ITMI20080366A1 - ANTRACENEDIONIC AND AZA-ANTRACENEDIONAL DERIVATIVES AS AGENTS ABLE TO INHIBIT THE AGGREGATION OF BETA AMYLOID PEPTIDES - Google Patents
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Description
“DERIVATI ANTRACENEDIONICI E AZA-ANTRACENEDIONICI COME AGENTI CAPACI DI INIBIRE L’AGGREGAZIONE DI PEPTIDI BETA AMILOIDI” "ANTHRACENEDIONIC AND AZA-ANTHRACENEDIONIC DERIVATIVES AS AGENTS ABLE TO INHIBIT THE AGGREGATION OF BETA AMYLOID PEPTIDES"
La presente invenzione ha per oggetto composti a struttura antracenedionica o azaantracenedionica come agenti capaci di inibire l’aggregazione di peptidi e proteine amiloidi, in particolare di inibire la fibrillogenesi e l’accumulo di oligomeri tossici associati a amiloidosi. The present invention relates to compounds with an anthracenedionic or azaantracenedionic structure as agents capable of inhibiting the aggregation of peptides and amyloid proteins, in particular to inhibit fibrillogenesis and the accumulation of toxic oligomers associated with amyloidosis.
Stato della tecnica State of the art
Numerosi disturbi comunemente noti come amiloidosi sono causati principalmente da un processo di misfolding proteico associato alla formazione di aggregati extracellulari tossici e insolubili, chiamati fibrille<1>. I depositi fibrillari di amiloidosi neurodegenerative come la malattia di Alzheimer (AD) sono costituiti principalmente da peptidi beta-amiloidi (Aβ), che derivano dal processing proteolitico di una proteina precursore dell’amiloide (APP). In particolare, il peptide a 42 aminoacidi Aβ1-42, normalmente espresso nel cervello umano e presente sia nel plasma sia nel fluido cerebrospinale umani in condizioni fisiologiche, svolge un ruolo critico nell’eziologia di AD<2-4>. Qui la formazione di placche avviene attraverso un processo di polimerizzazione nucleazione-dipendente, in cui i monomeri Aβ1-42si autoassemblano omotipicamente in oligomeri intermedi solubili e parzialmente strutturati, che costituiscono una popolazione eterogenea di aggregati globulari e metastabili<5-6>. Numerous disorders commonly known as amyloidosis are mainly caused by a process of protein misfolding associated with the formation of toxic and insoluble extracellular aggregates, called fibrils <1>. The fibrillar deposits of neurodegenerative amyloidosis such as Alzheimer's disease (AD) consist mainly of beta-amyloid peptides (Aβ), which derive from the proteolytic processing of an amyloid precursor protein (APP). In particular, the 42 amino acid peptide Aβ1-42, normally expressed in the human brain and present both in plasma and in human cerebrospinal fluid under physiological conditions, plays a critical role in the etiology of AD <2-4>. Here the formation of plaques occurs through a nucleation-dependent polymerization process, in which the Aβ1-42 monomers self-assemble homotypically into soluble and partially structured intermediate oligomers, which constitute a heterogeneous population of globular and metastable aggregates <5-6>.
Sebbene le prime dimostrazioni di neurotossicità indotta da Aβ in vitro e in vivo siano state inizialmente associate alle fibrille insolubili<7>, più recentemente numerosi gruppi hanno focalizzato l’attenzione verso questi oligomeri transienti anziché verso le fibrille, in quanto essi sembrano essere i principali effettori della malattia<8>. Di conseguenza, la cosiddetta “ipotesi oligomerica” considera gli assemblati oligomeri solubili Aβ<9,10>e le protofibrille<11>come i primi mediatori tossici della disfunzione neuronale nell’AD e l’interesse è stato focalizzato progressivamente verso gli aggregati a peso molecolare più elevato. Although the first demonstrations of Aβ-induced neurotoxicity in vitro and in vivo were initially associated with insoluble fibrils <7>, more recently numerous groups have focused attention on these transient oligomers rather than on fibrils, as they appear to be the main ones. disease effectors <8>. Consequently, the so-called "oligomeric hypothesis" considers the assembled soluble oligomers Aβ <9.10> and protofibrils <11> as the first toxic mediators of neuronal dysfunction in AD and interest has been progressively focused on weight aggregates higher molecular.
A queste specie intermedie sono stati attribuiti nomi diversi, fra cui Aβ, Aβ-oligomeri a basso peso molecolare<12>, aggregati amorfi, micelle, ligandi diffusibili Aβ-derivati (ADDLs), come pure aggregati prefibrillari, protofilamenti o protofibrille (PFs)<13,14>. Different names have been given to these intermediate species, including Aβ, low molecular weight Aβ-oligomers <12>, amorphous aggregates, micelles, Aβ-derived diffusible ligands (ADDLs), as well as prefibrillar aggregates, protofilaments or protofibrils (PFs) <13.14>.
È da notare che questi aggregati solubili sono stati individuati nel cervello e nel fluido cerebrospinale di pazienti con AD a concentrazioni superiori a quelle osservate in pazienti non affetti da demenza<10,15>. Alcuni modelli di simulazione della fibrillogenesi di Aβ confermano che la formazione iniziale di una piccola fibrilla comporta variazioni conformazionali multiple, in cui aggregati amorfi solubili precedono la comparsa di un nucleo fibrillare<16>. Of note, these soluble aggregates have been detected in the brain and cerebrospinal fluid of AD patients at concentrations higher than those seen in non-dementia patients <10.15>. Some simulation models of Aβ fibrillogenesis confirm that the initial formation of a small fibril involves multiple conformational changes, in which soluble amorphous aggregates precede the appearance of a fibrillar nucleus <16>.
In lavori pionieristici, gli ADDLs sono stati definiti come oligomeri con una massa tra 17 e 42 kDa (tetrameri-decameri)<5>. Recentemente gli ADDLs vengono considerati complessi a peso molecolare (PM) superiore<12>e comprendono tutti gli oligomeri solubili diffusibili di Aβ con PM tra 10 e 100 kDa,<13-17>o specie maggiori con peso molecolare ≥ 24-meri<18-20>. Studi in vivo su topi transgenici hanno supportato l’importanza degli assemblati di Abeta dodecamerici, stabilendo che l’accumulo extracellulare di un oligomero solubile da 56 kDa di Aβ1-42è responsabile dei deficit della memoria e probabilmente contribuisce al declino cognitivo associato a AD<21>. In pioneering work, ADDLs have been defined as oligomers with a mass between 17 and 42 kDa (tetramers-decamers) <5>. Recently, ADDLs are considered complexes with molecular weight (MW) higher <12> and include all diffusible soluble oligomers of Aβ with PM between 10 and 100 kDa, <13-17> or major species with molecular weight ≥ 24-mers <18 -20>. In vivo studies in transgenic mice supported the importance of dodecameral Abeta assemblies, establishing that extracellular accumulation of a 56 kDa soluble Aβ1-42 oligomer is responsible for memory deficits and likely contributes to AD-associated cognitive decline <21 >.
