ITMI20080866A1

ITMI20080866A1 - HEMATOPOIETAL CELLS EXPRESSING GSG1L PROTEIN AND BINDERS FOR GSG1L PROTEIN

Info

Publication number: ITMI20080866A1
Authority: IT
Inventors: Sergio Abrignani; Mariacristina Crosti; Monica Moro
Original assignee: Istituto Naz Di Genetica Molecolare Ingm
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2008-05-13
Publication date: 2009-11-14

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo: Attached to a patent application for INDUSTRIAL INVENTION entitled:

“Cellule ematopoietiche esprimenti la proteina GSG1L e i leganti per la proteina GSG1L” "Hematopoietic cells expressing the GSG1L protein and the binding agents for the GSG1L protein"

La presente invenzione riguarda cellule ematopoietiche ex vivo caratterizzate dall'espressione della proteina GSG1 L sulla superficie di dette cellule, metodi per preparare dette cellule e leganti per GSG1 L. The present invention relates to ex vivo hematopoietic cells characterized by the expression of the GSG1 L protein on the surface of said cells, methods for preparing said cells and binding for GSG1 L.

La proteina GSG1 L è nota nell'arte grazie alla sua sequenza genica. Il gene per Homo sapiens è rappresentato dal numero GenelD 146395 secondo la denominazione Entrez gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Il gene GSG1L è presente sul cromosoma 16. L’acronimo della proteina gsgll/GSGlL significa GSGl-Like. The GSG1 L protein is known in the art due to its gene sequence. The gene for Homo sapiens is represented by the GenelD number 146395 according to the Entrez gene designation (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). The GSG1L gene is present on chromosome 16. The acronym for the gsgll / GSGlL protein means GSGl-Like.

E’ sentita nell’arte la necessità di migliorare le procedure di isolamento e riconoscimento di specifiche cellule appartenenti al sistema ematopoietico. E’ anche sentita la necessità di migliorare l’uso di cellule appartenenti al sistema ematopoietico nel campo terapeutico/diagnostico/prognostico. The need to improve the isolation and recognition procedures of specific cells belonging to the hematopoietic system is felt in the art. The need is also felt to improve the use of cells belonging to the hematopoietic system in the therapeutic / diagnostic / prognostic field.

E’ infine sentita nell’ arte la necessità di poter definire lo stato metabolico e/o fisiologico di una cellula appartenente al sistema ematopoietico. Finally, the need is felt in art to be able to define the metabolic and / or physiological state of a cell belonging to the hematopoietic system.

La Richiedente ha sorprendentemente trovato che l’espressione di GSG1L su cellule ematopoietiche risponde alle esigenze sopra richieste perché l’espressione di GSG1L, e la presenza di GSG1L sulla superficie di dette cellule, è correlata allo stato mitogenico e/o metabolico di cellule ematopoietiche. The Applicant has surprisingly found that the expression of GSG1L on hematopoietic cells meets the above requirements because the expression of GSG1L, and the presence of GSG1L on the surface of said cells, is related to the mitogenic and / or metabolic state of hematopoietic cells.

La presente invenzione, oltre che nella descrizione dettagliata che segue, viene ulteriormente illustrata qui di seguito mediante l’ausilio delle figure allegate. La Figura 1 mostra i risultati di un esperimento in cui la distribuzione di GSG1L sulla superficie di linfociti presenti nel sangue periferico è rilevata mediante “Fluorescent-activated celi sorting” (FACS) (si veda l’Esempio 1 per la descrizione di tale metodo). The present invention, as well as in the detailed description that follows, is further illustrated below with the aid of the attached figures. Figure 1 shows the results of an experiment in which the distribution of GSG1L on the surface of lymphocytes present in peripheral blood is detected by "Fluorescent-activated celi sorting" (FACS) (see Example 1 for the description of this method) .

La Figura la mostra la distribuzione di GSG1L sulla superficie di linfociti del sangue periferico (PBL) rilevata usando FACS. I PBL vengono identificati all’intemo delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sulla base dei parametri fisici di dimensione (Forward Scatter, FSC) e granulosità (Side Scatter, SSC). Nel grafico sono riportate due tracce, di cui una di controllo dell’efficacia dell’anticorpo contro GSG1L. La cifra indicata è la percentuale di PBL che esprimono GSG1L. Figure 1a shows the distribution of GSG1L on the peripheral blood lymphocyte (PBL) surface detected using FACS. PBLs are identified within peripheral blood mononuclear cells (PBMC) on the basis of physical parameters of size (Forward Scatter, FSC) and graininess (Side Scatter, SSC). The graph shows two traces, one of which controls the efficacy of the antibody against GSG1L. The figure shown is the percentage of PBLs expressing GSG1L.

La Figura lb mostra la distribuzione di GSG1L sulla superficie di specifiche sottopopolazioni linfocitarie. Dette sottopopolazioni sono selezionate tramite dei marker presenti sulla superficie delle cellule: CD3 per linfociti T, CD 19 per linfociti B e CD56 per cellule NK, rappresentate da Figura lb)i), b)ii) e b)iii) rispettivamente. Figure 1b shows the distribution of GSG1L on the surface of specific lymphocyte subpopulations. Said subpopulations are selected by means of markers present on the cell surface: CD3 for T lymphocytes, CD 19 for B lymphocytes and CD56 for NK cells, represented by Figure 1b) i), b) ii) and b) iii) respectively.

Nei diagrammi FACS, i quadranti a destra mostrano le specifiche sottopopolazioni individuate usando detti marker presenti sulla superficie delle cellule selezionate da PBL, ed il quadrante a destra in alto mostra la percentuale di dette cellule individuate che esprimono GSG1L. In the FACS diagrams, the quadrants on the right show the specific subpopulations identified using said markers present on the surface of the cells selected by PBL, and the upper right quadrant shows the percentage of said cells identified expressing GSG1L.

Si vede che i numeri relativi di cellule che presentano GSG1L sulla superficie di linfociti T e cellule NK sono molto più bassi rispetto al numero delle stesse cellule che non esprimono GSG1L, tanto che questi possono essere attribuiti a rumore di fondo dovuti al metodo di produzione degli anticorpi per GSG1L usati nell’ esperimento FACS e pertanto non hanno significatività statistica. Si nota invece che il numero di linfociti B esprimenti GSG1L è notevole, all’incirca 46% di linfociti B presenti. It is seen that the relative numbers of cells presenting GSG1L on the surface of T lymphocytes and NK cells are much lower than the number of the same cells that do not express GSG1L, so much so that these can be attributed to background noise due to the method of production of the antibodies to GSG1L used in the FACS experiment and therefore have no statistical significance. Instead, it is noted that the number of B lymphocytes expressing GSG1L is considerable, approximately 46% of B lymphocytes present.

