ITMI20082148A1 - Procedimento per l'estrazione di proteine da campioni di tessuto biologico ffpe - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

“Procedimento per l'estrazione di proteine da campioni di tessuto biologico FFPEâ€

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce al campo della estrazione di proteine da campioni di tessuto biologico.

STATO DELLA TECNICA

Negli archivi di tessuti fissati con formalina ed inclusi in paraffina (FFPE acronimo di Formalin Fixed Paraffin Embedded) à ̈ racchiusa una grande quantità d’informazioni riguardanti le proteine coinvolte in diversi aspetti di numerosi stati patologici. Questi archivi sono il risultato di procedure diagnostiche immunoistochimiche effettuate nei laboratori di anatomia patologica degli ospedali di tutto il mondo. Se accessibili, le molecole proteiche dei tessuti FFPE rappresenterebbero un’inestimabile risorsa in termini di ricerca di biomarcatori, specialmente se si considera la portata delle informazioni retrospettive relative a diagnosi, prognosi ed esito della patologia specifica.

Negli ultimi anni sono stati numerosi gli sforzi diretti a rendere possibile l’accesso a questo “tesoro nascosto†. Il lavoro svolto nel settore ha portato allo sviluppo di varie strategie volte ad estrarre le proteine da campioni di tessuto FFPE.

L’estrazione di proteine da tessuti FFPE à ̈ tuttavia ostacolata dalla chimica del fissaggio con formaldeide e, nonostante alcuni metodi abbiano dato risultati soddisfacenti, essi spesso offrono limitate possibilità di applicazione in tecniche analitiche successive all’estrazione. Infatti con tali metodi si ottengono scarse rese di estrazione e una scarsa qualità delle proteine estratte; inoltre, lo stato in cui queste vengono ottenute le rende incompatibili con le più diffuse tecniche di analisi proteomica.

Nel documento W02006/1 22898 A1 à ̈ stato descritto un metodo di estrazione a caldo di proteine da un campione biologico FFPE, in cui il campione biologico viene incubato, ad una temperatura adeguata a rilasciare le proteine e in assenza di composti proteolitici attivi, in un tampone contenente un detergente. Secondo quanto descritto negli esempi, tale metodo à ̈ stato messo in pratica utilizzando un tampone a pH 6.8, facoltativamente in presenza di un agente riducente ditiotreitolo (DTT) in concentrazione 1mM. Per gli estratti proteici così ottenuti, à ̈ stato possibile applicare una analisi di espressione basata su microarray di proteine a fase inversa.

I metodi di estrazione fino ad oggi ottenuti, tuttavia, non permettono di avere una qualità dei campioni di proteine FFPE estratte tale da consentire l’applicazione di analisi quali la separazione per elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), le procedure di proteomica differenziale o spettroscopia di massa (MS) basate su digestione in-gel delle bande di proteine separate con SDS-PAGE, ma soprattutto la combinazione di 2D-PAGE e MALDI-MS, la tecnica di analisi attualmente più diffusa e pratica nel campo della proteomica differenziale.

Scopo della presente invenzione à ̈ quindi quello di fornire un metodo affidabile e versatile per l’estrazione di proteine da campioni FFPE, che consenta al contempo di ottenere estratti, di alta qualità e con alte rese, che siano compatibili con la maggioranza delle metodiche proteomiche, quali ad esempio l’analisi mediante SDS-PAGE, western immunoblotting e array di proteine. In particolare la presente invenzione fornisce un metodo che consente di ottenere estratti proteici adatti alla successiva applicazione combinata di 2D-PAGE e MALDI-MS.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

Lo scopo indicato più sopra e i vantaggi che verranno descritti sono stati raggiunti mediante un procedimento per l'estrazione di proteine da campioni di tessuto FFPE comprendente le seguenti fasi:

ii) aggiungere al campione FFPE un tampone di estrazione comprendente:

A) una soluzione tampone a pH maggiore o uguale a 8; e

B) un agente riducente in concentrazione maggiore o uguale a 100mM; iii) incubare il campione FFPE nel tampone di estrazione a una temperatura nell’intervallo da 55°C a 100°C,

in cui detto agente riducente à ̈ un composto scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA).

Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un kit per l’estrazione di proteine da campioni FFPE, come prodotto combinato per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nel procedimento di estrazione dell’invenzione, comprendente:

a) una soluzione tampone a pH maggiore o uguale 8;

b) un agente riducente in concentrazione maggiore o uguale 100mM in cui detto agente riducente à ̈ un composto scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA).

Inaspettatamente, il procedimento della presente invenzione ha fornito estratti proteici da campioni di tessuto FFPE con rese e qualità superiori rispetto a quanto ottenibile con i metodi noti e paragonabili a quelle ottenibili da corrispondenti campioni freschi-congelati.

La presente invenzione presenta il vantaggio di permettere di ottenere estratti proteici, che possono essere impiegati direttamente, senza ulteriori elaborazioni, nelle più diffuse tecniche proteomiche. L’estratto ottenuto trova infatti applicazione per l’analisi mediante SDS-PAGE, western immunoblotting e array di proteine e le proteine separate tramite SDS-PAGE e 2D-PAGE possono essere successivamente analizzate con tecniche di spettrometria di massa come la MALD1-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization - Time of Flight Mass Spectrometry) e la nanoHPLC-nano-ESI-QTOF-MS/MS (nano-High Pressure Liquid Chromatography-nano-ElectroSpray lonization-Quadrupole Time of Flight Tandem Mass Spectrometry).

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

L’invenzione verrà ora descritta in dettaglio facendo riferimento ad alcune figure in cui:

- la Figura 1A à ̈ la rappresentazione dei risultati di elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) di proteine estratte secondo il metodo della presente invenzione, da tessuti freschi congelati e da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina (FFPE). Nella figura M indica marcatore di peso molecolare; 1: tessuto fresco di muscolo scheletrico; 2: tessuto FFPE di muscolo scheletrico; 3: tessuto FFPE di tiroide umana ipertrofica; 4: fegato umano sano FFPE; 5: carcinoide polmonare FFPE; 6: carcinoma polmonare FFPE. La reattività con anticorpi antiactina à ̈ mostrata sotto il corrispondente profilo proteico totale. Le proteine ottenute con il metodo dell’invenzione nell’esempio 1 sono state quantificate col metodo Bradford e sono stati caricati rispettivamente circa 10 microgrammi di proteine totali per l’SDS-PAGE e 1 microgrammo di proteine totali per il western blotting;

- la Figura 1 B à ̈ la rappresentazione in grafico del confronto fra i profili di densità relativa delle proteine separate in SDS-PAGE da tessuto muscolare fresco (grìgio scuro) di muscolo e da tessuto muscolare FFPE (grigio chiaro);

- la Figura 2A riporta i risultati della reattività osservata in western blot e protein arrays con le proteine estratte secondo il metodo della presente invenzione da tessuti freschi e da campioni FFPE come ottenuto nell’esempio 1. Nella figura M: marcatore di peso molecolare;

- la Figura 2B riporta i risultati della reattività delle proteine GAPDH (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), TROPOMYOSIN (tropomiosina), VINCULIN (vinculina), DESMIN (desmina), MYOSIN (miosina) nel test ELISA. Sono riportati i valori dì media e deviazione standard della densità ottica a 650 nm per tre repliche sperimentali indipendenti;

- la Figura 3 riporta in alto i diagrammi di Venn che illustrano la distribuzione delle proteine identificate da estratti di tessuto fresco (bianco) e FFPE (grigio scuro) ottenuti mediante il metodo della presente invenzione. Nel riquadro a sinistra il 64% delle proteine identificate da tessuto fresco vengono identificate anche da tessuto FFPE, mentre l’85% delle proteine identificate in FFPE vengono identificate anche nel fresco. Nel riquadro a destra per le 50 proteine più rappresentate, l’80% vengono identificate in entrambi i tessuti fresco ed FFPE. Nella figura 3 vengono altresì riportati tre diagrammi ad istogrammi che rappresentano le statistiche delle identificazioni delle proteine da tessuto fresco (grigio chiaro) e FFPE (grigio scuro);

- la Figura 4 riporta il confronto di spettri di massa rappresentativi di peptidi identificati in estratti di tessuto muscolare scheletrico ovino fresco ed FFPE col metodo di cui alla presente invenzione.

