ITMI20091099A1 - Superfici funzionali con morfologia controllata sulla scala nanometrica atte a modulare l'adesione, vitalita' e proliferazione di cellule - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

SUPERFICI FUNZIONALI CON MORFOLOGIA CONTROLLATA SULLA SCALA

NANOMETRICA ATTE A MODULARE L’ADESIONE, VITALITÀ’ E

PROLIFERAZIONE DI CELLULE

STATO DELL’ARTE

La tecnologia di crescita di film sottili e le tecniche di nanofabbricazione offrono la possibilità di controllare le scale spaziali di vari materiali con precisione su scale spaziali che vanno dal nanometro ai micrometri.

La crescita di un film sottile è un fenomeno dinamico governato da meccanismi cinetici. Di conseguenza le superfici dei film sottili mostrano una rugosità generata da asperità, protuberanze e avvallamenti che si traduce in fluttuazioni verticali della topografia (fig. 1). E’ riconosciuto che la rugosità σ, misurata come la fluttuazione quadratica media dell’altezza topografica dei rilievi rispetto alla loro altezza media, scali con le lunghezze spaziali laterali (al di sotto di una lunghezza di correlazione longitudinale ξ) e verticali (per spessori inferiori ad una lunghezza di correlazione trasversale Q secondo le seguenti regole:

dove si intende che lo spessore nominale h varia linearmente con il tempo di crescita h=Ff dove F è la velocità di deposizione. Gli esponenti α, β e le lunghezze spaziali asat, ξ e ζ caratterizzano la morfologia della superficie. In particolare gli esponenti definiscono la classe di universalità del fenomeno di crescita e quindi permettono di identificare il meccanismo cinetico dominante<2>. Un importante parametro morfologico è la dimensione frattale (df), che viene definita come: df=E-a, dove E è la dimensione euclidea che racchiude la superficie stessa. Nel caso di superfici tridimensionali E=3, mentre per oggetti su una superficie piana E=2.

Gli esponenti di scala dipendono dai parametri di processo come ad esempio la temperatura di deposizione T, e il flusso o velocità di deposizione F. Le lunghezze spaziali dipendono, oltre che da T e F, dal tempo/spessore Ft«h. Se T ed F sono tenute costanti, allora la variazione sistematica di h permette di controllare asat. ξ e ζ con un'accuratezza pari a quella del controllo sperimentale di h.

Le tecniche di crescita, come ad esempio la sublimazione in alto- o ultra-alto vuoto, o in alcuni casi anche l’erosione/modificazione della superficie (es. sputtering), consentono un controllo molto accurato di h, dell’ordine di frazioni di nm, e un conseguente controllo dei parametri morfologici sotto il nanometro sulla scala verticale (fig. 1). Questo si accompagna ad un controllo della lunghezza di correlazione laterale ξ dell’ordine delle decine di nm. Varie tecniche di caratterizzazione di superficie, come ad es. microscopie a scansione di sonda (SPM), laser light scattering (LLS), riflettività a raggi X, permettono di misurare accuratamente le lunghezze spaziali caratteristiche e gli esponenti di scala, e quindi di verificare quantitativamente la riproducibilità del processo di crescita del film sottile<3>(fig. 2).

In conclusione, diverse tecnologie di crescita di film sottili possono essere utilizzate per il controllo accurato dei parametri morfologici di superficie sulla scala nanometrica.

E’ stato recentemente riconosciuto che l’architettura superficiale dei substrati può avere effetti importanti sul comportamento delle cellule e che le interazioni cellulasubstrato possono essere importanti per l’utilizzo nel campo dell’ingegneria cellulare-tissutale e dei biosensori. In vivo le cellule interagiscono con un ambiente tridimensionale<4>; questo accade anche quando le cellule entrano in contatto con il substrato di coltura, attraverso le proteine di membrana.

E’ stato riconosciuto che le caratteristiche fisico-chimiche dei materiali influenzano le interazioni cellula-materiale (es. tensione superficiale, idrofilicità / idrofobicità, chimica, cariche, topografia di superficie, elasticità, rigidità e cedevolezza)<5>e che la morfologia superficiale del materiale influenza significativamente l’adesione delle cellule ed il loro comportamento, ad es. la proliferazione e la maturazione così come la selezione di diversi tipi cellulari<6>. Poiché le risposte cellulari dipendono dalla morfologia tridimensionale del materiale, varie nanostrutturazioni (es. reticoli con rilievi o recessi) sono state utilizzate per influenzare la biocompatibilità e la differenziazione cellulare<7>.

I parametri morfologici di una superficie possono essere controllati tramite fabbricazione o nanostrutturazione ( patterning ) della superficie o di un film sottile o di un materiale depositato sulla superficie stessa. Se si sceglie un approccio basato sul patterning di strati resistivi o sacrificali, seguito poi da erosione, oppure da deposizione e lift-off, allora il controllo laterale e’ largamente dettato dal processo di trasferimento della maschera (e quindi dal materiale resistivo usato), mentre quello sullo spessore dal processo di deposizione successivo. Nel caso invece di patterning di film sottili o di deposizione spazialmente controllata di materiali, esistono diverse tecniche litografiche non convenzionali, sia parallele sia seriali, che permettono un controllo accurato dello spessore di strutture fabbricate o depositate direttamente su una superficie (fig. 3). Tra queste citiamo le tecniche di litografia soffice come microcontact printing, lithographically controlled wetting/dewetting, MIMIC, replica molding, SAMIM, etc.; nanoimprinting lithography ; dip-pen nanolithography, constructive lithography, etc<8>.