La Figura 2 mostra i risultati di un esperimento in cui si misura l'espressione di GSG1L tramite una reazione realtime polymerase chain reaction (RT-PCR). I risultati mostrano chiaramente che GSG1L viene espresso in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). La colonna MW rappresenta un set di markers di peso molecolare noti nelfarte per calibrare le sequenze risultanti dal RT-PCR con il loro peso molecolare. Figure 2 shows the results of an experiment in which GSG1L expression is measured via a realtime polymerase chain reaction (RT-PCR). The results clearly show that GSG1L is expressed in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The MW column represents a set of molecular weight markers known in the art to calibrate the sequences resulting from the RT-PCR with their molecular weight.

Nel contesto della presente invenzione, con “cellule ematopoietiche”, si intendono tutte quelle cellule nucleate che provengono in vivo e/o ex vivo dal lineaggio dendogrammatico che parte dalla cellula staminale ematopoietica presente nel midollo osseo fino ad arrivare a cellule mature come ad es. ad un leucocita maturo. In the context of the present invention, with "hematopoietic cells" we mean all those nucleated cells that come in vivo and / or ex vivo from the dendogrammatic lineage that starts from the hematopoietic stem cell present in the bone marrow up to mature cells such as eg. to a mature leukocyte.

Nel contesto della presente invenzione, l’espressione di una proteina “sulla superficie della cellula” è intesa come l’espressione di una proteina che attraversa la membrana o è ancorata nella membrana e che mostra almeno una parte della sua struttura tri-dimensionale sulla superficie esteriore della membrana cellulare. In the context of the present invention, the expression of a protein "on the cell surface" is understood as the expression of a protein which crosses the membrane or is anchored in the membrane and which exhibits at least part of its three-dimensional structure on the surface outer cell membrane.

Nel contesto della presente invenzione, con “risposta immunitaria”, si intende un qualsiasi tipo di risposta fisiologica, cioè una serie di reazioni biochimiche, sviluppata dall’ospite in seguito al contatto e/o alla presentazione di un antigene a cellule appartenenti al sistema immunitario. In the context of the present invention, "immune response" means any type of physiological response, that is a series of biochemical reactions, developed by the host following contact and / or presentation of an antigen to cells belonging to the immune system .

Nel contesto della presente invenzione, con “sistema immunitario”, si intende un insieme di cellule e componenti chimici, tra cui citochine, che sono presenti nel sistema ematopoietico di un mammifero. Dette cellule e componenti chimici appartenenti al sistema immunitario possono appartenere al sistema immunitario innato o adattati vo. In the context of the present invention, "immune system" means a set of cells and chemical components, including cytokines, which are present in the hematopoietic system of a mammal. These cells and chemical components belonging to the immune system may belong to the innate or adaptive immune system.

Nel contesto della presente invenzione, con “sistema immunitario adattativo”, si intende una parte del sistema immunitario caratterizzata dalla capacità di discriminare e “riconoscere” in modo specifico un numero molto elevato di macromolecole differenti (antigeni) e dalla capacità di “ricordare” un antigene verso cui il sistema ha precedentemente risposto. Queste caratteristiche fanno si che il sistema immunitario adattativo possa essere educato e che le risposte ad una successiva reinfezione con un patogeno siano più rapide ed efficaci. Le cellule che compongono l’immunità adattativa sono i linfociti T ed i linfociti B. Dette componenti del sistema immunitario, e le loro risposte, sono ben note nell’ arte. E’ anche ben noto che le diverse componenti del sistema immunitario interagiscono tra di loro per conferire un sistema immunitario completo. In the context of the present invention, the term "adaptive immune system" means a part of the immune system characterized by the ability to specifically discriminate and "recognize" a very large number of different macromolecules (antigens) and the ability to "remember" a antigen to which the system has previously responded. These characteristics mean that the adaptive immune system can be educated and that the responses to a subsequent reinfection with a pathogen are more rapid and effective. The cells that make up adaptive immunity are T lymphocytes and B lymphocytes. These components of the immune system, and their responses, are well known in the art. It is also well known that the different components of the immune system interact with each other to give a complete immune system.

Nel contesto della presente invenzione, il termine "cellule" include qualunque fase di maturazione in cui può trovarsi la cellula medesima come ad es., il termine "linfociti B" include tutte le possibili fasi di un linfocita B da cellule pro-B (CD34<+>CD19<+>CD20<'>Ig ) fino, ad esempio, ad una cellula plasma (CD38<+>CD27<+>CD 19<+/'>CD2<(>THLA<'>DR<'>). In the context of the present invention, the term "cells" includes any maturation stage in which the cell itself may be such as, for example, the term "B lymphocytes" includes all possible stages of a B lymphocyte from pro-B cells (CD34 <+> CD19 <+> CD20 <'> Ig) up to, for example, a plasma cell (CD38 <+> CD27 <+> CD 19 <+ /'> CD2 <(> THLA <'> DR <'> ).

Formano oggetto della presente invenzione, cellule ematopoietiche ex vivo che esprimono sulla loro superficie GSG1L. The object of the present invention is ex vivo hematopoietic cells expressing GSG1L on their surface.

Le cellule secondo l’invenzione possono derivare da qualsiasi fonte di cellule ematopoietiche, preferibilmente una fonte di cellule appartenenti al sistema immunitario adattativo ed ancor più preferibilmente in vivo. Detta fonte è preferibilmente il sangue periferico. The cells according to the invention can derive from any source of hematopoietic cells, preferably a source of cells belonging to the adaptive immune system and even more preferably in vivo. Said source is preferably the peripheral blood.

Preferibilmente, le cellule secondo l’invenzione derivano da un essere umano. L'essere umano è preferibilmente un adulto. Preferably, the cells according to the invention derive from a human being. The human being is preferably an adult.

Le cellule secondo l’invenzione sono preferibilmente cellule appartenenti al sistema immunitario, più preferibilmente appartenenti al sistema immunitario adattativo, ancora più preferibilmente linfociti B. Dette cellule sono preferibilmente linfociti B che presentano marker CD 19. The cells according to the invention are preferably cells belonging to the immune system, more preferably belonging to the adaptive immune system, even more preferably B lymphocytes. Said cells are preferably B lymphocytes that have CD 19 markers.

In una realizzazione, le cellule secondo l’invenzione sono comprese in una composizione che comprende inoltre eccipienti e/o stabilizzanti e/o veicolanti. In una realizzazione preferita, detta composizione comprende inoltre un vaccino. In una realizzazione più preferita detta composizione comprende inoltre linfociti T e/o monociti. In one embodiment, the cells according to the invention are included in a composition which also comprises excipients and / or stabilizers and / or carriers. In a preferred embodiment, said composition further comprises a vaccine. In a more preferred embodiment, said composition further comprises T lymphocytes and / or monocytes.