- la Figura 5 riporta il confronto della distribuzione delle proteine identificate da estratti di tessuto fresco (sinistra) e FFPE (destra), ottenute mediante il metodo della presente invenzione in base a criteri di classificazione genica ( Gene Ontology, GO). Il diagramma superiore indica le seguenti classi funzionali di proteine: B, legame; C, catalisi; M, motoria; S, strutturale; T, trasporto; R, trascrizione/regolazione; O: altro. Il diagramma in basso indica le seguenti localizzazione subcellulari: E, extracellulare; Y, citoplasmatico; Mt, mitocondriale; N, nucleare; Mn, membrana; U, altro o non definito.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per l’estrazione di proteine da campioni di tessuto FFPE comprendente la fase ii) di aggiungere al campione FFPE un tampone di estrazione comprendente:

A) una soluzione tampone a pH maggiore o uguale a 8; e

B) un agente riducente in concentrazione maggiore o uguale a 100mM;

e la fase iii) di incubare il campione FFPE nel tampone di estrazione a una temperatura nell'intervallo da 55°C a 100°C,

in cui detto agente riducente à ̈ un composto scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA).

Il procedimento dell'invenzione prevede pertanto una fase ii) di aggiunta al campione FFPE il tampone di estrazione. Tale tampone di estrazione comprende un agente riducente scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA). Più preferibilmente detto agente riducente à ̈ il composto ditiotreitolo (DTT).

L'agente riducente secondo la presente invenzione à ̈ in quantità, nel tampone di estrazione, maggiori o uguali a 100mM. Preferibilmente detto agente riducente à ̈ presente nel tampone di estrazione in quantità nell’intervallo da 100 a 300 mM. Più preferibilmente in concentrazione uguale a circa 200mM.

il tampone di estrazione comprende altresì una soluzione tampone a un pH maggiore o uguale a 8. Preferibilmente detta soluzione tampone à ̈ una soluzione tampone avente un pH nell’intervallo 8 < pH< 9, più preferibilmente il tampone à ̈ a pH 8.8.

Preferibilmente detta soluzione tampone à ̈ a base di trisidrossimetilaminometano cioridrato (TrisHCI), Tricina o glicina-glicina (Gly-Gly), esso à ̈, più preferibilmente, a base a base di Tris HCI 20mM.

In una forma di realizzazione vantaggiosa il tampone di estrazione comprende una soluzione tampone a base di Tris HCI 20mM a pH 8.8 e come agente riducente ditiotreitolo (DTT).

Detto tampone di estrazione preferibilmente comprende anche un detergente. Detto detergente à ̈ preferibilmente in concentrazione nell'intervallo da 0.5 a 4 % in peso, preferibilmente in concentrazione 2% in peso. Detto detergente à ̈ preferibilmente scelto dal gruppo consistete in sodiododecilsolfato (SDS), sodio colato, sodio deossicolato, polietilen-glicol p-(1 ,1,3-tetrametilbutil)-etere (Triton X100®), Poliossietilene (20) sorbitan monolaurato (Tween20®), octil-βglucopiranoside, tert-Octilfenossi poli(ossietilene)etano (Nonidet P40®), più preferibilmente detto detergente à ̈ SDS ed à ̈ presente nella tampone di estrazione al 2% in peso.

In una più preferita forma di realizzazione, il tampone di estrazione à ̈ composto da 20 mM Tris HCI pH 8.8, 2% SDS, 200 mM DTT. Questa particolare composizione del tampone ha fornito risultati di estrazione molto efficienti come sarà evidente dalla parte sperimentale che segue.

Il tampone di estrazione opzionalmente comprende anche un ulteriore detergente di tipo amidosolfobetainico. Esso preferibilmente à ̈ scelto dal gruppo consistente in ASB-14, ASB-16, ASB-C7BzO, 3-[(3-Colamidopropil)dimetilammonio]-1-propanesolfonato (CHAPS), 3-[(3-Colamidopropil)dimetilammonio]-2-idrossi-1 -propanesolfonato (CHAPSO). Detto ulteriore agente detergente à ̈ utile per l’estrazione di proteine ad elevato contenuto lipidico ed à ̈ preferibilmente aggiunto dopo una prima incubazione a caldo nel tampone di estrazione sopra descritto. Detto ulteriore detergente à ̈ aggiunto al tampone di estrazione, preferibilmente, in forma di soluzione acquosa in concentrazione nell'intervallo da 5 a 15% in peso, più preferibilmente 10%, in proporzione da 1 :10 a 1 :30 rispetto al tampone di estrazione finale, più preferibilmente 1 :20, così da ottenere una concentrazione finale nel tampone di estrazione uguale a circa 0.5%.

Il procedimento secondo l'invenzione comprende la fase iii) di incubare il campione FFPE nel tampone di estrazione a una temperatura nell'intervallo da 55°C a 100°C. Preferibilmente detta fase di incubazione iii) avviene in due sottofasi:

Ni- prima parte) incubare il campione ad un temperatura nell’intervallo da 90 a 100°C per un tempo nell’intervallo 15-25min;

Hi- seconda parte) incubare il campione sottoposto alla fase iii-prima parte) ad un temperatura nell’intervallo da 55 a 85°C per un tempo nell’Intervallo 1.5-2.5 ore; Successivamente alla fase di incubazione il procedimento prevede la fase iv) dì recupero della porzione liquida del prodotto di incubazione della fase iii) contenente le proteine estratte.

Preferibilmente il procedimento dell’invenzione prevede una fase i) di deparaffinazione del campione FFPE. Più preferibilmente detta fase i) di deparaffinazione viene effettuata con un solvente scelto dal gruppo consistente in xilene, toluene, ottano, ottano/metanolo e loro miscele. Detto solvente à ̈ ancor più preferibilmente xilene.

Dopo la fase di deparaffinazione i) vantaggiosamente il procedimento dell’invenzione può prevedere di effettuare una fase di reidratazione del campione FFPE con un alcool a gradazioni decrescenti prima di sottoporlo alla fase di aggiunta del tampone ii). Preferibilmente detta fase di reidratazione viene effettuata con etanolo al 100%, al 96% o al 70%.

Dopo la fase di incubazione a caldo iii) - prima parte, preferibilmente il procedimento di estrazione può prevedere una fase di aggiunta di un ulteriore detergente di tipo amidosolfobetainico.

Nella forma di realizzazione estremamente vantaggiosa il procedimento dell’invenzione prevede la fase di aggiunta di un tampone di estrazione comprendente 20 mM Tris HCI pH 8.8, 2% SDS, 200 mM DTT.

Il procedimento dell’invenzione comprendente tutte le fasi preferite e vantaggiose ha fornito estrazioni di proteine molto efficienti con rese di estrazione nell’intervallo 100-200 pg per fetta di tessuto.

Specificatamente risultati sorprendenti di rese di estrazione sono stati ottenuti impiegando fette di tessuto FFPE microtomiche, 10 pm di spessore, tagliate da un blocchetto di tessuto FFPE di 1 cm<3>.

Sotto un altro aspetto l’invenzione concerne un kit per l'estrazione di proteine da campioni FFPE, come prodotto combinato per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nel procedimento di estrazione dell'invenzione, comprendente a) una soluzione tampone a pH maggiore o uguale 8; e b) un agente riducente in concentrazione maggiore o uguale 100mM, in cui detto agente riducente à ̈ un composto scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA).

