ITMI20081000A1

ITMI20081000A1 - Idrogelo idoneo a contenere e veicolare cellule neuronali

Info

Publication number: ITMI20081000A1
Authority: IT
Inventors: Francesco Daniele; Carmen Giordano; Maurizio Masi; Giuseppe Perale; Filippo Rossi
Original assignee: Milano Politecnico
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2009-11-30

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“IDROGELO IDONEO A CONTENERE E VEICOLARE CELLULE NEURONALI”

La presente invenzione ha per oggetto un idrogelo a doppia matrice polimerica interpenetrante formata da un polimero di acido acrilico o carbomerico, un polimero naturale, un agente di reticolazione, detto idrogelo contenendo cellule neuronali appoggiate sulla sua superficie esterna o alloggiate all’interno del reticolo tridimensionale formato da detta matrice polimerica.

CONTESTO DELL’INVENZIONE

Nella cura di molte patologie che portano alla degenerazioni di specifici organi spesso l’unica alternativa terapeutica possibile è rappresentata dal trapianto d’organi. Esso è però associato a un grado di rischio elevato per il paziente, dato che sono possibili complicazioni quali la trasmissione di patologie da donatore a ricevente o il rigetto dell’organo stesso, unito alla cronica scarsità di organi disponibili. Inoltre, questo tipo di approccio non può essere applicato a tutti i distretti corporei soggetti a patologie degenerative. In particolare, a tutt’oggi, non esiste la possibilità di applicare terapie di trapianto in tutte le patologie degenerative del sistema nervoso centrale.

Poiché la maggior parte dei neuroni del sistema nervoso centrale non proliferano né si rinnovano, molto interesse è stato rivolto alle terapie basate sulla sostituzione o sulla rigenerazione del tessuto danneggiato utilizzando cellule isolate e reimpiantate. Nella sua storia recente, l’ingegneria tissutale neurale si è maggiormente concentrata sulla malattia di Parkinson [vedi ad esempio: Tabar et al., Nature Medicine (2008), doi:10,1038/nm1732] e sulle lesioni del midollo spinale [vedi ad esempio: Perale et al. Journal of Applied Biomaterials and Biomechanics (2008) vol. 6 pp.1-8; Huang et al. Journal of Neurosurgery (2008) vol. 108 pp. 343-347; Nomura et al Journal of Neurotrauma (2006) vol. 23 pp. 496-507; Iwata et al. Tissue Engineering (2006) vol. 12 pp. 101-110], essendo ben conosciuti i rapporti causa-effetto implicati in tali malattie e non essendo ancora disponibili terapie efficaci per la cura delle stesse. In questo ambito i primi esperimenti sono stati condotti trapiantando o iniettando direttamente sospensioni acquose di singole cellule o di popolazioni cellulari. Sfortunatamente, tale procedura permette il raggiungimento di una ricostruzione solo parziale e spesso nemmeno di quella. Le ragioni di questo insuccesso sono principalmente da ricercarsi nella mancanza di un supporto fisico per le cellule così trapiantate, o iniettate, nel lasso di tempo che intercorre tra l’impianto e l’integrazione con i tessuti adiacenti. Inoltre, in assenza di un adeguato supporto permeabile ai nutrienti esse non riescono ad approvvigionarsi dei nutrienti stessi necessari alla loro sopravvivenza.

Le precedenti ragioni hanno portato la ricerca ad orientarsi verso lo sviluppo di matrici di supporto che permettessero la veicolazione delle cellule permettendone altresì la sopravvivenza e l’integrazione con il tessuto bersaglio, al fine ultimo di dar origine ad un nuovo tessuto funzionale ed integrato istologicamente con le strutture adiacenti.

Alla luce di quanto precedentemente detto, oltre alle cellule, il secondo elemento essenziale nell’ingegneria tissutale è pertanto rappresentato dai materiali utilizzati, tra questi gli idrogeli svolgono un ruolo di primo piano essendo particolarmente utili come sistemi per il sostegno e la veicolazione di cellule e di popolazioni cellulari. Tuttavia, pur essendo la letteratura sull’argomento piuttosto vasta, gli idrogeli specificamente idonei ad ospitare cellule del sistema nervoso centrale ne rappresentano solo una minoranza. Allo scopo si veda quanto riportato nella seguente letteratura: Huang et al. Journal of Neurosurgery (2008) vol. 108 pp. 343-347; Crompton et al. Biomaterials (2007) vol. 28 pp. 441-449; Frampton et al. Journal of Neural Engineering (2007) vol. 4 pp. 399-409; Hind et al. Journal of Biomaterial Science Polymer Edition (2007) vol. 18 pp. 1223–1244; Mahoney et al. Biomaterials (2006) vol. 27 pp. 2265-2274; Prang et al. Biomaterials (2006) vol. 27 pp. 3560-3569; Luo et al. Nature Materials (2004) vol. 3 249-253; Vacanti et al. Transplantation Proceedings (2001) vol. 33 pp. 592-598; Woerly, EP929323). Ciò è principalmente dovuto alle difficoltà nella costruzione di idrogeli che permettano alle cellule del sistema nervoso centrale di sopravvivere e crescere al loro interno fornendo loro sia sostegno che un adeguato spazio vitale.

