroetileni. Una delle problematiche principali associata all’uso di detti polimeri à ̈ la possibilità che esse determinino una marcata riposta infiammatoria, la quale può condurre sino alla reazione di rigetto della protesi innestata. Al contrario l’obiettivo terapeutico à ̈ rappresentato dalla completa integrazione della protesi nel nuovo tessuto biologico in modo da rigenerare una struttura simile a quella che si intende sostituire o ricostruire. Da questo punto di vista, quindi, materiali polimerici che fungano da supporto temporaneo per la ricolonizzazione cellulare e vengano successivamente e in modo progressivo biodegradati, rappresenta un approccio largamente preferibile. Autologous or heterologous prostheses are widely used in reparative and reconstructive surgery both in the human and veterinary field. In most cases, the products currently available on the market consist of synthetic polymers including, for example, silicones, polyuterans, polymers based on amide acrylates and polytetrafluoroethylenes. One of the main problems associated with the use of these polymers is the possibility that they determine a marked inflammatory response, which can lead to the rejection of the grafted prosthesis. On the contrary, the therapeutic objective is represented by the complete integration of the prosthesis in the new biological tissue in order to regenerate a structure similar to the one that is to be replaced or reconstructed. From this point of view, therefore, polymeric materials that act as a temporary support for cellular recolonization and are subsequently and progressively biodegraded, represents a largely preferable approach.
Negli ultimi anni sono state sviluppate protesi a base di polimeri sintetici biodegradabili come l’acido polilattico (PLA), l’acido poliglicolico o il policaprolactone (PCL). Alcune protesi (sotto forma di garze) costruite con questi materiali sono commercialmente disponibili come ad esempio il Vicrylâ„¢. La peculiarità di questi polimeri à ̈ rappresentata dalla loro scarsa immunogenicità che rende queste protesi tollerabili dall’organismo, associata ad una relativa assenza di effetti collaterali. Lo svantaggio principale di queste protesi eterologhe sintetiche à ̈ rappresentato dalla bassa capacità di integrazione biologica che ne determina un utilizzo temporaneo. In letteratura sono ben documentati altri problemi associati all’utilizzo di questo tipo di protesi tra cui i più importanti per la salute del paziente sono l’infezione batterica delle protesi e dei tessuti circostanti. Queste infezioni sono difficili da trattare e spesso conducono al fallimento dell’impianto protesico ed alla sua sostituzione. Un altro problema associato all’uso di protesi eterologhe sintetiche à ̈ la perdita graduale delle proprietà meccaniche della protesi. In recent years, prostheses based on biodegradable synthetic polymers such as polylactic acid (PLA), polyglycolic acid or polycaprolactone (PCL) have been developed. Some prostheses (in the form of gauze) made of these materials are commercially available such as Vicrylâ „¢. The peculiarity of these polymers is represented by their poor immunogenicity which makes these prostheses tolerable by the body, associated with a relative absence of side effects. The main disadvantage of these synthetic heterologous prostheses is represented by the low capacity of biological integration which determines their temporary use. Other problems associated with the use of this type of prosthesis are well documented in the literature, among which the most important for the patient's health are bacterial infection of the prostheses and surrounding tissues. These infections are difficult to treat and often lead to the failure of the prosthetic implant and its replacement. Another problem associated with the use of synthetic heterologous prostheses is the gradual loss of the mechanical properties of the prosthesis.
Occorre ricordare, inoltre, che le protesi sintetiche sono inerti da un punto di vista biologico, quindi incapaci di indurre una risposta biologica che porta ad una progressiva integrazione e successiva sostituzione con tessuto biologico. Questa relativa inerzia à ̈ dovuta principalmente alla mancanza di biomimetismo. It should also be remembered that synthetic prostheses are inert from a biological point of view, therefore unable to induce a biological response that leads to a progressive integration and subsequent replacement with biological tissue. This relative inertia is mainly due to the lack of biomimicry.
Da questo punto di vista, i polimeri biodegradabili di origine naturale, in particolare quelli a struttura polisaccaridica, hanno suscitato grande interesse nell’ultimo decennio nelle applicazioni di ingegneria tessutale e medicina rigenerativa, in ragione della loro grande rassomiglianza con i componenti principali della matrice extraxellulare. Questa caratteristica li rende particolarmente adatti a svolgere una funzione di sostegno e di stimolo temporaneo alla ricostruzione di un tessuto o un organo danneggiato o malato ed a interfacciarsi positivamente con tessuti biologici. Una rassegna esaustiva di detti materiali e delle loro caratteristiche à ̈ fornita, ad esempio da J.F. Mano et al. (J. R. Soc. Interface, 2007, 4, 999-1030). From this point of view, biodegradable polymers of natural origin, in particular those with a polysaccharide structure, have aroused great interest in the last decade in the applications of tissue engineering and regenerative medicine, due to their great resemblance to the main components of the matrix. extraxellular. This feature makes them particularly suitable to perform a function of support and temporary stimulus to the reconstruction of a damaged or diseased tissue or organ and to positively interface with biological tissues. An exhaustive review of these materials and their characteristics is provided, for example by J.F. Mano et al. (J. R. Soc. Interface, 2007, 4, 999-1030).
Tra detti polimeri il chitosano rappresenta, probabilmente, quello di maggiore interesse per l’impiego in medicina rigenerativa (C. Shi et al., J. Surgical Res., 2006, 133, 185-192). Una panoramica della letteratura scientifica al riguardo à ̈ riportata da A. Di Martino et al. Among these polymers, chitosan is probably the one of greatest interest for use in regenerative medicine (C. Shi et al., J. Surgical Res., 2006, 133, 185-192). An overview of the scientific literature in this regard is reported by A. Di Martino et al.
[Biomaterìals, 2005, 26, 5983-5990) e da J.-K. F. Suh and H. W.T. Matthew ( Biomaterìals , 2000, 21, 2589-2598). [Biomaterìals, 2005, 26, 5983-5990) and by J.-K. F. Suh and H. W.T. Matthew (Biomaterìals, 2000, 21, 2589-2598).
II chitosano à ̈ un derivato parzialmente deacetilato della chitina, ad alto peso molecolare ed à ̈ il secondo polimero naturale più abbondante. E’ un polisaccaride lineare composto da JV-acetilglucosamina e glucosamina legate mediante legame β(1-4) glicosidico. Il rapporto tra le unità di glucosamina e IV-acetil-glucosammina viene definito come grado di deacetilazione. Il peso molecolare può variare tra 300 a oltre 2000 kD, mentre il grado di deacetilazione può variare tra il 30% ed il 98%. Chitosan is a partially deacetylated derivative of chitin, with a high molecular weight and is the second most abundant natural polymer. It is a linear polysaccharide composed of JV-acetylglucosamine and glucosamine linked by β (1-4) glycosidic bond. The ratio of glucosamine to IV-acetyl-glucosamine units is defined as the degree of deacetylation. The molecular weight can vary between 300 and over 2000 kD, while the degree of deacetylation can vary between 30% and 98%.
Il chitosano risulta particolarmente indicato nella costruzione di supporti tridimensionali ad alto grado di porosità che permettano una agevole colonizzazione da parte delle cellule dell’organismo ospite. Chitosan is particularly suitable for the construction of three-dimensional supports with a high degree of porosity that allow easy colonization by the cells of the host organism.
Per quanto concerne la forma, alcune applicazioni, in particolare quelle che riguardano la rigenerazione di organi cavi quali intestino, tratto genito-urinario, vasi sanguigni o rami dell’albero respiratorio, richiedono la disponibilità di un supporto polimerico costituito da un cilindro internamente cavo, che possa essere colonizzato da cellule dell’ospite senza che questo determini una occlusione della cavità nella quale deve poter continuare a scorrere liberamente un fluido (sangue, bile, urina, succo pancreatico, liquido gastrointestinale ecc.) o, come nel caso dell’apparato respiratorio, un gas. Inoltre, detto fluido deve rimanere confinato nel lume di detta struttura cilindrica, senza che si abbia un suo passaggio nella parete del cilindro o perdita e versamento nelle zone circostanti. As regards the shape, some applications, in particular those concerning the regeneration of hollow organs such as the intestine, genitourinary tract, blood vessels or branches of the respiratory tree, require the availability of a polymeric support consisting of an internally hollow cylinder , which can be colonized by host cells without this causing an occlusion of the cavity in which a fluid (blood, bile, urine, pancreatic juice, gastrointestinal fluid, etc.) must continue to flow freely or, as in the case of € ™ respiratory system, a gas. Furthermore, said fluid must remain confined in the lumen of said cylindrical structure, without its passing through the cylinder wall or leaking and pouring into the surrounding areas.
A. Wang et al. ( Tsighua Science and Technology 2005, IO, 449-453) riportano la produzione di uno scaffold tubulare di chitosano mediante un processo di lavorazione a maglia combinato con una separazione di fase indotta termicamente. Lo stesso gruppo di autori (L. Zang et al., J. Biomed Mater. Res., 2006, 77 A, 277-284) riporta l’ulteriore rivestimento del tubo sopra citato mediante una soluzione di chitosano e chitosano gelatina. Il tutto viene quindi solidificato mediante liofilizzazione. A. Wang et al. (Tsighua Science and Technology 2005, IO, 449-453) report the production of a tubular chitosan scaffold by a knitting process combined with a thermally induced phase separation. The same group of authors (L. Zang et al., J. Biomed Mater. Res., 2006, 77 A, 277-284) reports the further coating of the aforementioned tube using a solution of chitosan and chitosan gelatine. The whole is then solidified by lyophilization.
La domanda di brevetto CN 1404881 riporta un metodo per la preparazione di un tubo di chitosano poliporoso. Per la preparazione di detto tubo, una soluzione di chitosano in acido acetico à ̈ posta in uno stampo nel quale viene inserito un ulteriore cilindro centrale. Il tutto viene solidificato mediante liofilizzazione. Patent application CN 1404881 reports a method for the preparation of a polyporous chitosan tube. For the preparation of said tube, a solution of chitosan in acetic acid is placed in a mold in which a further central cylinder is inserted. The whole is solidified by freeze-drying.
Il principale problema legato airottenimento di strutture porose a base di chitosano mediante liofilizzazione di una soluzione in acido acetico (o altro acido parzialmente volatile) riguarda la permanenza di residui di acido nello scaffold essiccato che possono risultare citotossici e determinare la parziale dissoluzione dello scaffold medesimo una volta che questo venga a contatto con soluzioni acquose come i fluidi biologici. The main problem linked to obtaining porous structures based on chitosan by lyophilization of a solution in acetic acid (or other partially volatile acid) concerns the permanence of acid residues in the dried scaffold which can be cytotoxic and determine the partial dissolution of the scaffold itself. once this comes into contact with aqueous solutions such as biological fluids.
Un’alternativa per la produzione di scaffold cilindrici e’ rappresentata dall’elettospinning. An alternative for the production of cylindrical scaffolds is represented by electospinning.
La domanda di brevetto CN 1944724 descrive un processo per la deposizione mediante elettrospinning di fibre nanometriche di proteine del collagene e di chitosano. Patent application CN 1944724 describes a process for the deposition by electrospinning of nanometric fibers of collagen and chitosan proteins.
La domanda di brevetto KR20070024092 descrive uno scaffold tridimensionale e il metodo per la sua preparazione. Detto scaffold comprende fibre di materiali ad alto e/o basso peso molecolare alle quali viene data, mediante elettrospinning, la forma di una rete tridimensionale. Tra le sostanze ad altro peso molecolare di origine naturale sono riportati anche il chitosano o la chitina. La compatibilità biologica di detto materiale rimane comunque da dimostrare. Patent application KR20070024092 describes a three-dimensional scaffold and the method for its preparation. Said scaffold comprises fibers of high and / or low molecular weight materials which are given, by means of electrospinning, the shape of a three-dimensional network. Among the substances with high molecular weight of natural origin are also listed chitosan or chitin. However, the biological compatibility of this material remains to be demonstrated.
La domanda di brevetto W02008/077949 riporta una composizione adatta alla realizzazione di un gel stabile in forma di film o matrice tridimensionale ottenuta mescolando sali e zuccheri con una soluzione debolmente acida di chitosano e successivamente neutralizzando la soluzione risultante. I gel così ottenuti sono dotati di un’eccellente citocompatibilità , biocompatibilità e biodegradabilità e pertanto adatti a fungere da supporto per l’adesione e la proliferazione cellulare sia in vitro che in vivo. Tali caratteristiche rendono detti gel adatti alla costruzione di strutture tridimensionali complesse per applicazioni di ingegneria tissutale e d’organo, quali ad esempio protesi vascolari, protesi di dotti biliari, materiali di riempimento per difetti ossei, adiuvanti nella riparazione delle ferite, ricostruzione di organi parenchimatosi o tessuti emopoietici. Patent application WO2008 / 077949 reports a composition suitable for making a stable gel in the form of a three-dimensional film or matrix obtained by mixing salts and sugars with a weakly acid solution of chitosan and subsequently neutralizing the resulting solution. The gels thus obtained are endowed with excellent cytocompatibility, biocompatibility and biodegradability and therefore suitable to act as support for cell adhesion and proliferation both in vitro and in vivo. These characteristics make these gels suitable for the construction of complex three-dimensional structures for tissue and organ engineering applications, such as for example vascular prostheses, bile duct prostheses, filling materials for bone defects, adjuvants in wound repair, organ reconstruction parenchymatous or hematopoietic tissues.