Poiché il kit dell’invenzione à ̈ un prodotto combinato per l’uso nel procedimento dell’invenzione esso, vantaggiosamente, comprenderà tutti gli ingredienti vantaggiosi e preferiti indicati più sopra per il tampone di estrazione del procedimento dell’invenzione. Esso quindi comprenderà preferibilmente almeno un ulteriore detergente. Nella forma vantaggiosa esso comprenderà ancora un ulteriore detergente di natura amidosolfibetainica.

Detto kit, più preferibilmente, comprende:

- un recipiente C contenente una miscela comprendente: detta soluzione tampone, detto detergente ed opzionalmente detto ulteriore detergente di natura amidosolfobetainica;

- una pluralità di contenitori Dn contenenti ciascuno una adatta quantità di agente riducente da sospendere in una adatta quantità di detta miscela al momento dell’uso per completare la formazione di una adatta quantità di tampone di estrazione dell'invenzione;

- un foglietto per le istruzioni all’uso.

Facoltativamente, detto kit può comprendere un ulteriore recipiente contenente una soluzione acquosa di detto ulteriore detergente a struttura amidosolfobetainica, qualora non già presente nel recipiente C.

Vantaggiosamente detto kit comprende:

- un recipiente C comprendente 10mL una miscela comprendente: detta soluzione tampone, detto detergente ed facoltativamente detto ulteriore detergente di natura amidosolfobetainica; ;

- 10 contenitori D contenenti ciascuno 30mg di agente riducente a cui aggiungere 1mL di detta miscela per preparare 1mL di tampone di estrazione pronto per l’uso al punto (ii) del metodo sopra descritto.

Facoltativamente, detto kit, qualora detto ulteriore detergente a struttura amidosolfobetainica non sia già presente in detta miscela, comprenderà un ulteriore recipiente contenente 500Î1⁄4Ι_ di soluzione acquosa al 10% in peso di detto ulteriore detergente a struttura amidosolfobetainica da aggiungere nel procedimento dell'invenzione.

Nella forma di realizzazione più preferita detta miscela comprende TrisHCI 20mM a pH 8.8 e SDS al 2% e facoltativamente ASB-14 al 0.5% e detto agente riducente à ̈ preferibilmente DTT.

Detto ulteriore detergente a struttura amidosolfobetainica, qualora non sia già presente in detta miscela, à ̈ preferibilmente ASB-14 in forma di soluzione acquosa al 10% in peso.

Il tampone di estrazione del procedimento dell’invenzione una volta preparato dal kit dell’invenzione può essere conservato a -20°C al massimo per 5 giorni.

Tutti i componenti del kit possono essere conservati a temperatura ambiente oppure conservati anche in ambienti refrigerati. In quest’ultimo caso nel caso di formazione di precipitati i componenti possono essere riscaldati a temperatura ambiente o a 37°C prima dell’uso.

Preferibilmente detti contenitori sono provette tipo Eppendorf.

Secondo l’invenzione la metodica di quantificazione preferita dopo l’applicazione del procedimento di estrazione dell’invenzione à ̈ quella denominata Bradford (Bradford, M., Anal. Chem. 1976, 72, 248-254).

Il metodo di estrazione delle proteine da tessuti FFPE sopra descritto à ̈ dotato di un’efficienza elevata fornendo estratti con resa e qualità elevate. Gli estratti generati sono compatibili con la maggioranza delle metodiche proteomiche classiche e generano risultati affidabili e riproducibili. L’estratto ottenuto con il procedimento dell’invenzione trova applicazione per l’analisi mediante SDS-PAGE, western immunoblotting e array di proteine. Le proteine separate tramite SDS-PAGE e 2D-PAGE possono essere, vantaggiosamente, successivamente analizzate con tecniche di spettrometria di massa come la MALDI-TOF-MS e l’HPLC-nano-ESI-QTOF-MS/MS.

La presente domanda di brevetto mostra analisi comparative degli estratti da tessuti FFPE ottenuti con il metodo della presente invenzione rispetto ad estratti da tessuti freschi-congelati.

L’invenzione viene ora illustrata attraverso alcuni esempi a titolo illustrativo e non limitativo del procedimento dell’invenzione e attraverso alcuni esempi di analisi delle proteine estratte. Gli esempi di applicazione delle tecniche di analisi sono stati effettuati in modo comparativo con campioni di tessuto freschi.

Per l’analisi mediante protein arrays, le proteine estratte sono state portate alla concentrazione desiderata con tampone d’estrazione e quindi spottate sul supporto, specificatamente nitrocellulosa.

Per l’analisi mediante SDS-PAGE e western immunoblotting, le proteine sono state diluite alla concentrazione desiderata in tampone di Laemmli, incubate a 95°C per 5 min, e infine depositate nei pozzetti del gel.

Per l’analisi mediante ELISA ed elettroforesi bidimensionale, à ̈ stata effettuata la precipitazione delle proteine con TCA/acetone, e quindi la loro risospensione in acqua nel primo caso ed in soluzione di focalizzazione nel secondo.

In seguito ad elettroforesi mono e bidimensionale, le proteine separate sono state tagliate dal gel, idrolizzate ed analizzate mediante spettrometria di massa secondo le metodiche convenzionali.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1: Preparazione degli estratti proteici

Campioni di tessuto

Per l’ottimizzazione delle procedure di estrazione ed analisi sono stati utilizzati tessuti di pecora, ottenuti come di seguito. Immediatamente dopo la macellazione, sono state tagliate dal muscolo femorale porzioni di tessuto di circa 1 cm<3>, e repliche multiple del campione sono state immediatamente congelate a -80°C oppure fissate per 24 ore in formalina tamponata al 10%, disidratate con una serie crescente di alcoli ed infine incluse in paraffina. I campioni da banche di tessuti umani provenivano da biopsie di tiroide iperplastica, fegato normale, carcinoide e carcinoma polmonari. La diagnosi à ̈ stata effettuata in immunoistochimica durante le normali procedure ospedaliere.

Preparazione degli Estratti proteici secondo il procedimento dell’invenzione.

Gli estratti proteici sono stati ottenuti sia da tessuti freschi (preparazione comparativa) che FFPE (preparazione dell’invenzione).

Il tessuto fresco congelato à ̈ stato ridotto in frammenti con un bisturi sterile, messo in provette da 2 mi, immerso in un tampone di estrazione secondo la presente invenzione per una concentrazione finale di tessuto al 5% p/v e sottoposto a 3 cicli da 3 minuti a 30 cicli al secondo in un omogeneizzatore meccanico Tissue Lyser (Qiagen). Gli omogenati di tessuto sono stati chiarificati per 10 minuti a 4°C a 12000 x g, quantificati col metodo Bradford e conservati a -80°C fin quando necessario.

5 sezioni di microtomo da 10 micron di tessuto FFPE sono state poste in provette da 2 mi, deparaffinate mediante incubazione a temperatura ambiente con xilene per 10 minuti. Dopo ogni incubazione, il tessuto à ̈ stato sottoposto a centrifugazione a 12000 x g per 3 minuti. I passaggi di incubazione e centrifugazione sono stati ripetuti per 3 volte. I pellet così ottenuti sono stati o direttamente trattati per l’estrazione o reidratati con una serie di alcoli a concentrazione decrescente (100%, 96%, 70% v/v). A questo punto i campioni sono stati sottoposti alla procedura di estrazione ad alte temperature, secondo il metodo della presente invenzione. Il tampone di estrazione presentava valori di pH pari a 8.8; concentrazioni di riducente (DTT) di 200mM; l’estrazione a caldo à ̈ stata condotta con le seguenti modalità di incubazione: 20 minuti a 100°C e 2 ore a 80°C, in presenza di agitazione orbitale.Gli estratti proteici sono stati chiarificati per centrifugazione, quantificati con metodo Bradford e conservati a -80°C.

Per confronto, gli estratti proteici da tessuto fresco sono stati sottoposti ad un protocollo di riscaldamento ad alte temperature corrispondente a quello utilizzato per l’estrazione proteica da tessuti FFPE.

