ITMI20091158A1 - Sistema automatizzato per la rivelazione di aflatossina negli alimenti - Google Patents

Description

Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“Sistema automatizzato per la rivelazione di aflatossina negli alimentiâ€

La presente invenzione ha come oggetto un sistema automatizzato ed un procedimento per la rivelazione di aflatossina negli alimenti.

Come noto, le aflatossine sono micotossine prodotte principalmente da ceppi fungini appartenenti alla specie Aspergillus Flavus, (solo alcuni ceppi) e Aspergillus parasiticus (quasi tutti i ceppi) funghi a diffusione ubiquitaria che possono contaminare diversi alimenti destinati all’alimentazione umana ed animale, fra i quali i più colpiti sono i cereali (mais, grano, soia, sorgo), i semi oleaginosi, la frutta secca e le spezie.

Le condizioni ottimali per la crescita del micelio fungino sono rappresentate da una temperatura compresa tra i 36 e i 38° C, da un’umidità del substrato intorno al 30% e da una umidità ambientale intorno all’85%, mentre la maggior produzione di tossine avviene tra 24 e 30°C.

In particolare, tra i diversi tipi di aflatossine conosciute (B1, B2, G1, G2), l’aflatossina denominata B1à ̈ un potente agente cancerogeno a tropismo epatico.

In conseguenza della pericolosità di tale sostanza, sono stati stabiliti dei limiti massimi di contaminazione dalle aflatossine totali e AFB1(aflatossina B1) in particolare, poiché maggiormente riscontrata (fino ad un valore di 90% di aflatossine totali) negli alimenti, elaborati da organi istituzionali di controllo, caratterizzati da soglie massime differenti in base all’uso per il quale gli alimenti sono destinati (ad esempio mangime per animali ovvero prodotti per l’alimentazione umana).

Per le ragioni sopra esposte, gli alimenti destinati all’alimentazione umana ed animale soggetti a possibile contaminazione dalle aflatossine, vengono sottoposti ad opportuni controlli atti a valutare la presenza di una possibile contaminazione ed eventualmente a determinarne la quantità in modo da poter definire l’idoneità o meno del prodotto in esame, in relazione ai suddetti limiti di legge.

In particolare sono noti alcuni test che utilizzano campioni di prodotto di piccole dimensioni, quali la tecnica High Performance Liquid Chromatography (una cromatografia in fase liquida) o ancora il test ELISA (un sistema diagnostico immunoenzimatico).

Gli inconvenienti delle metodologie come la HPLC ed ELISA risiedono principalmente nel rischio di non riuscire a rappresentare l’effettivo grado di contaminazione della partita o del lotto di prodotto in esame in quanto si basano, come detto, su quantità di prodotto troppo esigue rispetto alla totalità.

Inoltre tali metodi comportano una notevole laboriosità di analisi ed un’eccessiva lunghezza dei tempi di preparazione dei campioni da analizzare, oltre che un costo considerevole delle apparecchiature utilizzate per l’analisi stessa.

Ne consegue che tali procedimenti vengono solitamente utilizzati per analisi che non comportano dei risultati utilizzabili in tempo reale.

Un metodo alternativo ai suddetti, basato sull’analisi di campioni di peso notevolmente maggiore e pertanto più rappresentativi, si avvale dell’impiego di luce ultravioletta.

Più in particolare, il principio che sta alla base dell’impiego della radiazione UV per stimare la contaminazione da aflatossine, consiste nella proprietà da parte dei funghi che appartengono al genere Aspergillus di produrre acido coico (metabolita delle aflatossine) il quale, se esposto a luce UV, emette una radiazione fluorescente.

Nel metodo di analisi delle emissioni fluorescenti appartenente alla tecnica nota, un campione del prodotto da analizzare – quale ad esempio un certo numero di cariossidi di cereale - viene posto su un supporto scorrevole ed irraggiato mediante una lampada UV.

Le luminescenze, che si creano sulla superficie delle cariossidi contaminate da aflatossina, sono rivelate da una telecamera che invia il segnale ad un monitor.