Le cellule secondo l’invenzione sono mantenute in vita ex vivo scegliendo metodiche ed apparati opportuni tra quelli noti nell’arte per mantenere e conservare cellule ematopoietiche in vitro. In una realizzazione preferita, dopo una separazione mediante FICOLL, le cellule vengono sospese in un mezzo nutritivo isotonico contenente sali, vitamine, cofattori e proteine (ad es. terreni come RPMI1640 o D-MEM) addizionato di fattori di crescita (ad es. si utilizza 10% del volume di colture di Fetal Bovine Serum o Normal Human Serum). Risospese in tale mezzo di coltura, le cellule risultano vitali ed in buone condizioni per un periodo di diverse ore (fino a 24 ore). Il vantaggio di detto mezzo di coltura è che le cellule possono anche essere sottoposte a stimoli di diverso genere (ad esempio il trattamento con il mitogeno PHA-L) e se ne può monitorare il comportamento per diversi giorni, rinfrescando il mezzo di coltura con opportune quantità di nuovo mezzo. The cells according to the invention are kept alive ex vivo by choosing suitable methods and apparatuses among those known in the art to maintain and preserve hematopoietic cells in vitro. In a preferred embodiment, after separation by FICOLL, the cells are suspended in an isotonic nutrient medium containing salts, vitamins, cofactors and proteins (e.g. media such as RPMI1640 or D-MEM) added with growth factors (e.g. si uses 10% culture volume of Fetal Bovine Serum or Normal Human Serum). Resuspended in this culture medium, the cells are viable and in good condition for a period of several hours (up to 24 hours). The advantage of said culture medium is that the cells can also be subjected to stimuli of different kinds (for example treatment with the PHA-L mitogen) and its behavior can be monitored for several days, refreshing the culture medium with appropriate amount of new medium.

Forma ulteriore oggetto dell’invenzione un metodo per preparare le cellule secondo l’invenzione. Detto metodo è caratterizzato dai seguenti passaggi: Another object of the invention is a method for preparing cells according to the invention. This method is characterized by the following steps:

- preparare un campione di cellule comprendenti cellule ematopoietiche, - prepare a cell sample comprising hematopoietic cells,

- determinare se GSG1L è presente sulla superficie delle cellule nel campione. In una realizzazione di detto metodo, si isolano le cellule che presentano GSG1L nello stesso passaggio in cui si determina se GSG1L è presente o in un passaggio successivo. In una realizzazione preferita del metodo, prima o durante o dopo il passaggio in cui si determina la presenza di GSG1L, si isolano cellule linfocitarie, preferibilmente linfociti B, dal campione di cellule. - determine if GSG1L is present on the surface of the cells in the sample. In one embodiment of said method, cells presenting GSG1L are isolated in the same step in which it is determined whether GSG1L is present or in a subsequent step. In a preferred embodiment of the method, before or during or after the step in which the presence of GSG1L is determined, lymphocyte cells, preferably B lymphocytes, are isolated from the cell sample.

E’ preferibile usare in detto metodo per preparare le cellule secondo l’invenzione, un legante per la proteina GSG1L, più preferibilmente un legante proteico, come ad es. un anticorpo o una proteina lectina. It is preferable to use in said method to prepare the cells according to the invention, a ligand for the GSG1L protein, more preferably a protein ligand, such as e.g. an antibody or a lectin protein.

Pertanto forma ulteriore oggetto della presente invenzione un legante per la proteina GSG1L. Therefore, a further object of the present invention is a ligand for the GSG1L protein.

Preferibilmente detto legante è specifico per solo la proteina GSG1L. Preferably said ligand is specific for only the GSG1L protein.

Detto legante è preferibilmente un anticorpo policlonale o monoclonale contro la proteina GSG1L. Said ligand is preferably a polyclonal or monoclonal antibody against the GSG1L protein.

Tra detti leganti, il preferito è un anticorpo monoclonale contro la proteina GSG1L. L’anticorpo monoclonale può essere prodotto con metodi noti nell’arte, come ad es. metodi di ricombinazione o metodi che utilizzano la tecnologia di Kohler e Midstein. Detto metodo include preferibilmente i seguenti passaggi: i) immunizzare un animale avente una milza, con la proteina GSG1L in modo da ottenere una risposta immunitaria, preferibilmente in combinazione con un adiuvante; Among said ligands, the preferred is a monoclonal antibody against the GSG1L protein. The monoclonal antibody can be produced with methods known in the art, such as for example recombination methods or methods using Kohler and Midstein technology. Said method preferably includes the following steps: i) immunizing an animal having a spleen, with the GSG1L protein so as to obtain an immune response, preferably in combination with an adjuvant;

ii) rimuovere la milza dalTanimale e trattarla in modo da avere una sospensione di cellule intatte ed isolare da essa i leucociti, come ad es. linfociti B; ii) remove the spleen from the animal and treat it so as to have a suspension of intact cells and isolate the leukocytes from it, such as eg. B lymphocytes;

iii) formare un ibridoma, ad es. tramite fusione, da una cellula leucocita isolata dalla sospensione risultante in (ii) con una cellula immortalizzata, come ad esempio cellule da un lineaggio mieloma HGRP<~/_>, iii) form a hybridoma, e.g. via fusion, from a leukocyte cell isolated from the resulting suspension in (ii) with an immortalized cell, such as cells from an HGRP <~ / _> myeloma lineage,

iv) arricchire il numero di cellule formate in (iii) con un mezzo adatto, come ad es. un celi feeder layer, iv) enriching the number of cells formed in (iii) with a suitable medium, such as e.g. a celi feeder layer,

v) selezionare tramite un metodo di selezione negativa cellule che hanno formato un ibridoma funzionante, come ad es. crescendo le cellule formate in (iii) su un mezzo HAT se si usa un mieloma HGRP<'/_>; v) selecting by a negative selection method cells that have formed a functioning hybridoma, such as e.g. growing the cells formed in (iii) on a HAT medium if using an HGRP <'/ _> myeloma;

vi) isolare cellule che producono anti corpi contro GSG1L tramite metodi noti nell’arte come ad esempio usando GSG1L legato ad un marcatore, ad esempio una sonda; vi) isolating cells that produce antibody against GSG1L by methods known in the art such as using GSG1L linked to a marker, for example a probe;

vii) isolare e moltiplicare le cellule selezionate per produrre gli anticorpi monoclonali contro GSG1L. vii) isolate and multiply the selected cells to produce monoclonal antibodies against GSG1L.

Detti leganti possono essere usati in protocolli di preparazione opportunamente scelti tra quelli noti neH’arte come ad esempio separazione magnetica od altri metodi. Il metodo per selezionare le cellule secondo l’invenzione o le sottopopolazioni specifiche di cellule può incorporare sia protocolli di selezione positiva e/o protocolli di selezione negativa noti nell’arte. Said binders can be used in preparation protocols appropriately selected from those known in the art such as magnetic separation or other methods. The method for selecting cells according to the invention or specific subpopulations of cells can incorporate both positive selection protocols and / or negative selection protocols known in the art.