Gli idrogeli sono strutture polimeriche tridimensionali in grado di rigonfiare trattenendo acqua, o altri liquidi, al loro interno. Le catene polimeriche sono legate tra loro tramite legami intermolecolari che possono essere di diversa natura. Gli idrogeli possono essere prodotti in numerosi modi, uno dei quali consiste nella reazione di uno o più monomeri oppure grazie all’associazione di ponti a idrogeno o forti interazioni di van der Waals tra catene polimeriche. A seconda dei componenti utilizzati, gli idrogeli possono risultare biodegradabili oppure biostabili, biocompatibili o citotossici. Molti idrogeli biocompatibili, biodegradabili e non, stanno ottenendo notevole attenzione da parte del mondo scientifico-tecnico grazie alle loro caratteristiche intrinseche che li rendono particolarmente adatti ed ideali per molte applicazioni in ambito biomedico.

Da un punto di vista strettamente chimico, gli idrogeli possono essere classificati in diversi modi, in base al loro metodo di preparazione, alla carica ionica distribuita o alla loro struttura fisica. Per quanto riguarda il metodo di preparazione, gli idrogeli possono essere classificati come omopolimerici, copolimerici, multipolimerici o polimerici interpenetranti. I primi sono costituiti da reti polimeriche legate tra di loro da un’unità monomerica che deve essere idrofila. I secondi sono costituiti da due comonomeri, almeno uno dei quali deve essere idrofilo. I multipolimerici sono ottenuti partendo da tre o più comonomeri intereagenti tra loro, di cui almeno uno idrofilo. Infine, i polimerici interpenetranti sono ottenuti attraverso il rigonfiamento di una prima rete attorno alla quale successivamente si forma una struttura tridimensionale.

Le proprietà chimiche e fisiche degli idrogeli li rendono particolarmente adatti per l’utilizzo in campo biomedico e farmaceutico. In particolare, la loro biocompatibilità costituisce il primo requisito fondamentale per tali applicazioni. La loro idrofilia può garantire ottime caratteristiche in termini di permeabilità ai gas e ad altre sostanze, permettendo anche il rilascio controllato di principi attivi e sostenendo la presenza di popolazioni cellulari al loro interno o sulla loro superficie. Una delle prime applicazioni, ancor oggi maggiormente diffusa, è legata alla fabbricazione di lenti a contatto dove gli idrogeli sono utilizzati grazie alla loro buona stabilità meccanica, il favorevole indice di rifrazione e l’elevata permeabilità all’ossigeno. Altre applicazioni includono l’uso degli idrogeli quali materiali artificiali bioadesivi, membrane artificiali, cartilagini articolari, pelle artificiale, materiali per la ricostruzione maxillo-facciale e delle corde vocali.

Va sottolineato che gli idrogeli hanno un vasto impiego anche come supporto per la crescita cellulare in vitro in applicazioni di screening farmacologico, di saggio per farmaco-sviluppo, di efficacia farmacologica o di tossicità. Tali supporti sono usualmente configurati come film sottili sopra i quali vengono depositati e fatti crescere i neuroni. Si tratta pertanto di strutture bidimensionali sulle quali i neuroni sono depositati su una delle superfici e non posti al loro interno. Tra tutti gli idrogeli pensati e sviluppati per questi impieghi, i più utilizzati sono il Matrigel™ (Beckton Dickinson, USA) ed il gel di fibrina.

Va ricordato come i recenti progressi nell’elettronica abbiano messo a disposizione dei neuroscienziati varie soluzioni tecnologiche che permettono la comunicazione tra dispositivi elettronici specifici e cellule neuronali viventi. Sono infatti disponibili sul mercato dispositivi di misura appositamente realizzati per monitorare l’attività cellulare di neuroni singoli o popolazioni durante differenti tipologie di test che vanno dal monitoraggio della conducibilità dei segnali, a test di efficacia farmacologica. In tali sistemi elettronici spesso il contatto tra neuroni e substrato elettronico è mediato da un sottile film (alcuni micron) di idrogelo polimerico appositamente disegnato e realizzato al fine di permettere il passaggio dei segnali elettrici e chimici.