Diverse di queste tecniche sfruttano il confinamento di reazioni chimiche, fenomeni di auto-organizzazione ed auto-assemblamento, oppure forze capillari e flussi idrodinamici nei recessi o sotto le protuberanze di stampi. In questo caso, le scale laterali sono controllate attraverso il confinamento e quelle verticali attraverso il tempo del processo o la concentrazione di precursori o reagenti. Le scale spaziali asat, ξ, e ζ dipendono sia dal processo sia dal disegno della maschera o del motivo trasferito. Le diverse tecniche di patterning hanno diversa risoluzione e forniscono una diversa dimensione del minimo dettaglio ( feature size), secondo la tipologia ed il materiale utilizzato. Si può andare da un’accuratezza di 1 nm sulla scala verticale a 10 nm su quella laterale, fino a scale spaziali maggiori, più tipicamente dimensioni laterali di alcune centinaia di nanometri sono facilmente raggiungibili anche su larga area. Diverse delle tecniche sopra enunciate sono scalabili a larghe aree consistentemente con gli standard di fabbricazione correnti.

Molti lavori scientifici sono stati effettuati sulla reazione delle cellule in coltura su topografie con rugosità su scala micrometrica, mentre pochi studi riportano l’effetto di dettagli della superficie sulla scala nanometrica<6i 7>. In questo ambito nessuno studio né nessun brevetto sviluppato riguarda un’analisi dettagliata della crescita su materiali semiconduttori organici. La prima pubblicazione di cellule neuronali ottenute per differenziazione di cellule staminali secondarie è stata riportata da alcuni dei presenti inventori nel 2008<9>. Occorre aggiungere che diversi semiconduttori organici, essendo composti coniugati, sono spesso tossici per la materia vivente e possono avere effetti oncogeni e teratogeni. Tuttavia, il loro effetto dipende dalla forma di aggregazione, dalla fase, e dalla forma. La possibilità di usare polimeri o macromolecole non solubili in acqua o in membrana cellulare, oppure processare il materiale nella forma di film sottile molto compatto ed adeso sul substrato, rende possibile la biocompatibilizzazione di un materiale che intrinsecamente potrebbe non esserlo. L’effetto sulle cellule, e più in generale su un organismo vivente, dipenderà quindi dal materiale, dal suo stato, e non ultimo dal processo del materiale e da quello con cui si interfaccia con la materia vivente.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Fig. 1: Rappresentazione schematica della deposizione e nanostrutturazione di un film sottile di semiconduttore organico tramite patterning; rappresentazione schematica della struttura del film di materiale organico a morfologia controllata ottenuto.

Fig. 2: Dipendenza della morfologia dallo spessore, espresso come numero di monostrati (ML) molecolari depositati: (a) rugosità asat; la scala doppio-logaritmica evidenzia la legge di potenza asat=ah<p>con esponente dinamico β; b) dimensione frattale df; c) lunghezza di correlazione ξ.

Fig. 3: Immagini con il microscopio a forza atomica (AFM) di superfici nanostutturate con diversi materiali organici nella forma di film sottili: aminopropiltrietossisilano (APTES) su superficie di semiconduttore organico (a); DNA su mica (b); micelle lipidiche (c) e doppio strato lipidico (d) su superficie di semiconduttore organico e mica patternate tramite MIMIC. (e) Sfere di polimetimetacrilato (PMMA) di diametro 300 nm depositate su film organico, con dettagli AFM delle mesosfere.

Fig. 4: Evoluzione dei parametri morfologici dei film sottili di pentacene in funzione dello spessore del film sottile (ML).Fig. 5: Immagini AFM di differenti superfici, con le misurazioni dell’angolo di contatto e della rugosità asateffettuate su: silicio nativo (a), vetro (b), piastra per culture cellulari (c); semiconduttore organico (d). Fig. 6: (a-b-c) Immagini AFM di film ultrasottili di pentacene a diverso spessore; (de-f) immagini ottiche di cellule gliali umane, cresciute su film di pentacene a intervalli di tempo 24-48-72 ore, rispettivamente. Le cellule sono marcate con il colorante fluorescente FDA.