Un protocollo preferito da usare nella preparazione di detta sottopopolazione è un protocollo di citometria a flusso che riesce a determinare ed isolare le cellule secondo l’invenzione discriminando tra cellule che esprimono e cellule che non esprimono GSG1L. E’ ancor più preferito un protocollo di preparazione e in cui si usa citometria a flusso con fluorocromi (FACS<®>della Beckton-Dickinson), preferibilmente come fase finale e/o seguente ad un protocollo di arricchimento, come ad es. con un protocollo che comprende l’uso di biglie magnetiche con anticorpi specifici legati su di essi. A preferred protocol to be used in the preparation of said subpopulation is a flow cytometry protocol that is able to determine and isolate the cells according to the invention by discriminating between cells that express and cells that do not express GSG1L. A preparation protocol is even more preferred in which flow cytometry with fluorochromes (FACS <®> by Beckton-Dickinson) is used, preferably as a final step and / or following an enrichment protocol, such as eg. with a protocol that includes the use of magnetic beads with specific antibodies bound on them.

Nell’esempio 1 viene riportata in dettaglio una realizzazione, a titolo esemplificativo e assolutamente non limitante, di un metodo per identificare cellule appartenenti al sistema immunitario adattativo che esprimono la proteina GSG1L sulla loro superficie partendo da sangue periferico prelevato da un essere umano adulto. Example 1 shows in detail a realization, by way of example and absolutely not limiting, of a method for identifying cells belonging to the adaptive immune system that express the GSG1L protein on their surface starting from peripheral blood taken from an adult human.

In un’altra realizzazione, le cellule secondo l’invenzione possono essere usate in un metodo ex vivo per rilevare lo stato immunitario, preferibilmente quello adattativo, di un paziente da cui le cellule derivano. Detto metodo comprende un passaggio in cui si determina la percentuale di linfociti B che presentano GSG1L sulla loro superficie rispetto alla totale popolazione di linfociti B compresa in un campione di cellule ematopoietiche di detto paziente. Si confronta detta percentuale con percentuali standard. Una percentuale alta rispetto allo standard indica un'attività nel sistema immunitario più alta rispetto a valori standard. I reagenti e protocolli di rilevazione e quantificazione delle cellule sono quelli già sopra descritti. In another embodiment, the cells according to the invention can be used in an ex vivo method to detect the immune state, preferably the adaptive one, of a patient from which the cells derive. Said method comprises a step in which the percentage of B lymphocytes presenting GSG1L on their surface is determined with respect to the total population of B lymphocytes included in a sample of hematopoietic cells of said patient. This percentage is compared with standard percentages. A high percentage compared to the standard indicates a higher activity in the immune system than standard values. The reagents and protocols for the detection and quantification of the cells are those already described above.

In una realizzazione preferita di detto metodo, un antigene viene presentato alle cellule prima del passaggio in cui si determina la percentuale di linfociti B che presenta GSG1L. La percentuale risultante indica la risposta immunitaria. Detta risposta immunitaria da detta prova diagnostica fornisce informazioni alla persona esperta dell’arte riguardante lo stato immunitario dell’ospite da cui le cellule secondo l’invenzione derivano. Dette informazioni riguardanti lo stato immunitario comprendono informazioni riguardanti la memoria antigenica presente nelle cellule linfocitarie e la probabilità del sistema immunitario adattativo di sviluppare una risposta immunitaria all’antigene specifico che si è presentato nella prova diagnostica. Detto uso per prove diagnostiche è specialmente utile quando l’ antigene specifico è un possibile vaccino che si vuole esaminare. I protocolli da seguire per presentare l'antigene sono opportunamente scelti dalla persona esperta nell’arte da quelli noti nell'arte e in funzione dell’ antigene presentato. Ad esempio si può presentare l’antigene secondo metodi noti nell’arte come semplice introduzione dell’ antigene in un mezzo/soluzione contenente le cellule o introducendo una cellula autoioga alle cellule secondo l’invenzione (ad esempio un macrofago) che ha processato l’antigene e lo presenta sulla sua superficie in un complesso MHC. In a preferred embodiment of said method, an antigen is presented to the cells before the step in which the percentage of B lymphocytes presenting GSG1L is determined. The resulting percentage indicates the immune response. Said immune response from said diagnostic test provides information to the person skilled in the art regarding the immune status of the host from which the cells according to the invention derive. This information regarding the immune status includes information regarding the antigenic memory present in lymphocyte cells and the probability of the adaptive immune system to develop an immune response to the specific antigen that occurred in the diagnostic test. This use for diagnostic tests is especially useful when the specific antigen is a possible vaccine that you want to examine. The protocols to be followed to present the antigen are suitably chosen by the person skilled in the art from those known in the art and according to the antigen presented. For example, the antigen can be presented according to methods known in the art as a simple introduction of the antigen into a medium / solution containing the cells or by introducing an autohygenic cell to the cells according to the invention (for example a macrophage) which has processed the antigen and presents it on its surface in an MHC complex.

Forma un altro oggetto della presente invenzione l’uso delle cellule ematopoietiche ex vivo che esprimono GSG1L sulla loro superficie come medicamento. Another object of the present invention is the use of ex vivo hematopoietic cells that express GSG1L on their surface as a drug.

In una realizzazione dell'invenzione, le cellule secondo l'invenzione sono usate per il trattamento o la prevenzione di patologie la cui cura richiede un aumento nel numero di cellule appartenenti ad un sistema ematopoietico. Con il termine "patologie" si intende qualsiasi alterazione di un organismo, in particolare di un umano, che non ne permette il funzionamento in modo normale.Altemativamente, , le cellule secondo l’invenzione sono usate per la preparazione di un medicamento per trattare o prevenire patologie la cui cura richiede l’aumento nel numero delle cellule appartenenti al sistema ematopoietico . In an embodiment of the invention, the cells according to the invention are used for the treatment or prevention of pathologies whose cure requires an increase in the number of cells belonging to a hematopoietic system. The term "pathologies" means any alteration of an organism, in particular of a human, which does not allow it to function in a normal way. Alternatively, the cells according to the invention are used for the preparation of a medicament to treat or prevent diseases whose treatment requires an increase in the number of cells belonging to the hematopoietic system.

In un'altra realizzazione correlata, le cellule secondo l'invenzione sono usate per il trattamento o la prevenzione di patologie la cui cura richiede l'aumento nell'efficacia del sistema ematopoietico. Alternativamente, le cellule secondo l’invenzione sono usate per la preparazione di un medicamento per trattare o prevenire patologie la cui cura richiede l'aumento nell'efficacia del sistema ematopoietico. In another related embodiment, the cells according to the invention are used for the treatment or prevention of pathologies whose cure requires increasing the efficacy of the hematopoietic system. Alternatively, the cells according to the invention are used for the preparation of a drug to treat or prevent pathologies whose cure requires an increase in the efficacy of the hematopoietic system.