Un operatore, osservando il monitor suddetto, agisce attraverso un comando manuale (ad es. un interruttore) ogni qualvolta rileva la presenza di una luminescenza, registrando in questo modo il conteggio del numero di unità fluorescenti presenti nel campione in esame.

Tale metodologia comporta numerosi problemi legati all’imprecisione dei risultati: il sistema à ̈ in grado infatti di discriminare tra campioni con bassi o alti livelli di contaminazione da aflatossine ma non consente di ottenere dati molto accurati.

Più in dettaglio, detto metodo misura unicamente il numero di luminescenze emesse.

Inoltre sono state osservate, in diversi casi, cariossidi apparentemente fluorescenti anche in assenza di contaminazione.

Tale fenomeno à ̈ dovuto al fatto che un’eventuale presenza di cariossidi spezzate, all’interno del campione, fa sì che il corpo interno delle stesse rifletta luce bianca.

Come noto dalla letteratura di merito, l’emissione in fluorescenza dell’acido coico può avvenire solo nelle due bande della luce, del verde e del rosso, pertanto la luce bianca eventualmente emessa dalle cariossidi spezzate, contenendo anche le bande del rosso e del verde, comporta la rivelazione di falsi positivi da parte del test.

I metodi di analisi del prodotto tramite luce ultravioletta appartenenti alla tecnica nota, sovrastimano quindi di fatto il livello di contaminazione da aflatossina.

Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di proporre un sistema automatizzato ed un procedimento per la rivelazione di aflatossina negli alimenti alternativo a quelli convenzionali e, preferibilmente, risolvere i summenzionati problemi.

Ad esempio, un ulteriore scopo della presente invenzione à ̈ realizzare un sistema automatizzato per la rivelazione di aflatossina negli alimenti che sia economicamente vantaggioso.

La presente invenzione riguarda un sistema automatizzato per la rivelazione di aflatossina negli alimenti ed il relativo procedimento, come alle rivendicazioni 1 e 9, alle quali si rimanda per brevità.

L’invenzione viene qui di seguito dettagliatamente descritta, a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento alla allegata figura 1 la quale mostra uno schema a blocchi rappresentante una forma preferita di realizzazione del dispositivo di rivelazione oggetto della presente invenzione.

Il sistema automatizzato per la rivelazione di aflatossine negli alimenti oggetto della presente invenzione à ̈ indicato globalmente con il riferimento numerico 100.

Il sistema automatizzato 100, come mostrato in figura 1, può comprendere:

- un dispositivo di trasporto 10;

- almeno una sorgente di radiazione 20 per investire un campione di alimenti atto a generare corrispondenti emissioni fluorescenti;

- un dispositivo di acquisizione 30 di immagini; - un encoder 14;

- un’unità di elaborazione 40;

- almeno un monitor 50;

- almeno una porta di collegamento 60 per almeno una periferica esterna 70.

In una forma preferita di realizzazione del sistema automatizzato oggetto della presente invenzione, il detto dispositivo di trasporto 10 comprende un nastro trasportatore 11, movimentato da un motore elettrico in corrente alternata 12 tramite un albero 15 e collegato ad un inverter 13 nonché al detto encoder 14.

Inoltre, la detta sorgente di radiazione 20 Ã ̈ preferibilmente costituita da una lampada di Wood ed il dispositivo di acquisizione 30 di immagini comprende una telecamera digitale ad alta risoluzione. PC industriale

La suddetta unità di elaborazione 40 può comprendere un PC industriale 40, gestisce l’automazione del sistema 100 per la rivelazione di aflatossina comprende, oltre che una main board nonché una memoria di massa asportabile (CD o stato solido) in grado di memorizzare dati e immagini di almeno 50 prove.

L’unità di elaborazione 40 à ̈ dotata inoltre di un modulo di abilitazione atto a consentire l’attivazione del sistema in seguito a un riconoscimento di un utente autorizzato.