Fig. 7: Morte (a) e proliferazione (b) di cellule astrogliali. a) Le cellule sono incubate per 12 (■), 24 (·) e 48 (À) ore su substrati di pentacene a diverso spessore del film sottile. Le cellule necrotiche, riportate come % del numero totale di cellule (100%), sono state saggiate tramite il saggio del Trypan blue, b) Proliferazione cellulare in funzione del tempo sui diversi substrati di pentacene. Fig. 8: Rappresentazione 3D della vitalità delle cellule astrogliali 1321N1 cresciute su film sottili di pentacene con diverso livello di copertura (ML) per 12-24-48 ore. DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione è basata sull’osservazione che la proliferazione ed altre funzioni cellulari, quali la vitalità, la morte ed il differenziamento, sono modificate o influenzate dalle caratteristiche morfologiche di una superficie a spessore ultrasottile, quali la dimensione frattale, la lunghezza di correlazione e la rugosità. Pertanto i processi di deposizione o crescita in cui le suddette caratteristiche morfologiche del substrato sono adeguatamente controllate, in termini di accuratezza e omogeneità attraverso la superficie, offrono la possibilità di controllare tecnologicamente il comportamento di colture cellulari e tissutali.

Le tecniche di crescita del substrato, come ad esempio la sublimazione in alto- o ultra-alto vuoto, o in alcuni casi anche l’erosione/modificazione della superficie (es. sputtering), consentono un controllo molto accurato di altezza (h), dell’ordine di frazioni di monostrati, e quindi dei parametri morfologici sotto il nanometro sulla scala verticale (fig. 1). Questo si accompagna ad un controllo della lunghezza di correlazione laterale ξ dell’ordine delle decine di nm. Varie tecniche di caratterizzazione di superficie, come microscopie a scansione di sonda (SPM), laser tight scattering (LLS), riflettività a raggi X, permettono di misurare accuratamente le lunghezze spaziali caratteristiche e gli esponenti di scala, e quindi di verificare quantitativamente la riproducibilità del processo di crescita del film sottile<3>(fig. 2).

In particolare è stato osservato che alcuni intervalli dei seguenti parametri morfologici (spessore nominale, lunghezza di correlazione ξ, dimensione frattale e rugosità asat) di film sottili o ultrasottili risultano particolarmente adatti per le funzioni cellulari:

- spessore nominale h compreso tra 0.1 e 50 nm,

- lunghezza di correlazione ξ compresa tra 0.05 e 5 μΜ,

- dimensione frattale dfcompresa tra 2 e 3,

- rugosità asatcompresa tra 0.1 e 6 nm, più preferibilmente compresa tra 1-4 nm e secondo una realizzazione ancor più preferita compresa tra e 1.25 e 2.5 nm.

Questi parametri hanno una dipendenza di scala dallo spessore e sono controllabili attraverso il tempo e i parametri del processo di formazione del film sottile. Ne consegue che anche le risposte cellulari sono soggette ad un controllo attraverso la scelta e l'ottimizzazione dei parametri di deposizione del film sottile. Gli insiemi ottimali dei parametri morfologici possono essere ottenuti anche con tecniche di nanostrutturazione ( nanopatterning ) (fig. 1) .

Al fine di meglio descrivere l’invenzione, viene data la definizione di alcuni termini tecnici, come segue:

- cellule staminali internally programmed (iPS= Induced pluripotent stem celi, come definite in Amabile G., Meissner A., 2009. Induced pluripotent stem cells: current progress and potential for regenerative medicine. Trends Mol Med., 15, 59-68),

- ML: monolayer è il numero di monostrati del materiale molecolare depositato (come descritto in Ruiz R. et al., 2004. Pentacene Thin Film Growth. Chem Mater., 16, 4497-4508),

- rugosità di saturazione o asat(saturated root mean square : rms, come descritta in: Biscarini F. et al., 1997, Scaling behavior of anisotropie organic thin films grown in high vacuum. Phys Rev Leti. 78, 2389-2392); asatè la misura delle fluttuazioni topografiche invarianti con la scala delle lunghezze spaziali: si esprime in nm (come descritta in: Barabàsi A.L. & Stanley H.E., Fractal Concepts in Surface Growth, Cambridge University Press, 1995),

- lunghezza di correlazione ξ: esprime la distanza laterale caratteristica tra dominii e gradini; quando le isole sono connesse, corrisponde alla dimensione delle isole; si esprime in pm (come descritta in: Biscarini F., et al., 1997 vedi sopra),

- dimensione frattale (df): esprime la scala delle fluttuazioni topografiche su una scala di lunghezza inferiore a ξ : è un valore numerico (come descritta in: Meyer zu Heringdorf F.J., Reuter M.C., & Tromp R.M., 2001. Growth dynamics of pentacene thin films. Nature 412, 517-520),

- nano-imprinting e contact-printing : tecniche litografica che utilizzano uno stampo elastomerico per riprodurre disegni o motivi su una superficie, in scala nanometrica (Xia Y. and Whitesides G.M., 1998. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Ed ., 37, 550-575).

Costituisce oggetto della presente invenzione un metodo per la preparazioni di substrati adatti alla modulazione delle funzioni cellulari sopra menzionate in cui ad un substrato opportuno di un materiale organico viene impartita una morfologia superficiale aventi le seguenti caratteristiche: uno spessore compreso tra 0.1 e 10 ML, una lunghezza di correlazione ξ compresa tra 0.05 e 5 μΜ, una dimensione frattale (df) compresa tra 2 e 3 (per una dimensione Euclidea E=3) ed una rugosità osatcompresa tra 0.1 e 6 nm, più preferibilmente compresa tra 1-4 nm e secondo una realizzazione ancor più preferita compresa tra e 1.25 e 2.5 nm.