Nonostante l’enorme interesse per l’attività biologica e patologica, come pure per la localizzazione in vivo di questi oligomeri transienti, non è ancora chiaro se essi siano intermedi obbligati della formazione di fibrille<11>o siano specie separate e distinte<22>che popolano una via alternativa di aggregazione<23>. Inoltre, rimane ancora da chiarire il meccanismo con cui oligomeri solubili di amiloide e protofibrille esercitano la loro patogenicità<8>. Despite the enormous interest in the biological and pathological activity, as well as in the in vivo localization of these transient oligomers, it is still unclear whether they are obligate intermediates of fibril formation <11> or are separate and distinct species <22> that populate an alternative way of aggregation <23>. Furthermore, the mechanism by which soluble amyloid oligomers and protofibrils exert their pathogenicity remains to be elucidated <8>.
Il legame non-covalente degli oligomeri e la loro natura transitoria intrinseca rendono difficili sia gli studi di caratterizzazione del processo di enucleazione-allungamento sia la quantificazione delle specie polimerizzanti nel tempo, fino alla formazione delle fibrille. La dissociazione indotta da SDS ostacola il frazionamento e la quantificazione mediante SDS-PAGE, la diffrazione dei raggi X è preclusa poiché Abeta non cristallizza, e l’uso di tecniche spettroscopiche, compresi CD, FT-IR or NMR, fornisce soltanto dati sulla popolazione media. Le fasi iniziali di folding e assemblaggio di Aβ sono state descritte mediante crosslinking fotoindotte (PICUP) e poi quantificate tramite cromatografia a esclusione dimensionale<24,25>. I risultati ottenuti, nonostante la presenza di un vero e proprio legame chimico, erano paragonabili a quelli determinati mediante spettrometria a mobilità ionica (IMS) combinata a spettrometria di massa<26,27>. Tra questi studi seminali è stato recentemente sviluppato un metodo di elettroforesi capillare (CE) combinata con ultrafiltrazione che consente la determinazione quantitativa della distribuzione dimensionale degli oligomeri e il monitoraggio di eventuali variazioni mentre ha luogo il processo di deposizione fibrillare in vitro<28>. Tramite IMS, PICUP e CE è stato valutato un equilibrio tra differenti popolazioni di oligomeri e confermato il meccanismo di nucleazioneallungamento. The non-covalent bond of the oligomers and their intrinsic transient nature make both the characterization studies of the enucleation-elongation process and the quantification of the polymerizing species difficult over time, up to the formation of fibrils. SDS-induced dissociation hinders fractionation and quantification by SDS-PAGE, X-ray diffraction is precluded as Abeta does not crystallize, and the use of spectroscopic techniques, including CD, FT-IR or NMR, provides population data only average. The initial steps of Aβ folding and assembly were described by photoinduced crosslinking (PICUP) and then quantified by size exclusion chromatography <24.25>. The results obtained, despite the presence of a real chemical bond, were comparable to those determined by ion mobility spectrometry (IMS) combined with mass spectrometry <26.27>. Among these seminal studies a method of capillary electrophoresis (CE) combined with ultrafiltration has recently been developed which allows the quantitative determination of the size distribution of oligomers and the monitoring of any variations while the fibrillar deposition process takes place in vitro <28>. A balance between different populations of oligomers was assessed by IMS, PICUP and CE and the nucleation and elongation mechanism confirmed.
È importante il fatto che CE abbia consentito anche l’identificazione di dodecameri solubili o aggregati di dimensione superiore come principali effettori di neurotossicità sulle cellule<28>tramite un semplice metodo di separazione che funziona in soluzione, in assenza di agenti caotropici, e senza la formazione di legami covalenti. It is important that CE also allowed the identification of soluble dodecamers or larger aggregates as major neurotoxicity effectors on <28> cells by a simple separation method that works in solution, in the absence of chaotropic agents, and without the formation of covalent bonds.
Ciò fa di questo metodo uno strumento potenzialmente unico per valutare l’effetto di piccole molecole sulle cinetiche di formazione di tali specie tossiche e di conseguenza sulla formazione di fibrille. This makes this method a potentially unique tool for evaluating the effect of small molecules on the kinetics of formation of these toxic species and consequently on the formation of fibrils.
L’immuno-neutralizzazione di oligomeri di Aβ<6,29,30>o il targeting specifico con piccole molecole<23,31-34>sono stati esplorati soltanto recentemente. The immuno-neutralization of Aβ oligomers <6.29.30> or the specific targeting with small molecules <23.31-34> have only recently been explored.
Sono stati descritti numerosi bloccanti della formazione di fibrille Aβ compresi, tra gli altri, la rifampicina, peptidi derivati da Aβ, sali d’ammonio quaternari e alcune sostanze naturali contenenti polifenoli<38,39>. Tuttavia, il classico screening per inibitori dell’aggregazione che impiega saggi specifici per le fibrille non identificherebbe necessariamente gli inibitori dell’oligomerizzazione. Finora soltanto pochi composti hanno mostrato di inibire selettivamente l’oligomerizzazione di Aβ, e cioè la curcumina, derivati della β-ciclodestrina, estratti di Ginkgo biloba, composti benzilici come la vanillina<23>, derivati dell’idrossianilina<31>o composti di tipo fenolftaleinico<33>. In particolare, queste eccezioni comprendono anche i naftalen solfonati<40>, il rosso Congo<23>e una piccola molecola solfonata in commercio col nome di Alzhemed®<41>. Numerous blockers of the formation of Aβ fibrils have been described including, among others, rifampicin, peptides derived from Aβ, quaternary ammonium salts and some natural substances containing polyphenols <38.39>. However, the classic screening for aggregation inhibitors using specific assays for fibrils would not necessarily identify oligomerization inhibitors. So far only a few compounds have been shown to selectively inhibit the oligomerization of Aβ, namely curcumin, β-cyclodextrin derivatives, Ginkgo biloba extracts, benzyl compounds such as vanillin <23>, hydroxyaniline derivatives <31> or compounds of phenolphthalein type <33>. In particular, these exceptions also include naphthalen sulfonates <40>, Congo red <23> and a small sulfonated molecule commercially under the name of Alzhemed® <41>.