STATO DELLA TECNICA

Una rassegna della vasta letteratura tecnico-scientifca disponibile per quanto concerne i materiali, ivi compresi gli idrogeli, e la loro utilizzazione in ambito rigenerativo nervoso è stata recentemente svolta da Little et al. Chemical Reviews (2008) vol. 108 pp. 1787–1796. In questo ampio panorama, gli idrogeli sono di per sé noti e spesso sono descritti quali mezzi per il rilascio controllato di farmaci (drug-delivery) e come supporti per l’ingegneria dei tessuti.

La preparazione di vari gel anionici per il rilascio controllato di farmaci è stata descritta da Hsu et al. Pharmaceutical Research (1996) vol. 13 pp.

1865-1870. In particolare è descritta la preparazione di un gel idrofilo a due componenti costituito da una formulazione di agarosio e carbomer. Questo particolare gel viene preparato miscelando una dispersione di carbomer acquoso con una dispersione di agarosio preriscaldato ad una determinata temperatura. In particolare, non sono menzionati né l’aggiunta di composti reticolanti, in grado di modificare le proprietà meccaniche del polimero alla base dell’idrogelo, né l’aggiunta di sostanze tamponanti in grado di neutralizzare l’acidità che si libera durante il processo di formazione del gel, né l’aggiunta di composti elasticizzanti. Inoltre, non si fa alcuna menzione alla possibilità di applicare tale gel all’ingegneria dei tessuti viventi, né prevede altre applicazioni specifiche che non siano il rilascio di farmaci. Pertanto nella formulazione descritta non sono contenuti riferimenti all’aggiunta di mezzi di coltura e/o fattori o principi attivi adatti a fornire alle cellule il necessario nutrimento.

Nel brevetto EP929323 Woerly descrive un idrogel polimerico biostabile (e quindi non biodegradabile) per uso terapeutico, costituito da un copolimero di (a) una acrilammide o metacrilammide N-sostituita, (b) un agente di reticolazione e (c) materiale copolimerizzabile, utilizzabile per ricostruire tessuto cerebrale o spinale danneggiato.

Nella domanda di brevetto US2007010831 Ortega e Garcia descrivono un impianto per riparare nervi danneggiati, comprendente un condotto esterno perforato biocompatibile e una matrice a idrogel interna costituita da agar, agarosio, gomma xantano, carbopol, sali di alginato, polivinilpirrolidone, glicole polietilenico, chitosano, polimeri di cellulosa, acrilici, poliglicolici e altri polimeri naturali o sintetici.

Nel brevetto EP1206254 Nelson e Romero descrivono una matrice tridimensionale basata su fibre riassorbibili caricate con specifici farmaci, nella quale vengono fatte crescere cellule in vitro per poi essere impiantata in vivo.

L’analisi precedente mostra che non sono descritti idrogeli principalmente a base di carbomer e agarosio, le cui proprietà meccaniche (e conseguentemente la loro biodegradabilità) siano modulate dall’aggiunta di composti reticolanti quali glicol propilenico, glicerolo e trietil ammina, contenenti nutrienti cellulari e impiegati quali mezzi di sostegno e di veicolazione di cellule neuronali.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Scopo della presente invenzione è fornire una matrice polimerica a base di composti biodegradabili che possa essere utilizzata nel suo stato rigonfiato come dispositivo per l’alloggiamento di cellule neuronali per la rigenerazione di tessuti molli all’interno del sistema nervoso centrale.

Tale scopo è raggiunto attraverso un idrogelo a doppia matrice polimerica interpenetrante formata da un polimero di acido acrilico o da un carbomero, un polimero naturale scelto tra agarosio, chitosano, destrano o un glicosaminoglicano, un agente di reticolazione scelto tra glicerolo, glicole propilenico, etilenico, trietilammina o una loro miscela ed eventualmente un agente elasticizzante scelto tra acido alginico e suoi sali, un qualsiasi tipo di collagene, fibrina, fibrinogeno e acido ialuronico o un suo derivato, detto idrogelo contenendo cellule neuronali appoggiate sulla sua superficie esterna o alloggiate all’interno della matrice polimerica tridimensionale.

Un altro aspetto della presente invenzione riguarda l’uso di detto idrogelo per la preparazione di un impianto cellulare per la rigenerazione o la ricostituzione o la sostituzione di tessuto neuronale danneggiato o rimosso o non funzionante, anche solo parzialmente. È infatti possibile attraverso la presente invenzione migliorare e curare il tessuto nella zona di detto impianto attraverso l’approvvigionamento di cellule ed il controllo della loro proliferazione, infiltrazione ed integrazione con i tessuti circostanti la zona di impianto stessa.