Tuttavia l’impiego di detti materiali risulta essere limitato dalla loro scarsa resistenza meccanica, in particolare per quanto concerne la saturabilità con i fili normalmente utilizzati in chirurgia umana e veterinaria. However, the use of these materials is limited by their poor mechanical resistance, in particular as regards saturability with the threads normally used in human and veterinary surgery.
La letteratura scientifica e brevettuale riporta numerosi esempi di scaffold ottenuti mediante reticolazione di gel di chitosano o di gel misti di chitosano e collagene al fine di aumentare la biostabilità , vale a dire di ridurre la velocità di degradazione biologica, e di migliorare la caratteristiche meccaniche. L. Ma et al. ( Biomaterials 2003, 24, 4833-4841) descrivono uno scaffold per ingegneria tessutale della pelle ottenuto liofilizzando una soluzione costituita da una miscela di collagene e chitosano e successivamente reticolando lo scaffold con glutaraldeide. The scientific and patent literature reports numerous examples of scaffolds obtained by crosslinking chitosan gels or mixed chitosan and collagen gels in order to increase the biostability, that is to say to reduce the biological degradation rate, and to improve the mechanical characteristics. L. Ma et al. (Biomaterials 2003, 24, 4833-4841) describe a scaffold for tissue engineering of the skin obtained by lyophilizing a solution consisting of a mixture of collagen and chitosan and subsequently crosslinking the scaffold with glutaraldehyde.
La domanda di brevetto CN 1394655 rivendica uno scaffold poroso con adeguata velocità di degradazione ottenuto dapprima liofilizzando una miscela di chitosano e collagene, quindi reticolando lo scaffold con un aldeide o una carbodiimide. Patent application CN 1394655 claims a porous scaffold with an adequate degradation rate obtained first by lyophilizing a mixture of chitosan and collagen, then by crosslinking the scaffold with an aldehyde or a carbodiimide.
Similmente la domanda di brevetto CN 101596331 fornisce un metodo per preparare un rete tridimensionale di collagene e chitosano da impiegare come scaffold per la costruzione di una cornea artificiale. La preparazione si realizza aggiungendo come agente reticolante 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimmide e N-idrossisuccinimmide e liofilizzando la miscela così ottenuta. Similarly, patent application CN 101596331 provides a method for preparing a three-dimensional network of collagen and chitosan to be used as a scaffold for the construction of an artificial cornea. The preparation is carried out by adding 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide as cross-linking agent and lyophilizing the mixture thus obtained.
La domanda di brevetto CN 1342722 descrive uno scaffold a due strati di chitosano-gelatina-acido ialuronico ottenuto aggiungendo una soluzione di acido ialuronico alla soluzione di chitosano e gelatina in acido acetico, quindi aggiungendo carbodiimmide come agente reticolante e liofilizzando la miscela dopo averla colata in uno stampo. Patent application CN 1342722 describes a two-layer chitosan-gelatin-hyaluronic acid scaffold obtained by adding a solution of hyaluronic acid to the solution of chitosan and gelatin in acetic acid, then adding carbodiimide as a cross-linking agent and lyophilizing the mixture after pouring it into a mold.
La domanda di brevetto CN 1012543 13 descrive uno scaffold bistrato di collagene e chitosano per applicazioni di ingegneria tessutale della pelle. Lo scaffold à ̈ una struttura bistrato a rete nella quale i due strati sono costituiti da film di chitosano-collagene che danno luogo a strutture porose con pori interconnessi. La soluzione dei due componenti viene congelata, reticolata e liofilizzata. Patent application CN 1012543 13 describes a bilayer scaffold of collagen and chitosan for skin tissue engineering applications. The scaffold is a two-layer mesh structure in which the two layers are made up of chitosan-collagen films that give rise to porous structures with interconnected pores. The solution of the two components is frozen, cross-linked and lyophilized.
Tuttavia, l’impiego di scaffold che contengono un agente reticolante risulta essere criticabile per applicazioni biomediche, in particolare per rimpianto di scaffold in organismi viventi essenzialmente per tre motivi: 1) anzitutto la bio de gradazione dello scaffold determina la liberazione localizzata nel sito dell’impianto dell’agente reticolante che può esercitare una spiccata tossicità sia locale che sistemica; 2) in secondo luogo, la reticolazione riduce la possibilità che lo scaffold possa essere bioriassorbito; 3) in terzo luogo la reticolazione spesso coinvolge gruppi funzionali idrofili della catena polimerica principale o laterale. However, the use of scaffolds containing a cross-linking agent appears to be criticized for biomedical applications, in particular for scaffold regression in living organisms essentially for three reasons: 1) first of all, the biodegradation of the scaffold determines the localized release in the site of the Implantation of the crosslinking agent which can exert a marked local and systemic toxicity; 2) secondly, crosslinking reduces the possibility that the scaffold can be bioabsorbed; 3) thirdly, crosslinking often involves hydrophilic functional groups of the main or lateral polymeric chain.
Ciò riduce la possibilità che questi gruppi stabiliscano legami ad idrogeno con l’acqua dell’ambiente circostante. Ciò può determinare una riduzione della bio compatibilità . This reduces the possibility that these groups establish hydrogen bonds with the water of the surrounding environment. This can lead to a reduction in bio compatibility.
Un approccio diverso per migliorare le caratteristiche meccaniche di gel di chitosano à ̈ rappresentato dall’accoppiamento di detti gel con strutture di supporto che in genere sono rappresentati da polimeri sintetici. A different approach to improve the mechanical characteristics of chitosan gels is represented by the coupling of said gels with support structures which are generally represented by synthetic polymers.
La domanda di brevetto CN 1785444 descrive uno scaffold bistrato per la rigenerazione tissutale costituito da uno scaffold di chitosano poroso per indurre la migrazione, riproduzione e differenziazione cellulare e da uno strato di silicone per prevenire l’evaporazione cutanea e l’intrusione di batteri. Patent application CN 1785444 describes a two-layer scaffold for tissue regeneration consisting of a porous chitosan scaffold to induce cell migration, reproduction and differentiation and a silicone layer to prevent skin evaporation and the intrusion of bacteria .
Il brevetto US 7,241,498 rivendica un processo di fabbricazione di un supporto costituito da fibre organiche o inorganiche rivestito, su almeno una faccia, da uno strato a base di chitosano. Detto strato à ̈ costituito dal residuo secco (almeno 80% in peso) di una soluzione acquosa di chitosano pre-idrolizzato avente una massa molecolare inferiore a 130.000 g/mol ed in concentrazione compresa fra 6 e 30% p/p. Le fibre organiche possono essere fibre di cellulosa o fibre sintetiche (poliestere, poliammide, polietilene, polipropilene e polivinilcloruro), artificiali (viscosa, cellulosa acetato), naturali (cotone, lana, polpa di legno), fibre di carbone. Le fibre inorganiche possono essere fibre di vetro o ceramiche. US patent 7,241,498 claims a manufacturing process of a support consisting of organic or inorganic fibers coated, on at least one face, with a chitosan-based layer. Said layer consists of the dry residue (at least 80% by weight) of an aqueous solution of pre-hydrolyzed chitosan having a molecular mass lower than 130,000 g / mol and in a concentration between 6 and 30% w / w. Organic fibers can be cellulose fibers or synthetic fibers (polyester, polyamide, polyethylene, polypropylene and polyvinyl chloride), artificial (viscose, cellulose acetate), natural (cotton, wool, wood pulp), carbon fibers. The inorganic fibers can be glass or ceramic fibers.
E’ di tutta evidenza che l’impiego di fibre non bioriassorbibili nella realizzazione dello strato dì supporto rende poco biocompatibile l’intera struttura descritta nel brevetto sopra riportato. Inoltre, i materiali citati tra quelli in grado di costituire le fibre di supporto non sempre posseggono proprietà meccaniche, quali flessibilità e conformabilità a tessuti molli, adatte all’applicazione chirurgica. It is quite clear that the use of non bioabsorbable fibers in the realization of the support layer makes the entire structure described in the above patent not very biocompatible. Furthermore, the materials cited among those able to constitute the support fibers do not always possess mechanical properties, such as flexibility and conformability to soft tissues, suitable for surgical application.
II brevetto EP 1 567 205 rivendica una protesi composita comprendente un tessuto di rinforzo su una faccia del quale à ̈ associato una matrice che consiste di un gel fisico di chitosano. Il materiale di rinforzo à ̈ un poliestere non tessuto. Anche in questo caso risulta questionabile la biocompatibilità del materiale di rinforzo in quanto anche impiegando poliesteri biodegradabili, la loro degradazione produce acidi che possono risultare localmente tossici. Patent EP 1 567 205 claims a composite prosthesis comprising a reinforcing fabric on one face of which is associated a matrix consisting of a physical chitosan gel. The reinforcement material is a non-woven polyester. Also in this case the biocompatibility of the reinforcing material is questionable as even using biodegradable polyesters, their degradation produces acids that can be locally toxic.
La domanda di brevetto W02009/ 130414 descrive una composizione da impiegare come protesi costituita da un materiale di rinforzo biodegradabile che presenta su una delle facce di detto materiale un film di chitosano e da un gel di chitosano. La funzione del film di chitosano à ̈ quella di mantenere separato il materiale di rinforzo dal gel di chitosano. Il materiale di rinforzo può essere un materiale polimerico in particolare un polimero sintetico, preferibilmente polipropilene. Patent application WO2009 / 130414 describes a composition to be used as a prosthesis consisting of a biodegradable reinforcing material which has a chitosan film and a chitosan gel on one of the faces of said material. The function of the chitosan film is to keep the reinforcing material separate from the chitosan gel. The reinforcing material can be a polymeric material in particular a synthetic polymer, preferably polypropylene.
La domanda di brevetto WO00/ 16817 rivendica, tra l’altro, una spugna mista di chitosano e collagene che contiene una maglia di chitosano ottenuta tessendo fibre di chitosano. Patent application WO00 / 16817 claims, among other things, a mixed sponge of chitosan and collagen which contains a chitosan mesh obtained by weaving chitosan fibers.
In ogni caso, le strutture composite sopra riportate non sono in grado di costituire una guida adatta alla ricolonizzazione guidata spazialmente di differenti tipi cellulari al fine di rigenerare un organo, o parte di esso, dotato di una struttura complessa che richiede il posizionamento e la crescita di cellule in strati, settori, o zone spazialmente distinti tra loro. In any case, the above composite structures are not able to constitute a guide suitable for the spatially guided recolonization of different cell types in order to regenerate an organ, or part of it, with a complex structure that requires positioning and growth. of cells in spatially distinct layers, sectors, or zones.
SOMMARIO SUMMARY
Come risposta alle limitazioni presentate dai materiali attualmente proposti o disponibili per la realizzazione di strutture tubulari destinate all 'ingegneria di tessuti e organi sopra menzionate, oggetto della presente invenzione à ̈ una protesi a forma di un cilindro cavo internamente, la cui parete à ̈ una struttura polimerica multistrato comprendente: uno strato esterno formato da un gel di chitosano, uno strato intermedio formato da collagene, ed uno strato interno formato da un film non poroso di chitosano. Detti strati sono tra loro diversi per morfologia e struttura chimico-fisica, ed ognuno svolge una diversa funzione: lo strato di gel idratato esterno ha lo scopo di promuovere la colonizzazione da parte di fibroblasti e cellule deputate alla neoangiogenesi, il film non poroso posto nella parte luminale del cilindro svolge la funzione di contenimento per i fluidi che scorrono nel lume dopo anastomosi con organi cavi con funzioni di trasporto nell’organismo vivente; tale film non poroso ha anche caratteristiche di citocompatibilità tali da favorire lo sviluppo di tessuto epiteliale. Lo strato di collagene intermedio impartisce proprietà meccaniche adeguate alla sutura chirurgica. As a response to the limitations presented by the materials currently proposed or available for the construction of tubular structures intended for the engineering of tissues and organs mentioned above, the object of the present invention is a prosthesis in the shape of an internally hollow cylinder, whose wall is a multilayer polymeric structure comprising: an external layer formed by a chitosan gel, an intermediate layer formed by collagen, and an internal layer formed by a non-porous film of chitosan. These layers are different from each other in morphology and chemical-physical structure, and each performs a different function: the external hydrated gel layer has the purpose of promoting colonization by fibroblasts and cells responsible for neoangiogenesis, the non-porous film placed in the luminal part of the cylinder carries out the function of containment for the fluids that flow in the lumen after anastomosis with hollow organs with transport functions in the living organism; this non-porous film also has cytocompatibility characteristics such as to favor the development of epithelial tissue. The intermediate collagen layer imparts mechanical properties appropriate to the surgical suture.