Alcuni dei richiedenti , in un lavoro precedente<42>, hanno riscontrato che la suramina, una molecola solfonata che mostra una certa somiglianza strutturale col rosso Congo, rallentava le cinetiche di refolding della β2-microglobulina, una proteina responsabile dell’amiloidosi da dialisi. Sebbene la suramina non eserciti alcun effetto sulla formazione di fibrille, un composto simile alla suramina, chiamato 573, scelto da uno screening di una libreria di composti chimici, inibisce la fibrillogenesi della β2-microglobulina in vitro in modo dose-dipendente e accelera la cinetica di refolding. Some of the applicants, in a previous work <42>, found that suramine, a sulfonated molecule that shows a certain structural similarity to Congo red, slowed the refolding kinetics of β2-microglobulin, a protein responsible for dialysis amyloidosis. Although suramine has no effect on fibril formation, a suramine-like compound called 573, selected from a screening of a chemical compound library, inhibits β2-microglobulin fibrillogenesis in vitro in a dose-dependent manner and accelerates kinetics. by refolding.
Descrizione dell’invenzione Description of the invention
Si è ora trovato che derivati a struttura antracenedionica o aza-antracenedionica, in particolare mitoxantrone e pixantrone, sono particolarmente efficaci nell’inibire l’aggregazione amiloide, in particolare di inibire la fibrillogenesi e l’accumulo di oligomeri tossici. It has now been found that derivatives with an anthracenedionic or aza-anthracenedionic structure, in particular mitoxantrone and pixantrone, are particularly effective in inhibiting amyloid aggregation, in particular to inhibit fibrillogenesis and the accumulation of toxic oligomers.
Mitoxantrone e pixantrone sono due derivati antrachinonici strutturalmente correlati ad attività anti-tumorale. Il mitoxantrone, descritto in US 4,197,249, è disponibile in commercio sia come anti-tumorale sia come immunomodulatore nella terapia della sclerosi multipla.<43>Mitoxantrone and pixantrone are two anthraquinone derivatives structurally related to anti-tumor activity. Mitoxantrone, described in US 4,197,249, is commercially available both as an anti-tumor and as an immunomodulator in the therapy of multiple sclerosis. <43>
Il pixantrone, descritto in US 5,587,382 US 5,717,099, US 5,506,232, US 5,616,709, ha recentemente ottenuto l’approvazione regolatoria privilegiata dalla Food and Drug Administration per il trattamento di linfoma non-Hodgkin recidivato o refrattario in combinazione con fludarabina e rituximab. Il pixantrone è attualmente usato in forma di dimaleato. Pixantrone, described in US 5,587,382 US 5,717,099, US 5,506,232, US 5,616,709, has recently obtained privileged regulatory approval from the Food and Drug Administration for the treatment of relapsed or refractory non-Hodgkin's lymphoma in combination with fludarabine and rituximab. Pixantrone is currently used in the form of dimaleate.
L’attività di mitoxantrone e pixantrone nell’inibizione della fibrillogenesi e dell’aggregazione amiloide è stata studiata nei test riportati a titolo di esempio nella sezione sperimentale, in confronto a suramina e al composto 573. The activity of mitoxantrone and pixantrone in the inhibition of fibrillogenesis and amyloid aggregation was studied in the tests reported as an example in the experimental section, in comparison with suramine and compound 573.
Le formule di struttura di mitoxantrone, pixantrone, suramina e composto 573 sono riportate in Figura 1. The structural formulas of mitoxantrone, pixantrone, suramine and compound 573 are shown in Figure 1.
Dai dati ottenuti nel corso degli esperimenti effettuati, è possibile concludere che i composti a struttura antracenedionica o aza-antracenedionica, in particolare il pixantrone, possono essere utili come agenti in grado di contrastare i meccanismi patogenetici di amiloidosi, in particolare di amiloidosi neurodegenerative quali la malattia di Alzheimer. From the data obtained during the experiments carried out, it is possible to conclude that compounds with an anthracenedionic or aza-anthracenedionic structure, in particular pixantrone, may be useful as agents capable of counteracting the pathogenetic mechanisms of amyloidosis, in particular of neurodegenerative amyloidosis such as Alzheimer's disease.
L’invenzione riguarda pertanto l’uso di mitoxantrone, pixantrone o loro derivati per la preparazione di medicamenti per il trattamento o la prevenzione di amiloidosi, in particolare della malattia di Alzheimer. The invention therefore relates to the use of mitoxantrone, pixantrone or their derivatives for the preparation of medicaments for the treatment or prevention of amyloidosis, in particular of Alzheimer's disease.
Con il termine di “derivati”, si intendono sali farmaceuticamente accettabili, pro-farmaci che possano ad esempio facilitare il passaggio della barriera emato-encefalica o comunque migliorare le caratteristiche farmacocinetiche oppure ancora composti con modifiche strutturali in grado di ridurre il potenziale citotossico e/o gli effetti collaterali, mantenendo l’attività di inibizione della fibrillogenesi. La preparazione di sali e pro-farmaci rientra nell’ambito delle comuni conoscenze degli esperti del settore. Analogamente, le modifiche strutturali sono alla portata di chimici farmaceutici che possono avvalersi di studi consolidati di correlazione struttura-attività nonché delle tecniche di screening descritte nella presente invenzione. The term "derivatives" means pharmaceutically acceptable salts, pro-drugs that can, for example, facilitate the passage of the blood-brain barrier or in any case improve the pharmacokinetic characteristics or compounds with structural modifications capable of reducing the cytotoxic potential and / or side effects, maintaining the fibrillogenesis inhibition activity. The preparation of salts and pro-drugs falls within the common knowledge of industry experts. Similarly, structural modifications are within the reach of pharmaceutical chemists who can make use of established structure-activity correlation studies as well as the screening techniques described in the present invention.
Per i previsti impieghi terapeutici, mitoxantrome, pixantrone e i loro derivati potranno essere opportunamente formulati in composizioni farmaceutiche adatte alla somministrazione orale o parenterale. I dosaggi clinici efficaci potranno essere agevolmente determinati in base a parametri di farmaco-tossicologia e agli studi clinici preliminari secondo metodologie consolidate. Essi potranno variare entro ampi limiti e saranno inoltre dipendenti da diversi fattori quali peso, sesso età del paziente e dalla gravità della patologia. Si ritiene comunque a titolo indicativo che dosaggi efficaci possano essere compresi tra circa 10 e circa 100 mg/Kg/die, somministrati preferibilmente per via parenterale, da ripetersi a distanza di alcuni giorni o settimane secondo cicli o protocolli analoghi a quelli usati negli studi clinici attualmente in corso. Nel caso del pixantrone, forme di somministrazione particolarmente vantaggiose sono descritte in EP 1503797 e in EP 1221940. For the intended therapeutic uses, mitoxantrome, pixantrone and their derivatives may be suitably formulated in pharmaceutical compositions suitable for oral or parenteral administration. Effective clinical dosages can be easily determined on the basis of pharmaco-toxicology parameters and preliminary clinical studies according to established methodologies. They will vary within wide limits and will also depend on various factors such as weight, sex, age of the patient and the severity of the disease. However, it is believed as an indication that effective dosages can be between about 10 and about 100 mg / kg / day, preferably administered parenterally, to be repeated after a few days or weeks according to cycles or protocols similar to those used in clinical studies. currently in progress. In the case of pixantrone, particularly advantageous forms of administration are described in EP 1503797 and EP 1221940.