Sempre in una forma preferita di realizzazione del sistema 100 oggetto della presente invenzione, il detto monitor 50 può essere costituito da un monitor LCD touch screen, mentre le dette periferiche esterne 70 possono comprendere una stampante per la riproduzione di un report riguardante i dati relativi al test effettuato dal sistema.

Il sistema automatizzato 100 opera, secondo un esempio, come descritto nel seguito.

Il prodotto da analizzare (ad es. cariossidi di cereale) viene disposto sul nastro trasportatore 11, senza alcun tipo di pre-trattamento.

Il movimento del suddetto nastro 11 à ̈ preferibilmente controllato dall’encoder 14 calettato sull’albero 15 del motore 12, che aziona il nastro 11 stesso; detto encoder 14 à ̈ ad esempio impostato in modo da inviare un impulso ogni decimo di grado di rotazione dell’albero 15.

Tale accorgimento consente di controllare con elevata risoluzione lo spostamento del nastro trasportatore 11.

La telecamera digitale 30 ad alta sensibilità viene installata nella parte superiore di un tunnel -all’interno del quale il prodotto in analisi transita sul detto nastro trasportatore 11 – e visualizza il passaggio del prodotto stesso sotto la luce UV emessa dalle lampade 20. La telecamera 30 à ̈ gestita dal PC 40, che comanda tra l’altro l’acquisizione di un’immagine dopo l’altra, conteggiando gli impulsi del suddetto encoder 14.

Nella fase di taratura iniziale del sistema di acquisizione di immagini, il nastro trasportatore 11 viene fatto avanzare passo dopo passo, ed il sistema visualizza l’immagine acquisita dalla telecamera 30 fino a quando la detta immagine non sia completamente sostituita dalla successiva. In questo modo à ̈ possibile ricavare il numero di impulsi generati dall’encoder 14, necessari affinché la serie di fotografie ottenute non contengano sovrapposizioni o intervalli tra una e l’altra.

Durante la fase di analisi pertanto la telecamera 30 acquisisce diverse immagini di corrispondenti porzioni del prodotto da analizzare, mentre il nastro trasportatore 11 avanza. Si osservi che in ogni immagine acquista vi possono essere cariossidi che presentano fluorescenza oltre ad altre cariossidi che non danno luogo a fluorescenza.

In particolare, le immagini acquisite dal dispositivo 30, sono immagini digitali che definiscono una pluralità di pixel a ciascuno dei quali à ̈ associato un livello di emissione della fluorescenza.

L’unità di elaborazione 40 elabora i dati e le informazioni (i livelli di emissione della fluorescenza) associate ai pixel acquisti dalla telecamera 30, quali. In particolare, l’unità di elaborazione 40 definisce, sulla base dei suddetti livelli di emissione, e per ogni immagine o frame un numero di pixel selezionati per frame Npsi a cui corrisponde una presenza stimata di aflatossina. Questa selezione à ̈ effettuata, ad esempio, mediante comparazione dei vari livelli di fluorescenza misurati in seguito all’acquisizione delle immagini con un livello di fluorescenza di soglia.

Si noti che il numero di pixel selezionati per frame Npsi à ̈ rappresentativo di una porzione della superficie dell’immagine i-esima stimata come contaminata. Ad esempio, l’unità di elaborazione 40 calcola, quindi, un numero di pixel selezionati totale Nps come somma dei numeri di pixel selezionati relativi a tutti i frame. Preferibilmente, nel calcolo del numero di pixel selezionati totale Nps sono esclusi quei valori del numero di pixel selezionati per immagine Npsi inferiori ad una soglia prestabilita.

In merito alla fase di selezione dei pixel che si ritengono associati alla presenza di contaminazione à ̈ vantaggiosamente impiegata dall’unità di elaborazione 40 una metodologia che analizza separatamente le emissioni fondamentali luminose nelle bande del: rosso R, verde G e blu B. A tal proposito si noti che l’aflatossina (o meglio dire il suo metabolita) emette fluorescenza solo alle lunghezze d’onda corrispondenti alla componente cromatica rossa oppure alla componente cromatica verde.