La protesi oggetto della presente invenzione à ̈ bioriassorbibile, altamente citocompatibile, non permeabile ai comuni fluidi biologici che scorrono in organi cavi; inoltre à ̈ dotata di caratteristiche meccaniche quali flessibilità , conformabilità a tessuti molli, resistenza alla trazione ed al taglio, così da renderla agevolmente suturabile a porzioni di organi cavi e tale da resistere alle sollecitazioni meccaniche in vivo postimpianto. Il bioriassorbimento del materiale che costituisce la protesi à ̈ controllabile e non genera composti citotossici. Detta protesi può essere impiegata nella ricostruzione in vivo di organi cavi o di una porzione di essi. The prosthesis object of the present invention is bioabsorbable, highly cytocompatible, not permeable to the common biological fluids that flow in hollow organs; moreover, it is equipped with mechanical characteristics such as flexibility, conformability to soft tissues, resistance to traction and cutting, so as to make it easily suturable to portions of hollow organs and such as to resist mechanical stresses in vivo after implantation. The bioabsorption of the material that constitutes the prosthesis is controllable and does not generate cytotoxic compounds. Said prosthesis can be used in the in vivo reconstruction of hollow organs or a portion of them.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1: protesi tubulare multistrato ottenuta neiresempio 3. Figura 2: Immagini SEM delle piastrine depositate sulla superficie della porzione luminale della protesi tubulare multistrato dell’esempio 6 (Pannello a), vetro borosilicato (Pannello b), plastica per colture cellulari (Pannello c). Figure 1: multilayer tubular prosthesis obtained in example 3. Figure 2: SEM images of the platelets deposited on the surface of the luminal portion of the multilayer tubular prosthesis of example 6 (Panel a), borosilicate glass (Panel b), plastic for cell culture (Panel c).
Figura 3: Assorbenza (O.D.) di soluzioni proteiche dopo contatto con plastica, con vetro, o con la porzione luminale della protesi dell’esempio 6. Figure 3: Absorption (O.D.) of protein solutions after contact with plastic, glass, or with the luminal portion of the prosthesis of example 6.
Figura 4: fasi dell’impianto di protesi sostitutiva biliare epatico-duodenale, senza conservazione della continenza papillare a seguito di resezione totale del coledoco associata a colecistectomia. Inizio della sutura epatico-protesica (pannello a); interposizione epaticoprotesica completata (pannello b) Figure 4: phases of the implantation of hepatic-duodenal biliary replacement prosthesis, without preservation of papillary continence following total resection of the choledochus associated with cholecystectomy. Beginning of the hepatic-prosthetic suture (panel a); completed hepaticoprosthetic interposition (panel b)
Figura 5: impianto di protesi sostitutiva bilio-biliare retroperitoneale susseguente a resezione subtotale del coledoco associata a colecistectomia. Interposizione protesica coledoco-coledocica completata (Pannello a); Completamento della sintesi del foglietto glissoniano a protezione della protesi {Pannello b) . Figure 5: Retroperitoneal biliary biliary replacement prosthesis implantation following subtotal resection of the choledochus associated with cholecystectomy. Completed choledocholedochal prosthetic interposition (Panel a); Completion of the synthesis of the Glisson sheet to protect the prosthesis {Panel b).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DETAILED DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda una protesi polimerica multistrato, di forma cilindrica, adatta ad essere impiegata nella chirurgia ricostruttiva o sostitutiva di organi cavi o di porzioni di essi. The present invention relates to a multilayer polymeric prosthesis, cylindrical in shape, suitable for use in reconstructive or replacement surgery of hollow organs or portions thereof.
Il termine “chitosano†qui utilizzato include i polisaccaridi lineari di JV-acetil-glucosamina e glucosamina legate mediante legame p(l-4) glicosidico, così come i derivati della chitina o poli-N-acetil-D-glucosamina (comprese le poliglucosamine e gli oligomeri della glucosamina), nei quali il contenuto di gruppi N-acetilici à ̈ stato ridotto per idrolisi (deacetilazione). Il grado di deacetilazione, ovvero la percentuale di gruppi N-acetilici rimossi per deacetilazione, à ̈ preferibilmente compreso fra 40 e 98%, più preferibilmente fra 60 e 97% e ancor più preferibilmente fra 70 e 95%. Il peso molecolare di detto chitosano à ̈ preferibilmente compreso fra 1 e 2.000 kDa, più preferibilmente fra 3 e 1.000 kDa e ancor più preferibilmente fra 5 e 300 kDa. Detto chitosano à ̈ utilizzabile indifferentemente per la preparazione dello strato interno e/o esterno della protesi; i due strati possono contenere polimeri di chitosano diversi o, preferibilmente, uguali tra loro. La differenza nello stato fisico tra i due stradi dipende essenzialmente dal rispettivo procedimento di preparazione che, nel primo caso porta alla formazione di un gel tridimensionale e nel secondo caso ad una matrice sottile, compatta e non porosa. The term â € œchitosanâ € used herein includes the linear polysaccharides of JV-acetyl-glucosamine and glucosamine linked by p (1-4) glycosidic bond, as well as derivatives of chitin or poly-N-acetyl-D-glucosamine (including polyglucosamines and glucosamine oligomers), in which the content of N-acetyl groups has been reduced by hydrolysis (deacetylation). The degree of deacetylation, that is the percentage of N-acetyl groups removed by deacetylation, is preferably between 40 and 98%, more preferably between 60 and 97% and even more preferably between 70 and 95%. The molecular weight of said chitosan is preferably between 1 and 2,000 kDa, more preferably between 3 and 1,000 kDa and even more preferably between 5 and 300 kDa. Said chitosan can be used indifferently for the preparation of the internal and / or external layer of the prosthesis; the two layers can contain different or, preferably, identical chitosan polymers. The difference in the physical state between the two paths essentially depends on the respective preparation process which, in the first case leads to the formation of a three-dimensional gel and in the second case to a thin, compact and non-porous matrix.
Lo strato esterno della protesi à ̈ costituito da un gel acquoso di chitosano, parzialmente disidratato. Lo spessore di detto strato esterno à ̈ preferibilmente compreso fra 0, 1 e 1 mm e preferibilmente tra 0,2 e 0,6 mm. Tale gel à ̈ preparabile utilizzando tecniche in sé note. In particolare esso à ̈ ottenibile da una soluzione acquosa di detto chitosano, a concentrazione compresa fra 0,5 e 10% p/v, preferibilmente tra 1 e 6%, più preferibilmente tra 2 e 5%; la soluzione comprende un acido, ad es. acido acetico, acido borico, acido cloridrico, acido lattico o acido ascorbico; la concentrazione dell’acido à ̈ compresa fra 0,1 e 5 % p/v e preferibilmente fra 0,5 e 2,5 % p/v. Inoltre, la soluzione comprende anche sali inorganici e zuccheri, secondo quanto descritto nella domanda di brevetto W02008/ 077949: tra i possibili sali inorganici si possono citare fosfati e cloruri di metalli alcalini e alcalinoterrosi, ad es. cloruro di sodio, cloruro di potassio, fosfato monosodico di sodio, fosfato monosodico di potassio; gli zuccheri sono tipicamente di- e tri-saccaridi e loro idrati, ad es. raffìnosio pentaidrato, saccarosio, ecc. Detti sali inorganici e zuccheri permettono di ottenere gel che, dopo neutralizzazione, sono dotati di una elevata citocompatibilità ; essa à ̈ significativamente superiore a quella ottenibile con gel di solo chitosano o gel ottenuti in assenza di detta combinazione di componenti. Il residuo acido contenuto nel gel viene convenientemente neutralizzato mediante aggiunta di un’opportuna quantità di alcali in soluzione idroalcolica. The outer layer of the prosthesis consists of an aqueous chitosan gel, partially dehydrated. The thickness of said outer layer is preferably between 0.1 and 1 mm and preferably between 0.2 and 0.6 mm. This gel can be prepared using known techniques. In particular, it can be obtained from an aqueous solution of said chitosan, at a concentration comprised between 0.5 and 10% w / v, preferably between 1 and 6%, more preferably between 2 and 5%; the solution comprises an acid, e.g. acetic acid, boric acid, hydrochloric acid, lactic acid or ascorbic acid; the acid concentration is between 0.1 and 5% w / v and preferably between 0.5 and 2.5% w / v. Furthermore, the solution also includes inorganic salts and sugars, as described in the patent application W02008 / 077949: among the possible inorganic salts, phosphates and chlorides of alkaline and alkaline earth metals can be mentioned, eg. sodium chloride, potassium chloride, sodium monosodium phosphate, potassium monosodium phosphate; sugars are typically di- and tri-saccharides and their hydrates, e.g. raffinose pentahydrate, sucrose, etc. Said inorganic salts and sugars allow to obtain gels which, after neutralization, are endowed with a high cytocompatibility; it is significantly higher than that obtainable with chitosan gel alone or gel obtained in the absence of said combination of components. The acid residue contained in the gel is conveniently neutralized by adding a suitable quantity of alkali in a hydroalcoholic solution.
Lo strato intermedio à ̈ costituito da collagene, preferibilmente non reticolato, mono o pluristratificato. Detto collagene à ̈ adatto ad essere usato in chirurgia umana o veterinaria. Si possono impiegare strati di collagene disponibili in commercio quali ad esempio Permacolâ„¢ (Covidien, USA) o Pegasusâ„¢ (Mediatek, Italy), Pericardial bioprostesis (Edwards Lifescience, Italia), TissueFleeceâ„¢ (Baxter, USA). Preferibilmente si impiega collagene non reticolato chimicamente disponibile in commercio in forma di fogli mono o multi stratificati ad esempio OsseoGuardâ„¢ (Collagen Matrix, USA), Surgisisâ„¢ (Cook Biotech Incorporated, USA), Lyoplantâ„¢ (Adr, Italia), Collagen-kleeâ„¢ (Colageno.com, Spagna), Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG, Svizzera) . Lo spessore di questo strato della protesi à ̈ preferibilmente compreso fra 0,05 e 2 mm, più preferibilmente fra 0,08 e 1.5 mm. The intermediate layer is made up of collagen, preferably non cross-linked, mono or multilayered. Said collagen is suitable for use in human or veterinary surgery. Commercially available collagen layers such as Permacolâ „¢ (Covidien, USA) or Pegasusâ„ ¢ (Mediatek, Italy), Pericardial bioprostesis (Edwards Lifescience, Italy), TissueFleeceâ „¢ (Baxter, USA) can be used. Chemically uncrosslinked collagen commercially available in the form of mono or multi-layered sheets is preferably used, for example OsseoGuardâ „¢ (Collagen Matrix, USA), Surgisisâ„ ¢ (Cook Biotech Incorporated, USA), Lyoplantâ „¢ (Adr, Italy), Collagen-kleeâ „¢ (Colageno.com, Spain), Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG, Switzerland). The thickness of this layer of the prosthesis is preferably between 0.05 and 2 mm, more preferably between 0.08 and 1.5 mm.
La porzione luminale della protesi (strato interno) à ̈ costituita da un film di chitosano, compatto non poroso. Lo spessore di detto film à ̈ preferibilmente compreso fra 0,05 e 1,5 mm, e più preferibilmente tra 0,1 e 1 mm. The luminal portion of the prosthesis (inner layer) is made up of a compact, non-porous chitosan film. The thickness of said film is preferably between 0.05 and 1.5 mm, and more preferably between 0.1 and 1 mm.
Il film à ̈ realizzabile utilizzando tecniche in sé note, ad es. portando a secco la soluzione di chitosano precedentemente descritta, preventivamente disposta su uno strato sottile. Lo strato ottenuto, esternamente liscio e regolare, presenta caratteristiche ideali di impermeabilità ai liquidi organici e di non trombogenicità . Detto film, opportunamente idratato, può essere curvato in forma tubolare. The film can be made using known techniques, eg. drying the previously described chitosan solution, previously arranged on a thin layer. The layer obtained, externally smooth and regular, has ideal characteristics of impermeability to organic liquids and of non-thrombogenicity. This film, suitably hydrated, can be curved into a tubular shape.
II procedimento per preparare la protesi in accordo con la presente invenzione comprende quattro fasi generali: The process for preparing the prosthesis according to the present invention comprises four general steps:
(i) preparazione del film di chitosano e suo avvolgimento su un supporto cilindrico; (ii) applicazione, sulfassemblato ottenuto in (i), dello strato di collagene opportunamente idratato; (iii) formazione dello strato di gel di chitosano intorno all’assemblato ottenuto in (ii); (iv). (i) preparation of the chitosan film and its winding on a cylindrical support; (ii) application, on the assembly obtained in (i), of the suitably hydrated collagen layer; (iii) formation of the chitosan gel layer around the assembly obtained in (ii); (iv).
parziale disidratazione dell’assemblato ottenuto in (iii). Il supporto cilindrico utilizzato in (i) non fa parte della protesi e viene quindi rimosso, preferibilmente al termine della fase (iii). partial dehydration of the assembly obtained in (iii). The cylindrical support used in (i) is not part of the prosthesis and is therefore removed, preferably at the end of step (iii).
Durante il suddetto procedimento, à ̈ preferibile applicare una soluzione di chitosano tra gli strati (a) e (b) e/o tra gli strati (b) e (c); tale soluzione, che può essere convenientemente uguale a quella utilizzata per preparare il gel, aumenta l’adesività tra gli strati coinvolti, e quindi la coesione della protesi nel suo insieme. Una modalità preferita e non limitativa per realizzare la protesi oggetto dell’invenzione à ̈ descritta come segue. During the above procedure, it is preferable to apply a chitosan solution between layers (a) and (b) and / or between layers (b) and (c); this solution, which can be conveniently the same as that used to prepare the gel, increases the adhesiveness between the layers involved, and therefore the cohesion of the prosthesis as a whole. A preferred and non-limiting method for making the prosthesis object of the invention is described as follows.