Nel preparare l’estratto proteico sono state seguite le seguenti fasi dettagliate: - Deparaffinazione del campione FFPE mediante la seguente procedura:

5 fettine da 10 micron tagliate dal blocchetto incluso in paraffina sono state risospese e quindi collocate in una provetta da 2 mL con tappo di sicurezza. 1 mL di xilene à ̈ stato depositato nella provetta, che à ̈ stata chiusa e agitata vigorosamente con Vortex per almeno 10 s. La provetta à ̈ stata quindi incubata per 8 min a temperatura ambiente e sottoposta a centrifugazione a 12.000 x g per 3 min e il surnatante à ̈ stato rimosso. La fase di incubazione fino alla rimozione del surnatante à ̈ stata ripetuta per altre due volte.

- Reidratazione con etanolo a gradazione decrescente secondo la seguente procedura:

1 ml_ di etanolo al 100% à ̈ stato erogato nella provetta, che à ̈ stata chiusa e agitata vigorosamente con Vortex per almeno 10 s. Quindi si à ̈ proceduto ad incubare per 8 min a temperatura ambiente, centrifugare a 12.000 x g per 5 min e Rimuovere il surnatante. Le fasi di incubazione, centrifugazione e rimozione del surnatante sono state ripetute per altre due volte. 1 mL di etanolo al 96% à ̈ stato quindi erogato nella provetta, che à ̈ stata chiusa e agitata vigorosamente con Vortex per almeno 10 s. Si à ̈ quindi proceduto ad incubare per 8 min a temperatura ambiente, centrifugare a 12.000 x g per 5 min e rimuovere il surnatante. Le fasi di incubazione, centrifugazione e rimozione del surnatante sono state ripetute per altre due volte. 1 mL di etanolo al 70% à ̈ stato quindi erogato nella provetta, che à ̈ stata chiusa e agitata vigorosamente con Vortex per almeno 10 s. Si à ̈ quindi proceduto ad incubare per 8 min a temperatura ambiente, centrifugare a 12.000 x g per 5 min e rimuovere il surnatante. Le fasi di incubazione, centrifugazione e rimozione del surnatante sono state ripetute per altre due volte.

- Trattamento con tampone di estrazione secondo la seguente procedura:

Al pellet residuo sono stati aggiunti 150 microlitri di tampone di estrazione comprendente:

- 20 mM Tris HCI a pH 8.8;

- ditiotreitolo (DTT) 200 mM;

- Sodio Dodecil Solfato (SDS) 2%;

La massa à ̈ stata quindi agitata vigorosamente con Vortex per 10s ed incubata in ghiaccio per 10 min, quindi nuovamente agitata vigorosamente con Vortex e quindi incubata a 100°C per 20 min in blocchetto termico. E’ stata quindi aggiunta Amidosolfobetaina-14 (ASB-14) al 10% in proporzione 1 :20 alla miscela (0.5% finale). La massa à ̈ stata quindi incubata a 80°C per 2h in un blocchetto agitato a 700 rpm.

- Recupero della porzione liquida

La porzione liquida contenente le proteine estratte à ̈ stata quindi recuperata mediante la seguente procedura:

Le provette sono state collocate in ghiaccio per 10 min, sottoposte a centrifugazione a 14.000 x g per 15 min; il surnatante à ̈ stato quindi recuperato in una nuova provetta.

Le proteine estratte potevano essere utilizzate o conservate a -20°C oppure a -70°C per lunghi periodi di conservazione.

Esempio 2: Preparazione degli estratti proteici

5 sezioni di microtomo da 10 micron di tessuto FFPE sono state poste in provette da 2 mi e deparaffinate mediante incubazione a temperatura ambiente con ottano per 10 minuti. Dopo ogni incubazione, il tessuto à ̈ stato sottoposto a centrifugazione a 12000 x g per 3 minuti. I passaggi di incubazione e centrifugazione sono stati ripetuti per 3 volte. I pellet così ottenuti sono stati reidratati con una serie di alcoli a concentrazione decrescente (100%, 96%, 70% v/v). A questo punto i campioni sono stati sottoposti alla procedura di estrazione ad alte temperature, secondo il metodo della presente invenzione. Il tampone di estrazione presentava valori di pH pari a 8.8, in assenza di agenti riducenti (oppure: in presenza di DTT 50 mM); l’estrazione a caldo à ̈ stata condotta con le seguenti modalità di incubazione: 20 minuti a 100°C e 2 ore a 60°C in blocchetto termostatato in condizioni statiche. Gli estratti proteici sono stati chiarificati per centrifugazione, quantificati con metodo Bradford e conservati a -80°C.

Per confronto, gli estratti proteici da tessuto fresco sono stati sottoposti ad un protocollo di riscaldamento ad alte temperature corrispondente a quello utilizzato per l’estrazione proteica da tessuti FFPE.

Esempio 3: Analisi degli estratti proteici dell’esempio 1

Elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE)

Gli estratti proteici ottenuti da tessuti freschi e FFPE dell’esempio 1 sono stati sottoposti ad elettroforesi bidimensionale secondo Laemmli. Le proteine sono state colorate con Brilliant blue G 250 secondo il protocollo di Westermeier, l’immagine digitalizzata con un ImageScanner e processata col software ImageQuant TL.

Per dimostrare l’applicabilità del metodo estrattivo a campioni provenienti da banche di tessuti umani FFPE e per verificare la sua coerenza e riproducibilità, la procedura di estrazione tipica della presente invenzione à ̈ stata applicata ad alcuni tessuti umani rappresentativi: sezioni di tessuti FFPE di fegato normale, tiroide iperplastica, carcinoide polmonare e carcinoma polmonare sono state sottoposte allo stesso protocollo di estrazione con risultati soddisfacenti (Figura 1).

La Figura 1 mostra il profilo elettrof oretico ottenuto dalla separazione delle proteine estratte da tessuto fresco e FFPE. Il profilo proteico corrispondente all’estratto FFPE appariva ben risolto, le bande erano nette e l’abbondanza relativa era comparabile a quella del tessuto fresco. E’ stata anche ottenuta la figura 1B che riporta un diagramma che raffigura il confronto tra la densità relativa dell'immagine del profilo dell’estratto FFPE con quello fresco. Come à ̈ evidente esisteva una significativa somiglianza tra le aree dei picchi corrispondenti alle bande proteiche.

Western immunoblotting

Le proteine separate in elettroforesi sono state trasferite su membrana di nitrocellulosa, bloccate con una soluzione di latte scremato al 5 % in PBS con Tween20 allo 0.05% per un tempo da una a dodici ore ed i seguito processate per la rivelazione immunologica.

Al fine di accertare la reattività dei prodotti di estrazione, tutti gli estratti ottenuti sono stati incubati con anticorpi anti-actina come controllo. Come mostrato in figura 1 (in basso), si può osservare una forte, chiara e nitida banda corrispondente all’actina all’altezza prevista in tutti gli estratti proteici separati per elettroforesi: ciò confermava che le proteine avevano mantenuto il loro corretto peso molecolare e la loro immunoreattività à ̈ stata ripristinata con successo.

Quindi, à ̈ stata testata negli estratti da muscolo FFPE la reattività immunologica di altre proteine con peso molecolare superiore o inferiore a quello dell’actina (Tabella 1).