Un esempio di possibile analisi separata delle emissioni può essere il seguente: ad ogni pixel sono associate una prima intensità luminosa relativa alla componente cromatica rossa R, una seconda intensità luminosa associata alla componente cromatica verde G ed una terza intensità luminosa associata alla componente cromatica blu B.

L’unità di elaborazione 40 confronta fra loro le dette intensità luminose e seleziona pixel aventi associata almeno una fra detta prima e seconda intensità luminosa superiore alla terza intensità luminosa, in modo da ottenere i suddetti pixel selezionati.

In maggior dettaglio, si compara (dopo una normalizzazione dei parametri impostati) il livello di luminosità della componente cromatica blu B con quello della componente cromatica rossa R e nel caso in cui la componente cromatica blu B sia maggiore, si elimina dall’algoritmo la componente cromatica rossa R. Successivamente, si compara la luminosità della componente cromatica blu B con quella della componente cromatica verde G. Se la luminosità associata alla componente cromatica blu B à ̈ maggiore di quella del verde, si elimina dall’algoritmo la componente cromatica verde. In questa situazione, in cui risulta preponderante la luminosità della componente cromatica blu B, il relativo pixel sarà considerato come non contaminato.

Nei casi in cui dai precedenti confronti risulti come luminosità preponderante quella associata al verde G o al rosso R e questa superi una soglia prestabilita, il relativo pixel sarà selezionato come pixel associato alla presenza di contaminazione.

L’algoritmo sopra descritto evita che pixel con fluorescenza non associata a lunghezze d’onda del verde o del rosso siano conteggiati nel calcolo dei pixel selezionati totale Nps e consente di evitare falsi positivi del test.

Successivamente, sulla base del numero di pixel selezionati totale Nps, l’unità di elaborazione 40 fornisce un’informazione indicativa della quantità di aflatossina (per esempio, espressa in ppb, parti per bilione) presente nel campione di alimenti sottoposto all’analisi.

In particolare, con riguardo alla valutazione della quantità di aflatossina presente nel campione, l’unità di elaborazione 40 comprende inoltre un modulo di memoria che immagazzina dati digitali corrispondenti ad una curva di calibrazione atta a correlare valori numerici di pixel selezionati totale Nps con valori di quantità di aflatossina. Tale curva di calibrazione à ̈ ottenibile mediante una fase di taratura un cui esempio à ̈ riportato più avanti.

Secondo un esempio, l’unità di elaborazione 40 può anche comandare la periferica esterna 70 (ad esempio, una stampante) in modo da rendere disponibile un report che indichi, fra altro: il numero delle immagini acquisite, il numero totale delle cariossidi contaminate, il numero di pixel selezionati totale Nps interessati dalla contaminazione da aflatossina e la quantità di aflatossina stimata.

Il sistema automatizzato 100 per la rivelazione di aflatossina oggetto della presente invenzione, presenta importanti vantaggi rispetto ai sistemi utilizzati nella tecnica nota.

Si noti che la procedura che prevede il calcolo del numero di pixel stimati come contaminati permette una valutazione dell’aflatossina estremamente accurata. In particolare, la discriminazione delle lunghezze d’onda impiegata per la selezione dei pixel riduce o evita il verificarsi di falsi positivi.

Inoltre, il particolare sistema descritto risulta facile da utilizzare, non richiedendo tra l’altro personale addetto specializzato. In aggiunta, si osservi che il tempo di analisi à ̈ estremamente ridotto e non à ̈ richiesta alcuna preparazione del campione né l’utilizzo di reagenti.

Un ulteriore vantaggio del metodo utilizzato dal sistema oggetto della presente invenzione à ̈ che consiste in un test non distruttivo, pertanto uno stesso campione può essere eventualmente utilizzato per essere analizzato attraverso ulteriori metodi alternativi.

Infine un rivelante vantaggio relativo al sistema 100 oggetto della presente invenzione à ̈ che detto sistema à ̈ automatico, pertanto fornisce risultati og gettivi e riproducibili.