(i) Preparazione del film di chitosano. (i) Preparation of the chitosan film.
Il film viene preparato a partire da una soluzione acquosa di chitosano in presenza di un acido, ad es. acetico, acido borico, acido cloridrico o acido lattico. Il grado di deacetilazione di detto chitosano à ̈ compreso fra 40 e 98% e preferibilmente fra 60 e 97% e ancor più preferibilmente fra 70 e 95%. Il peso molecolare di detto chitosano à ̈ compreso fra 1 e 2.000 kDa, e preferibilmente fra 3 e 1.000 kDa e ancor più preferibilmente fra 5 e 300 kDa. La concentrazione del chitosano in detta soluzione à ̈ compresa fra 0,5 e 10% p/v. La concentrazione dell’acido à ̈ compresa fra 0, 1 e 5 % p/v e preferibilmente fra 0,5 e 2,5 % p/v. Detta soluzione comprende sali inorganici e zuccheri secondo quanto descritto nella domanda di brevetto W02008/ 077949, qui incorporata per riferimento. The film is prepared starting from an aqueous solution of chitosan in the presence of an acid, e.g. acetic, boric acid, hydrochloric acid or lactic acid. The degree of deacetylation of said chitosan is comprised between 40 and 98% and preferably between 60 and 97% and even more preferably between 70 and 95%. The molecular weight of said chitosan is comprised between 1 and 2,000 kDa, and preferably between 3 and 1,000 kDa and even more preferably between 5 and 300 kDa. The chitosan concentration in said solution is between 0.5 and 10% w / v. The acid concentration is between 0, 1 and 5% w / v and preferably between 0.5 and 2.5% w / v. Said solution comprises inorganic salts and sugars as described in patent application WO2008 / 077949, incorporated herein by reference.
La soluzione acquosa così ottenuta viene depositata un uno stampo di forma adeguata (ad es. rettangolare o quadrata) a formare uno strato sottile di opportuno e uniforme spessore. La soluzione nello stampo viene quindi posta ad essiccare, preferibilmente in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura compresa fra 35 e 50 °C e preferibilmente a 45 °C per un tempo compreso fra 30 e 90 minuti e preferibilmente tra 40 e 60 minuti ed ancor più preferibilmente per 45 minuti. 11 film essiccato così ottenuto viene, quindi, posto in una soluzione acquosa alcalina il cui pH non sia inferiore a 8. Detta soluzione alcalina à ̈ preferibilmente una soluzione di un idrossido di un metallo alcalino o di un metallo alcalino terroso, più preferibilmente si tratta di una soluzione di idrossido di sodio o di idrossido di potassio in concentrazione sufficiente per neutralizzare l’eccesso di acido contenuto nel film. Preferibilmente la concentrazione dell’idrossido di sodio o di potassio à ̈ compresa fra 0,5 e 15 % p/v, ancor più preferibilmente tra 3 e 6 % p/v. Il film neutralizzato à ̈ lavato in acqua distillata almeno per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta. The aqueous solution thus obtained is deposited in a mold of suitable shape (eg rectangular or square) to form a thin layer of suitable and uniform thickness. The solution in the mold is then left to dry, preferably in an air circulation oven at a temperature between 35 and 50 ° C and preferably at 45 ° C for a time between 30 and 90 minutes and preferably between 40 and 60 minutes and even more preferably for 45 minutes. The dried film thus obtained is then placed in an alkaline aqueous solution whose pH is not lower than 8. Said alkaline solution is preferably a solution of a hydroxide of an alkali metal or of an alkaline earth metal, more preferably it it is a solution of sodium hydroxide or potassium hydroxide in a concentration sufficient to neutralize the excess acid contained in the film. Preferably the sodium or potassium hydroxide concentration is between 0.5 and 15% w / v, even more preferably between 3 and 6% w / v. The neutralized film is washed in distilled water at least 3 times, keeping it in water for at least 10 minutes each time.
(ii). Applicazione dello strato di collagene (ii). Application of the collagen layer
Il film lavato viene posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con un sottile strato di soluzione di chitosano, preferibilmente uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso. Il volume di soluzione impiegata à ̈ compreso fra 1/4 e 4/4 del volume impiegato per la preparazione del film stesso, preferibilmente à ̈ compreso tra 1,5/4 e 3/4 ed ancor più preferibilmente à ̈ 1/2 del volume impiegato per la preparazione del film stesso. The washed film is placed on a flat surface and covered on the face exposed to the air with a thin layer of chitosan solution, preferably the same as that used for the preparation of the film itself. The volume of solution used is between 1/4 and 4/4 of the volume used for the preparation of the film itself, preferably it is between 1.5 / 4 and 3/4 and even more preferably it is 1/2 of the volume used for the preparation of the film itself.
Il film ricoperto di soluzione viene arrotolato completamente su un asta cilindrica rigida la cui lunghezza à ̈ circa del 20% superiore alla lunghezza finale della protesi ed il cui diametro à ̈ pari al diametro del lume della protesi che si vuole ottenere. Il film viene arrotolato intorno all’asta per una o più volte, preferibilmente fra 1 e 8 volte, più preferibilmente fra 2 e 6 volte, ed ancor più preferibilmente 4 volte. Detta asta à ̈ costituita di vetro, plexiglas, acciaio inossidabile, polivinilcloruro o teflon® rigido o altro materiale plastico rigido e dotato di superficie liscia. L’asta viene montata su un mandrino e posta in rotazione a tra 5 e 15 rpm e preferibilmente a 8 rpm, preferibilmente in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura compresa fra 35 e 50 °C e preferibilmente a 45 °C per un tempo compreso fra 30 e 90 minuti e preferibilmente tra 40 e 60 minuti ed ancor più preferibilmente per 45 minuti. The film covered with solution is rolled up completely on a rigid cylindrical rod whose length is approximately 20% greater than the final length of the prosthesis and whose diameter is equal to the diameter of the lumen of the prosthesis to be obtained. The film is rolled around the rod one or more times, preferably between 1 and 8 times, more preferably between 2 and 6 times, and even more preferably 4 times. Said rod is made of glass, Plexiglas, stainless steel, polyvinyl chloride or rigid Teflon® or other rigid plastic material with a smooth surface. The rod is mounted on a spindle and rotated at between 5 and 15 rpm and preferably at 8 rpm, preferably in an air-circulation oven at a temperature between 35 and 50 ° C and preferably at 45 ° C for a time comprised between 30 and 90 minutes and preferably between 40 and 60 minutes and even more preferably for 45 minutes.
Sull’asta ricoperta dal film così ottenuta viene arrotolato il foglio di collagene che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per almeno 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta aH’aria con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume sono uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui viene effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. The collagen sheet is rolled onto the rod covered by the film thus obtained, which has previously been hydrated in distilled water for at least 1 hour and covered on the face exposed to the air with a thin layer of chitosan solution whose composition and whose volume are equal to those used in the film coating described above. The procedure used to roll up the collagen sheet is the same as described for the chitosan film.
(iii) Applicazione dello strato di gel di chitosano (iii) Application of the chitosan gel layer
L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene viene montata su un mandrino e posta in rotazione tra 5 e 15 rpm e preferibilmente a 8 rpm, preferibilmente in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura compresa fra 35 e 50 °C e preferibilmente a 45 °C per un tempo compreso fra 30 e 90 minuti e preferibilmente tra 40 e 60 minuti ed ancor più preferibilmente per 45 minuti. Quindi, detta asta ricoperta viene inserita nella porzione centrale di uno stampo cilindrico di dimensioni compatibili con l’organo tubulare cavo che si vuole ricostruire mediante la protesi oggetto della presente invenzione. In particolare, il diametro interno del cilindro sottratto del diametro dell’asta ricoperta à ̈ pari allo spessore dello strato esterno di gel di chitosano, il quale coincide all’incirca con lo spessore della parete dell’organo cavo che si vuole riparare o ricostruire mediante la protesi oggetto della presente invenzione. The rod covered with the chitosan film and the collagen sheet is mounted on a spindle and rotated between 5 and 15 rpm and preferably at 8 rpm, preferably in an air-circulating oven at a temperature between 35 and 50 ° C and preferably at 45 ° C for a time comprised between 30 and 90 minutes and preferably between 40 and 60 minutes and even more preferably for 45 minutes. Then, said covered rod is inserted in the central portion of a cylindrical mold of dimensions compatible with the hollow tubular organ that is to be reconstructed by means of the prosthesis object of the present invention. In particular, the internal diameter of the cylinder subtracted from the diameter of the covered rod is equal to the thickness of the outer layer of chitosan gel, which roughly coincides with the thickness of the wall of the hollow organ to be repaired. or reconstruct with the prosthesis object of the present invention.
Lo stampo può essere costituito da un unico pezzo oppure da due o più pezzi che opportunamente assemblati costituiscono un cilindro. The mold can be made up of a single piece or of two or more pieces which, when suitably assembled, form a cylinder.
Il sistema così assemblato da luogo ad un’intercapedine cilindrica nella quale viene versata la soluzione acquosa di chitosano precedentemente descritta nella procedura di preparazione del gel. Il tutto viene posto ad una temperatura generalmente compresa tra -5 °C e -180 °C, preferibilmente fra -20 °C e -80 °C, più preferibilmente a -60°C, per un tempo variabile tra le 2 e le 24 ore, preferibilmente tra le 4 e le 10 ore e più preferibilmente per 6 ore. The system thus assembled gives rise to a cylindrical cavity into which the aqueous solution of chitosan previously described in the procedure for preparing the gel is poured. The whole is placed at a temperature generally between -5 ° C and -180 ° C, preferably between -20 ° C and -80 ° C, more preferably at -60 ° C, for a time varying between 2 and 24 hours, preferably between 4 and 10 hours and more preferably for 6 hours.
Quindi, lo stampo cilindrico viene tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale à ̈ posta, per un tempo compreso tra 6 e 60 ore, preferibilmente tra 24 e 54 ore, più preferibilmente 48 ore e ancor più preferibilmente per 12 ore, in una soluzione idroalcolica alcalina con pH uguale o superiore a 8 preventivamente raffreddata ad una temperatura compresa tra 4°C ed -60°C, preferibilmente tra -10 °C e -40 °C, e più preferibilmente -20 °C. La concentrazione di alcool in detta soluzione à ̈ compresa tra 40 e 95% v/v, preferibilmente à ̈ 60% v/v; detta soluzione alcalina à ̈ preferibilmente una soluzione di un idrossido di un metallo alcalino o di un metallo alcalino terroso, più preferibilmente idrossido di sodio o di potassio, in quantità sufficiente per neutralizzare l’eccesso di acido contenuto nel gel. Preferibilmente la concentrazione dell’idrossido di sodio o di potassio à ̈ compresa fra 0,5 e 15 % p/v, più preferibilmente tra 3 e 6 % p/v, ancor più preferibilmente à ̈ 5% p/v. Then, the cylindrical mold is removed and the frozen chitosan solution around the central rod is placed, for a time between 6 and 60 hours, preferably between 24 and 54 hours, more preferably 48 hours and even more preferably for 12 hours, in an alkaline hydroalcoholic solution with pH equal to or higher than 8 previously cooled to a temperature between 4 ° C and -60 ° C, preferably between -10 ° C and -40 ° C, and more preferably -20 ° C. The alcohol concentration in said solution is between 40 and 95% v / v, preferably 60% v / v; said alkaline solution is preferably a solution of a hydroxide of an alkali metal or of an alkaline earth metal, more preferably sodium or potassium hydroxide, in sufficient quantity to neutralize the excess acid contained in the gel. Preferably the sodium or potassium hydroxide concentration is between 0.5 and 15% w / v, more preferably between 3 and 6% w / v, even more preferably it is 5% w / v.
Il tutto viene quindi lavato in soluzione fisiologica almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Con il termine soluzione fisiologica si intende una soluzione acquosa che presenti un’osmolarità pari a quella di liquidi fisiologici, tipicamente detta soluzione à ̈ una soluzione acquosa contenente 0,9 grammi di cloruro di sodio per 100 mL di acqua distillata. Il lavaggio comporta l’eliminazione dei sali inorganici e zuccheri contenuti nella soluzione usata per formare il gel; tali sali e zuccheri, benché necessari per la formazione degli strati di gel e film citocompatibili, non sono necessari per la funzionalità nella protesi finita. The whole is then washed in physiological solution at least 3 times, keeping it in said solution for at least 10 minutes each time. The term physiological solution means an aqueous solution that has an osmolarity equal to that of physiological liquids, typically said solution is an aqueous solution containing 0.9 grams of sodium chloride per 100 mL of distilled water. Washing involves eliminating the inorganic salts and sugars contained in the solution used to form the gel; these salts and sugars, although necessary for the formation of the cytocompatible gel and film layers, are not necessary for their functionality in the finished prosthesis.