Il substrato è preferibilmente in forma di film ultrasottile e di un semiconduttore organico, dove per ultrasottile si intende uno spessore compreso tra 1 e 20 ML preferibilmente compreso tra 0.1 e 10 ML o, ancor più preferibilmente compreso tra 1 e 5 ML.

Il film ultrasottile può essere deposto su un supporto di natura diversa dal substrato, purché garantisca localmente e attraverso l'intera area, le proprietà morfologiche del film sottile.

La deposizione del substrato, preferibilmente costituito da un semiconduttore organico, su opportuno supporto, è effettuata mediante deposizione di un film sottile tramite una tecnica adatta a controllare parametri morfologici (lunghezza di correlazione, dimensione frattale, rugosità di saturazione), ovvero con tecnologie che permettono di raggiungere la morfologia ottimale in proporzione al numero di strati depositati in successione, oppure mediante stampi ed un processo di stampa o stampaggio. Tra queste tecniche si menzionano: i) sublimazione di molecole in alto- o ultra alto- vuoto che consente una crescita controllata sul supporto per spessori inferiori a 1 ML; ii) la crescita di film molecolari per deposizione fisica in corrente di vapore (PVD); iii) la deposizione mediante drop casting o spin coating del semiconduttore (molecolare o polimerico) disciolto in un opportuno solvente ad elevata tensione di vapore o basso punto di ebollizione; iv) la deposizione del soluto da una soluzione mediante micro- e nanofluidica; v) la deposizione mediante una tecnologia di stampa della famiglia delle litografie soffici, es. lithographically controlled wetting o dewetting o micro-contact printing , adatta a promuovere l’auto-organizzazione delle molecole costituenti il materiale in maniera da ottenere nanostrutture organizzate su scala molecolare e nanometrica e riproducenti le lunghezze caratteristiche imposte dal motivo definito dallo stampo utilizzato; vi) la formatura per replica molding o nanoimprinting lithography mediante adesione conforme ai recessi e protuberanze dello stampo. Altri esempi di tecniche di fabbricazione seriali adatte allo scopo sono ink-jet printing, scrittura o ablazione laser, sputtering di ioni e plasma, calandratura, flessigrafia.

Tra materiali idonei a essere “deposti” o “stampati” in film sottili di morfologia controllata con le caratteristiche sopra definite, particolarmente preferiti sono i semiconduttori organici, selezionati nei seguenti gruppi :

o oligomeri pi-coniugati preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di:

pentacene, sexitienile, oligofenilenevinilene, oligofluorene;

o composti polieterociclici, preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di: ftalocianine; rubrene (5,6,11,12-tetraphenylnaphthacene), perileni e suoi derivati quali ad es. il terrilene, PTCDA (perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic-3,4,9,10-dianhydride), PDI;

o allotropi del carbonio preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di:

fullerene C60, grafene, nanografene.

Il controllo morfologico raggiungibile attraverso le diverse tecniche di crescita e di nanostrutturazione permette di attribuire a tali substrati le caratteristiche più adatte allo sviluppo cellulare o perlomeno a tutte le funzioni dipendenti dall’adesione della cellula al substrato quali la crescita, la divisione, nonché il differenziamento di precursori cellulari con caratteristiche staminali.

Particolarmente preferito quale substrato è il pentacene (C22H14) utilizzato quale sistema modello per dimostrare la spiccata influenza della morfologia sulla scala nanometrica nei confronti sviluppo cellulare. Il pentacene è una molecola coniugata lineare. Depositato sul substrato tramite sublimazione in alto vuoto, forma una struttura cristallina che è definita “fase di film sottile” 0 polimorfo di Holm<10>a bassi spessori, mentre a spessori sopra i 20 nm una fase “massiva” 0 polimorfo di Campbell<11>. I film di pentacene non crescono necessariamente strato-a-strato, ovvero per completamento e sovrapposizione di strati monomolecolari. Invece, essi sono costituiti da isole interconnesse tra loro, e ogni isola è formata per impilamento di terrazze monomolecolari di dimensioni laterali progressivamente decrescenti verso l’alto e la cui altezza denominata a seguito hi dipende dalla fase cristallina dominante (hi=1.5 nm per la struttura di Holm<10>, hi=1.4 nm per quella di Campbell<11>) La distribuzione delle terrazze (numero di terrazze, dimensione media delle isole) e la loro forma dipendono dalle condizioni di crescita e dal substrato. Questo si riflette nella variazione dei parametri morfologici sopradescritti con le condizioni di crescita, come mostrato ad es. nella Fig. 4 dove si osserva la variazione in funzione dello spessore. E’ importante sottolineare che la morfologia del film e la sua adattabilità alle diverse funzioni cellulari dipende dall’architettura sovradescritta, come diventerà chiaro nella descrizione a seguito.