Un altro scopo della presente invenzione è fornire un mezzo per la rigenerazione tessutale del sistema nervoso centrale attraverso l’uso di una matrice polimerica biodegradabile particolarmente vantaggiosa sia dal punto di vista clinico che economico per i pazienti neurologici quali gli spinalizzati, oppure coloro che hanno subito ictus o interventi a causa di tumori cerebrali o spinali, o ancora coloro che soffrono di patologie neurodegenerative come ad esempio Alzheimer o Parkinson.

Un altro scopo della presente invenzione è fornire un mezzo per la rigenerazione tessutale del sistema nervoso centrale che abbia delle caratteristiche tali per cui possa essere facilmente posizionato nella zona bersaglio attraverso tecniche chirurgiche tradizionali o mini-invasive e che possa essere facilmente adattato alle dimensioni del sito di impianto.

Un altro aspetto della presente invenzione è un metodo per preparare detto idrogelo, che comprende la preparazione di una dispersione acquosa contenente (% in peso) da 0,01% a 5% di polimero acrilico o di un carbomero, da 0,01% a 5% di polimero naturale, da 0,1% a 40% di agente reticolante ed eventualmente da 0,01% a 5% di agente elasticizzante, a una temperatura di 20-90°C e per un tempo variabile da 10 minuti secondi a 240 minuti primi, in funzione del grado di reticolazione che si vuole ottenere e dei polimeri utilizzati, e l’eventuale successivo raffreddamento a una temperatura compresa tra 37°C e temperatura ambiente. A detta miscela di polimeri può essere aggiunta una base in grado di neutralizzare l’acido che si sviluppa durante la reazione, preferibilmente scelta tra trietilammina e ammoniaca. I rapporti ponderali tra i diversi componenti possono essere variati negli intervalli sopra definiti, potendo in questo modo modulare le dimensioni delle maglie del reticolo polimerico in funzione del tipo cellulare. Preferibilmente i polimeri utilizzati soddisfano i criteri di purezza e sterilità richiesti per applicazioni mediche, biologiche, biomediche e farmaceutiche.

È un altro scopo della presente invenzione fornire una nuova miscela polimerica con le opportune caratteristiche chimico-fisiche affinché al suo interno possano essere mescolate delle cellule viventi garantendo alle stesse la possibilità di sopravvivere e proliferare.

Un altro aspetto dell’invenzione è pertanto un metodo per realizzare un dispositivo bio-ibrido bidimensionale o tridimensionale che possa essere utilizzato per l’alloggiamento e la veicolazione di cellule neuronali per la rigenerazione di tessuti molli all’interno del sistema nervoso centrale. Un’ulteriore caratteristica fondamentale è che tale dispositivo si degradi con una cinetica predeterminata e compatibile con l’integrazione tra le cellule veicolate e il tessuto bersaglio.

Un altro aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per la preparazione di un dispositivo a base di detto idrogelo contenente cellule neuronali. Dette cellule neuronali possono essere prelevate da tessuto fresco o mantenute in coltura staccate dal supporto (ad esempio capsula Petri o altro), eventualmente lavate e successivamente aggiunte alla miscela di polimeri, agente reticolante ed eventuale agente elasticizzante durante il processo di gelificazione, preferibilmente nella fase di raffreddamento. Per mantenere il maggior numero di cellule intrappolate nella matrice dell’idrogelo in uno stato vitale e in condizioni di crescita è preferibile aggiungere un idoneo terreno di coltura alla dispersione acquosa dei polimeri prima della gelificazione. In alternativa, le cellule intrappolate nella matrice polimerica possono essere rifornite di sostanze nutrienti e fattori necessari alla loro crescita mettendo in contatto o immergendo l’idrogelo in un opportuno terreno di coltura. Inoltre, durante la preparazione del gel possono essere aggiunti farmaci che sono in grado di modulare l’azione delle cellule neuronali e che vengono rilasciati gradualmente dalla matrice polimerica una volta che l’impianto è stato introdotto nel tessuto bersaglio.

Un altro aspetto della presente invenzione è l’uso di un idrogelo che possegga una elevata capacità di rigonfiarsi, incorporando una miscela dove detta miscela è principalmente a base di acqua e di un mezzo di coltura eventualmente addizionato con fattori e/o altri principi attivi, detta miscela essendo adatta a fornire alle cellule ospitate il necessario nutrimento affinché possano sopravvivere e proliferare all’interno dell’idrogelo stesso.

Diversi tipi di cellule neuronali possono essere utilizzati per la preparazione di detto dispositivo bio-ibrido secondo l’invenzione, potendo essere dette cellule adulte, embrionali, staminali, wild-type, ingegnerizzate, non, o diversamente, primarie o immortalizzate (di linea).