(iv) parziale disidratazione (iv) partial dehydration
Quindi, si procede a sfilare l’asta centrale e si pone la protesi cilindrica così ottenuta ad una temperatura compresa fra 4 e 40 °C e preferibilmente fra 10 e 35 °C ed ancor più preferibilmente a 25 °C per un tempo compreso fra 5 e 180 minuti, preferibilmente fra 15 e 90 minuti ed ancor più preferibilmente per 30 minuti. Si ottiene così un grado di essiccamento intermedio in cui lo strato esterno à ̈ in uno stato gelificato a maggiore densità , dotato quindi di un grado di rigidità sufficiente per permettere la manipolazione della protesi da parte del chirurgo. La protesi viene quindi confezionata in un opportuno contenitore sigillato, così da mantenere costante il grado di disidratazione ottenuto, fino al momento dell’uso. Le operazioni sopradescritte sono condotte in un ambiente sterile ad esempio in una cappa a flusso laminare d’aria sterilizzata attraverso un filtro assoluto HEPA o in una stanza classificata come 100 secondo Federai Standard N. 209. In alternativa, dette operazioni possono essere condotte in un ambiente non sterile e la protesi viene sterilizzata in autoclave o mediante radiazioni ionizzanti in accordo con le procedure descritte dalla Farmacopea Ufficiale della Repubblica Italiana (FU XII ed.) capitolo 5.1 pagina 678. Detto processo di sterilizzazione non comporta una modificazione delle caratteristiche della protesi. Then, the central rod is removed and the cylindrical prosthesis thus obtained is placed at a temperature between 4 and 40 ° C and preferably between 10 and 35 ° C and even more preferably at 25 ° C for a period of time included. between 5 and 180 minutes, preferably between 15 and 90 minutes and even more preferably for 30 minutes. An intermediate degree of drying is thus obtained in which the outer layer is in a gelled state with greater density, thus having a degree of rigidity sufficient to allow the surgeon to manipulate the prosthesis. The prosthesis is then packaged in a suitable sealed container, so as to keep the degree of dehydration obtained constant, until the moment of use. The operations described above are carried out in a sterile environment, for example in a laminar flow hood with sterilized air through an absolute HEPA filter or in a room classified as 100 according to Federal Standard No. 209. Alternatively, these operations can be carried out in a non-sterile environment and the prosthesis is sterilized in an autoclave or by ionizing radiation in accordance with the procedures described in the Official Pharmacopoeia of the Italian Republic (FU XII ed.) chapter 5.1 page 678. This sterilization process does not involve a modification of the characteristics of the prosthesis .
La protesi in accordo con la presente invenzione possiede elevate caratteristiche di citocompatibilità e adeguata resistenza meccanica per essere suturata ad un tessuto vivente. Inoltre, la sua struttura a più strati permette una colonizzazione differenziata di diversi tipi di cellule e, quindi, una ricostruzione adeguata di organi cavi che riproduce la fisiologica stratificazione dei tessuti che esplicano una differente funzione. The prosthesis according to the present invention possesses high characteristics of cytocompatibility and adequate mechanical resistance to be sutured to a living tissue. Furthermore, its multi-layered structure allows a differentiated colonization of different types of cells and, therefore, an adequate reconstruction of hollow organs that reproduces the physiological stratification of the tissues that perform a different function.
Il particolare, l’impiego di un film o un gel tridimensionale di chitosano preparato secondo quanto descritto nella domanda di brevetto W02008/ 077949, opportunamente uniti tra loro mediante un foglio di collagene idratato, danno luogo ad un composito ad elevata citocompatibilità , ottimale per la crescita cellulare. Tali caratteristiche di citocompatibilità , unitamente ad una resistenza meccanica adeguata per la manipolazione e saturazione chirurgica, si riscontrano anche nella protesi ottenuta per parziale disidratazione del composito. La protesi cosi realizzata mantiene la struttura a tre strati sopra descritta, con la particolarità che foglio intermedio di collagene (b) risulta parzialmente interfuso all’interfaccia con gli strati (a) e (c). The particular, the use of a three-dimensional film or gel of chitosan prepared as described in the patent application W02008 / 077949, suitably joined together by means of a sheet of hydrated collagen, gives rise to a composite with high cytocompatibility, optimal for cell growth. These characteristics of cytocompatibility, together with an adequate mechanical resistance for surgical manipulation and saturation, are also found in the prosthesis obtained by partial dehydration of the composite. The prosthesis thus made maintains the three-layer structure described above, with the particularity that an intermediate sheet of collagen (b) is partially interfused at the interface with layers (a) and (c).
Un’ulteriore caratteristica della presente invenzione riguarda la capacità dello strato interno non poroso di trattenere nel lume della protesi cilindrica i fluidi fisiologici che possono scorrere nella protesi stessa a seguito della sua anastomosi su un organo cavo deputato al trasporto di detti fluidi. Infatti, l’impiego di un tubo di solo collagene, costruito secondo la procedura impiegata per la costruzione della protesi multistrato ma senza il film di chitosano nella porzione luminale e il gel di chitosano nella porzione esterna, non à ̈ in grado di trattenere detti fluidi fisiologici all’interno della protesi e di evitarne lo sversamento (trasudamento) negli spazi circostanti. A further feature of the present invention relates to the capacity of the non-porous internal layer to retain in the lumen of the cylindrical prosthesis the physiological fluids that can flow in the prosthesis itself following its anastomosis on a hollow organ dedicated to the transport of said fluids. In fact, the use of a collagen-only tube, built according to the procedure used for the construction of the multilayer prosthesis but without the chitosan film in the luminal portion and the chitosan gel in the external portion, is not able to retain these physiological fluids inside the prosthesis and to avoid spilling (exudation) into the surrounding spaces.
La presente invenzione comprende l’utilizzo della suddetta protesi nella preparazione di protesi per la chirurgia ricostruttiva o sostitutiva di organi cavi o porzioni di essi, in particolare per la ricostruzione o sostituzione di vie biliari, vasi arteriosi o venosi, dotti pancreatici, porzioni dell’intestino, dell’apparato respiratorio, dell’esofago, delle vie genito- urinarie, ecc. L’invenzione comprende inoltre l’uso delle suddette protesi nella chirurgia ricostruttiva o sostitutiva dei suddetti organi cavi o porzioni di essi. L’invenzione comprende inoltre un metodo di chirurgia ricostruttiva o sostitutiva dei suddetti organi cavi o porzioni di essi, comprendente rimpianto delle suddette protesi in un paziente che ne necessita. The present invention includes the use of the aforementioned prosthesis in the preparation of prostheses for reconstructive or replacement surgery of hollow organs or portions of them, in particular for the reconstruction or replacement of biliary tracts, arterial or venous vessels, pancreatic ducts, portions of the Intestine, respiratory system, esophagus, genitourinary tract, etc. The invention also includes the use of the aforesaid prostheses in reconstructive or replacement surgery of the aforesaid hollow organs or portions of them. The invention furthermore comprises a method of reconstructive or replacement surgery of the aforesaid hollow organs or portions thereof, comprising regret of the aforesaid prostheses in a patient who needs them.
A titolo esemplificativo, ma non limitativo vengono di seguito riportati alcuni esempi relativi alla preparazione e illustranti le caratteristiche dell’invenzione. By way of non-limiting example, some examples relating to the preparation and illustrating the characteristics of the invention are reported below.
PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART
Esempio 1 Preparazione della protesi tabulare multistrato tipo I Example 1 Preparation of the type I multilayer tabular prosthesis
Il film à ̈ stato preparato sciogliendo 4.5 g di chitosano (Chitosan 95/50/A1-P, batch no. 200-22409-03, HMC<+>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 95% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK) A detta soluzione sono stati aggiunti 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) e sono stati quindi aggiunti 19,9 grammi di D-(+) -raffino sio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany). The film was prepared by dissolving 4.5 g of chitosan (Chitosan 95/50 / A1-P, batch no. 200-22409-03, HMC <+>, Halle, Germany) with a molecular weight of 150 kDa and a medium degree of deacetylation. equal to 95% in 100 mL of an aqueous solution containing 1% (v / v) of acetic acid (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK) To this solution 800 mg of sodium chloride, 20 mg of potassium chloride, 115 mg of monosodium phosphate and 20 mg of monopotassium phosphate (all salts were RPE grade, Carlo Erba, Milan, Italy) and then 19.9 grams of D - (+) -raffino sio pentahydrate were added (lot # 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).
5 mL di detta soluzione sono stati colati in un uno stampo di forma rettangolare (5x10 cm) a formare uno strato di 1 mm di spessore. La soluzione nello stampo à ̈ stata posta in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. Il film essiccato così ottenuto à ̈ stato, quindi, posto per 6 ore in una soluzione acquosa di idrossido di potassio con concentrazione pari a 5% (p/v) avente pH pari a 10. 5 mL of said solution was poured into a rectangular mold (5x10 cm) to form a 1 mm thick layer. The solution in the mold was placed in an air circulation oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes. The dried film thus obtained was then placed for 6 hours in an aqueous solution of potassium hydroxide with a concentration of 5% (w / v) and a pH of 10.
Il film neutralizzato à ̈ stato lavato in acqua distillata per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta. The neutralized film was washed in distilled water 3 times, keeping it in water for at least 10 minutes each time.
Il film lavato à ̈ stato posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta aU’arìa con 2.5 mL di una soluzione di chitosano di composizione uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso. The washed film was placed on a flat surface and covered on the face exposed to the area with 2.5 mL of a chitosan solution of the same composition as that used for the preparation of the film itself.
II film ricoperto di detta soluzione à ̈ stato arrotolato completamente su un asta cilindrica in plexiglas<®>di lunghezza 90 mm e diametro 5 mm. Il film à ̈ stato arrotolato intorno all’asta per 4 volte. The film covered with said solution was completely rolled on a cylindrical Plexiglas rod <®> 90 mm long and 5 mm diameter. The film was rolled around the rod 4 times.
L’asta à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. The rod was mounted on a spindle and rotated at 8 rpm in an air-circulation oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes.
Quindi, sull’asta ricoperta dal film à ̈ stata arrotolato il foglio di collagene di 3x7 cm (spessore, 0,2 mm) (Surgisis, lot. n, LB 409116 Cook Medicai, Irlanda) che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta albana con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume erano uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui à ̈ stato effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. L’assemblato così ottenuto (asta+film+foglio di collagene) à ̈ stato inserito nella porzione centrale di uno stampo cilindrico in plexiglas<®>di 99 mm di lunghezza e di 8 mm di diametro. Nell’intercapedine dell’assemblato così ottenuto sono stati versati 3,2 mL di una soluzione acquosa di chitosano di composizione uguale a quella impiegata per la preparazione del film sopra descritta. Then, the 3x7 cm (thickness, 0.2 mm) collagen sheet (Surgisis, lot. N, LB 409116 Cook Medicai, Ireland) was rolled onto the film-covered rod and previously hydrated in water distilled for 1 hour and covered on the exposed albana face with a thin layer of chitosan solution whose composition and volume were the same as those used in the film coating described above. The procedure used to roll up the collagen sheet is the same as described for the chitosan film. The rod covered with the chitosan film and the collagen sheet was mounted on a spindle and rotated at 8 rpm in an air-circulating oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes. The assembly thus obtained (rod + film + collagen sheet) was inserted in the central portion of a cylindrical mold in Plexiglas <®> of 99 mm in length and 8 mm in diameter. 3.2 mL of an aqueous solution of chitosan of the same composition as that used for the preparation of the film described above was poured into the cavity of the assembly thus obtained.
Il tutto à ̈ stato posto in un frigorifero alla temperatura di -60°C per 6 ore. The whole thing was placed in a refrigerator at a temperature of -60 ° C for 6 hours.
Quindi, sotto una cappa a flusso laminare verticale, il supporto cilindrico à ̈ stato tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale é stata posta per 12 ore in una soluzione idroalcolica costituita da 60% (v/v) di etanolo (95 °) e 40% soluzione acquosa di idrossido di potassio (5% p/v) mantenuta alla temperatura di -20 °C. Dopo detto tempo, sempre sotto una cappa a flusso laminare verticale, il tutto à ̈ stato neutralizzato mediante lavaggi in soluzione fisiologica sterile (0,9% p/v di NaCl in acqua) almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Quindi, sotto cappa a flusso laminare verticale, si à ̈ proceduto a sfilare l’asta centrale e si à ̈ esposto la protesi cilindrica così ottenuto al flusso dell’aria della cappa ad una temperatura di 25 °C per 30 minuti. Then, under a vertical laminar flow hood, the cylindrical support was removed and the chitosan solution frozen around the central rod was placed for 12 hours in a hydroalcoholic solution consisting of 60% (v / v) of ethanol (95 °) and 40% aqueous solution of potassium hydroxide (5% w / v) maintained at a temperature of -20 ° C. After said time, always under a vertical laminar flow hood, everything was neutralized by washing in sterile physiological solution (0.9% w / v of NaCl in water) at least 3 times, keeping it in said solution for at least 10 minutes each time. Then, under a vertical laminar flow hood, the central rod was removed and the cylindrical prosthesis thus obtained was exposed to the air flow of the hood at a temperature of 25 ° C for 30 minutes.
La protesi così ottenuta à ̈ stata posta in un contenitore sterile, chiuso ermeticamente, e conservata a temperatura ambiente sino al momento dell’uso. The resulting prosthesis was placed in a sterile, hermetically sealed container and stored at room temperature until use.