L’invenzione sarà ora descritta in maggiore dettaglio nella seguente sezione sperimentale, a titolo di esempio. The invention will now be described in greater detail in the following experimental section, by way of example.
PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART
Materiali Materials
Il peptide Aβ1-42base libera è stato sintetizzato dal Dott. M.O. Lively presso il Core Protein Laboratory della Wake Forest University (Winston-Salem, USA). La suramina è stata acquistata dalla Sigma-Aldrich e il composto 573 è una delle 200 molecole solfonate e/o suramino-simili, appartenenti ad una libreria chimica selezionata e acquistata dalla ditta Specs (Delft, Olanda). The free Aβ1-42base peptide was synthesized by Dr. M.O. Lively at the Core Protein Laboratory of Wake Forest University (Winston-Salem, USA). Suramine was purchased from Sigma-Aldrich and compound 573 is one of 200 sulfonated and / or suramine-like molecules, belonging to a chemical library selected and purchased by the company Specs (Delft, Holland).
NaH2PO4, Na2HPO4e Na2CO3sono stati forniti dalla Merck (Darmstadt, Germania), e il NaCl dalla Carlo Erba Reagenti (Milano, Italia). La Tioflavina T (ThT) e l’acetonitrile sono stati acquistati dalla Sigma. NaH2PO4, Na2HPO4 and Na2CO3 were supplied by Merck (Darmstadt, Germany), and the NaCl by Carlo Erba Reagenti (Milan, Italy). Thioflavine T (ThT) and acetonitrile were purchased from Sigma.
Le soluzioni tampone sono state preparate quotidianamente utilizzando acqua deionizzata, filtrate su membrane Millipore (Bedford, MA, USA) di 0,45 µm e degasate tramite sonicazione. L’acqua deionizzata è stata prodotta utilizzando il sistema Millipore Direct-Q TM. Buffer solutions were prepared daily using deionized water, filtered on 0.45 µm Millipore membranes (Bedford, MA, USA) and degassed by sonication. Deionized water was produced using the Millipore Direct-Q TM system.
Le membrane (Microcon YM-100) per centrifugazione sono della Millipore. The membranes (Microcon YM-100) for centrifugation are from Millipore.
Strumentazione Instrumentation
Elettroforesi capillare. Tutti gli esperimenti in CE sono stati eseguiti con una strumentazione Agilent Technologies 3D dotata di un detector a serie di diodi (Waldbronn, Germania). Capillary electrophoresis. All CE experiments were performed with Agilent Technologies 3D instrumentation equipped with a diode array detector (Waldbronn, Germany).
I dati sono stati analizzati utilizzando un computer HP Vectra XA/166, software Chemstation A.10.01. Il capillare di silice fusa non ricoperto (diametro interno 50 µm, diametro esterno 360 µm, lunghezza totale 53 cm, lunghezza effettiva 44,5 cm) è della Polymicro Technologies (Phoenix, Arizona, USA). Applicando una pressione di 1 bar all’inlet del capillare, ogni nuovo capillare è stato condizionato con NaOH 1 M per 60 min, con acqua per 60 min e con il tampone di corsa (sodio fosfato 80 mM, pH 7.4) per 90 min. Il tampone fosfato è stato preparato miscelando soluzioni 80 mM di disodio idrogeno fosfato e sodio diidrogeno fosfato di grado analitico, fino all’ottenimento del pH desiderato. Per il condizionamento fra le corse elettroforetiche sono stati flussati nel capillare SDS 50 mM<35>e acqua per 1,5 min e tampone di corsa per 2 min. L’iniezione dei campioni è stata eseguita applicando una pressione di 50 mbar per 8 s. I capillari sono stati termostatati ad aria a 25°C e le separazioni sono state eseguite applicando un voltaggio di 16 kV (corrente = 75 - 78 µA) all’anodo, polo di iniezione del campione. Le lunghezze d’onda di acquisizione dei dati sono state 200 e 280 nm. Data were analyzed using an HP Vectra XA / 166 computer, Chemstation A.10.01 software. The uncoated fused silica capillary (internal diameter 50 µm, external diameter 360 µm, total length 53 cm, effective length 44.5 cm) is from Polymicro Technologies (Phoenix, Arizona, USA). By applying a pressure of 1 bar to the capillary inlet, each new capillary was conditioned with 1 M NaOH for 60 min, with water for 60 min and with running buffer (80 mM sodium phosphate, pH 7.4) for 90 min. The phosphate buffer was prepared by mixing 80 mM solutions of disodium hydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate of analytical grade, until the desired pH was obtained. For conditioning between electrophoretic runs, 50 mM <35> SDS capillary and water for 1.5 min and run buffer for 2 min were flushed into the capillary SDS. The injection of the samples was performed by applying a pressure of 50 mbar for 8 s. The capillaries were thermostated with air at 25 ° C and the separations were performed by applying a voltage of 16 kV (current = 75 - 78 µA) to the anode, the sample injection pole. The data acquisition wavelengths were 200 and 280 nm.
Saggio fluorimetrico con tioflavina T. È stato seguito il classico metodo spettrofluorimetrico di LeVine<36>. Soluzioni di ThT sono state preparate in tampone fosfato 0,025 M, pH 6.0 e conservate a 4°C in contenitori ricoperti di alluminio per non più di 2 settimane, a causa della loro fotosensibilità. Le analisi sono state eseguite con un fluorimetro Perkin-Elmer LS 55 (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA) utilizzando una cuvetta in quarzo da 700 µL. I dati sono stati analizzati con il software FLWinLab. La fluorescenza è stata misurata alle lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 440 nm (ampiezza finestra 5 nm) e di 485 nm (ampiezza finestra 10 nm), tempo di integrazione 2 s. Fluorimetric assay with thioflavin T. The classical LeVine <36> spectrofluorimetric method was followed. Solutions of ThT were prepared in 0.025 M phosphate buffer, pH 6.0 and stored at 4 ° C in aluminum-coated containers for no more than 2 weeks, due to their photosensitivity. Analyzes were performed with a Perkin-Elmer LS 55 fluorometer (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA) using a 700 µL quartz cuvette. The data were analyzed with the FLWinLab software. The fluorescence was measured at the excitation and emission wavelengths of 440 nm (5 nm window width) and 485 nm (10 nm window width) respectively, integration time 2 s.