Rappresenta quindi un ulteriore oggetto dell’invenzione un substrato colturale per cellule comprendente un film di materiale semiconduttore di spessore compreso tra 0.1 e 10 ML, lunghezza di correlazione ξ compresa tra 0.05 e 5 μΜ, dimensione frattale compresa tra 2 e 3 (per una dimensione Euclidea E=3) e rugosità osatcompresa tra 0.1 e 6 nm, più preferibilmente compresa tra 1-4 nm e secondo una realizzazione ancor più preferita compresa tra e 1.25 e 2.5 nm, su un supporto di materiale inerte, che può essere di materiale polimerico (poliolefine, polietilentereftalato, mylar, policarbonato, teflon), ovvero un supporto poroso, vetroso, ovvero un wafer di silicio, anche patternato con strutture passive, funzionali, con dispositivi elettronici (come transistori, diodi, giunzioni di van der Pauw, giunzioni Hall, diodi emettitori di luce, transistori emettitori di luce, etc.), e microfluidici (canali, giunzioni a H, partitori, etc.) .

Il substrato dell’invenzione può essere opportunamente ed ulteriormente trattato, funzionalizzato o patternato con materiali biocompatibili o biodegradabili noti per favorire o modificare l’adesione cellulare, preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di: poli-L-lisina, laminina, fibrina, fibrinogeno, collagene, ligandi peptidici sintetici, APTES, PEG.

Per i materiali semiconduttori organici, in particolare quelli compresi nel gruppo costituito da: pentacene, sexitienile, PTCDA, PDCI, terrilene, ftalocianine, oligofenilenevinilene; rubrene; fullerene C60, noti all’esperto del ramo, la morfologia superficiale è controllata attraverso il controllo dei parametri del processo di crescita/deposizione o di generazione della superficie, che comprendono:

i) temperatura del substrato di deposizione, compresa tra -100° e 300°C;

ii) velocità di deposizione da 0.001 A/s a 1000 A /s , per tecniche che sfruttano flussi di materiali, fasci molecolari, deposizione fisica in corrente di vapore, plasma, deposizione da soluzioni, stampa ink-jet , a contatto, o in prossimità (gravure, fotolitografia, serigrafia, etc.);

iii) spessore medio del film sottile depositato compreso in un intervallo tra 0.05 ML e 500 ML;

iv) tensione superficiale del substrato, che può essere modificata mediante trattamenti chimici, fisici e chimico-fisici prima della deposizione del materiale di interesse.

Per un film che cresce per impilamento di strati monomolecolari di altezza h, lo spessore medio corrisponde al ricoprimento totale

e la rugosità corrispondente è data da:

dov è il numero medio di strati che dipende dal meccanismo di

crescita attraverso la distribuzione Ρ(Θί)=Θ|/Θ.

Ε' stata riportata una espressione fenomenologica che collega la rugosità di scala σ alla rugosità di saturazione asat>alla dimensione frattale dfe alla lunghezza di correlazione ξ:

Quindi secondo un aspetto preferito l’invenzione riguarda un metodo per la preparazione di substrati per colture cellulari con spessore compreso tra 0.1 e 10 ML, lunghezza di correlazione ξ compresa tra 0.05 e 5 μΜ, dimensione frattale compresa tra 2 e 3 (per una dimensione Euclidea E=3) e rugosità asatcompresa tra 0.1 e 6 nm, più preferibilmente compresa tra 1-4 nm e secondo una realizzazione ancor più preferita compresa tra e 1.25 e 2.5 nm, comprendente i seguenti passaggi:

o controllo dello spessore del film o del tempo di deposizione per un certo flusso pari a frazioni di monostrato al minuto;

o controllo deH’omogeneità del deposito;

o analisi del comportamento di scala auto-affine del film sottile.

Particolarmente preferite sono le seguenti condizioni che danno film di materiale organico semiconduttore comprese tra 0.1 e 10 ML:

• semiconduttore organico è pentacene;

• tecnica di deposizione è per sublimazione in alto vuoto;

• la temperatura di deposizione > 25°C;

• flusso pari a 0.1 nm/min e non in eccesso di 1 nm/min;

• condizioni di alto- o ultra alto vuoto (pressioni di base <10<'5>mbar).

Nel caso della nanofabbricazione, la morfologia della superficie (rugosità, lunghezza di correlazione, dimensione frattale) può essere modificata depositando strutture spazialmente controllate con uno stampo o mediante lo stampaggio di un film altrimenti liscio e omogeneo. La rugosità sarà funzione della frazione della superficie Θ dello stampo corrispondente ai recessi rispetto alla superficie totale. Inoltre, dipenderà dalla altezza h delle strutture rispetto ai recessi, che è funzione di parametri come concentrazione della soluzione (nel caso di tecniche di stampa come lithographically controlled wetting o contact printing) oppure dalla pressione e temperatura nel caso della nanoimprinting lithography. La rugosità corrispondente sarà data da a=h-i[©(1-0)]<0·5>. Nonostante questa espressione sia simmetrica attorno a 0=0.5, il risultato sulla risposta delle cellule non lo sarà necessariamente in quanto un diverso coverage, anche se simmetrico attorno al valore di 0.5, produrrà una diversa distribuzione dei recessi e delle protuberanze, in termini di estensione, energia superficiale e area superficiale locali.