Tabella 1 - Proteine, anticorpi (Ab), and diluizioni usate per analisi immunologica

Proteina (Ag) MW Origine dell’ Produttore WB ELISA (kDa) Ab Diluizione Diluizione Tropomyosin 34 Rabbit Sigma-Aldrich 1:5,000 1:1,000 GAPDH 36 Rabbit Sigma-Aldrich 1:50,000 1:5,000 Actin 45 Rabbit Sigma-Aldrich 1 :50,000 1:5,000 Desmin 53 Rabbit Sigma-Aldrich 1:5000 1:1,000 Vinculin 120 Rabbit Sigma-Aldrich 1:5,000 1:1,000 Myosin HC 200 Mouse Millipore 1:50,000 1:1,000 Come mostrato in Figura 2 A, sono stati ottenuti i seguenti risultati:

La reattività per la GAPDH risultava chiara e coerente col peso molecolare atteso (circa 35 kDa); anche la tropomiosina mostrava un segnale chiaro al peso molecolare atteso, accompagnato da una strisciata di crossreattività nella parte alta del gel. La reattività della desmina era ugualmente osservata all’altezza corretta, anche se con un segnale debole. La vinculina, che ha un peso molecolare più elevato, presentava una banda di debole reattività. La miosina non dava invece alcun segnale con l’anticorpo utilizzato in questa analisi (Figura 2). Protein arrays

Gli estratti proteici da tessuto fresco e FFPE sono stati spottati su fogli di nitrocellulosa secondo il seguente schema:

I microgrammo di estratto proteico totale, 2 diluizioni seriali (1 :2 e 1:4) dell’estratto in tampone di estrazione, tampone tal quale come controllo negativo.

II foglio di nitrocellulosa à ̈ stato lasciato asciugare, bloccato con una soluzione di latte scremato al 5 % in PBS con Tween20 allo 0.05% per un tempo da una a dodici ore ed in seguito processato per la rivelazione immunologica. La reattività antigenica à ̈ stata rivelata utilizzando anticorpi secondari anti-topo o anti-coniglio coniugati con perossidasi, tramite l'aggiunta del substrato chemiluminescente della perossidasi.

Gli estratti FFPE ottenuti con il metodo della presente invenzione sono stati testati con la tecnica degli arrays. Tutti gli anticorpi testati hanno prodotto un segnale forte, riproducibile e quantitativo negli estratti FFPE, comprese vinculina e miosina che non avevano dato ottimi risultati col western blotting. La tropomiosina, invece, ha mostrato un risultato interessante; infatti, si può notare tra estratti freschi e FFPE una differenza nell’intensità del segnale: questo comportamento può essere correlato alla “scia" di crossreattività già osservata nel blotting con lo stesso anti corpo.

ELISA

Gli esperimenti di ELISA sono stati svolti secondo il seguente protocollo. Gli estratti di proteine totali da tessuti freschi e FFPE ottenuti col metodo della presente invenzione sono stati precipitati con acido tricloroacetico/acetone secondo le procedure standard, quantificati e risospesi in PBS ad una concentrazione di 100 microgrammi/ml. 100 microlitri di campione sono stati dispensati in pozzetti di una piastra maxisorp ed incubati a temperatura ambiente fino ad asciugarsi. A questo punto i pozzetti sono stati lavati e bloccati con una soluzione di PBS-T con albumina ai 5% per un’ora. Dopo lavaggi con PBS-T, in ogni pozzetto à ̈ stato aggiunto l’anticorpo primario, incubato per due ore a temperatura ambiente e lavato cinque volte con PBS-T. E’ stato poi aggiunto l'appropriato anticorpo secondario e i pozzetti sono stati incubati per un’ora a 37°C e lavati come sopra. I controlli di reattività dopo l’incubazione (acqua tal quale, PBS tal quale, anticorpo secondario tal quale) sono stati corsi in parallelo con ogni esperimento. Un substrato cromogenico à ̈ stato quindi aggiunto a tutti i pozzetti e l’assorbanza a 650 nm à ̈ stata letta ogni 15 minuti per un’ora. I saggi sono stati replicati in triplicato, e media e deviazione standard sono state calcolate e rappresentate graficamente con l’ausilio di Microsoft Excel. Anticorpi e diluizioni sono schematizzati in tabella 1.

La tecnica ELISA à ̈ stata applicata con successo a tutti gli anticorpi testati come mostrato in Figura 2B. Infatti, si può osservare come in tutti i casi si ottengano valori di assorbenza più elevati per i campioni rispetto ai controlli, costituiti da PBS e da acqua. Inoltre, i valori ottenuti per gli estratti FFPE sono in generale vicini o comparabili a quelli ottenuti con il tessuto fresco.

Idrolisi in situ di bande proteiche ottenute da Elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE1

Dopo la colorazione con Coomassie colloidale, sono state tagliate 21 bande visibili dalle corsie corrispondenti agli estratti freschi e agli estratti da FFPE; successivamente si à ̈ proceduto con la decolorazione tramite ripetuti lavaggi sequenziali con ammonio bicarbonato 50mM a pH8.0 ed acetonitrile. I campioni sono stati poi ridotti mediante incubazione per 45 minuti a 56°C in una soluzione di DTT 10mM in ammonio bicarbonato 50 mM e carbamidometilati mediante incubazione per 30 minuti al buio a temperatura ambiente in una soluzione di iodoacetamide 55mM in ammonio bicarbonato 50 mM. i campioni alchilati sono poi stati digeriti overnight con tripsina a 37°C, utilizzando 100 ng di enzima per ogni banda.

Analisi in spettrometria di massa tandem

Le analisi LC-MS/MS sono state condotte su uno spettrometro di massa ibrido Q-TOF equipaggiato con una sorgente nano lock Z-spray ed accoppiato on-line con un sistema cromatografico capillare CapLC. Dopo l'iniezione, la miscela peptidica à ̈ stata concentrata e lavata a 20 microlitri/minuto in una precolonna a fase inversa utilizzando acido formico 0.2% come eluente. Il campione à ̈ stato dunque frazionato in una colonna capillare a fase inversa Ci8ad una velocità di flusso di 250 nanolitri/minuto, utilizzando un gradiente lineare dell'eluente B nell’eluente A. Lo spettrometro di massa à ̈ stato settato in modalità MS/MS dati-dipendente in cui uno spettro di analisi completa à ̈ stato seguito da uno spettro di massa tandem. Gli ioni peptidici sono stati selezionati tra i tre picchi più intensi dell'analisi precedente. Una adatta energia di collisione à ̈ stata applicata in relazione alla massa e alla carica dello ione precursore. Il software ProteinLynx à ̈ stato utilizzato per analizzare gli spettri e generare una lista di picchi che à ̈ stata introdotta nel software Mascot per l’identificazione proteica. Le assegnazioni di classificazione genica sono state effettuate con l'ausilio del software GoMiner e le rappresentazioni grafiche con Microsoft Excel.

La separazione in SDS-PAGE à ̈ stata utilizzata come un passaggio di prefrazionamento per un approccio di idrolisi in situ che permettesse l’analisi in massa tandem degli estratti da tessuti FFPE con uno spettrometro di massa tandem. La tabella 2 riporta l’identità di tutte le proteine identificate dal tessuto muscolare scheletrico di pecora fresco (A) e FFPE (B). Per ogni proteina sono stati riportati il numero di picchi accoppiati, la copertura di sequenza, il Mowse score, la massa nominale, il valore di punto isoelettrico calcolato e il numero identificativo Swiss-Prot. Come rappresentato in figura 3, in totale, sono state identificate 85 e 66 proteine rispettivamente da tessuto fresco e FFPE. In totale il 64% (corrispondente a percentuali di identità, che sono state ricavate dalla sovrapposizione dei numeri assoluti riportati nel grafico) delle proteine identificate da tessuto fresco vengono identificate anche da tessuto FFPE, mentre l'85% delle proteine identificate in FFPE vengono identificate anche nel fresco. All’interno delle 50 proteine più rappresentate, l’80% vengono identificate in entrambi i tessuti fresco ed FFPE.

I peptidi ottenuti dalla digestione con tripsina delle proteine estratte da tessuti FFPE hanno dato origine a spettri di frammentazione di massa comparabili con quelli ottenuti da estratti freschi.

La Figura 4 riporta sei spettri rappresentativi ottenuti per la anidrasi carbonica 3, l’alfa actinina 2 e la NADH deidrogenasi, rispettivamente nei tessuti fresco e FFPE. La fissazione con la formalina sembrava non avere effetti dannosi sulla qualità degli spettri di massa ottenuti da tessuti fresco e FFPE.