In una forma di realizzazione della presente invenzione, l’idrogelo possiede adeguate caratteristiche chimico-fisiche per essere prodotto sottoforma di film sottile attraverso una delle metodiche note allo stato dell’arte della tecnica quali, a titolo esemplificativo e non esaustivo, lo spincoating da fuso con successivo raffreddamento, il dip-coating da fuso con successivo raffreddamento oppure il sol-gel. L’idrogelo così ottenuto ha uno spessore nell’ordine di qualche micrometro.

Un altro aspetto della presente invenzione riguarda l’uso di detto idrogelo prodotto sottoforma di film sottile come supporto per la crescita cellulare in vitro in applicazioni di screening farmacologico, di saggio per farmaco-sviluppo, di efficacia farmacologica o di tossicità. Tale supporto è realizzato come film sottile sul quale vengono depositati e fatti crescere singole cellule neuronali o popolazioni di cellule neuronali, anche differenti tra loro. Tale supporto è realizzato anche come substrato di collegamento tra cellule neuronali e dispositivi di misura appositamente realizzati per monitorare l’attività cellulare di neuroni singoli o popolazioni cellulari durante differenti tipologie di test che vanno dal monitoraggio della conducibilità dei segnali, a test di efficacia farmacologica. Tale film sottile di idrogelo polimerico deve essere appositamente disegnato e realizzato al fine di permettere il passaggio dei segnali elettrici e chimici. L’alta porosità della struttura dell’idrogelo unita alla presenza di elettroliti nella soluzione acquosa permette di ottenere alti valori di conducibilità elettrica (comparabili a quelli misurati nella soluzione stessa) e di diffusione degli ioni.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, l’idrogelo è ottenuto a partire da una miscela contenente carbopol, agarosio, glicerolo e glicole propilenico, in presenza di trietilammina, dispersi in un opportuno mezzo acquoso addizionato di una miscela di nutrienti quali ad esempio glucosio, amminoacidi essenziali, proteine, oligoelementi, sali minerali, vitamine ed antibiotici battericidi. Tale idrogelo contenente le cellule può essere posizionato per comodità all’interno di pozzetti adatti alle colture cellulari. Le cellule incapsulate nella matrice tridimensionale rimangono vitali e continuano a crescere e ad aggregarsi, come si è potuto osservare nel corso di esperimenti in cui è stata valutata la morfologia, la vitalità e la proliferazione cellulare all’interno di un idrogelo ottenuto come sopra descritto.

In un’altra realizzazione preferita dell’invenzione, l’idrogelo è ottenuto a partire da una miscela contenente carbopol, agarosio, glicerolo e glicole propilenico, in presenza di trietilammina, dispersi in un opportuno mezzo acquoso. Tale idrogelo è all’interno di un sostegno circolare cavo e sottoposto a rotazione a velocità tale da permettere l’ottenimento di un film sottile e regolare dello stesso una volta raffreddato. Successivamente su tale film di idrogelo, una volta rimosso dal supporto e posizionato in un dispositivo microelettronico, è depositata una dispersione liquida contenente cellule neuronali.

ESEMPI

Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggior dettaglio. ESEMPIO 1 - Preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili e con due diversi tipi di cellule neuronali da inserire alternativamente al suo interno

La procedura sotto riportata porta alla formazione di un idrogel con percentuale di carbomer dello 0,5% e di agarosio dello 0,5% oppure dello 0,25% e con cellule neuronali al suo interno.

Reagenti necessari per la preparazione di 100mL di gel con cellule neuronali:

- Carbomer 974 P (CAS 151687-96-6, Fagron, Bufa, Paesi Bassi):

0,5 g

- Agarosio (CAS 9012-36-6, Invitrogen Corp., Carlsbad, USA): (0,5 g oppure 0,25g)

- Glicole di propilene (CAS 504-63-2, Sigma-Aldrich, Germania):

30 mL

- Glicerolo (CAS 56-81-5, Merck Chemicals, Germania): 1 mL

- Trietilammina (CAS 121-44-8, preparazione ad alta purezza, Sigma-Aldrich, Germania): 0,5 mL

- PBS: quanto basta

- Cellule: U87 (neuroglia) oppure N9 (neuroni)

- Terreno di coltura: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) per U87, oppure IMEM (Iscove’s Minimal Essential Medium, Sigma-Aldrich, Germania) per N9 Procedura operativa per la preparazione delle cellule. Tale procedura inizia con le seguenti operazioni di scongelamento delle cellule dalla soluzione criopreservante, da svolgersi interamente sotto cappa sterile di classe II:

1. prelevare l’aliquota necessarie di cellule criopreservate nella loro criovial;