Costituisce un ulteriore aspetto dell’invenzione, l’uso del substrato e del substrato su supporto descritti sopra, per la coltura di cellule, in particolare per la modulazione di una o più funzioni cellulari, quali la divisione, la vitalità, l’adesione, il differenziamento.

I parametri cellulari correlati a queste funzioni possono essere misurati con metodi noti al tecnico del ramo: ad es. la vitalità è misurata mediante colorazione vitale delle cellule, la proliferazione cellulare può essere misurata attraverso conta cellulare e metodi di analisi delle immagini microscopiche, l’adesione è misurata mediante conteggio cellulare e colorazione delle cellule, il differenziamento attraverso marcatura cellulare con anticorpi e composti fluorescenti.

Nel caso specifico, ad esempio, il differenziamento di precursori neuronali in neuroni può essere misurato morfologicamente per la comparsa di neuriti. Secondo un aspetto preferito, le caratteristiche di adesione, morfologia e crescitaproliferazione cellulare sono state determinate tramite saggi con coloranti fluorescenti, quali fluoresceina di-acetato (FDA), ioduro di propidio (PI), Hoechst, DAPI, calceina-AM, trypan blue, con coloranti di vitalità-tossicità in vitro quali MTS, con kit ELISA o con tecniche di immunocitochimica, ovvero con qualsiasi tecnica microscopica atta a rilevare il numero di cellule o parametri ad esso correlati.

L'invenzione risulta particolarmente utile per modulare la risposta di cellule di organismi complessi quali i mammiferi. Quindi secondo un aspetto preferito, le cellule sono di mammifero, sono adulte, somatiche o staminali, anche embrionali (preferibilmente non umane) e possono essere in linea o essere primarie.

Secondo una realizzazione preferita le cellule sono differenziate o precursori multipotenti della linea neuronaie, mesenchimale, epiteliale, muscolare, adipocitaria, o circolanti.

Pertanto l’invenzione riguarda un metodo per modulare almeno una funzione cellulare quale la divisione, la vitalità, l’adesione, il differenziamento, utilizzando il procedimento di preparazione di substrati a morfologia su scala nanometrica controllata sopra descritto ed in cui le cellule possono essere distribuite sul substrato in opportuno terreno di crescita, incubate a temperatura ottimale, in condizioni di sterilità e di percentuali di anidride carbonica adeguate, preferibilmente in assenza di siero ed in cui ad un tempo definito e compreso tra 2 ore e 1 settimana, si misura il parametro cellulare di interesse, con le tecniche più opportune.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1. Preparazione dei film di pentacene a morfologia controllata.

La crescita dei film sottili di pentacene per sublimazione in alto vuoto è una metodologia ben conosciuta grazie a numerosi studi. Investigazioni morfologicostrutturali con diffrazione ai raggi X e microscopia a forza atomica, sono stati effettuati per caratterizzarne l’ordine molecolare e i parametri morfologici su scale meso e microscopiche. Inoltre sono stati determinati i parametri che governano la dinamica della crescita dei film: la velocità e la temperatura di evaporazione, le caratteristiche del substrato e così via<1'2"3>.

Le molecole di pentacene inizialmente si orientano perpendicolarmente alla superficie; durante la fase iniziale di crescita, isole bidimensionali stabili nucleano sulla superficie, formando la fase di film sottile.

Aumentando lo strato di copertura, le isole si allargano e un secondo strato inizia la nucleazione, quando il primo strato non è ancora completo. La densità di nucleazione dipende dalla velocità di deposizione e dalla preparazione del substrato. La figura 2a illustra la dipendenza del ricoprimento di ciascuno strato di pentacene in funzione dello spessore totale<3>.

I film ultrasottili di pentacene sono stati cresciuti tramite la sublimazione in alto vuoto e caratterizzati tramite tecniche di microscopie a scansione di sonda. La tipica crescita piramidale del semiconduttore organico (fig. 2) è stata correlata alla rugosità quadratica media σ, in accordo con la teoria di riscalamento dinamico<12>, alla dimensione frattale nonché alla relativa lunghezza di correlazione (fig. 4). L’analisi frattale è stata effettuata ogni volta per verificare la riproducibilità della modalità di crescita.

Differenti parametri morfologici superficiali del pentacene (1÷80 monostrati) sono stati prodotti utilizzando velocità di sublimazione controllate ed utilizzati per i test con le cellule. La misurazione degli angoli di contatto è stata effettuata sui diversi substrati utilizzati (fig. 5).

E’ quindi possibile crescere film di pentacene con spessore tra 0.1 e 10 ML, rugosità di saturazione compresa tra 0.1 e 6 nm, dimensione frattale compresa tra 2 e 3 e lunghezza di correlazione compresa tra 0.1 e 5 μιτι, mediante sublimazione di pentacene a velocità e parametri controllati e la cui morfologia può essere misurata quantitativamente da immagini AFM (fig. 5).

Esempio 2. Prove di coltura cellulare su film di pentacene: valutazione della proliferazione, necrosi ed adesione cellulare.