Preparazione del campione Sample preparation
Aβ1-42è stato preparato secondo la procedura descritta in Sabella et al.<28>Una soluzione peptidica non filtrata è stata separata in aliquote, poi liofilizzate e conservate a -20°C. Soluzioni madre di mitoxantrone, suramina e 573 1 mM sono state preparate in tampone fosfato 20 mM, pH 7.4 e diluite nello stesso tampone. Soluzioni madre di pixantrone 1 mM sono state preparate in sodio cloruro 0,9% e diluite nello stesso solvente. Tutte le soluzioni sono state conservate al buio e a -20°C. Aβ1-42 was prepared according to the procedure described in Sabella et al. <28> An unfiltered peptide solution was separated into aliquots, then lyophilized and stored at -20 ° C. Stock solutions of mitoxantrone, suramine and 573 1 mM were prepared in 20 mM phosphate buffer, pH 7.4 and diluted in the same buffer. Stock solutions of 1 mM pixantrone were prepared in 0.9% sodium chloride and diluted in the same solvent. All solutions were stored in the dark and at -20 ° C.
Ogni aliquota di peptide liofilizzata è stata risospesa in 80 µL di tampone fosfato 20 mM, pH 7.4 (peptide controllo 100 µM). Quando si sono eseguiti studi di co-incubazione, il peptide liofilizzato è stato risospeso in una soluzione con il composto appropriatamente diluito, per avere una concentrazione del peptide 100 µM e ottenere differenti rapporti peptide/analita, relativi al monomero di Aβ1-42(1:0.01, 1:0.1, 1:0.25, 1:0.5, 1:1, 1:2 per mitoxantrone e pixantrone e 1:10 per suramina e 573). Each aliquot of lyophilized peptide was resuspended in 80 µL of 20 mM phosphate buffer, pH 7.4 (100 µM control peptide). When co-incubation studies were performed, the lyophilized peptide was resuspended in a solution with the appropriately diluted compound, to have a peptide concentration of 100 µM and to obtain different peptide / analyte ratios, relative to the monomer of Aβ1-42 (1 : 0.01, 1: 0.1, 1: 0.25, 1: 0.5, 1: 1, 1: 2 for mitoxantrone and pixantrone and 1:10 for suramine and 573).
I campioni sono stati sonicati per 3 min con un bagno ad ultrasuoni e poi centrifugati (per 20 min a 3326 x g, 4°C). Una breve sonicazione favorisce la rottura di aggregati preformati e aumenta la concentrazione del peptide.<37>Negli esperimenti in CE, i surnatanti di tutti i campioni sono stati immediatamente iniettati (t0) o lasciati a temperatura ambiente e iniettati a differenti tempi trascorsi dal prelievo del surnatante. The samples were sonicated for 3 min with an ultrasonic bath and then centrifuged (for 20 min at 3326 x g, 4 ° C). A brief sonication favors the breakdown of preformed aggregates and increases the concentration of the peptide. <37> In the experiments in CE, the supernatants of all the samples were immediately injected (t0) or left at room temperature and injected at different times after collection of the supernatant.
Per gli esperimenti con le membrane Microcon il surnatante è stato ultrafiltrato con filtri a cut-off di 100000 Da per 20 min a 3326 x g. Per ottenere un volume appropriato da iniettare e per ristabilire la concentrazione originale sono stati aggiunti 80 µL di tampone fosfato 20 mM, pH 7.4 al campione trattenuto dal filtro. For the experiments with Microcon membranes the supernatant was ultrafiltered with filters at a cut-off of 100000 Da for 20 min at 3326 x g. To obtain an appropriate volume to inject and to restore the original concentration, 80 µL of 20 mM phosphate buffer, pH 7.4, was added to the sample retained by the filter.
Studi per determinare la quantità esatta del campione trattenuto non sono stati eseguiti. Tuttavia, il confronto tra gli elettroferogrammi ottenuti prima e dopo filtrazione indicano che le concentrazioni delle specie iniettate in CE sono confrontabili. Studies to determine the exact amount of the retained sample have not been performed. However, the comparison between the electropherograms obtained before and after filtration indicate that the concentrations of the species injected into the EC are comparable.
Nel saggio con ThT, il peptide controllo e i campioni co-incubati con le diverse molecole sono stati preparati come descritto sopra e incubati a 25°C. In the ThT assay, the control peptide and samples co-incubated with the different molecules were prepared as described above and incubated at 25 ° C.
30 µL di surnatante di tutti i campioni sono stati diluiti con 470 µL di ThT 25 µM e la fluorescenza è stata immediatamente letta a 25°C. 30 µL of supernatant of all samples was diluted with 470 µL of ThT 25 µM and the fluorescence was immediately read at 25 ° C.
Microscopia Elettronica a Trasmissione Transmission Electron Microscopy
Per ciascun campione, una piccola goccia (10 µL) di sospensione o soluzione è stata applicata ad una retina di nickel Formvar (200 mesh) ricoperta di carbone (Electron Microscopy Sciences, Washington, PA). Il campione è stato lasciato sedimentare sul film di carbone per 15 min, l’eccesso della soluzione è stato eliminato tramite adsorbimento su un filtro di carta. La colorazione negativa è stata eseguita con 10 µL di una soluzione 2% (p/v) di acetato di uranile (Electron Microscopy Sciences, EMS, Washington, PA) e il campione è stato trasferito al microscopio elettronico per essere esaminato. I campioni sono stati analizzati utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione Philips CM12, operando a 80 kV. Le immagini elettroniche dei campioni a colorazione negativa sono state fotografate su film Kodak. For each sample, a small drop (10 µL) of suspension or solution was applied to a carbon-coated Formvar nickel retina (200 mesh) (Electron Microscopy Sciences, Washington, PA). The sample was left to settle on the carbon film for 15 min, the excess of the solution was eliminated by adsorption on a paper filter. Negative staining was performed with 10 µL of a 2% (w / v) solution of uranyl acetate (Electron Microscopy Sciences, EMS, Washington, PA) and the sample was transferred to the electron microscope for examination. The samples were analyzed using a Philips CM12 transmission electron microscope, operating at 80 kV. Electronic images of the negatively stained samples were photographed on Kodak film.