Un esempio di una patologia la cui cura richiede l’aumento nel numero di cellule appartenenti ad un sistema ematopoietico e/o l’aumento nell’efficacia del sistema ematopoietico è l'anemia o la condizione clinica dopo chemioterapia o radioterapia. An example of a disease whose treatment requires an increase in the number of cells belonging to a hematopoietic system and / or an increase in the efficacy of the hematopoietic system is anemia or the clinical condition after chemotherapy or radiotherapy.

Preferibilmente, dette cellule ex vivo comprendono cellule appartenenti al sistema immunitario adattativo, preferibilmente linfociti-B, che esprimono GSG1L sulla loro superficie. Preferably, said ex vivo cells comprise cells belonging to the adaptive immune system, preferably B-lymphocytes, which express GSG1L on their surface.

In una realizzazione preferita dette patologie sono patologie o condizioni cliniche in cui è coinvolto il sistema immunitario, ancora più preferibilmente il sistema immunitario adattativo. In una realizzazione ancora più preferita, le patologie coinvolgono linfociti B. Un esempio di dette patologie la cui cura richiede l'aumento nel numero di cellule appartenenti al sistema linfocitario sono le condizioni dopo trattamenti linfo-ablativi, come ad es. radioterapia conseguente a patologie come ad es. leucemia. Un altro esempio di una patologia la cui cura richiede l’aumento in efficacia e/o nel numero di linfociti B è una patologia immunodepressiva, come ad es. sindrome di DiGeorge o di Wiskott-Aldrich o come HIV. In a preferred embodiment, said pathologies are pathologies or clinical conditions in which the immune system is involved, even more preferably the adaptive immune system. In an even more preferred embodiment, the pathologies involve B lymphocytes. An example of said pathologies whose cure requires an increase in the number of cells belonging to the lymphocytic system are the conditions after lympho-ablative treatments, such as e.g. radiotherapy resulting from pathologies such as eg. leukemia. Another example of a disease whose treatment requires an increase in efficacy and / or in the number of B lymphocytes is an immunosuppressive disease, such as eg. DiGeorge or Wiskott-Aldrich syndrome or HIV.

Detto medicamento, per aumentare il numero di cellule appartenenti al sistema ematopoietico o aumentare l’efficacia del sistema ematopoietico, preferibilmente quelle appartenenti al sistema linfocitario, è preferibilmente preparato in modo da essere applicato secondo metodi noti nell’arte per la trasfusione di cellule in un paziente. La somministrazione dei medicamenti nel contesto della presente invenzione avviene tramite metodi noti nell’arte, preferibilmente tramite iniezione via intra-venosa. I medicamenti preparati secondo l’invenzione possono essere presenti in una composizione come sopra descritto. Said medicament, in order to increase the number of cells belonging to the hematopoietic system or to increase the efficacy of the hematopoietic system, preferably those belonging to the lymphocyte system, is preferably prepared so as to be applied according to methods known in the art for the transfusion of cells in a patient. The administration of medicaments in the context of the present invention takes place by methods known in the art, preferably by injection via intra-venous. The medicaments prepared according to the invention can be present in a composition as described above.

Un altro oggetto dell’invenzione è il legante che si lega alla proteina GSG1L come sopra menzionato. Detto legante può essere preparato come sopra descritto. In una realizzazione preferita detto legante è presente in una composizione farmaceutica con eccipienti e/o adiuvanti. Another object of the invention is the ligand that binds to the GSG1L protein as mentioned above. Said binder can be prepared as described above. In a preferred embodiment, said binder is present in a pharmaceutical composition with excipients and / or adjuvants.

Il legante secondo l’invenzione può essere usato come medicamento. The binder according to the invention can be used as a medicament.

In una realizzazione, detto legante può essere usato per l'attivazione dello stato metabolico e/o dello stato fisiologico di cellule ematopoietiche, preferibilmente cellule del sistema immunitario ed ancor più preferibilmente cellule del sistema immunitario adattativo. Alternativamente, lo stesso legante può essere usato nella preparazione di un medicamento per attivare lo stato metabolico e/o fisiologico delle cellule ematopoietiche, preferibilmente cellule del sistema immunitario ed ancor più preferibilmente cellule del sistema immunitario adattativo. Preferibilmente le cellule ematopoietiche sono presenti in un sistema ematopoietico. In detta realizzazione, il legante secondo l’invenzione è preferibilmente somministrato per via parenterale, preferibilmente via iniezione ed ancora più preferibilmente via intra-venosa o intra-arteriale. E’ ancora più preferibile se detto medicamento contiene eccipienti e/o adiuvanti. In detta realizzazione, preferibilmente detto medicamento per attivare le cellule del sistema immunitario adattativo è combinato con un vaccino da somministrare ed il medicamento è usato per incrementare la probabilità di una risposta positiva ad un vaccino. In detta realizzazione preferita, il medicamento opzionalmente contiene inibitori del sistema immunitario innato, come ad es. CI inibitori. In one embodiment, said ligand can be used for the activation of the metabolic state and / or the physiological state of hematopoietic cells, preferably cells of the immune system and even more preferably cells of the adaptive immune system. Alternatively, the same binder can be used in the preparation of a medicament to activate the metabolic and / or physiological state of hematopoietic cells, preferably cells of the immune system and even more preferably cells of the adaptive immune system. Preferably the hematopoietic cells are present in a hematopoietic system. In said embodiment, the binder according to the invention is preferably administered parenterally, preferably via injection and even more preferably via intra-venous or intra-arterial. It is even more preferable if the drug contains excipients and / or adjuvants. In said embodiment, preferably said medicament for activating the cells of the adaptive immune system is combined with a vaccine to be administered and the medicament is used to increase the probability of a positive response to a vaccine. In said preferred embodiment, the medicament optionally contains inhibitors of the innate immune system, such as e.g. CI inhibitors.

In un’altra realizzazione preferita, detto legante può essere usato per la disattivazione dello stato metabolico e/o dello stato fisiologico di cellule ematopoietiche, preferibilmente cellule del sistema immunitario ed ancor più preferibilmente cellule del sistema immunitario adattativo. Alternativamente, lo stesso legante può essere usato nella preparazione di un medicamento per disattivare lo stato metabolico e/o fisiologico delle cellule ematopoietiche, preferibilmente cellule del sistema immunitario, ancor più preferibilmente cellule del sistema immunitario adattativo. Più preferibilmente la disattivazione del sistema immunitario adattativo coinvolge inibire o rallentare la risposta immunitaria adattativa. Preferibilmente le cellule ematopoietiche sono presenti in un sistema ematopoietico. In detta realizzazione, il medicamento contenente il legante secondo l’invenzione è preferibilmente somministrato per via parenterale, preferibilmente via iniezione ed ancora più preferibilmente via intravenosa o intra-arteriale. E’ ancora più preferibile se detto medicamento contiene eccipienti o immuno-depressivi. In another preferred embodiment, said ligand can be used for the deactivation of the metabolic state and / or the physiological state of hematopoietic cells, preferably cells of the immune system and even more preferably cells of the adaptive immune system. Alternatively, the same binder can be used in the preparation of a medicament to deactivate the metabolic and / or physiological state of hematopoietic cells, preferably cells of the immune system, even more preferably cells of the adaptive immune system. More preferably, the deactivation of the adaptive immune system involves inhibiting or slowing the adaptive immune response. Preferably the hematopoietic cells are present in a hematopoietic system. In said embodiment, the medicament containing the binder according to the invention is preferably administered parenterally, preferably by injection and even more preferably by intravenous or intra-arterial route. It is even more preferable if the drug contains excipients or immuno-depressants.