Per comparare la qualità e la riproducibilità dell’estrazione, tutte le proteine identificate da tessuti freschi e FFPE sono state analizzate per la funzione molecolare e la localizzazione cellulare. La Figura 5 riporta la classificazione genica per entrambi gli estratti. Sebbene si possano notare alcune piccole differenze, la distribuzione in classi e le abbondanze relative sono in gran parte preservate; dunque, la fissazione con formalina precedente all’estrazione sembrava non introdurre un errore significativo a riguardo di particolari funzioni o localizzazioni cellulari, dimostrando la bontà del procedimento di estrazione della presente invenzione.

Tabella 2A. Proteine identificate da estratti di muscolo scheletrico frescocongelato mediante idrolisi in situ di bande di proteine separate in SDS-PAGE, ordinate secondo il numero di querìes matched (numero di picchi accoppiati). Le righe ombreggiate indicano le proteine identificate in entrambi gli estratti, sia da tessuto fresco sia da tessuto FFPE. Le righe bianche indicano le proteine identificate solo negli estratti da tessuto fresco.

Fresco-congelato

Numero Querìes Copertura Mowse Masa Valore pi

Proteina identificativo matched Sequenza Score nominale calcolato

Swiss-Prot

Myosin heavy chain (several isoforms) 281 36 5519 223764 5.57 Q9BE40

Actin, alpha skeletal muscle 171 47 2947 42366 5.23 P68138

Creatine kinase M-type 163 37 3353 43190 6.63 Q9XSC6

Fructose-bisphosphate aldolase A 78 42 1754 39774 8.31 P00883

Myoglobin 77 43 2686 17044 6.87 P02190

Myosin light chain 1, skeletal muscle 67 35 635 20994 4.97 P02602 Fresco-congelato

Numero Querìes Copertura Mowse Masa Valore pi Proteina identificativo matched Sequenza Score nominale calcolato

Swiss-Prot isoform

Pyruvate kinase muscle isozyme 52 25 997 58522 7.24 P11979 Alpha-actinin-2 47 35 1998 104284 5.31 Q3ZC55

Tropomyosin-1 alpha chaln 44 54 1531 32718 4.69 P58771

Tropomyosin beta Chain 43 39 1041 32931 4.66 P58774

Trìosephosphate isomerase 41 53 1343 26901 6.45 Q5E956

Troponin C, skeletal muscle 40 65 1116 18141 4.06 P02586

Glycogen phosphorylase, muscle forni 40 26 725 97702 6.65 018751

Myosin regulatory lìght Chain 2,

39 60 1310 19057 4.82 P97457 skeletal mUscle Isoform

Troponin I, fast skeletal muscle 37 31 895 21496 8.87 P48788 Glyceraldehyde-3-phosphate

34 31 1386 36Ã’73 8.50 P04406 dehydrogenase

Serum albumìn precursor 31 23 624 71139 5.80 P14639

Four and a half LIM domains protein 1 30 26 615 33821 8.76 Q9WUH4

Alpha-actinin-3 26 23 975 103605 5.31 088990

ADP/ATP translocase 1 25 27 320 33174 9.84 P02722

Phosphoglucomutase-1 25 16 654 61805 6.58 P00949

Carbonio anhydrase 3 24 32 682 29637 7.17 Q3SZX4

Beta-enolase 23 19 667 47409 7.6 Q3ZC09

ATP synthase sub. alpha, mit. prec. 19 15 614 59828 9.16 P25705

ATP synthase sub. beta, mit. prec. 17 24 784 56249 5.15 P00829

L-lactate dehydrogenase A chain 16 23 445 36947 8.16 P19858

Heat shock cognate 71 kDa 16 22 577 71424 5.49 P19120 Fresco-congelato

Numero Querìes Copertura Mowse Masa Valore pi Proteina identificativo matched Sequenza Score nominale calcolato

Swiss-Prot

Desmin 15 28 400 53556 5.21 062654

Heat shock 70 kDa protein 1A/1B 15 19 604 70495 5.54 Q27975

Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum

15 322 110532 2.17 Q0VCY0 calcium ATPase 1

Creatine kinase, sarcomeric mitoch.

14 15 375 47899 8,64 Q6P8J7 preo.

Glutathione S-transferase Mu 1 13 21 457 25789 6.90 Q9N0V4

Aconitate hydratase, mitoch. prec 13 12 186 86151 8.08 Q99KI0

6-phosphofructokinase 13 10 353 86083 8.48 Q867C9

Alpha crystallin B Chain 12 28 202 20024 6.76 P02510

Troponin T, fast skeletal muscle 11 14 100 31805 5.71 P45378

Fructose-bisphosphate aldolase C 11 9 933 39830 6.41 P09972

Adenylate kinase isoenzyme 1 10 26 270 21764 8.40 P00570

Glycerol-3-phosphate dehydrogenase

21 123 38194 6.42 Q5EA88 [NAD+], cytoplasmlc

Phosphoglycerate mutase 2 12 194 28919 8.99 P15259

Glucose-6-phosphate isomerase 8 239 63059 7.33 Q3ZBD7

Troponin T, slow skeletal muscle 7 199 31265 5.71 Q8MKH6

Troponin I, slow skeletal muscle 24 181 21856 9,61 Q9WUZ5

Malate dehydrogenase, mitoch. prec. 21 118 36102 8.82 Q32LG3

Voltage-dependent anion-selective

17 292 30836 8.62 P45879 channel protein 1

Phosphatidylethanolamine-BP 1 21 174 21087 6.96 P13696

PDZ and LIM domain protein 7 142 47486 8.69 Q3SX40 Fresco-congelato

Numero Queries Copertura Mowse Ma sa Valore pi Proteina identificativo matched Sequenza Score nominale calcolato

Swiss-Prot

Troponin C, slow skel. and card,

24 294 18519 4.05 P63315 muscles

Glutathione S-transferase A1 5 21 70 25549 8.66 Q28035

14-3-3 protein gamma 5 14 68 28456 4.80 P61981

Phosphoglycerate kinase 1 5 8 146 44985 8.30 P00558

Voltage-dependent anion-selective

7 197 31062 8.95 Q9MZ13 channel protein 3

Myotilin 4 125 55738 9.02 Q9JIF9

Heat-shock protein beta-6 28 142 17515 5.95 Q148F8

Histone H2A type 1-B 21 64 14127 11.05 P04908

NADH dehydrogenàse iron-sulfur

4 12 201 30473 6.54 P17694 protein 3, mitoch. prec.

Elongation factor 1 -alpha 2 4 7 93 50780 9.11 Q32PH8

Very-long-chain specific acyl-CoA

4 5 78 70745 8.92 P48818 dehydrogenàse, mitoch. prec.

AMP deaminase 1 4 4 134 87118 6.43 P23109

AP-1 complex subunit mu-1 4 1 31 48727 6.82 Q2KJ81

Calsequestrin-1 3 25 97 6610 4,61 P31236

14-3-3 protein epsilon 3 7 70 29326 4.63 P62261

Aldehyde dehydrogenase,

104 57129 7.55 P20000 mitochondrial precursor

Malate dehydrogenàse, cytoplasmic 3 6 94 36700 6.16 Q3T145

Aspartate aminotransferase,

4 98 44938 9.04 P08907 mitochondrial

Myosin-binding protein C, slow-type 3 3 111 129240 5.78 Q00872 Fresco-congelato

Numero Querìes Copertura Mowse Ma sa Valore pi Proteina identificativo matched Sequenza Score nominale calcolato

Swiss-Prot

Carbonio anhydrase 2 32 682 29637 7.71 P00921

Protein DJ-1 12 94 20194 6.84 Q5E946

Alpha-S1-casein precursor 10 55 24570 4.98 P02662

Heat-shock protein beta-1 8 127 22436 5.98 Q3T149

ATP synthase gamma Chain,

76 33108 9.34 Q4LDE7 mitochondrial precursor

Myozenin-1 75 31654 9.17 Q8SQ24

Kappa-casein precursor 64 21370 6.30 P02668

â–¡ihydrolipoyl dehydrogenase,

90 54689 7.95 P49819 mitochondrial precursor

PDZ and LIM domain protein 5 52 64544 8.61 Q8CI51

Four and a half LIM domains protein 3 62 33792 5.75 Q9R059

Heat shock protein HSP 90-alpha 70 85077 4.93 Q76LV2

LIM domain-binding protein 3 53 78226 8.47 075112

Cytochrome d heme protein,

45 35616 9.14 P00125 mitochondrial precursor

Cytochrome c oxidase subunit 2 48 25836 4.74 P00405

Transmembrane protein 38A 47 33694 8.56 Q9H6F2

Succinate dehydrogenase iron-sulfur

32 32296 8.91 Q3T189 protein, mitoch. prec.