Appendice: procedura di calibrazione

Per completezza di descrizione si riporta nel seguito una procedura di calibrazione del sistema basata sul confronto tra due test: uno utilizzante il metodo HPLC ed uno basato sull’analisi delle luminescenze emesse in seguito ad esposizione a luce UV.

Più in particolare, à ̈ stata effettuata una serie di analisi di riferimento (HPLC) per la ricerca della quantità di aflatossina B1 presente in un campione.

La procedura utilizzata à ̈ stata la seguente:

- ogni campione, analizzato mediante il metodo HPLC, Ã ̈ stato ottenuto effettuando 10 carotaggi su un campione di 5 kg di cereale;

- il campione di 5 kg à ̈ stato parallelamente processato per 5 volte dal sistema automatizzato oggetto della presente invenzione in modo da ottenere un “valore medio di contaminazione†;

- dal suddetto campione di 5 kg à ̈ stato successivamente estratto, un campione del peso di 1 kg il quale à ̈ stato a sua volta analizzato per 5 volte dal sistema automatizzato ed à ̈ stato definito come campione rappresentativo solo nel caso in cui il valore medio di fluorescenza riscontrato (espresso in numero di pixel), non si discostasse di uno scarto superiore al 5% dal valore medio ottenuto sui 5 kg ;

- il campione del peso di 1 kg à ̈ stato quindi macinato ed omogeneizzato opportunamente e sono stati ricavati da questo ulteriori due campioni del peso di 50 gr, i quali sono stati analizzati in doppio con HPLC. Il valore medio delle quattro letture à ̈ stato infine utilizzato per il calcolo della curva di calibrazione.

Per quanto riguarda le analisi in HPLC, sono stati testati 35 campioni tra i quali 16 per verificare la taratura dei parametri ottici del sistema automatizzato oggetto della presente invenzione. Dai 19 campioni rimanenti, à ̈ stata ricavata una curva di taratura non forzata all’origine degli assi.

Una successiva riduzione dei campioni della serie utilizzata per ricavare l’equazione che scartava i campioni aventi uno scarto eccessivo rispetto alla curva di tendenza ha portato a ridurre la popolazione a 11 punti.

Infine, l’equazione di taratura così ricavata à ̈ stata inserita nel software del sistema automatizzato oggetto della presente invenzione.

Da quanto descritto, appare evidente che i concetti inventivi espressi non sono limitati agli esempi applicativi illustrati, ma possono essere vantaggiosamente adattati ad altre analoghe applicazioni.

Il campo di impiego dell’invenzione non à ̈ limitato agli esempi riportati nella precedente descrizione.

Per esempio, à ̈ possibile attuare il metodo e impiegare il sistema descritto anche per l’individuazione degli altri tipi di aflatossine conosciute e cioà ̈ , aflatossine B2, G1 e G2 con modifiche progettuali alla portata del tecnico del ramo e con una corrispondente taratura della strumentazione.