Esempio 2 Preparazione della protesi tabulare multistrato tipo 2 Example 2 Preparation of the multi-layer tabular prosthesis type 2
Il film à ̈ stato preparato sciogliendo 4.5 g di chitosano (ACEF, Fiorenzuola d’Arda (PC) con peso molecolare di 10 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 90% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK) A detta soluzione sono aggiunti 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) sono stati quindi aggiunti 19,9 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany). The film was prepared by dissolving 4.5 g of chitosan (ACEF, Fiorenzuola dâ € ™ Arda (PC) with a molecular weight of 10 kDa and an average degree of deacetylation equal to 90% in 100 mL of an aqueous solution containing 1% (v / v) of acetic acid (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK) To this solution are added 800 mg of sodium chloride, 20 mg of potassium chloride, 115 mg of monosodium phosphate and 20 mg of monopotassium phosphate (all salts were of grade RPE, Carlo Erba, Milan, Italy) were then added 19.9 grams of D - (+) - raffinose pentahydrate (lot # 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).
4 mL di detta soluzione sono stati colati in un uno stampo di forma rettangolare (5x8 cm) a formare uno strato di 1 mm di spessore. La soluzione nello stampo à ̈ stata posta in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. Il film essiccato così ottenuto à ̈ stato, quindi, posto per 6 ore in una soluzione acquosa di idrossido di potassio con concentrazione pari a 5% (p/v) e avente pH pari a lO. 4 mL of this solution was poured into a rectangular mold (5x8 cm) to form a 1 mm thick layer. The solution in the mold was placed in an air circulation oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes. The dried film thus obtained was then placed for 6 hours in an aqueous solution of potassium hydroxide with a concentration equal to 5% (w / v) and having a pH equal to 10.
Il film neutralizzato à ̈ stato lavato in acqua distillata per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta. The neutralized film was washed in distilled water 3 times, keeping it in water for at least 10 minutes each time.
II film lavato à ̈ stato posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con 2 mL di una soluzione di chitosano di composizione uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso. The washed film was placed on a flat surface and covered on the face exposed to the air with 2 mL of a chitosan solution of the same composition as that used for the preparation of the film itself.
Il film ricoperto di soluzione à ̈ stato arrotolato completamente su un asta cilindrica in plexiglas<®>di lunghezza 90 mm e diametro 5 mm. Il film à ̈ stato arrotolato intorno all’asta per 4 volte. The solution-coated film was rolled up completely on a cylindrical Plexiglas rod <®> with a length of 90 mm and a diameter of 5 mm. The film was rolled around the rod 4 times.
L’asta à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. The rod was mounted on a spindle and rotated at 8 rpm in an air-circulation oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes.
Sull’asta ricoperta dal film così ottenuta à ̈ stata arrotolato il foglio di collagene di 2x7 cm (Collagen-Klee, Collageno.com, Spagna) che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume erano uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui à ̈ stato effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. The 2x7 cm collagen sheet (Collagen-Klee, Collageno.com, Spain) was rolled onto the rod covered by the film thus obtained and previously hydrated in distilled water for 1 hour and covered on the face exposed to the € ™ air with a thin layer of chitosan solution whose composition and volume were the same as those used in the film coating described above. The procedure used to roll up the collagen sheet is the same as described for the chitosan film. The rod covered with the chitosan film and the collagen sheet was mounted on a spindle and rotated at 8 rpm in an air-circulating oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes.
L’assemblato così ottenuto (asta+film+foglio di collagene) à ̈ stato inserito nella porzione centrale di uno stampo cilindrico di 99 mm di lunghezza e di 8 mm di diametro. The assembly thus obtained (rod + film + collagen sheet) was inserted in the central portion of a cylindrical mold 99 mm long and 8 mm in diameter.
Nell’intercapedine dell’assemblato così ottenuto sono stati versati 3,2 mL di una soluzione acquosa di chitosano ottenuta disciogliendo 2 g di chitosano (Chitosan 95/50/A1-P, batch no. 200-22409-03, HMC<+>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 95% in 100 mi di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K32985617409, DBH, Poole, UK), 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) e 20 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany). 3.2 mL of an aqueous solution of chitosan obtained by dissolving 2 g of chitosan (Chitosan 95/50 / A1-P, batch no. 200-22409-03, HMC <+>, Halle, Germany) with a molecular weight of 150 kDa and an average degree of deacetylation equal to 95% in 100 ml of an aqueous solution containing 1% (v / v) of acetic acid (Lot. K32985617409, DBH, Poole, UK), 800 mg of sodium chloride, 20 mg of potassium chloride, 115 mg of monosodium phosphate and 20 mg of monopotassium phosphate (all salts were of grade RPE, Carlo Erba, Milan, Italy) and 20 grams of D- (+) - raffinose pentahydrate (lot # 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).
II tutto à ̈ stato posto in un frigorifero alla temperatura di -60°C per 6 ore. Everything was placed in a refrigerator at a temperature of -60 ° C for 6 hours.
Quindi, sotto una cappa a flusso laminare verticale, lo stampo cilindrico à ̈ stato tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale é stata posta per 12 ore in una soluzione idroalcolica costituita da 60% (v/v) di etanolo (95 °) e 40% soluzione acquosa di idrossido di potassio (5% p/v) mantenuta alla temperatura di -20 °C. Dopo detto tempo, sempre sotto una cappa a flusso laminare verticale, il tutto à ̈ stato neutralizzato mediante lavaggi in soluzione fisiologica sterile (0,9% p/v di NaCl in acqua) almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Quindi, sotto cappa a flusso laminare verticale, si à ̈ proceduto a sfilare l’asta centrale e si à ̈ esposta la protesi cilindrica così ottenuta al flusso dell’aria della cappa ad una temperatura di 25 °C per 30 minuti. La protesi così ottenuta à ̈ stata posta in un contenitore sterile, chiuso ermeticamente, e conservata a temperatura ambiente sino al momento dell’uso. Then, under a vertical laminar flow hood, the cylindrical mold was removed and the chitosan solution frozen around the central rod was placed for 12 hours in a hydroalcoholic solution consisting of 60% (v / v) of ethanol (95 °) and 40% aqueous solution of potassium hydroxide (5% w / v) maintained at a temperature of -20 ° C. After said time, always under a vertical laminar flow hood, everything was neutralized by washing in sterile physiological solution (0.9% w / v of NaCl in water) at least 3 times, keeping it in said solution for at least 10 minutes each time. Then, under a vertical laminar flow hood, the central rod was removed and the cylindrical prosthesis thus obtained was exposed to the air flow of the hood at a temperature of 25 ° C for 30 minutes. The resulting prosthesis was placed in a sterile, hermetically sealed container and stored at room temperature until use.
Esempio 3 Preparazione della protesi tubulare multistrato tipo 3 Example 3 Preparation of the multilayer tubular prosthesis type 3
Il film à ̈ stato preparato sciogliendo 4.5 g di chitosano (Chitosan 75/50/A1-P, batch no. 200-230409-02, HMC<+>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 75% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K32985617409, DBH, Poole, UK) A detta soluzione sono aggiunti 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) sono stati quindi aggiunti 19,9 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany). The film was prepared by dissolving 4.5 g of chitosan (Chitosan 75/50 / A1-P, batch no. 200-230409-02, HMC <+>, Halle, Germany) with a molecular weight of 150 kDa and an average degree of deacetylation. equal to 75% in 100 mL of an aqueous solution containing 1% (v / v) of acetic acid (Lot. K32985617409, DBH, Poole, UK) To this solution are added 800 mg of sodium chloride, 20 mg of potassium, 115 mg of monosodium phosphate and 20 mg of monopotassium phosphate (all salts were of RPE grade, Carlo Erba, Milan, Italy) were then added 19.9 grams of D - (+) - raffinose pentahydrate (lot # 0001433730 , Fluka, Steinheim, Germany).
Circa 2 mL di detta soluzione sono stati colati in un uno stampo di forma rettangolare (5x4 cm) a formare uno strato di 1 mm di spessore. La soluzione nello stampo à ̈ stata posta in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. Il film essiccato così ottenuto à ̈ stato, quindi, posto per 6 ore in una soluzione acquosa di idrossido di potassio con concentrazione pari a 5% (p/v) e avente pH pari a 10. About 2 mL of said solution was poured into a rectangular mold (5x4 cm) to form a 1 mm thick layer. The solution in the mold was placed in an air circulation oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes. The dried film thus obtained was then placed for 6 hours in an aqueous solution of potassium hydroxide with a concentration of 5% (w / v) and a pH of 10.
II film neutralizzato à ̈ stato lavato in acqua distillata per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta. The neutralized film was washed in distilled water 3 times, keeping it in water for at least 10 minutes each time.
Il film lavato à ̈ stato posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con 1 mL di una soluzione di chitosano di composizione uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso. The washed film was placed on a flat surface and covered on the face exposed to the air with 1 mL of a chitosan solution of the same composition as that used for the preparation of the film itself.
Il film ricoperto di soluzione à ̈ stato arrotolato completamente su un asta cilindrica in plexiglas<®>di lunghezza 40 mm e diametro 5 mm. Il film à ̈ stato arrotolato intorno all’asta per 6 volte. The solution-coated film was completely rolled onto a cylindrical Plexiglas rod <®> with a length of 40 mm and a diameter of 5 mm. The film was rolled around the rod 6 times.
L’asta à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. The rod was mounted on a spindle and rotated at 8 rpm in an air-circulation oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes.
Sull’asta ricoperta dal film così ottenuta à ̈ stata arrotolato il foglio di collagene di 1,5x2 cm (OsseoGuard, REF OG1520 lot.CM3N07E3 Collagen Matrix, USA) che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta alfaria con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume erano uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui à ̈ stato effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. The 1.5x2 cm collagen sheet (OsseoGuard, REF OG1520 lot.CM3N07E3 Collagen Matrix, USA) was rolled onto the rod covered by the film thus obtained and previously hydrated in distilled water for 1 hour and covered on the face exposed to alfaria with a thin layer of chitosan solution whose composition and volume were the same as those used, the coating of the film described above. The procedure used to roll up the collagen sheet is the same as described for the chitosan film. The rod covered with the chitosan film and the collagen sheet was mounted on a spindle and rotated at 8 rpm in an air-circulating oven at a temperature of 45 ° C for 45 minutes.
L’assemblato così ottenuto (asta+film foglio di collagene) à ̈ stato inserito nella porzione centrale di uno stampo cilindrico di 50 mm di lunghezza e di 8 mm di diametro. The assembly thus obtained (rod + collagen film sheet) was inserted in the central portion of a cylindrical mold 50 mm long and 8 mm in diameter.
NeH’intercapedine dell’assemblato così ottenuto sono stati versati 1, 92 mL di una soluzione acquosa di chitosano ottenuta disciogliendo 2 g di chitosano (Chitosan 75/50/A1-P, batch no. 200-230409-02, HMC<H>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 95% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK), 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) e 20 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germania). 1.92 mL of an aqueous solution of chitosan obtained by dissolving 2 g of chitosan (Chitosan 75/50 / A1-P, batch no. 200-230409-02, HMC <H>, Halle, Germany) with a molecular weight of 150 kDa and an average degree of deacetylation equal to 95% in 100 mL of an aqueous solution containing 1% (v / v) of acetic acid (Lot. K329856 17409, DBH, Poole , UK), 800 mg of sodium chloride, 20 mg of potassium chloride, 115 mg of monosodium phosphate and 20 mg of monopotassium phosphate (all salts were of grade RPE, Carlo Erba, Milan, Italy) and 20 grams of D - (+) - raffinose pentahydrate (lot # 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).
Il tutto à ̈ stato posto in un frigorifero alla temperatura di -60°C per 6 ore. The whole thing was placed in a refrigerator at a temperature of -60 ° C for 6 hours.
Quindi, sotto una cappa a flusso laminare verticale, il supporto cilindrico à ̈ stato tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale é stata posta per 12 ore in una soluzione idroalcolica costituita da 60% (v/v) di etanolo (95 °) e 40% soluzione acquosa di idrossido di potassio (5% p/v) mantenuta alla temperatura di -20 °C. Dopo detto lasso di tempo, sempre sotto una cappa a flusso laminare verticale, il tutto à ̈ stato neutralizzato mediante lavaggi in soluzione fisiologica sterile (0,9% p/v di NaCl in acqua) almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Quindi, sotto cappa a flusso laminare verticale, si à ̈ proceduto a sfilare l’asta centrale e si à ̈ esposta la protesi cilindrica così ottenuto al flusso dell’aria della cappa ad una temperatura di 25 °C per 30 minuti. Then, under a vertical laminar flow hood, the cylindrical support was removed and the chitosan solution frozen around the central rod was placed for 12 hours in a hydroalcoholic solution consisting of 60% (v / v) of ethanol (95 °) and 40% aqueous solution of potassium hydroxide (5% w / v) maintained at a temperature of -20 ° C. After this period of time, always under a vertical laminar flow hood, everything was neutralized by washing in sterile physiological solution (0.9% w / v of NaCl in water) at least 3 times, keeping it in said solution to at least 10 minutes each time. Then, under a vertical laminar flow hood, the central rod was removed and the cylindrical prosthesis thus obtained was exposed to the air flow of the hood at a temperature of 25 ° C for 30 minutes.