Saggio colorimetrico MTT MTT colorimetric assay
Colture cellulari IMR32 (neuroblastoma umano) sono state fatte crescere in RPMI contenente il 10% (v/v) di siero fetale bovino, penicillina (100 U mL<-1>), streptomicina (100 µg mL<-1>) e glutammina 2 mM. IMR32 cell cultures (human neuroblastoma) were grown in RPMI containing 10% (v / v) fetal bovine serum, penicillin (100 U mL <-1>), streptomycin (100 µg mL <-1>) and glutamine 2 mM.
Le cellule sono state tenute a 37°C in un’atmosfera umidificata di CO25% e aria 95%. I materiali usati per le colture cellulari sono stati acquistati dalla Celbio (Milano, Italia). The cells were kept at 37 ° C in a humidified atmosphere of CO25% and air 95%. The materials used for cell cultures were purchased from Celbio (Milan, Italy).
L’attività della deidrogenasi mitocondriale che riduce il bromuro di metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT, Sigma, St Louis, MO, USA) è stata utilizzata per determinare l’attività ossidoriduttiva cellulare, iniziale indicatrice di morte cellulare, in un saggio colorimetrico quantitativo. Al giorno 0 le cellule IMR32 sono state poste su piastra con una densità di 5x10<4>cellule per pozzetto su una sistema a 96 pozzetti. Il giorno seguente, le cellule sono state incubate con gli analiti a diversa concentrazione in presenza o assenza di Aβ1-42per 24 h a 37°C e poi sono state esposte ad una soluzione di MTT in PBS (1 mg mL<-1>). Le soluzioni analizzate non interferiscono con il saggio colorimetrico MTT. Dopo 4 ore di incubazione con MTT e trattamento con SDS per 24 ore, la riduzione delle cellule vive è stata quantificata utilizzando un BIO-RAD (Modello 550; Hercules, CA, USA). The activity of mitochondrial dehydrogenase that reduces methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma, St Louis, MO, USA) was used to determine the cellular redox activity, an initial indicator of cell death, in a quantitative colorimetric assay. On day 0 the IMR32 cells were placed on a plate with a density of 5x10 <4> cells per well on a 96-well system. The following day, the cells were incubated with analytes at different concentrations in the presence or absence of Aβ1-42 for 24 h at 37 ° C and then exposed to a solution of MTT in PBS (1 mg mL <-1>). The analyzed solutions do not interfere with the MTT colorimetric assay. After 4 hours of incubation with MTT and treatment with SDS for 24 hours, the reduction of live cells was quantified using a BIO-RAD (Model 550; Hercules, CA, USA).
Risultati Results
Contrariamente alle tecniche spettroscopiche, il metodo di separazione CE precedentemente sviluppato da Sabella et al.<28>si avvale di una tecnica separativa e pertanto fornisce in linea teorica informazioni su quando una molecola interagisce con l’oligomero, durante la sua formazione a condizione che esso sia sufficientemente stabile e separato da altre specie lungo il percorso di fibrillogenesi. In breve, il precedente lavoro evidenziava che l’intermedio oligomerico corrispondente al picco B in figura 2(a) ha un peso molecolare superiore a 50 kDa ed è neurotossico, mentre oligomeri a PM inferiore che migrano sotto il picco A non lo sono<28>. Utilizzando filtri a membrana con un cut off di 100 kDa e iniettando il campione ritenuto (figura 2(b)), si può evincere che sotto il picco B migrano oligomeri con PM notevolmente superiori a 50 kDa. Riportando in grafico le aree normalizzate del picco B e del picco A<44>divise per le aree totali dei picchi, è stato dedotto un equilibrio tra i due picchi, che suggerisce come l’aumentare dell’area del picco B a spese del picco A corrisponda a una conversione da ologomeri più piccoli a oligomeri di maggiori dimesioni, fino alla deposizione di fibrille<28>. Il tempo di migrazione degli standard dei farmaci analizzati, nelle condizioni operative CE è molto lento in tutti i casi (maggiore di 30 min) e non interferisce coi tempi di corsa elettroforetica delle specie peptidiche. Contrary to spectroscopic techniques, the EC separation method previously developed by Sabella et al. <28> makes use of a separative technique and therefore theoretically provides information on when a molecule interacts with the oligomer, during its formation provided that it is sufficiently stable and separated from other species along the fibrillogenesis path. In short, previous work highlighted that the oligomeric intermediate corresponding to peak B in figure 2 (a) has a molecular weight greater than 50 kDa and is neurotoxic, while lower MW oligomers that migrate below peak A are not <28 >. Using membrane filters with a cut off of 100 kDa and injecting the retained sample (Figure 2 (b)), it can be deduced that oligomers with PM considerably higher than 50 kDa migrate below peak B. Plotting the normalized areas of peak B and peak A <44> divided by the total areas of the peaks, an equilibrium was deduced between the two peaks, which suggests that the area of peak B increases at the expense of the peak. A corresponds to a conversion from smaller hologomers to larger oligomers, up to the deposition of fibrils <28>. The migration time of the standards of the analyzed drugs, under the CE operating conditions, is very slow in all cases (greater than 30 min) and does not interfere with the electrophoretic run times of the peptide species.
Si è proceduto quindi a co-incubare Aβ1-42con le piccole molecole selezionate e monitora il profilo elettroforetico nel tempo. Le figure 2 (c) e (d), prese dopo 9 ore dalla solubilizzazione dei campioni peptidici addizionati di un eccesso rispettivamente di suramina o di 573, rivelano che non viene influenzata l’area normalizzata del picco B. L’analisi nel tempo (dati non mostrati) indica che il profilo elettroforetico in entrambi i casi segue un profilo qualitativo e quantitativo molto simile a quello del campione controllo studiato precedentemente. Inoltre, la comparsa precoce di spikes nell’elettroferogramma<45>a un tempo di migrazione non-riproducibile e frequentemente durante la migrazione del picco (figura 2 (d)), indica che si verifica una micro-precipitazione probabilmente indotta dalla ridotta solubilità del campione oppure da una accelerazione della deposizione di fibrille. Aβ1-42 was then co-incubated with the selected small molecules and the electrophoretic profile was monitored over time. Figures 2 (c) and (d), taken 9 hours after solubilization of the peptide samples added with an excess of suramine or 573 respectively, reveal that the normalized area of peak B is not affected. The analysis over time ( data not shown) indicates that the electrophoretic profile in both cases follows a qualitative and quantitative profile very similar to that of the previously studied control sample. Furthermore, the early appearance of spikes in the electropherogram <45> at a non-reproducible migration time and frequently during peak migration (Figure 2 (d)), indicates that micro-precipitation occurs probably induced by the reduced solubility of the sample or by an acceleration of the deposition of fibrils.