Cellule umane astrogliali 1321N1 (ECACC 86030402) sono state scelte come prototipo cellulare per la crescita su film sottili di pentacene. Le cellule furono coltivate in terreno Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM F-12) in condizioni standard, a 37°C in atmosfera controllata (95% umidità, 5% C02).

Coloranti fluorescenti, conta delle cellule e microscopia ottica a fluorescenza, uniti all’AFM, sono stati utilizzati per monitorare l’adesione, la morfologia e la proliferazione cellulare. La vitalità delle cellule nel tempo è stata misurata in funzione delle caratteristiche morfologiche dei film sottili di semiconduttore organico, utilizzando un algoritmo di conta ed immagini ottiche in fluorescenza (fig.

6).

Le caratteristiche di adesione, morfologia e crescita-proliferazione cellulari sono state determinate tramite saggi con Fluoresceina Di-Acetato (FDA, 75 pg/ml), Propidium lodide (PI, 2 pg/ml) e/o Trypan blue (0.4%), come precedentemente descritto<13>, o con tecniche di immunocitochimica.

I dati sono stati riportati in funzione dei parametri morfologici dei film sottili organici. Piastre di coltura in polistirene (standard per colture cellulari) e vetrini sono stati utilizzati come superfici di controllo. Tutti I dati sono stati riportati come media±SEM (errore standard della media) ed analizzati statisticamente tramite il test One-Way ANOVA ( Bonferroni’s multiple comparison test) o Student’s West (two tails, unpaired); la significatività è stata riportata per valori di P<0.05.

Divisione e proliferazione cellulare

Per gli esperimenti di vitalità, le cellule sono state seminate (5x10<4>cells/ml; 2.5x10<4>cells/cm<2>) su film sottili di pentacene preparati come descritti nell’esempio I e lasciate proliferare per 12-72 ore, in condizioni standard, poi marcate con coloranti Trypan Blue o FDA/PI e contate dopo vari intervalli di tempo. Dai risultati ottenuti emerge che i film organici di pentacene permettono una normale adesione e crescita cellulare.

II livello di morte (necrosi) delle cellule 1321 N1 (fig. 7a) è significativamente differente, rispetto alle superfici di controllo, solo nei film di pentacene più rugosi (> 30ML), dopo 48 ore.

In particolare, come mostrato in figura 7b e 8, c’è una proliferazione preferenziale delle cellule che crescono su film sottili di spessore < ai 10 ML. C’è una diminuzione nella densità delle cellule vitali quando lo spessore del film di pentacene aumenta, con un valore critico a 10 ML di spessore. La proliferazione cellulare ha la velocità maggiore sui film di pentacene con spessore < 10 ML e minore su quelli con spessore > 60 ML. In relazione alla lunghezza di correlazione e alla dimensione frattale dei film, superati i 10 ML il livello di crescita cellulare non viene alterato significativamente.

In particolare dopo 12, 24 e 48 ore in coltura, il numero delle cellule vitali risultò significativamente più alto nei campioni con ML< 12 e quindi con lunghezza di correlazione > 0.5 μηι e dimensione frattale >2.5 ed una più bassa rugosità superficiale (σ < 4 nm).

In fig. 4 sono riportati i parametri morfologici dei film sottili di pentacene in funzione dello spessore medio dello strato di pentacene. I risultati incrociati indicano che i parametri morfologici dei film sottili di semiconduttore organico possono influenzare le caratteristiche di vitalità delle cellule soprattutto per film di spessore inferiore o uguale a 10 ML (fig. 8), e che una crescita preferenziale avviene su film di spessore inferiore a 10 ML.

Adesione cellulare

Per gli esperimenti di adesione, le cellule gliali 1321N1 sono state incubate sui film di pentacene per 3 ore, in mezzo senza siero, e le caratteristiche di adesione sono state determinate tramite il colorante fluorescente FDA. FDA entra per diffusione passiva nelle cellule ed è convertita, dall’enzima non-specifico esterasi, in fluoresceina (fluorescente alla luce con lunghezza d’onda di 490 nm), che è trattenuta dalle cellule vitali con membrana piasmatica intatta mentre fuoriesce rapidamente dalle cellule morte o danneggiate.

L’adesione delle cellule gliali sembra diminuire all’aumentare dello spessore del film (>10 ML), quindi della rugosità di saturazione del film sottile organico (> 4 nm) e al diminuire della lunghezza di correlazione < 0.5 μιτι (P=0.048, One-way ANOVA).

Quindi, controllando le caratteristiche di superficie del semiconduttore organico è possibile influenzare le risposte e le caratteristiche delle cellule in coltura su questi substrati.

Esempio 3. Differenziamento di cellule su substrato di pentacene.

Sono stati effettuati esperimenti con cellule neuronali, in particolare cellule di neuroblastoma umano SHSY5Y (ATCC: CRL-2266). Le cellule sono state cresciute su film sottili di pentacene a diversa morfologia in condizioni standard e quindi differenziate tramite l’esposizione ad acido retinoico per ottenere reti neuronali su film sottili di pentacene. Le reti neurali furono evidenziate con esperimenti di immunocitochimica, tramite l'utilizzo di un’anticorpo primario anti-β III tubulina ed il corrispondente anticorpo secondario legato ad una molecola fluorescente (Alexa Fluor 488; λ=490 nm).