Preferibilmente, detta inibizione o rallentamento della risposta immunitaria adattativa coinvolge patologie considerate di eziologia autoimmune, come ad es. flogosi, diabete, sclerosi multipla o patologie ove si vuole eliminare la distinzione immunitaria tra self e non-self, come ad esempio in patologie come Grafi v Host Disease (GVHD). Preferably, said inhibition or slowing of the adaptive immune response involves pathologies considered to be of autoimmune etiology, such as e.g. inflammation, diabetes, multiple sclerosis or pathologies where the immune distinction between self and non-self is to be eliminated, such as in pathologies such as Grafi v Host Disease (GVHD).

In una realizzazione preferita di detto uso per disattivare lo stato metabolico e/o fisiologico delle cellule ematopoietiche, i leganti per GSG1L sono legati a sostanze nocive. La sostanza nociva è legata al legante, come ad es. tramite un anticorpo secondario, ed è tossica o comunque adattata allo scopo di eliminare l’obiettivo del legante, cioè la cellula esprimente GSG1L sulla sua superficie. Detta sostanza tossica può essere una tossina o un atomo radioattivo, come ad esempio iodio 131 o un enzima che può successivamente essere coinvolto in un sistema di terapia monoclonale noto nell’arte come ADEPT. In a preferred embodiment of said use for deactivating the metabolic and / or physiological state of the hematopoietic cells, the ligands for GSG1L are bound to harmful substances. The harmful substance is bound to the binder, such as eg. through a secondary antibody, and is toxic or otherwise adapted in order to eliminate the target of the ligand, that is, the cell expressing GSG1L on its surface. Said toxic substance can be a toxin or a radioactive atom, such as iodine 131 or an enzyme that can subsequently be involved in a monoclonal therapy system known in the art as ADEPT.

In un’altra realizzazione preferita, il legante per GSG1L è legato ad un marcatore, come ad esempio un anticorpo secondario associato ad una sonda, come ad es. una sonda fluorescente, fosforescente o radioattiva, legata sull’ anticorpo secondario. In another preferred embodiment, the ligand for GSG1L is linked to a marker, such as a secondary antibody associated with a probe, such as e.g. a fluorescent, phosphorescent or radioactive probe, linked to the secondary antibody.

Detto legante legato ad un marcatore può essere usato per la diagnosi qualitativa o quantitativa dello stato metabolico e/o dello stato fisiologico di cellule ematopoietiche, preferibilmente linfociti B. Alternativamente, lo stesso legante può essere usato per la preparazione di un medicamento per valutare qualitativamente o quantitativamente lo stato metabolico e/o fisiologico di cellule ematopoietiche, preferibilmente linfociti B. Detta valutazione dello stato metabolico e/o fisiologico delle cellule secondo rinvenzione può essere fatta ex vivo o in vivo. Preferibilmente le cellule ematopoietiche sono presenti in un sistema ematopoietico. Il numero di cellule che esprimono GSG1L indica quanto è attivo lo stato metabolico e/o fisiologico delle cellule secondo l’invenzione. La distribuzione di GSG1L su ogni cellula indica quanto è attivo lo stato metabolico e/o fisiologico delle cellule secondo l’invenzione. La posizione in vivo dei leganti che è correlata alla posizione delle cellule secondo l’invenzione, indica invece i siti corporei di maggior affluenza per le cellule del sistema ematopoietico, preferibilmente quello immunitario, ancor più preferibilmente quelle dei linfociti B. Said ligand linked to a marker can be used for the qualitative or quantitative diagnosis of the metabolic state and / or the physiological state of hematopoietic cells, preferably B lymphocytes. Alternatively, the same ligand can be used for the preparation of a medicament to evaluate qualitatively or quantitatively, the metabolic and / or physiological state of hematopoietic cells, preferably B lymphocytes. Said evaluation of the metabolic and / or physiological state of the cells according to the invention can be made ex vivo or in vivo. Preferably the hematopoietic cells are present in a hematopoietic system. The number of cells expressing GSG1L indicates how active the metabolic and / or physiological state of the cells according to the invention is. The distribution of GSG1L on each cell indicates how active the metabolic and / or physiological state of the cells is according to the invention. The in vivo position of the ligands which is related to the position of the cells according to the invention, instead indicates the body sites of greatest affluence for the cells of the hematopoietic system, preferably the immune system, even more preferably those of B lymphocytes.

Esempio 1 - Isolamento di sottopopolazioni di cellule secondo l’invenzione che esprimono GSG1L in sangue periferico Example 1 - Isolation of subpopulations of cells according to the invention that express GSG1L in peripheral blood

Isolamento di cellule mononucleate dal sangue periferico Isolation of mononuclear cells from peripheral blood

1. Un campione di 10 mi di sangue periferico di donatore sano è stato diluito 1 :50 in una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). 1. A 10 mL sample of healthy donor peripheral blood was diluted 1: 50 in phosphate buffered saline (PBS).

2. 15 mi di Ficoll-Hypaque (densità l,077g/l) sono stati introdotti in una Falcon da 50 mi e poi 30 mi di sangue periferico di donatore sano è stato stratificato sopra. Il sangue è stato fatto scendere molto lentamente per non perturbare l’interfaccia. L’operazione è stata ripetuta fino ad esaurire tutto il campione. 3. La Falcon è poi stata centrifugata a 1600 rpm per 30 min a temperatura ambiente, senza freno. Le cellule mononucleate (PBMC) si sono posizionate all’interfaccia tra Ficoll-Hypaque e plasma. Detto anello di PBMC è stato raccolto e trasferito in una Falcon da 50 mi. 2. 15ml of Ficoll-Hypaque (density 1.077g / L) was introduced into a 50ml Falcon and then 30ml of healthy donor peripheral blood was layered on top. The blood was let down very slowly so as not to disturb the interface. The operation was repeated until the entire sample was exhausted. 3. The Falcon was then centrifuged at 1600 rpm for 30 min at room temperature, without brake. Mononuclear cells (PBMCs) are positioned at the interface between Ficoll-Hypaque and plasma. Said PBMC ring was collected and transferred to a 50ml Falcon.

4. I PBMC sono stati lavati 2 volte con 50ml PBS contenente 5% siero umano normale (NHS) centrifugando per 10 min a 1200 rpm. 4. The PBMCs were washed 2 times with 50ml PBS containing 5% normal human serum (NHS) by centrifuging for 10 min at 1200 rpm.