La protesi così ottenuta (Figura 1) à ̈ stata posta in un contenitore sterile, chiusa ermeticamente, e conservata a temperatura ambiente sino al momento dell’uso. The resulting prosthesis (Figure 1) was placed in a sterile, hermetically sealed container and stored at room temperature until use.
Esempio 4 Resistenza meccanica Example 4 Mechanical resistance
La resistenza meccanica alla trazione ed alla sutura di un film di chitosano o della protesi preparati secondo quanto descritto nell’esempio 1 sono stati determinati applicando uno stress in trazione per mezzo di un dinamometro (Acquati AG MCI, Italia) su provini di 10x12 mm di dimensione e aventi spessore pari 0,4 mm e 3,2 mm per il film, e la protesi rispettivamente. Detti provini sono stati ottenuti ritagliando un film di chitosano o la protesi preparati secondo quanto descritto nell’esempio 1. I provini sono stati stirati sino alla rottura ad una velocità di trazione di 15mm/ min. The mechanical resistance to traction and suture of a chitosan film or of the prosthesis prepared as described in example 1 were determined by applying a tensile stress by means of a dynamometer (Acquati AG MCI, Italy) on 10x12 mm samples. in size and having a thickness of 0.4 mm and 3.2 mm for the film, and the prosthesis respectively. Said specimens were obtained by cutting out a chitosan film or the prosthesis prepared as described in example 1. The specimens were stretched until breaking at a tensile speed of 15mm / min.
II segnale analogico corrispondente alla forza applicata dallo strumento à ̈ stato digitalizzato per mezzo di una scheda PowerLab 400 e registrato in funzione del tempo tramite un software Scope 3.5 software funzionante su un computer Macintosh Powerbook G3 (Apple, USA). La forza applicata, normalizzata per lo spessore del provino, à ̈ stata rappresentata in grafico in funzione della deformazione (allungamento). Quest’ultima à ̈ stata calcolata tenendo conto della velocità di allungamento applicata dallo strumento. La pendenza del tratto lineare della curva ottenuta à ̈ stata presa come valore del modulo elastico (Physical Pharmacy, A. Martin Ed.. 4<th>Edition, Lea Ss Febiger, Philadelphia, London, 1993, pp. 575-578) secondo l’equazione: The analog signal corresponding to the force applied by the instrument was digitized by means of a PowerLab 400 card and recorded as a function of time by means of a Scope 3.5 software running on a Macintosh Powerbook G3 computer (Apple, USA). The applied force, normalized for the thickness of the specimen, was plotted as a function of the deformation (elongation). The latter was calculated taking into account the elongation speed applied by the instrument. The slope of the linear section of the obtained curve was taken as the value of the elastic modulus (Physical Pharmacy, A. Martin Ed .. 4 <th> Edition, Lea Ss Febiger, Philadelphia, London, 1993, pp. 575-578) according to the equation:
F JL -LA F JL -LA
— -E -4 V A) j â € ”-E -4 V A) j
nella quale F à ̈ la forza applicata alla unità di area in sezione del provino, A, E rappresenta il modulo elastico e L e Lo rappresentano rispettivamente la lunghezza misurata e la lunghezza iniziale. in which F is the force applied to the unit of area in section of the specimen, A, E represents the elastic modulus and L and Lo represent the measured length and the initial length respectively.
E’ stato inoltre registrato il valore percentuale di allungamento registrato alla rottura del provino. The percentage value of elongation recorded at the breaking of the specimen was also recorded.
In Tabella 1 sono riportati i valori di modulo elastico e di allungamento alla rottura per i campioni testati. Table 1 shows the elastic modulus and elongation at break values for the tested samples.
Tabella T. Modulo elastico e di allungamento alla rottura di provini di dimensione 10x12 mm ottenuti dal fìlm e dalla protesi preparati secondo quanto descritto nelVesempio 1. Deviazione standard in parentesi (n=3)- Table T. Modulus of elasticity and elongation at break of 10x12 mm specimens obtained from film and prosthesis prepared as described in Example 1. Standard deviation in brackets (n = 3) -
Modulo Elastico, x IO<3>Allungamento alla rottura, N/m<2>% Elastic modulus, x IO <3> Elongation at break, N / m <2>%
Film di chitosano 257 (19) 17 (1) Chitosan film 257 (19) 17 (1)
Protesi > 1600 Prosthetics> 1600
II valore di allungamento alla rottura nel caso della protesi à ̈ risultato superiore alla capacità di misura dello strumento e comunque maggiore di 100%, vale a dire almeno un ordine di grandezza superiore rispetto al valore registrato per il film. Si osserva che il film presentava un modulo elastico, e quindi una rigidità , significativamente più basso rispetto alla protesi. The elongation value at break in the case of the prosthesis was higher than the measuring capacity of the instrument and in any case greater than 100%, ie at least an order of magnitude higher than the value recorded for the film. It is observed that the film had an elastic modulus, and therefore a rigidity, significantly lower than the prosthesis.
Le caratteristiche di resistenza meccanica misurate per la protesi ne permettono un’efficace saturabilità ai tessuti del paziente, garantendo inoltre un’elevata resistenza allo stress funzionale in-vivo dopo rimpianto. The mechanical resistance characteristics measured for the prosthesis allow it to be effectively saturated with the patient's tissues, also guaranteeing high resistance to functional stress in-vivo after regret.
Esempio 5 Impermeabilità del film agli acidi biliari La permeabilità di soluzioni acquose di bile bovina alla concentrazione di 30 mg/mL attraverso il film {spessore 200 Î1⁄4ιη) di chitosano preparato a partire da una soluzione di chitosano alla concentrazione di 4,5%, come descritto nell’esempio 1, à ̈ stata determinata per mezzo di una cella di permeazione verticale tipo Resomat II (H.W. Dibbem et al, Arzeneim.-Forsch./Drug Res. (1969) 19, 1140-) Una porzione del film di superficie pari a 0,6 cm<2>à ̈ stata posta fra il compartimento donatore e quello ricevente della cella di permeazione. Il compartimento donatore conteneva 200 Î1⁄4Î ^di soluzione acquosa di bile bovina ricostituita (Sigma. Adrich, USA) mentre il compartimento ricevente conteneva 100 mL di acqua distillata. La cella era mantenuta alla temperatura costante di 37 °C. Example 5 Impermeability of the film to bile acids The permeability of aqueous solutions of bovine bile at a concentration of 30 mg / mL through the film {thickness 200 Î1⁄4ιΠ·) of chitosan prepared starting from a solution of chitosan at a concentration of 4.5 %, as described in example 1, was determined by means of a vertical permeation cell type Resomat II (H.W. Dibbem et al, Arzeneim.-Forsch./Drug Res. (1969) 19, 1140-) A portion of the surface film equal to 0.6 cm <2> was placed between the donor and recipient compartment of the permeation cell. The donor compartment contained 200 Î1⁄4Î ^ of reconstituted bovine bile aqueous solution (Sigma. Adrich, USA) while the recipient compartment contained 100 mL of distilled water. The cell was kept at a constant temperature of 37 ° C.
Ad intervalli di tempo prefissati, 1,5 mL di soluzione sono stati prelevati dal compartimento ricevente, sostituiti con acqua distillata ed analizzati in spettroscopia UV visibile secondo il metodo colorimetrico descritto da Reihnold e Wilson ( J.G Reinhold and D.W. Wilson, J. Biol Chem, (1932) 96, 637) allo scopo di quantificare gli acidi colici permeati. At predetermined time intervals, 1.5 mL of solution was withdrawn from the receiving compartment, replaced with distilled water and analyzed in visible UV spectroscopy according to the colorimetric method described by Reihnold and Wilson (J.G Reinhold and D.W. Wilson, J. Biol Chem, (1932) 96, 637) for the purpose of quantifying permeated cholic acids.
La percentuale di acidi colici permeata attraverso il film nel lasso di tempo di due giorni risultava inferiore al 3%, ottenendo così un grado di impermeabilità adeguato ai fini dell’invenzione . The percentage of cholic acids permeated through the film in the time span of two days was less than 3%, thus obtaining a degree of impermeability suitable for the purposes of the invention.
Else m pio 6 Emocompatibilìtà in vitro, test di adesione piastrinica su film di chitosano Else m pio 6 Hemocompatibility in vitro, platelet adhesion test on chitosan film
Campioni di sangue sono stati raccolti da donatori umani sani, evitando la stasi venosa prolungata, e posti in provette Vacutainer 3.5 mL contenenti K3EDTA come anticoagulante. Una prima provetta contenente sangue intero à ̈ stata centrifugata per 10 min a 500 g, ed il sovranatante ricentrifugato a 800 g. Il sovranatante ottenuto da una seconda provetta di sangue à ̈ stato sottoposto ad una nuova centrifugazione a 3000 g per 15 min. Nei due sovranatanti ottenuti, definiti “plasma ricco di proteine†(PRP) e “plasma povero di proteine (PPP), à ̈ stata determinata la concentrazione di piastrine. La concentrazione piastrinica del plasma utilizzato nel test di adesione à ̈ stata portata a l-3x 10<5>/Î1⁄4Α mescolando adeguate quantità di PPP e PRP. Il plasma é stato incubato a 37°C per 30 min prima di essere posto a contatto con i campioni di materiale da testare. Detti campioni erano costituiti da provini quadrati di 1 cm<2>ed erano rappresentati rispettivamente da un film di chitosano preparato secondo l’esempio 3, oppure vetro borosilicato, o plastica per colture cellulari (polistirene). Detti provini sono stati sterilizzati mediante immersione in una soluzione alcolica al 70% (v/v) per 60 minuti, quindi essiccati all’aria sterile in una cappa a flusso laminare per 120 minuti e, successivamente immersi in una soluzione di tampone fosfato, PBS, (pH 7,4) per 1 ora. Blood samples were collected from healthy human donors, avoiding prolonged venous stasis, and placed in Vacutainer 3.5 mL tubes containing K3EDTA as an anticoagulant. A first tube containing whole blood was centrifuged for 10 min at 500 g, and the supernatant re-centrifuged at 800 g. The supernatant obtained from a second blood tube was subjected to a new centrifugation at 3000 g for 15 min. The concentration of platelets was determined in the two supernatants obtained, defined as â € œplasma rich in proteinsâ € (PRP) and â € œplasma poor in proteins (PPP). The platelet concentration of the plasma used in the adhesion test was brought to l-3x 10 <5> / Î1⁄4Î 'by mixing adequate quantities of PPP and PRP. The plasma was incubated at 37 ° C for 30 min before being placed in contact with the material samples to be tested. Said samples consisted of 1 cm <2> square specimens and were represented respectively by a chitosan film prepared according to example 3, or borosilicate glass, or plastic for cell cultures (polystyrene). These specimens were sterilized by immersion in a 70% (v / v) alcohol solution for 60 minutes, then dried in sterile air in a laminar flow hood for 120 minutes and then immersed in a phosphate buffer solution, PBS, (pH 7.4) for 1 hour.
Successivamente, 40 pL di plasma sono state depositate in strato sottile sulla superficie di ciascun provino ed incubate in termostato per 5 ore. Al termine, i campioni sono stati lavati in PBS per eliminare le piastrine che non avevano aderito alla superficie. I campioni sono fissati con una soluzione di glutaraldeide al 2.5% (p/v) per 20 min, lavati in PBS e disidratati con successivi passaggi in soluzioni di etanolo a concentrazione via via crescente (30°, 50°, 70°, 90°, 96°). I campioni essiccati sono stati fissati su un supporto in vetro, metallizzati al carbonio e analizzati al microscopio elettronico a scansione (SEM). Subsequently, 40 µL of plasma were deposited in a thin layer on the surface of each specimen and incubated in a thermostat for 5 hours. At the end, the samples were washed in PBS to remove any platelets that had not adhered to the surface. The samples are fixed with a 2.5% (w / v) glutaraldehyde solution for 20 min, washed in PBS and dehydrated with subsequent passages in increasingly concentrated ethanol solutions (30 °, 50 °, 70 °, 90 ° , 96 °). The dried samples were fixed on a glass holder, carbon metallized and analyzed under a scanning electron microscope (SEM).
In Figura 2 sono riportate le immagini SEM dei campioni dopo essiccamento e fissazione. Si osserva che sul film (Pannello A) le piastrine risultano adese alla mantenendo la forma rotondeggiante. Ciò indica mancanza di trombogenicità della superficie del film: esso può pertanto essere utilizzato come costituente della porzione luminale di protesi cilindriche nelle quale debba scorrere il sangue. Nel Pannello B (Vetro) e, maggiormente, nel pannello C (plastica per colture cellulari) si osserva una marcata attivazione delle piastrine caratterizzata dal cambiamento di forma (appiattimento del corpo cellulare) e presenza di pseudopodi allungati formanti un reticolo. Figure 2 shows the SEM images of the samples after drying and fixation. It is observed that on the film (Panel A) the plates are adhered to while maintaining the rounded shape. This indicates a lack of thrombogenicity of the film surface: it can therefore be used as a constituent of the luminal portion of cylindrical prostheses in which the blood must flow. In Panel B (Glass) and, more importantly, in Panel C (plastic for cell cultures) a marked activation of platelets is observed characterized by the change of shape (flattening of the cell body) and the presence of elongated pseudopods forming a lattice.