I risultati ottenuti dimostrano che film sottili di pentacene, a rugosità controllata, sono utilizzabili anche con cellule neuronali, poiché ne permettono la crescita, la proliferazione e la differenziazione.

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Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la preparazione di un substrato, adatto alla crescita di cellule eucariote, avente superficie a spessore controllato, tale superficie caratterizzata da uno o più dei seguenti parametri morfologici: spessore nominale compreso tra 0.1 e 50 nm (o 0.1 e 10 ML), una lunghezza di correlazione ξ compresa tra 0.05 e 5 μΜ, una dimensione frattale (df) compresa tra 2 e 3 ed una rugosità asatcompresa tra 0.1 e 6 nm, più preferibilmente compresa tra 1-4 nm e ancor più preferibilmente compresa tra e 1.25 e 2.5 nm.
2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 dove tale substrato è costituito da un film sottile organico depositato su una superficie solida;
3. 3. Il metodo secondo la rivendicazione 2 dove tale film sottile organico è costituito da un semiconduttore organico;
4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 3 dove tale semiconduttore organico è selezionato nei seguenti gruppi : o oligomeri pi-coniugati preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di: pentacene, sexitienile, oligofenilenevinilene, oligofluorene; o composti polieterociclici, preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di: ftalocianine; rubrene (5,6,11,12-tetraphenylnaphthacene), perileni e suoi derivati quali ad es. il terrilene, PTCDA (perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic-3,4,9,10-dianhydride), PDI; o allotropi del carbonio preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di: fullerene C60, grafene, nanografene.
5. 5. Il metodo secondo la rivendicazione 4 dove tale semiconduttore organico di un oligomero pi-coniugato è depositato come film sottile o ultrasottile su un supporto tramite tecnica con controllo della quantità di deposito inferiore a 1 ML di copertura nominale.
6. 6. Il metodo secondo la rivendicazione 5 dove tale tecnica di deposizione è selezionata tra le seguenti: sublimazione in alto- o ultra-alto vuoto, drop casting o spin coating, ink-jet printing, fotolitografia, serigrafia, stampaggio, stampa a contatto o a pressione, nanoimprinting lithography, o una combinazione di queste tecniche.
7. 7. Il metodo secondo la rivendicazione 6 dove tale tecnica è la sublimazione ed awiene alle seguenti condizioni: a. temperatura di deposizione > 25°C; b. flusso compreso tra 0.1 nm/min e non in eccesso di 1 nm/min; c. pressione <10<"5>mbar.
8. 8. Il metodo secondo le rivendicazioni 5-7 dove tale supporto è un materiale selezionato nel gruppo consistente di: materiale polimerico, materiale poroso, materiale vetroso, materiale plastico, wafer di silicio anche patternato o un wafer di silicio stampato con strutture funzionali e non funzionali, dispositivi elettronici e microfluidici.
9. 9. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-8 comprendente un ulteriore passaggio di rivestimento della superficie a spessore controllato, con uno o più materiali biocompatibili e/o biodegradabili, atti a modificare l’adesione cellulare, preferibilmente selezionato nel gruppo consistente di polipeptidi ed oligopeptidi (L-poli-lisina, laminina, fibrina, fibronettina, collagene, o di ligandi peptidici sintetici) oppure APTES, PEG.
10. 10. Un metodo per la modulazione di almeno una delle seguenti funzioni cellulari in cellule isolate: proliferazione, vitalità, adesione, differenziamento e comprendente la preparazione di substrati a rugosità controllata secondo le rivendicazioni 1-9. 11.
11. 11 metodo secondo la rivendicazione 10 dove tali cellule isolate sono di mammifero.
12. 12. Il metodo secondo la rivendicazione 11 dove tali cellule sono adulte ovvero staminali, in linea o primarie.
13. 13. Il metodo secondo le rivendicazioni 11-12 dove tali cellule sono neuronali, mesenchimali, epiteliali, muscolari, adipose e circolanti del sangue.
14. 14.11 metodo secondo le rivendicazioni 12-13 dove tali cellule staminali sono internally programmed (iPS).
15. 15. Un supporto comprendente un substrato a superficie controllata ottenibile secondo il procedimento in accordo con le rivendicazioni 1-9 adatto alla crescita di cellule eucariote avente superficie a spessore controllato, dove tale superficie a spessore controllato è caratterizzata da uno o più dei seguenti parametri morfologici: a. spessore nominale compreso tra 0.1 e 50 nm (o 0.1 e 10 ML), b. lunghezza di correlazione ξ compresa tra 0.05 e 5 μΜ, c. dimensione frattale dfcompresa tra 2 e 3, d. rugosità asatcompresa tra 0.1 e 6 nm, più preferibilmente compresa tra 1-4 nm, ancor più preferibilmente compresa tra e 1.25 e 2.5 nm.