5. Il pellet è poi stato lavato con 50ml PBS 5% NHS centrifugando per 10 min a 800 rpm. 5. The pellet was then washed with 50ml PBS 5% NHS by centrifuging for 10 min at 800 rpm.

6. I PBMC risultanti in un pellet alla fine di passaggio 5 sono stati risospesi in 10-30 mi di PBS 5% NHS a temperatura ambiente. 6. The resulting PBMCs in a pellet at the end of step 5 were resuspended in 10-30 ml of PBS 5% NHS at room temperature.

Isolamento di cellule secondo Pinvenzione da PBMC Isolation of cells according to the invention from PBMC

1. Si sono contate le cellule con una camera di Burker e si sono colorate 5xl0<5>-1 x 10<6>di PBMC per campione. 1. Cells were counted with a Burker chamber and stained 5 x 10 <5> -1 x 10 <6> PBMC per sample.

2. I campioni sono stati incubati per 20 min a temperatura ambiente con PBS 50% NHS. 2. Samples were incubated for 20 min at room temperature with 50% NHS PBS.

3. I campioni sono stati centrifugati per 3 min a 1500 rpm e, senza lavare, sono stati incubati per 10 min in un bagno di ghiaccio con l’antisiero contro GSG1L diluito 1:50 e 1:150 in 100 microlitri di PBS 5% NHS.. 3. The samples were centrifuged for 3 min at 1500 rpm and, without washing, incubated for 10 min in an ice bath with the antiserum against GSG1L diluted 1:50 and 1: 150 in 100 microliters of 5% PBS. NHS ..

L’antisiero GSG1L è stato fatto secondo metodi noti nell’arte, immunizzando topi con l’intera struttura primaria di GSG1L. Campioni per il controllo negativo sono stati incubati per 10 min in ghiaccio con antiserio di un topo non immunizzato per settare la negatività della colorazione finale dell’immagine risultante dal FACS. The GSG1L antiserum was made according to methods known in the art, immunizing mice with the entire primary structure of GSG1L. Samples for the negative control were incubated for 10 min on ice with antiserum from a non-immunized mouse to set the negativity of the final staining of the image resulting from the FACS.

4. Le cellule dei campioni centrifugati sono state lavate due volte con PBS 5% NHS, rimuovendo il sumatante dopo centrifugazione per 3 min a 1500 rpm e risospendendo con PBS 5% NHS. 4. Cells from centrifuged samples were washed twice with 5% NHS PBS, removing the sump after centrifugation for 3 min at 1500 rpm and resuspending with 5% NHS PBS.

5. Dette cellule risospese sono state poi incubate di nuovo per 10 min in un bagno di ghiaccio con Goat-anti-mouse IgG-PE (Southern Biotech"), un noto anticorpo “secondario” con il fluorocromo ficoeritrina (PE) legato su di esso, diluito 1 : 100 in 100 microlitri PBS 5% NHS. 5. Said resuspended cells were then incubated again for 10 min in an ice bath with Goat-anti-mouse IgG-PE (Southern Biotech "), a known" secondary "antibody with phycoerythrin (PE) bound fluorochrome. it, diluted 1: 100 in 100 μl PBS 5% NHS.

13. Le cellule sono poi state lavate 2 volte con PBS 5% NHS, centrifugando per 3 min 1500 rpm, e risospendendo con PBS 5% NHS. 13. The cells were then washed twice with 5% NHS PBS, centrifuging for 3 min at 1500 rpm, and resuspending with 5% NHS PBS.

14. Al pellet risospeso e’ stato aggiunto 12 microgrammi per campione di mlgG (immunoglobuline di topo) e incubato per almeno 60 min in ghiaccio. 14. 12 micrograms per mlgG sample (mouse immunoglobulins) was added to the resuspended pellet and incubated for at least 60 min on ice.

15. Le cellule sono state incubate per 10 min in un bagno di ghiaccio con m-antihCD19Cychrome (BD Biosci ences<®>), un noto anticorpo monoclonale con il fluorocromo PE-Cy5 legato su di esso e con mouse-anti-hCD3FITC (BD Biosciences<®>), un noto anticorpo monoclonale con il fluorocromo fluoresceina (FITC) legato su di esso e con e con mouse-anti-hCD56APC (BD Biosciences ), un noto anticorpo monoclonale con il fluorocromo Alloficocianina legato su di esso. 15. Cells were incubated for 10 min in an ice bath with m-antihCD19Cychrome (BD Biosci ences <®>), a known monoclonal antibody with PE-Cy5 dye bound on it and mouse-anti-hCD3FITC ( BD Biosciences <®>), a known monoclonal antibody with fluorescein fluorochrome (FITC) bound on it and with and with mouse-anti-hCD56APC (BD Biosciences), a known monoclonal antibody with the fluorochrome allophycocyanin bound on it.

16. Infine le cellule colorate sono state lavate (centrifugando a 1500 rpm per 3 min) con PBS 10% NHS e rispospese in 500 microlitri per l’acquisizione al FACSCanto<®>. 16. Finally, the stained cells were washed (by centrifuging at 1500 rpm for 3 min) with PBS 10% NHS and reposted in 500 microliters for acquisition at FACSCanto <®>.

17. La macchina BecktonDickinson-FACS<®>è stata operata secondo i protocolli noti nell’arte e menzionati in Current Protocols in Immunology (2001), John Wiley and Sons Ine., Unità 5.4.1-5.4.22 per dare i risultati ottenuti che sono esposti in Figura 1. 17. The BecktonDickinson-FACS <®> machine was operated according to the protocols known in the art and mentioned in Current Protocols in Immunology (2001), John Wiley and Sons Ine., Unit 5.4.1-5.4.22 to give the results obtained which are shown in Figure 1.

Dai risultati, si vede che la proteina GSG1L è chiaramente presente sulla superficie di una percentuale di linfociti B che è tra 46 e 47%, ma non è chiaramente presente sulla superficie di altre cellule appartenenti al sistema immunitario, come ad es. cellule NK (cellule marcate con CD56 e riportate in Figura lb)iii) di Figura I). From the results, it can be seen that the GSG1L protein is clearly present on the surface of a percentage of B lymphocytes which is between 46 and 47%, but is not clearly present on the surface of other cells belonging to the immune system, such as eg. NK cells (cells labeled with CD56 and shown in Figure 1b) iii) of Figure I).

Per verificare le indicazioni sulfespressione di GSG1 L date dalfesperimento FACS qui sopra riportato, si è fatto un esperimento di controllo con RT-PCR per monitorare l’espressione del gene GSG1L nelle cellule mononucleate del sangue periferico totali. To verify the indications on the expression of GSG1 L given by the FACS experiment reported above, a control experiment was carried out with RT-PCR to monitor the expression of the GSG1L gene in total peripheral blood mononuclear cells.