Myosin-binding protein H 85 52531 6.30 Q13203

Myc box-dependent-interact. prot. 1 39 64887 4.97 000499

SET and MYND domain-containing

46 57549 6.66 Q8NB12 protein 1

Total: 85 proteine Identificate In estratti da tessuto di muscolo scheletrico fresco-congelato

Table 2B. Proteine identificate da estratti di muscolo scheletrico FFPE mediante idrolisi in situ di bande di proteine separate in SDS-PAGE, ordinate secondo il numero di queries matched (numero di picchi accoppiati). Le righe ombreggiate indicano le proteine identificate in entrambi gli estratti sia da tessuto fresco sia da tessuto FFPE. Le righe bianche indicano le proteine identificate solo nell’estratto da tessuti FFPE.

FFPE

Proteina Queries Copertura Mowse Massa Valore pi Numero matched Sequenza Score nominale calcolato identificativo Swiss-Prot.

Actin, alpha skeletal muscle 456 49 3075 42381 5.23 P68138

Creatine klnase M-type 153 26 856 43190 6.63 Q9XSC6

Myosin light cha!n 1, skeletal muscle 124 1547 20993 4.97 P02602 isoform

Myoglobin 121 1642 17044 6.87 P02190

Fructose-bisphosphate aldolase A 92 1343 39774 8.31 PQ0883

Triosephosphate isomerase 69 1676 26901 6.45 Q5E956

Heat-shock protein beta-1 60 1181 22436 5.98 Q3T149

Beta-enolase 54 1676 47409 7.6 Q3ZC09

Carbonic anhydrase 3 50 155 29637 7.71 Q3SZX4

Tropomyosin-1 alpha chain 48 441 32746 4.69 P09493

Tropomyosin beta chain 41 389 32945 4.66 P07951

Myosin regulatory light chain 2, 40 1235 19057 4.82 P97457 skeletal muscle Isoform

Serum albumin precursor 38 18 319 71139 5.80 P14639

Glyceraldehyde-3-phosphate 29 11 379 36073 8.50 P04406 dehydrogenase

FFPE

Proteina Querìes Copertura Mowse Massa Valore pi Numero matched Sequenza Score nominale calcolato identificativo Swiss-Prot.

Pymvate kinase muscle isozyme 22 21 378 58522 7.24 P11979

Myosin heavy Chain (several isoforms) 22 5 485 223946 5.59 Q9BE40

Adenylate kinase isoenzyme 1 19 29 210 21764 8,40 P00570

Alpha-actinìn-2 19 16 953 104284 6.31 Q3ZC55

ATP synthase sub. alpha, mit. prec. 16 20 708 59797 9.21 P25705

Fructose-bisphosphate aldolase C 14 39 1343 39774 8.31 P09972

Phosphogìycerate mutase 2 13 16 205 28919 8.99 P 15259

Hemoglobin subunit alpha-1/2 12 25 153 15212 8.72 P68240

Alpha crystallin B chain 11 32 156 20024 6.76 P02510

Glycogen phosphorylase, muscle forni 11 14 297 97702 6.65 018751

Alpha-actinin-3 11 11 449 103605 5.31 088990

Phosphatìdylethanolamine-binding 10 25 147 21087 6.96 P13696 protein 1

ATP synthase sub. beta, mit. prec. 10 14 571 56249 5.15 P00829

Hemoglobin subunit beta-C 9 16 130 15680 11.57 P68056

Glutathione S-transferase Mu 1 9 16 261 25789 6.90 Q9N0V4

Creatine kinase, sarcomeric 9 5 160 47714 8.45 Q3ZBP1 mitochondrial precursor

Troponin I, slowskeletal muscle 8 20 206 21850 9.61 Q9WUZ5

Heat shock 70 kDa protein 1 A/1 B 8 12 311 70500 5,68 Q27975

Troponin I, fast skeletal muscle 7 26 129 21496 8.87 P48788

Phosphoglucomutase-1 6 9 127 71764 6.30 P00949

Troponin C, skeletal muscle 5 35 206 18167 4.06 P02586 FFPE

Proteina Querìes Copertura Mowse Massa Valore pi Numero matched Sequenza Score nominale calcolato identificativo Swiss-Prot.

Calsequestrin-1 5 25 176 6610 4.71 P31236

Glutathione S-transferase A1 5 12 61 25549 8.66 Q28035

Malate dehydrogenase, mitoch. prec. 5 7 41 36102 8.82 Q32LG3

Heat shock cognate 71 kDa protein 5 5 245 71423 5.49 P19120

L-lactate dehydrogenase A chain 5 3 151 36947 8.16 P19858

14-3-3 protein gamma 4 14 67 28456 4.80 P61981

Malate dehydrogenase, cytoplasmic 4 7 116 36700 6,16 Q3T145

PDZ and LIM domain protein 7 4 5 67 47486 8.69 Q3SX40

Peroxiredoxin-6 3 13 115 25108 6.00 077834

Troponin T, fast skeletal muscle 3 10 81 31805 5.71 P45378

Phosphoglycerate kinase 1 3 6 63 44908 8.48 P00558

Decorin precursor 3 5 48 40196 8.72 P21793

T roponin T, slow skeletal muscle 3 4 78 31265 5.71 Q8MKH6

Heat-shock protein beta-6 2 14 65 17515 5.95 Q148F8

Telethonin 2 13 93 19204 5.50 Q6T8D8

Histone H2B type 1-A 2 12 32 14159 10.31 Q96A08

Thioredoxin-dependent peroxide 2 10 74 28406 7.15 P35705 reductase, mitoch. prec.

NADH dehydrogenase flavoprotein 2, 2 9 91 27575 8.21 P25708 mitoch. prec.

NADH dehydrogenase iron-sulfur 2 115 30437 6.54 P17694 protein 3, mitoch. prec.

Histone H2A type 1-A 2 6 42 14225 10.86 P04908

Kappa-casein precursor 2 5 69 21370 6.30 P02668 FFPE

Proteina Querìes Copertura Mowse Massa Valore pi Numero matched Sequenza Score nominale calcolato identificativo Swiss-Prot.

Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 45 38194 6.42 Q5EA88 [NAD+], cytoplasmic

Sarcalumenin precursor 89 101069 4.34 Q86TD4

Superoxide dismutase [Un], 1 52 22348 6.86 Q8HXP0 mitochondrial

Carbonio anhydrase 2 1 35 29193 6.41 P00921

Cytochrome c oxidase subunit 2 1 53 25836 4.74 P00405

Voltage-dependent anion-selective 1 70 30836 8.62 P45879 channel protein 1

Collagen alpha-2(l) Chain precursor 1 40 53495 7.23 Q28668

Prolargin precursor 1 43 44054 9.59 Q9GKN8

Glucose-6-phosphate isomerase 1 36 63335 8.43 Q3ZBD7

Myc box-depandent-interacting prot. 1 1 51 64887 4.97 000499

Totale: 66 proteine Identificate in estratti da tessuto di muscolo scheletrico FFPE

Come à ̈ evidente dalla Tabella 2B sono state identificate 66 proteine in estratti di muscolo FFPE a fronte delle 85 nei campioni di fresco, dimostrando l'efficacia del procedimento dell’invenzione nel fornire campioni di estratti proteici che possono essere analizzati con le tecniche più comuni e avanzate di proteomica.