La presente invenzione à ̈ pertanto suscettibile di numerose modifiche e varianti tutte rientranti nel concetto inventivo espresso nelle rivendicazioni allegate, mentre i dettagli tecnici potranno variare secondo le esigenze.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema (100) per la rivelazione di aflatossina in alimenti il sistema comprendendo: almeno una sorgente (20) di radiazione per investire un campione di alimenti atto a generare corrispondenti emissioni fluorescenti; un dispositivo di acquisizione (30) di immagini di detto campione; in cui dette immagini sono immagini digitali che definiscono una prima pluralità di pixel; a ciascun pixel essendo associato un livello di emissione associato alla fluorescenza, caratterizzata dal fatto di comprendere un'unità di elaborazione (40) configurata per definire sulla base dei livelli di emissione un numero di pixel selezionati a cui corrisponde una presenza stimata di aflatossina, ottenuta correlando il numero di pixel selezionati con dati digitali corrispondenti ad una curva di calibrazione atta a correlare valori numerici di pixel selezionati con valori di quantità di aflatossina, e fornire un'informazione indicativa di una quantità di aflatossina presente nel campione di alimenti sulla base di detto numero di pixel selezionati .
2. 2. Sistema (100) secondo la rivendicazione 1, in cui ad ogni pixel sono associate una prima intensità luminosa relativa alla componente cromatica rossa R, una seconda intensità luminosa associata alla componente cromatica verde G e una terza componente cromatica blu B; detta unità dì elaborazione essendo adatta a confrontare fra loro dette intensità luminose e a selezionare pixel aventi associata almeno una fra detta prima e seconda intensità luminosa superiore alla terza intensità luminosa in modo da ottenere detti pixel selezionati.
3. 3. Sistema (100) secondo almeno una delle precedenti rivendicazioni, in cui detta unità di elaborazione (40) comprende un modulo di memoria che immagazzina detti dati digitali corrispondenti a detta curva di calibrazione atta a correlare valori di numeri di pixel selezionati con valori di quantità di aflatossina .
4. 4. Sistema (100) secondo almeno una delle precedenti rivendicazioni, in cui: detta aflatossina à ̈ di un tipo compreso nel gruppo costituto da: aflatossina B2, G1, G2 e preferibilmente Bl; detto campione di alimenti comprende una pluralità di cariossidi; dette emissioni fluorescenti essendo associate alla presenza di acido coico in dette cariossidi; detto dispositivo di acquisizione (30) à ̈ una telecamera digitale; detta almeno una sorgente (20) comprende una lampada di Wood per l'emissione di radiazione ultravioletta; detta unità di elaborazione (40) comprendendo un Personal Computer Industriale.
5. 5. Sistema (100) secondo almeno una delle precedenti rivendicazioni, inoltre comprendente: un dispositivo di trasporto (10) atto movimentare il campione di alimenti; un encoder (14) operativamente associato al dispositivo di trasporto per fornire informazioni indicative di posizioni assunte dal campione di alimenti movimentato; in cui detta unità di elaborazione (40), sulla base di tali informazioni indicative delle posizioni assunte dal campione di alimenti, à ̈ in grado di estrarre da dati forniti dispositivo di acquisizione (30) immagini non sovrapposte ed adiacenti di una pluralità di porzioni del campione di alimenti.
6. 6. Sistema (100) secondo le rivendicazioni 4 e 5, in cui detto un dispositivo di trasporto (10) à ̈ un nastro trasportatore sul quale à ̈ distribuita la pluralità di cariossidi.
7. 7. Sistema (100) secondo almeno una delle precedenti rivendicazioni, in cui detta unità di elaborazione (40) à ̈ dotata di un modulo di abilitazione atto a consentire l'attivazione del sistema in seguito a un riconoscimento di un utente autorizzato.
8. 8. Sistema (100) secondo almeno una delle precedenti rivendicazioni, inoltre comprendente almeno una periferica (70) collegata a detta unità di elaborazione (40) atta a rendere disponibile per un utente detta informazione indicativa della quantità di aflatossina e parametri di impostazione di detto sistema e valori misurati su detto campione di alimenti .
9. 9. Procedimento per la rivelazione di aflatossina comprendente le fasi di: investire con radiazione un campione di alimenti atto a generare corrispondenti emissioni fluorescenti ; acquisire immagini digitali del campione di alimenti che definiscono una prima pluralità di pixel; a ciascun pixel essendo associato un dato rappresentativo di un livello di emissione associato alla fluorescenza; elaborare i dati rappresentativi dei livelli di emissione per determinare un numero di pixel selezionati a cui corrisponde una presenza stimata di aflatossina, ottenuta correlando il numero di pixel selezionati con dati digitali corrispondenti ad una curva di calibrazione atta a correlare valori numerici di pixel selezionati con valori di quantità di aflatossina; elaborare il numero di pixel selezionati e fornire un'informazione indicativa di una quantità di aflatossina presente nel campione di alimenti.
10. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, inoltre comprendente una fase di fornire il campione di alimenti sotto forma di una pluralità di cariossidi appartenenti ad almeno uno dei seguenti alimenti: cereali, mais, grano, soia, sorgo, semi oleaginosi, frutta secca, spezie.