Al contrario, il mitoxantrone e il pixantrone, studiati inizialmente a un rapporto peptide/composto di 1:2, inducono un effetto eclatante sul picco B già agli stadi precoci del processo di fibrillogenesi. In presenza del picco B del mitoxantrone l’area è ridotta a quasi un terzo in 9 ore (figura 2(e) e 3(b)) a spese di un aumento degli oligomeri più piccoli che migrano sotto il picco A. Dopo 12 ore, gli oligomeri più grandi sotto il picco B sono totalmente esauriti (figura 3(c)), il campione è ancora solubile e gli oligomeri più piccoli (picco A) sono individuabili e stabili per altre 12 ore (figura 3(d)). Quindi, mentre il campione è ancora visibilmente limpido, a successive iniezioni nel tempo in CE non si rivela più alcun picco La figura 3 mostra questo trend in confronto con il campione controllo, e in generale si può osservare che, nonostante questi oligomeri che migrano sotto il picco B abbiano un’area paragonabile a quella ottenuta al tempo zero in presenza e in assenza di mitoxantrone a concentrazione 200 microM (Figure 3(a) e 3(a’)), in presenza del farmaco essi diminuiscono fino a scomparsa dopo alcune ore dall’incubazione, anziché accumularsi nel tempo. Si potrebbe ipotizzare che l’interazione tra il mitoxantrone e il peptide blocchi e riduca l’accumulo di oligomeri grandi, disgregandoli a favore degli oligomeri a basso PM e che a loro volta sono degradati a specie minori o a monomeri che non assorbono nell’ultravioletto. Contemporaneamente, non si può escludere che sotto il picco B possano migrare specie con PM molto superiori a 100 kDa, vale a dire quelle protofibrille che, da veri intermedi fibrillari, possono sia formare fibrille sia dissociarsi in specie a basso peso molecolare<11>. On the contrary, mitoxantrone and pixantrone, initially studied at a peptide / compound ratio of 1: 2, induce a striking effect on the B peak already at the early stages of the fibrillogenesis process. In the presence of the mitoxantrone B peak, the area is reduced to nearly a third in 9 hours (Figure 2 (e) and 3 (b)) at the expense of an increase in smaller oligomers migrating below peak A. After 12 hours , the larger oligomers below peak B are completely depleted (figure 3 (c)), the sample is still soluble and the smaller oligomers (peak A) are detectable and stable for another 12 hours (figure 3 (d)). Therefore, while the sample is still visibly clear, no peak is revealed at subsequent injections over time in CE Figure 3 shows this trend in comparison with the control sample, and in general it can be observed that, despite these oligomers migrating under peak B have an area comparable to that obtained at time zero in the presence and absence of mitoxantrone at a concentration of 200 microM (Figures 3 (a) and 3 (a ')), in the presence of the drug they decrease until they disappear after a few hours after incubation, rather than accumulating over time. It could be hypothesized that the interaction between mitoxantrone and the peptide blocks and reduces the accumulation of large oligomers, breaking them down in favor of low PM oligomers and which in turn are degraded to minor species or to monomers that do not absorb in the ultraviolet. At the same time, it cannot be excluded that species with PM much higher than 100 kDa may migrate below peak B, i.e. those protofibrils which, as true fibrillar intermediates, can both form fibrils and dissociate into low molecular weight species <11>.
In presenza di pixantrone allo stesso rapporto di concentrazione, l’oligomero tossico a PM >100 kDa è già completamente depleto a tempo zero (figura 4(a)); nel profilo elettroforetico sono ancora presenti oligomeri a basso PM (A) a una concentrazione stabile fino a 24 ore. Ancora, analogamente a quanto osservato per i campioni co-incubati con mitoxantrone, le soluzioni limpide non mostrano picchi elettroforetici. Il, pixantrone sembra avere lo stesso effetto finale del mitoxantrone, ma con una cinetica molto più veloce. In the presence of pixantrone at the same concentration ratio, the toxic oligomer at PM> 100 kDa is already completely depleted at zero time (Figure 4 (a)); low PM (A) oligomers are still present in the electrophoretic profile at a stable concentration for up to 24 hours. Again, similarly to what was observed for samples co-incubated with mitoxantrone, the clear solutions did not show electrophoretic peaks. The, pixantrone appears to have the same final effect as the mitoxantrone, but with much faster kinetics.
Allo scopo di valutare la più bassa concentrazione attiva del pixantrone, il composto più promettente, è stato studiato il suo profilo in CE incubandolo col peptide Aβ1-42a rapporti di concentrazione inferiori. In figura 4 (b) e 4 (c) sono riportati gli elettroferogrammi ottenuti a t0, dove è evidente che esiste una correlazione inversa tra la popolazione del picco B e le concentrazioni di pixantrone. La concentrazione sub-stechiometrica più bassa, riferita al monomero Aβ1-42, che mostra di influire sull’area del picco B è quella riportata in Figura 4 (c) (50 microM di pixantrone aggiunto, rapporto peptide/analita 1:0.5), dove l’elettroferogramma al tempo zero è quantitativamente confrontabile con il campione controllo (figure 4 (c) e 3 (a’)). L’area del picco B mantiene lo stesso valore nel tempo per due giorni (dati non mostrati) e, sorprendentemente, altre iniezioni nel tempo della soluzione campione limpida non rivelano alcun picco elettroforetico. In order to evaluate the lowest active concentration of pixantrone, the most promising compound, its profile in EC was studied by incubating it with the peptide Aβ1-42a lower concentration ratios. Figures 4 (b) and 4 (c) show the electropherograms obtained at t0, where it is evident that there is an inverse correlation between the population of peak B and the concentrations of pixantrone. The lowest sub-stoichiometric concentration, referred to monomer Aβ1-42, which shows to affect the area of peak B is that shown in Figure 4 (c) (50 microM of pixantrone added, peptide / analyte ratio 1: 0.5), where the electropherogram at time zero is quantitatively comparable with the control sample (figures 4 (c) and 3 (a ')). The area of peak B maintains the same value over time for two days (data not shown) and, surprisingly, other injections of the clear sample solution over time do not reveal any electrophoretic peak.
Concentrazioni inferiori di farmaco saggiate (1, 10, e 25 µM) non producevano alcuna differenza significativa nel profilo CE di una soluzione di peptide 100 microM, se confrontate con il controllo. Lower drug concentrations tested (1, 10, and 25 µM) produced no significant difference in the EC profile of a 100 microM peptide solution when compared to the control.