A tal fine dalle cellule purificate tramite Ficoll è stato estratto l’RNA tramite il kit Qiagen (cat# 74104), secondo il protocollo del fornitore e il cDNA è stato prodotto a partire da 100 ng di RNA, mediante l’enzima RetroScript, (Ambion, cat# 1710) secondo il protocollo del fornitore. For this purpose, the RNA was extracted from the cells purified by Ficoll using the Qiagen kit (cat # 74104), according to the protocol of the supplier and the cDNA was produced starting from 100 ng of RNA, by means of the RetroScript enzyme, ( Ambion, cat # 1710) according to the supplier's protocol.

2 μΐ di cDNA sono stati utilizzati per l’analisi tramite RT-PCR, mediante primers specifici per GSG1L. I primers vengono descritti secondo lo standard intemazionale WIPO Standard ST.25 e la loro espressione è stata sviluppata con il programma Patent-In 3.3. Detta descrizione delle sequenze sopra menzionata è allegata al testo della presente invenzione. I primers sono : 2 μΐ of cDNA were used for analysis by RT-PCR, using specific primers for GSG1L. The primers are described according to the international standard WIPO Standard ST.25 and their expression has been developed with the Patent-In 3.3 program. Said description of the above-mentioned sequences is attached to the text of the present invention. The primers are:

GSG1L fw: SEQ ID NO. 1 GSG1L fw: SEQ ID NO. 1

GSG1L rev: SEQ ID NO. 2 GSG1L rev: SEQ ID NO. 2

Le condizioni usate per la RT-PCR con i primers specifici per GSG1L sono le seguenti: The conditions used for RT-PCR with GSG1L specific primers are as follows:

cDNA: 2 microlitri cDNA: 2 microliters

SEQ ID NO.l (lO microM): 1 microlitro SEQ ID NO.l (10 microM): 1 microliter

SEQ ID NO. 2 (10 microM): 1 microlitro SEQ ID NO. 2 (10 microM): 1 microliter

2X Taq PCR Master Mix (Qiagen, cat #201443): 25 microlitri 2X Taq PCR Master Mix (Qiagen, cat # 201443): 25 microliters

Acqua sterile: fino al raggiungimento di un volume finale di 50 microlitri. Sterile water: until a final volume of 50 microliters is reached.

Condizioni dei cicli termici della PCR: PCR thermal cycling conditions:

94°C. 3 min 94 ° C. 3 min

30 cicli di 94°C per 30 sec; 55°C per 30 sec e 72°C per 30 sec 30 cycles of 94 ° C for 30 sec; 55 ° C for 30 sec and 72 ° C for 30 sec

72°C, 10 min 72 ° C, 10 min

∞, 4°C ∞, 4 ° C

I risultati sono dimostrati in Figura 2, ove si vede chiaramente un’espressione del gene GSG1L nelle cellule mononucleate del sangue periferico. The results are demonstrated in Figure 2, where an expression of the GSG1L gene is clearly seen in peripheral blood mononuclear cells.

SEQUENCE LISTING SEQUENCE LISTING

<110> ISTITUTO NAZIONALE DI GENETICA MOLECOLARE - INGM <110> NATIONAL INSTITUTE OF MOLECULAR GENETICS - INGM

<120> Cellule ematopoietiche esprimenti la proteina GSGlL e i leganti per la proteina GSGlL <120> Hematopoietic cells expressing GSGlL protein and binding for GSGlL protein

<130> 21I019712IT10 <130> 21I019712IT10

<160> 2 <160> 2

<170> Patentin version 3.3 <170> Patentin version 3.3

<210> 1 <210> 1

<211> 21 <211> 21

<212> DNA <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> fw primer for GSGlL <223> fw primer for GSGlL

<400> 1 <400> 1

tctgtcacca cgctcaactc c tctgtcacca cgctcaactc c

<210> 2 <210> 2

<211> 21 <211> 21

<212> DNA <212> DNA

<213> Artificial <213> Artificial

<220> <220>

<223> Rev primer for GSGlL <223> Rev primer for GSGlL

<400> 2 <400> 2

aagacccagc actgtcggtt c aagacccagc actgtcggtt c

Claims

CLAIMS 1. Ex vivo hematopoietic cells characterized by the expression of GSG1L on the surface of these cells.

The cells according to claim 1, wherein the cells are B lymphocytes.

A composition comprising cells according to claim 1 or 2.

A method for preparing cells according to claim 1 or 2, said method comprising the following steps: prepare a cell sample comprising hematopoietic cells, determine if GSG1L is present on the cell surface in the sample with a binder for GSG1L e isolate from the sample the cells on which GSG1L is present.

The method according to claim 4, further comprising a step in which lymphocyte cells, preferably B lymphocytes, are isolated from the hematopoietic cell sample.

The cells according to claim 1 or 2 for use as a medicament.

The cells according to claim 1 or 2 for use in the treatment or prevention of diseases the treatment of which requires an increase in the number of cells belonging to the hematopoietic system.

8. The cells according to claim 1 or 2 for use in the treatment or prevention of diseases whose cure requires an increase in the efficacy of the hematopoietic system.

The cells according to claim 7 or 8, wherein the hematopoietic system is the adaptive immune system.

10. A method of detecting a patient's immune status comprising the following step: - determining the percentage of cells according to claim 2 with respect to the total population of B lymphocytes included in a sample of hematopoietic cells of said patient.

The method according to claim 10, wherein an antigen is presented to hematopoietic cells comprising B lymphocytes prior to said step in which the percentage of cells is determined.

12. A ligand for the GSG1L protein.

13. The binder according to claim 12, said binder being a monoclonal antibody.

A pharmaceutical composition comprising the binder according to claim 12 or 13.

The binder according to claim 12 or 13 for use as a medicament.

The ligand according to claim 12 or 13 for use in the activation of the metabolic state and / or physiological state of hematopoietic cells.

The ligand according to claim 16, wherein the hematopoietic cells are present in a hematopoietic system.

The binder according to claim 16 or 17, wherein the binder is used in combination with a vaccine.

The binder according to claim 12 or 13, wherein the binder is bound to a harmful substance.

The ligand according to claim 12 or 13 or 19 for use in deactivating the metabolic state and / or physiological state of hematopoietic cells.

The ligand according to claim 20, wherein the hematopoietic cells are present in a hematopoietic system.

The ligand according to claim 20 or 21, wherein the deactivation of the metabolic state and / or the physiological state of the hematopoietic cells involves an inhibition or slowdown of the adaptive immune response.

The ligand according to claim 22, wherein the adaptive immune response is involved in an autoimmune pathology.

The ligand according to claim 22, wherein the adaptive immune response is involved in Graphs; vs Host Disease.

The binder according to claim 12 or 13, wherein the binder is bonded to a marker.

The ligand according to claim 12 or 13 or 25 for use in the qualitative or quantitative diagnosis of the metabolic state and / or physiological state of hematopoietic cells, preferably the metabolic state and / or physiological state of B lymphocytes.

The ligand according to claim 26, wherein the hematopoietic cells are present in a hematopoietic system.