2. prelevare 10 mL di terreno di coltura e trasferirlo in un tubo da 50 mL mantenendolo a T=37°C;

3. prelevare 1 mL di terreno dal tubo e trasferirlo alla criovial contenente le cellule criopreservate e mescolare con la pipetta dolcemente per diluire il criopreservante a contatto con le cellule al fine di ottenerne il completo scongelamento;

4. ottenuto lo scongelamento totale, trasferire l’intera soluzione con la sospensione cellulare dalla criovial al tubo contenente il terreno e proseguire a sospendere nuovamente le cellule nel tubo con il terreno di coltura;

5. trasferire il tubo con le cellule nella centrifuga e centrifugare a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;

6. rimuovere il mezzo di coltura dal tubo, lasciando le cellule sul fondo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di coltura fresco e sospendere nuovamente le cellule;

7. eseguire la conta cellulare (ad esempio con camera di Neubauer) e quindi prelevare un volume di sospensione che contenga il numero di cellule che si intende seminare nella fiasca e trasferirvelo; in questo caso per una concentrazione di 40.000 unità/mL;

8. lasciare la fiasca all’interno di un apposito incubatore cellulare per il tempo necessario affinché le cellule raggiungano una sufficiente confluenza.

Procedura operativa per la preparazione del gel, sotto cappa sterile di classe II:

1. in un Becker pirex pesare il carbomer ed aggiungere la rispettiva quantità di PBS mettendo sotto agitazione spinta (1400 giri/minuto, con ancoretta) per 30 minuti primi a temperatura ambiente (T=25°C);

2. aggiungere glicerolo e glicole di propilene, mantenendo sotto agitazione alla medesima velocità per ulteriori 20 minuti primi, sempre a temperatura ambiente;

3. lasciare la sospensione senza agitazione per 60 minuti primi a temperatura ambiente;

4. per neutralizzare il pH della soluzione (se necessario) aggiungere q.b. di una soluzione di trietilammina al 98% in acqua, mescolando lentamente per 10 minuti primi sotto agitazione lenta (250 giri/minuto, con ancoretta);

5. pesare ed aggiungere l’agarosio in polvere in base alla concentrazione prefissata in precedenza e lasciare sotto agitazione (250 giri/minuto, con ancoretta) per 5 minuti primi a temperatura ambiente;

6. riscaldare la soluzione con radiazione elettromagnetica (500W) per circa 2 minuti primi fino al raggiungimento di una temperatura di circa 80°C;

7. estratta la soluzione, in fase di raffreddamento, a circa 40°C, aggiungere la soluzione precedentemente preparata contenente le cellule, in rapporto volumetrico di 1:1, mantenendo la nuova soluzione così ottenuta in lieve rotazione;

8. prelevare dalla soluzione finale di gel e cellule la quantità necessaria al riempimento dei pozzetti da colture cellulari utilizzati che andranno riempiti per il 50% del loro volume complessivo dalla soluzione finale di gel e cellule (pozzetti standard applicabili sono quelli delle piastre tipo “multiwell” da 48 pozzetti l’una), riempire il restante volume con il mezzo di coltura adatto per la tipologia di cellule in uso (mezzo surnatante);

9. per il mantenimento del gel con le cellule all’interno è necessario posizionare i campioni in un apposito incubatore da colture cellulari e sostituire il mezzo surnatante ogni 24 ore con del nuovo. Procedura operativa per i saggi di attività cellulare il cui scopo consiste nel valutare la morfologia, la vitalità e la proliferazione cellulare delle cellule U87 oppure N9 che sono state incapsulate all’interno di un idrogelo costituito come descritto nelle procedure precedenti.

Al fine di valutare la vitalità cellulare, a cadenza giornaliera eseguire sui campioni preparati come dalle procedure sopra descritte i saggi MTT (Sigma-Aldrich, Germania) ed Alamar Blue™ (AbD Serotec, Gran Bretagna). Un raffronto visibile relativo invece alla morfologia cellulare può essere ottenuto tramite microscopia ottica e/o elettronica a scansione.