Esempio 7 Emocompatibilità in vitro, test di adsorbimento di proteine su film di chìtosano Example 7 Hemocompatibility in vitro, protein adsorption test on ketosane film
E†̃ stato valutato l’adsorbimento di specifiche proteine piasmatiche o plasma umano su campioni costituiti da provini quadrati di 1 cm<2>rappresentati rispettivamente da un film preparato secondo l’esempio 3, oppure da vetro borosilicato o da plastica per colture cellulari (polistirene). Detti provini sono stati sterilizzati mediante immersione in una soluzione alcolica al 70% (v/v) per 60 minuti, quindi essiccati all’aria sterile in una cappa a flusso laminare per 120 minuti. The adsorption of specific piasmatic proteins or human plasma was evaluated on samples consisting of 1 cm <2> square specimens represented respectively by a film prepared according to example 3, or by borosilicate glass or plastic for crops cell phones (polystyrene). These specimens were sterilized by immersion in a 70% (v / v) alcohol solution for 60 minutes, then dried in sterile air in a laminar flow hood for 120 minutes.
Sono state quindi preparate tre soluzioni proteiche dissolvendo albumina serica bovina, albumina umana, o plasma in un tampone fosfato salino a pH 7.4 ad una concentrazione finale di 0.1 mg/ mi. I campioni da analizzare sono stati immersi in tampone fosfato pH 7.4 per 12 ore prima del test e successivamente incubati con 3 mL di soluzione proteica per 3 ore in piastre multi pozzetto con superficie a basso adsorbimento. Allo scadere dell’incubazione i campioni sono stati lavati (2 min x 5 volte) con tampone fosfato e successivamente posti in bagno ad ultrasuoni in una soluzione contenente 1% (p/v) di sodio docecilsolfato per rimuovere le proteine adsorbite. Three protein solutions were then prepared by dissolving bovine serum albumin, human albumin, or plasma in a phosphate buffer at pH 7.4 at a final concentration of 0.1 mg / ml. The samples to be analyzed were immersed in phosphate buffer pH 7.4 for 12 hours before the test and subsequently incubated with 3 mL of protein solution for 3 hours in multi-well plates with a low adsorption surface. At the end of the incubation the samples were washed (2 min x 5 times) with phosphate buffer and then placed in an ultrasonic bath in a solution containing 1% (w / v) of sodium docecyl sulfate to remove the adsorbed proteins.
L’assorbanza della soluzione à ̈ stata misurata a 595 nm mediante uno spettrofotometro in accordo con il metodo di Bradford (Anal Biochem, 1976;72, 248-254). Sono state effettuate 3 repliche dello stesso punto sperimentale. The absorbance of the solution was measured at 595 nm by means of a spectrophotometer according to the Bradford method (Anal Biochem, 1976; 72, 248-254). 3 replicates of the same experimental point were carried out.
In Figura 3 sono riportati i risultati ottenuti dal test di adsorbimento proteico sulle diverse superfici testate. Di rilevanza ai fini dell’invenzione, solo il film realizzato secondo l’invenzione ha mostrato una scarsa o nulla attivazione proteica: tale fatto à ̈ indicativo di una ridotta o nulla trombogenicità . Figure 3 shows the results obtained from the protein adsorption test on the various surfaces tested. Of relevance for the purposes of the invention, only the film made according to the invention showed little or no protein activation: this fact is indicative of reduced or no thrombogenicity.
Relativamente alla concentrazione di proteine trattenute, essa à ̈ risultata maggiore per la plastica per colture cellulari, in accordo con la sua peculiarità nota di formare un film proteico sulla superficie per aumentare l’adesione e la successiva proliferazione cellulare. Regarding the concentration of retained proteins, it was found to be higher for cell culture plastics, in accordance with its known peculiarity of forming a protein film on the surface to increase adhesion and subsequent cell proliferation.
Esempio 8 Impianto di protesi sostitutiva biliare epaticoduodenale, senza conservazione della continenza papillare a seguito di resezione totale del coledoco associata a colecistectomia. Example 8 Implantation of hepaticoduodenal biliary replacement prosthesis, without preservation of papillary continence following total resection of the choledochus associated with cholecystectomy.
Sei suini ibridi commerciali (incroci suini Large White e Landrace) di sesso femminile e del peso di circa 40 kg sono stati stabulati per una settimana in ambiente a temperatura controllata (25°C). La sera prima dell’intervento sono stati mantenuti a digiuno e, la mattina dell’intervento sottoposti ad anestesia generale. Six commercial hybrid pigs (crosses Large White and Landrace pigs) of female sex and weighing about 40 kg were housed for one week in a controlled temperature environment (25 ° C). The evening before the surgery they were kept fasted and, on the morning of the operation, they were subjected to general anesthesia.
L’intervento chirurgico era costituito da una serie di fasi di seguito descritte: laparotomia mediana xifo-ombelicale. Isolamento della via biliare principale che veniva circondata con tourniquet. Parziale mobilizzazione del complesso duodeno-pancreatico nel quale veniva individuato esattamente, nella seconda porzione duodenale lo sbocco del coledoco. Legatura/ sezione dei vasi cistici, previa apertura del foglietto peritoneale glissoniano con distacco della fellea dal letto epatico mediante elettrocauterio, senza tuttavia sezionare il dotto cistico che rimaneva così coerente con la via biliare principale (VBP). Emostasi locale per elettrocoagulazione. Duplice sezione della VBP, al di sopra del dotto cistico neirimmediata prossimità dell’ilo epatico e distalmente a livello dello sbocco del coledoco in papilla, con rimozione en bloc del dotto epatico comune, dotto cistico-colecisti e del coledoco stesso. Sintesi con tre punti in Maxon 5.0 del moncone biliare distale rasente la parete della seconda porzione duodenale. Previo svuotamento dello stomaco per aspirazione tramite sonda endogastrica, posizionamento di enterostato distalmente al piloro ed esecuzione di duodenotomia trasversale di circa 0.5 cm attraverso cui si introduceva aspiratore che permetteva un totale svuotamento del viscere da residui alimentari. Disinfezione della breccia duodenale con soluzione all’1% di povidone iodio e posizionamento di endoprotesi sostitutiva del tipo descritto nell’esempio 1 (lunghezza 6 cm; diametro 0.5 cm) mediante confezione di duplice anastomosi, rispettivamente bilio- protesica termino-terminale (Figura 4a) e protesico-duodenale termino-laterale "a becco di flauto†, con duplice emisutura continua, anteriore e posteriore, in Maxon 6.0 (Figura 4b) . The surgery consisted of a series of phases described below: xypho-umbilical median laparotomy. Isolation of the main biliary route which was surrounded with tourniquet. Partial mobilization of the duodenal-pancreatic complex in which the outlet of the choledochus was precisely identified in the second duodenal portion. Ligation / section of the cystic vessels, after opening the Glissonian peritoneal leaflet with detachment of the phleea from the hepatic bed by electrocautery, without however dissecting the cystic duct which remained so consistent with the main biliary tract (VBP). Local haemostasis by electrocoagulation. Double section of the VBP, above the cystic duct in the immediate vicinity of the hepatic hilum and distally at the level of the choledochus outlet in the papilla, with en bloc removal of the common hepatic duct, cystic-gallbladder duct and the same choledochus. Synthesis with three points in Maxon 5.0 of the distal biliary stump bordering the wall of the second duodenal portion. Prior emptying of the stomach by aspiration using an endogastric probe, positioning of the enterostat distal to the pylorus and execution of a transverse duodenotomy of about 0.5 cm through which an aspirator was introduced which allowed a total emptying of the bowel from food residues. Disinfection of the duodenal breach with 1% solution of povidone iodine and placement of replacement endoprosthesis of the type described in example 1 (length 6 cm; diameter 0.5 cm) by means of a double anastomosis package, respectively bilio-prosthetic end-to-end ( Figure 4a) and end-lateral prosthetic-duodenal "flute-beak", with double continuous hemisuture, anterior and posterior, in Maxon 6.0 (Figure 4b).
La cavità addominale à ̈ stata quindi lavata ripetutamente con soluzione antisettica ed à ̈ stata effettuata una sintesi parietale a strati. The abdominal cavity was then repeatedly washed with antiseptic solution and a layered parietal synthesis was performed.
Esempio 9 Impianto di protesi sostitutiva bilio-biliare retroperitoneale (conservazione continenza papillare) susseguente a resezione subtotale del coledoco associata a colecistectomia. Example 9 Retroperitoneal biliary biliary replacement prosthesis implantation (papillary continence preservation) following subtotal resection of the choledochus associated with cholecystectomy.
Sei suini ibridi commerciali (incroci suini Large White e Landrace) di sesso femminile del peso di circa 40 kg sono stati stabulati per una settimana in ambiente a temperatura controllata (25°C). La sera prima deirintervento sono stati mantenuti a digiuno e, a mattina delFintervento sottoposti ad anestesia generale. Six commercial hybrid pigs (crosses Large White and Landrace pigs) of female sex weighing approximately 40 kg were housed for one week in a controlled temperature environment (25 ° C). They were fasted the evening before the operation and underwent general anesthesia in the morning of the operation.
L’intervento chirurgico era costituito da una serie di fasi di seguito descritte: laparotomia mediana xifo-ombelicale. Previa apertura del foglietto glissoniano del ligamento epato-duodenale, isolamento in toto della via biliare principale che à ̈ stata circondata con tourniquet avendo cura di riconoscere e conservare i peduncoli vascolari, superiore ed inferiore diretti alle porzioni distale e prossimale della VBP. Parziale mobilizzazione del complesso duodeno-pancreatico nel quale à ̈ stato individuato esattamente, nella seconda porzione duodenale lo sbocco del coledoco. Legatura/ sezione dei vasi cistici, previa apertura del loro foglietto peritoneale con distacco della fellea dal letto epatico mediante elettrocauterio, senza tuttavia sezionare il dotto cistico che rimane così coerente con la via biliare principale (VBP). Emostasi locale per elettrocoagulazione. Duplice sezione della VBP, al di sopra del dotto cistico neU’immediata prossimità dell’ilo epatico e distalmente a livello del coledoco terminale avendo cura di far cadere la sezione biliare 0.5 cm al di sopra dello sbocco del coledoco in papilla,. Rimozione en bloc del dotto epatico comune, dotto cistico-colecisti e dei due terzi del coledoco distale. Detensione gastrica mediante svuotamento dello stomaco per aspirazione tramite sonda endogastrica. The surgery consisted of a series of phases described below: xypho-umbilical median laparotomy. After opening the Glisson's leaflet of the hepato-duodenal ligament, complete isolation of the main biliary tract that has been surrounded with tourniquets, taking care to recognize and preserve the vascular peduncles, superior and inferior directed to the distal and proximal portions of the VBP. Partial mobilization of the duodenum-pancreatic complex in which the outlet of the choledochus has been precisely identified in the second duodenal portion. Ligation / section of the cystic vessels, after opening their peritoneal leaflet with detachment of the phleea from the hepatic bed by electrocautery, without however dissecting the cystic duct which remains so consistent with the main biliary tract (VBP). Local haemostasis by electrocoagulation. Double section of the VBP, above the cystic duct in the immediate vicinity of the hepatic hilum and distally at the level of the terminal choledochus, taking care to drop the biliary section 0.5 cm above the outlet of the choledochus into the papilla. En bloc removal of the common hepatic duct, cystic-gallbladder duct and two-thirds of the distal choledochus. Gastric cleansing by emptying the stomach by aspiration through an endogastric tube.
Posizionamento di endoprotesi sostitutiva preparata secondo quanto descritto nell’esempio 3 {lunghezza 4 cm; diametro 0.5 cm) mediante confezione di duplice anastomosi, rispettivamente bilioprotesica termino-terminale e protesico-biliare termino-terminale, con duplice emisutura continua, anteriore e posteriore, in Maxon 6.0 (Figura 5a). Sintesi con sopraggitto continuo in Maxon 6.0 del foglietto glissoniano precedentemente aperto con ripristino della normale anatomia del ligamento epato-duodenale e conseguente posizionamento retroperitoneale dell’impianto protesico biliare {Figura 5b). Placement of replacement endoprosthesis prepared as described in example 3 {length 4 cm; diameter 0.5 cm) by means of a double anastomosis package, respectively end-to-end bilioprosthetic and end-to-end prosthetic-biliary prosthetic, with double continuous hemisuture, anterior and posterior, in Maxon 6.0 (Figure 5a). Synthesis with continuous overedge in Maxon 6.0 of the previously opened Glisson's sheet with restoration of the normal anatomy of the hepato-duodenal ligament and consequent retroperitoneal positioning of the biliary prosthetic implant (Figure 5b).
La cavità addominale à ̈ stata quindi lavata ripetutamente con soluzione antisettica ed à ̈ stata effettuata una sintesi parietale a strati. The abdominal cavity was then repeatedly washed with antiseptic solution and a layered parietal synthesis was performed.
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| WO2009027537A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Kitozyme Sa | Prosthesis for promoting the in vivo reconstruction of a hollow organ or a portion of a hollow organ |
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Patent Citations (3)
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| WO2011117758A2 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Sofradim Production | Implant for tissue repair |
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