Esempio comparativo

Il procedimento secondo l’invenzione à ̈ stata comparato con un procedimento eseguito con il kit commerciale denominato QProteome FFPE Tissue Kit. Il kit si basa sul procedimento della domanda di brevetto N. WO 2006/122898 A1 .

Il procedimento dell’invenzione produceva sempre risultati migliori in termini di quantità e qualità delle proteine estratte dopo analisi mediante SDS-PAGE.

Nella figura 6 à ̈ illustrato il risultato ottenuto in seguito a: 1) estrazione da tessuto muscolare scheletrico fresco; 2) estrazione da tessuto muscolare scheletrico ovino FFPE con la metodica qui descritta; 3) estrazione da tessuto muscolare scheletrico ovino FFPE con la metodica descritta nel brevetto N. WO 2006/122898 A1. Il risultato ottenuto con il procedimento dell’invenzione à ̈ superiore sia in termini di quantità di proteine estratte sia in termini di numero di bande proteiche osservabili nel campione. Nell’immagine riportata, il carico del campione nella corsia 3 (procedimento della tecnica anteriore) à ̈ stato incrementato allo scopo di rendere possibile la comparazione dei segnali proteici nei due estratti da FFPE. La resa, la qualità e la riproducibilità dell’estrazione sono state inoltre valutate mediante western blotting con anticorpi anti-actina. Sono stati allestiti esperimenti in replicato, in seguito ai quali l’efficienza di estrazione della proteina si à ̈ rivelata sempre superiore con il procedimento dell’invenzione rispetto al metodo descritto nella domanda di brevetto N. WO 2006/122898 A1. Inoltre, in alcuni replicati di estrazione la metodica anteriore non ha portato alla rilevazione di alcun segnale corrispondente all’actina; viceversa, il procedimento dell’invenzione ha riproducibilmente generato un segnale positivo in tutti i replicati di estrazione.

Nella figura 7 à ̈ illustrato un risultato rappresentativo di quanto ottenuto in seguito ad elettroforesi e western immunoblotting con anticorpi anti-actina. 1) segnale dell'actina ottenuto in seguito ad estrazione delle proteine da 5 fettine da 10 pm di muscolo scheletrico FFPE con il presente procedimento: 2) segnale dell’actina ottenuto in seguito ad estrazione delle proteine da 5 fettine da 10 pm di muscolo scheletrico FFPE con il metodo della domanda di brevetto N. WO 2006/122898 A1 ; 3) segnale dell’actina ottenuto in seguito ad estrazione delle proteine da tessuto muscolare scheletrico fresco. Nel caso 1 e 2 sono stati caricati 5 microlitri di estratto per corsia; nel caso 3 à ̈ stato caricato 1 microlitro di estratto per corsia.

Claims (23)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l’estrazione di proteine da campioni di tessuto FFPE comprendente le seguenti fasi: ii) aggiungere al campione FFPE un tampone di estrazione comprendente: A) una soluzione tampone a pH maggiore o uguale a 8; e B) un agente riducente in concentrazione maggiore o uguale a 100mM; iii) incubare il campione FFPE nel tampone di estrazione a una temperatura nell'intervallo da 55°C a 100°C, in cui detto agente riducente à ̈ un composto scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA).
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detto agente riducente à ̈ il composto ditiotreitolo (DTT).
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto agente riducente à ̈ presente nel tampone di estrazione in quantità nell'intervallo da 100 a 300 mM, preferibilmente in concentrazione uguale a circa 200mM.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta soluzione tampone à ̈ una soluzione tampone avente un pH nell’intervallo 8 <pH< 9, più preferibilmente il tampone à ̈ a pH 8.8.
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta soluzione tampone à ̈ scelta dal gruppo consistente in soluzione tampone a base di trisidrossimetilaminometano cloridrato (TrisHCI), soluzione tampone a base di Tricina e soluzione tampone a base di glicina-glicina (Gly-Gly).
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detta soluzione tampone à ̈ a base di Tris HCI 20mM.
7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto tampone di estrazione comprende anche un detergente.
8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui detto detergente à ̈ in concentrazione compresa fra 0.5 e 4 % in peso, preferibilmente in concentrazione 2% in peso.
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui detto detergente à ̈ scelto dal gruppo consistente in sodiododecilsolfato (SDS), sodio colato, sodio deossicolato, polietilen-glicol p-(1,1,3-tetrametilbutil)-etere (Triton X100®), Poliossietilene (20) sorbitan monolaurato (Tween20@), octil-β-glucopiranoside, e tert-Octilfenossi poli(ossietilene)etano (Nonidet P40®)
10. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui detto detergente à ̈ SDS.
11. 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, in cui il tampone di estrazione comprende un ulteriore detergente di tipo amidosolfobetainico.
12. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, in cui detto ulteriore detergente à ̈ scelto dal gruppo consistente in ASB-14, ASB-16, ASB-C7BzO, 3-[(3-Colamidopropil)dimetilammonio]-1 -propanesolfonato (CHAPS), 3-[(3-Colamidopropil)dimetilammonio]-2-idrossi-1-propanesolfonato (CHAPSO).
13. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 11 o 12, in cui detto ulteriore detergente à ̈ aggiunto al tampone di estrazione in forma di soluzione acquosa in concentrazione nell'intervallo da 5 a 15% in peso, più preferibilmente 10%.
14. 14. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, in cui la fase iii) avviene in due sottofasi: iii- prima parte) incubare il campione ad un temperatura nell'intervallo da 90 a 100°C per un tempo nell’intervallo 15-25min; iii- seconda parte) incubare il campione sottoposto alla fase iii-prima parte) ad un temperatura nell’intervallo da 55 a 85°C per un tempo nell’intervallo 1 .5-2.5 ore.
15. 15. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14, in cui successivamente alla fase di incubazione iii) il procedimento prevede la fase iv) di recupero della porzione liquida del prodotto di incubazione della fase iii) contenente le proteine estratte.
16. 16. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15, in cui detto procedimento, prima della fase ii) di aggiunta del tampone di estrazione prevede una fase i) di deparaffinazione del campione FFPE.
17. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, in cui la fase i) di deparaffinazione à ̈ effettuata con un solvente organico scelto dal gruppo consistente in xilene, toluene, ottano, ottano/metanolo e loro miscele.
18. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui dopo la fase di deparaffinazione i) il procedimento dell’invenzione comprende una fase di reidratazione del campione FFPE con un alcool a gradazioni decrescenti prima di sottoporlo alla fase aggiunta del tampone di estrazione ii).
19. 19. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18, in cui dopo la fase di incubazione iii) - prima parte, il procedimento di estrazione comprende una fase di aggiunta di un ulteriore detergente di tipo amidosolfobetainico.
20. 20. Kit per l’estrazione di proteine da campioni FFPE, come prodotto combinato per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nel procedimento di estrazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 19, comprendente a) una soluzione tampone a pH maggiore o uguale 8; e b) un agente riducente in concentrazione maggiore o uguale 100mM, in cui detto agente riducente à ̈ un composto scelto dal gruppo consistente in ditiotreitolo (DTT), ditioeritrolo (DTE), tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), mercaptoetanolo (MEA).
21. 21. Kit secondo la rivendicazione 20, comprendente: - un recipiente C contenente una miscela comprendente la soluzione tampone e il detergente; - una pluralità di contenitori Dn contenenti ciascuno una adatta quantità di agente riducente da sospendere in una adatta quantità di detta miscela al momento dell’uso per completare la formazione di una adatta quantità di tampone di estrazione dell’invenzione; - un foglietto per le istruzioni all’uso.
22. 22. Kit secondo la rivendicazione 21, in cui un ulteriore detergente di natura amidosolfobetainica à ̈ compreso nel recipiente C.
23. 23. Kit secondo la rivendicazione 21, in cui detto kit comprende un ulteriore recipiente contenente una soluzione acquosa di un ulteriore detergente a struttura amidosolfobetainica.