Una conferma dello stato di vitalità e proliferazione cellulare può essere ottenuto andando ad eseguire i menzionati saggi sulle cellule una volta estratte dal gel. Tale operazione si configura come distruttiva per il gel ma non significativamente per le cellule e avendo cura di disegnare un set sperimentale sufficientemente ampio essa può essere eseguita a diversi tempi. Una volta estratte le cellule dal gel è anche possibile eseguire ulteriori saggi e misure di attività quali ad esempio l’imaging dello ione Calcio. Tale estrazione può essere ottenuta con la seguente procedura operativa, da eseguirsi sotto cappa sterile di classe II:

1. recuperare il surnatante dei pozzetti contenenti i campioni e trasferirlo in un tubo da 50 ml e portarlo a 30 mL di volume aggiungendo q.b. di soluzione di PBS e SSPE 1X (Sigma-Aldrich, Germania) ed effettuare una prima centrifugazione a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;

2. al termine della centrifugazione, eliminare il surnatante e sospendere nuovamente con 30 mL della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X cui vanno aggiunti 0,5 mL di soluzione tripsina-EDTA 1X (Sigma-Aldrich, Germania; EDTA= Ethylene Diamine Triacetic Acid, acido etilen-diammino-triacetico);

3. nei pozzetti dove sono situati i campioni aggiungere 0,5 ml della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X cui vanno aggiunti 0,5 mL della soluzione precedentemente descritta di tripsina-EDTA 1X e riporre in apposito incubatore per almeno 5 minuti primi;

4. dopo l’incubazione recuperare l’intero contenuto dei pozzetti e trasferirlo nel medesimo tubo da 50mL precedentemente utilizzato, quindi effettuare una seconda centrifugazione a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;

5. al termine della centrifugazione, recuperare il surnatante in un secondo tubo da 50 mL e sospendere nuovamente quanto rimasto nel primo tubo con 20 mL della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X cui vanno aggiunti 1 mL della soluzione precedentemente descritta di tripsina-EDTA 1X;

6. effettuare una terza centrifugazione di entrambi i tubi da 50mL, a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;

7. al termine della centrifugazione, eliminare il surnatante da entrambi i tubi, sospendere quanto in entrambi i tubi con 20 mL della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X;

8. unire il contenuto dei due tubi in unico tubo e sottoporlo ad una quarta centrifugazione a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;

9. dal termine della centrifugazione, eliminare il surnatante e sospendere in adeguato terreno;

10. rimuovere la sospensione dal tubo e trasferirla nell’apposita fiasca per la conservazione in adeguato incubatore.

ESEMPIO 2 - preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili e con due diversi tipi di cellule neuronali da inserire alternativamente al suo interno e con un mezzo di coltura specifico per le popolazioni neuronali

Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio dove invece dei mezzi di coltura DMEM ed IMEM, per U87 ed N9 rispettivamente, si usa il seguente mezzo, ottenuto come soluzione specificamente realizzata per favorire le cellule neuronali all’interno del gel; quantità di reagenti proporzionati per 20mL di soluzione:

- Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma N4888, Germania) 18,790 mL - B27 (GIBCO, Invitrogen, USA) 400 µL - Insulin-Transferrin-Selenium-G Supplement, 100X

- (GIBCO, Invitrogen, USA) [diluizione 1:100] 10 µL - D–(+)Glucose @ 45% (Sigma G8769, Germania) 80 µL - L–Glutamine (Sigma G7513, Germania) 200 µL - Penicillin-Streptomycin (Sigma P0781, Germania) 60 µL - Sodium pyruvate (Sigma S8636, Germania) 200 µL - MEM Vitamins 100X (Sigma M6895, Germania) 20 µL - MEM Aminoacids 50X (Sigma M5550, Germania) 20 µL - MEM Non-Aminoacids 100X NEAA (Sigma M7145, Germania) 20 µL - HEPES Buffer (Sigma H0887, Germania) 200 µL ESEMPIO 3 - preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili, con un agente elasticizzante e con due diversi tipi di cellule neuronali da inserire alternativamente al suo interno

Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio nr. 1 dove però il PBS utilizzato per la preparazione del gel viene addizionato con 0,5% in peso di acido alginico (Sigma-Aldrich, Germania).

ESEMPIO 4 - preparazione di un film sottile dell’idrogelo e con due diversi tipi di cellule neuronali da farvi crescere sopra

Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio nr. 1 dove però la soluzione gelatinosa, una volta scaldata e quando questa è ancora in stato fuso, viene depositata in adeguata quantità su di uno specifico supporto cavo e circolare. Tale supporto viene quindi messo in rotazione ad una velocità adeguata con lo spessore finale che si mira a raggiungere mentre la soluzione stessa è lasciata raffreddare a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, il film di idrogelo viene rimosso dal supporto e posizionato in un pozzetto per colture cellulari sul quale viene poi depositata una dispersione liquida contenente cellule neuronali.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Idrogelo a doppia matrice polimerica interpenetrante formata da un polimero di acido acrilico o carbomerico, un polimero naturale scelto tra agarosio, chitosano, destrano o un glicosaminoglicano, un agente di reticolazione scelto tra glicerolo, glicole propilenico, etilenico, trietilammina o una loro miscela, detto idrogelo contenendo cellule neuronali appoggiate sulla sua superficie esterna o alloggiate all’interno del reticolo tridimensionale formato da detta matrice polimerica.
2. Idrogelo secondo la rivendicazione 1, in cui detta matrice polimerica contiene inoltre un agente elasticizzante scelto tra acido alginico e suoi sali, collagene, fibrina, fibrinogeno, acido ialuronico e suoi derivati.
3. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detta matrice polimerica comprende da 0,01% a 5% di polimero di acido acrilico o carbomerico, da 0,01% a 5% di polimero naturale, da 0,1% a 40% di agente di reticolazione, ed eventualmente da 0,01% a 5% di agente elasticizzante, dove le predette % sono in peso.
4. Idrogelo secondo la rivendicazione 1, in cui detto polimero acrilico è carbopol, detto polimero naturale è agarosio e detto agente di reticolazione è una miscela di glicerolo, glicole propilenico e trietilammina.
5. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-4, in cui dette cellule sono alternativamente cellule adulte, staminali, embrionali, wild-type, ingegnerizzate, primarie o immortalizzate (di linea).
6. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-5, comprendente inoltre sostanze nutritive e/o fattori di crescita per cellule, particolarmente per cellule neuronali.
7. Idrogelo secondo la rivendicazione 1-6, comprendente inoltre uno o più farmaci in grado di modulare l’azione delle cellule neuronali e/o di mantenerle vitali e/o di stimolarne il metabolismo e/o di stimolarne la crescita e lo sviluppo e/o di stimolarne il differenziamento e/o di stimolarne l’interazione e l’interconnettività mutua.
8. Idrogelo secondo le rivendicazioni precedenti, in forma di film sottile idoneo a supportare cellule neuronali per uso su dispositivi di misura appositamente realizzati per monitorare diversi parametri di attività cellulare.
9. Metodo per la preparazione di un idrogelo secondo le rivendicazioni precedenti, che comprende la preparazione di una miscela contenente (% in peso) da 0,01% a 5% di polimero acrilico, da 0,01% a 5% di polimero naturale, da 0,1% a 40% di agente reticolante in un mezzo acquoso, a una temperatura compresa tra 20°C e 90°C, per un tempo variabile da 10 minuti secondi a 240 minuti primi, e l’eventuale successivo raffreddamento fino a raggiungere una temperatura compresa tra temperatura ambiente e 37°C.
10. Metodo secondo la rivendicazione 9, che comprende inoltre l’aggiunta di una base in grado di neutralizzare l’acido che si sviluppa durante la reazione.
11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detta base è trietilammina.
12. Metodo secondo le rivendicazioni 8-11, in cui la miscela acquosa viene addizionata o sostituita con un terreno di coltura idoneo al mantenimento delle cellule neuronali in condizioni vitali e di crescita.
13. Metodo secondo la rivendicazione 8 o 12, in cui alla miscela acquosa o al terreno di coltura vengono aggiunti uno o più farmaci in grado di modulare l’azione delle cellule neuronali.
14. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-8 per la preparazione di un impianto di cellule neuronali per la rigenerazione o ricostituzione, integrali o parziali, di tessuto neuronale danneggiato o malato o rimosso.
15. Uso secondo la rivendicazione 14, dove detto tessuto neuronale fa parte del sistema nervoso centrale.
16. Uso secondo la rivendicazione 14, dove detto tessuto neuronale è danneggiato in conseguenza della malattia di Parkinson.
17. Uso secondo la rivendicazione 14, dove detto tessuto neuronale è danneggiato in conseguenza di lesioni a livello del midollo spinale.
18. Uso secondo la rivendicazione 14, dove detto tessuto neuronale è danneggiato in conseguenza di patologie oncologiche.
19. Uso secondo la rivendicazione 14, dove detto tessuto neuronale è danneggiato in conseguenza della malattia di Alzheimer.
20. Uso secondo la rivendicazione 14, dove detto tessuto neuronale è stato rimosso o ablato a seguito di un intervento chirurgico.
21. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-8 come interfaccia tra cellule neuronali e dispositivi elettronici.
22. Uso di un idrogelo secondo la rivendicazione 21, dove vengono monitorati diversi parametri di attività cellulare durante test per screening farmacologico.
23. Uso di un idrogelo secondo la rivendicazione 21, dove vengono monitorati diversi parametri di attività cellulare durante test di sviluppo di farmaci.
24. Uso di un idrogelo secondo la rivendicazione 21, dove vengono monitorati diversi parametri di attività cellulare durante test di efficacia farmacologica.
25. Uso di un idrogelo secondo la rivendicazione 21, dove vengono monitorati diversi parametri di attività cellulare durante test di tossicità. Milano, 29 maggio 2008