Test della Tioflavina T e dati di microscopia elettronica a trasmissione: effetto degli inibitori della oligomerizzazione sulla fibrillogenesi di Abeta 1-42 Thioflavine T test and transmission electron microscopy data: effect of oligomerization inhibitors on Abeta fibrillogenesis 1-42
Uno dei metodi utilizzati più frequentemente per studiare la polimerizzazione di Aβ è basato sulla variazione di fluorescenza della ThT quando si lega ad aggregati di amiloide. Sono stati quindi condotti degli esperimenti per valutare se l’effetto sulla formazione di oligomeri precedentemente descritto per il mitoxantrone e il pixantrone corrispondesse a un’attività anti-fibrillogenesi. Molto recentemente è stato proposto un modello ipotetico per l’aggregazione di Aβ1-42in vitro, utilizzando l’immunoreattività di anticorpi specifici per certi oligomeri in un saggio dot blot;sulla base di tre differenti classi di composti si sono identificati inibitori dell’oligomerizzazione, della fibrillogenesi o di entrambe<23>. Le due molecole attive, il mitoxantrone e il pixantrone, sono state quindi saggiate utilizzando il saggio di fluorescenza della ThT e le intensità di fluorescenza di Aβ1-42in assenza o in presenza dei composti (rapporto peptide/analita 1:2) sono state monitorate per due settimane. Come evidente da figura 5, il peptide controllo mostra un aumento sigmoidale del legame di ThT, tipico dei processi di fibrillogenesi, con un lag time di assemblaggio di circa 4 giorni, raggiungendo un plateau in ~ 200 h (8 giorni). È chiaramente mostrato anche che, in presenza di mitoxantrone o di pixantrone, il segnale di fluorescenza di ThT non aumenta, il che porta alla conclusione che questi composti inibiscano anche la fibrillogenesi. Questo comportamento dei campioni coincubati era associato all’assenza di torbidità, che invece è sempre visibile a occhio nudo nel campione controllo di Aβ1-42dopo 6-7 giorni dalla solubilizzazione, come riportato precedentemente<28>. One of the most frequently used methods to study Aβ polymerization is based on the fluorescence variation of ThT when it binds to amyloid aggregates. Experiments were then conducted to evaluate whether the effect on the formation of oligomers previously described for mitoxantrone and pixantrone corresponded to an anti-fibrillogenesis activity. Very recently a hypothetical model for the aggregation of Aβ1-42 in vitro has been proposed, using the immunoreactivity of specific antibodies for certain oligomers in a dot blot assay; on the basis of three different classes of compounds, inhibitors of oligomerization have been identified, fibrillogenesis or both <23>. The two active molecules, mitoxantrone and pixantrone, were then tested using the ThT fluorescence assay and the Aβ1-42 fluorescence intensities in the absence or presence of the compounds (peptide / analyte ratio 1: 2) were monitored for two weeks. As evident from Figure 5, the control peptide shows a sigmoidal increase in ThT binding, typical of fibrillogenesis processes, with an assembly lag time of about 4 days, reaching a plateau in ~ 200 h (8 days). It is also clearly shown that, in the presence of mitoxantrone or pixantrone, the fluorescence signal of ThT does not increase, leading to the conclusion that these compounds also inhibit fibrillogenesis. This behavior of the coincubated samples was associated with the absence of turbidity, which instead is always visible to the naked eye in the Aβ1-42 control sample after 6-7 days from solubilization, as previously reported <28>.
Alla fine dell’analisi CE, vale a dire quando non veniva individuato più i alcun picco elettroforetico, i campioni sono stati osservati al microscopio elettronico. At the end of the EC analysis, that is, when no electrophoretic peak was detected anymore, the samples were observed under the electron microscope.
Quando la co-incubazione non produce alcun effetto sulle specie oligomeriche migranti sotto il picco B in confronto al controllo, come nei casi della suramina (figura 6 (b)) e 573 (figura 6 (c)), è stata osservata la presenza di filamenti lunghi (lunghezza micrometrica), lineari, non ramificati che presentano un diametro di circa 10 nm e corrispondenti alla caratteristica di classiche fibrille di amiloide. Tutti i campioni co-incubati con mitoxantrone e pixantrone (figure 6 (d), (e), (f), (g)) come descritto sopra, hanno rivelato la presenza di aggregati amorfi anziché di fibrille. Nel complesso, questi dati mostrano che la deplezione di oligomeri, più o meno rapida, indotta da un rapporto peptide/pixantrone 1:2 (o mitoxantrone) rispettivamente, o anche una stabilizzazione della crescita degli oligomeri indotta da un rapporto 1:1 o 1:0.5 peptide/pixantrone, corrispondono a una chiara attività antifibrillogenica. Se ne deduce pertanto che la disgregazione o la stabilizzazione di questa specie impedisca al processo di fibrillogenesi di arrivare a completezza. Si potrebbe anche ipotizzare che per innescare la fibrillogenesi si debba raggiungere una concentrazione soglia di oligomero. When co-incubation produces no effect on migrating oligomeric species below peak B compared to control, as in the cases of suramine (figure 6 (b)) and 573 (figure 6 (c)), the presence of long filaments (micrometric length), linear, unbranched with a diameter of about 10 nm and corresponding to the characteristic of classic amyloid fibrils. All samples co-incubated with mitoxantrone and pixantrone (figures 6 (d), (e), (f), (g)) as described above, revealed the presence of amorphous aggregates rather than fibrils. Overall, these data show that more or less rapid oligomer depletion induced by a 1: 2 peptide / pixantrone ratio (or mitoxantrone) respectively, or even a stabilization of oligomer growth induced by a 1: 1 or 1 ratio. : 0.5 peptide / pixantrone, correspond to a clear antifibrillogenic activity. It can therefore be deduced that the disintegration or stabilization of this species prevents the fibrillogenesis process from reaching completeness. It could also be hypothesized that a threshold concentration of oligomer must be reached to trigger fibrillogenesis.
Prove di tossicità Toxicity tests
La citotossicità è un’attività correlata all’inibizione della fibrillogensi di Aβ<46>. Sebbene una vera ricerca di un trattamento efficace di AD sia al momento prematura, una semplice attività antifibrillogenica dovrebbe essere supportata da un aumento parallelo della vitalità cellulare. Questa considerazione è particolarmente rilevante nel contesto del mitoxantrone e del pixantrone, due farmaci che inibiscono la fibrillogenesi e ostacolano parallelamente l’accumulo degli oligomeri tossici. Cytotoxicity is an activity related to the inhibition of Aβ <46> fibrillogens. Although a genuine search for an effective AD treatment is currently premature, a simple antifibrillogenic activity should be supported by a parallel increase in cell viability. This consideration is particularly relevant in the context of mitoxantrone and pixantrone, two drugs that inhibit fibrillogenesis and simultaneously hinder the accumulation of toxic oligomers.
Abbiamo pertanto studiato gli effetti di queste due molecole a diverse concentrazioni sulla vitalità della stessa linea cellulare di neuroblastoma (IMR32) usata precedentemente<28>, che è sensibile alla morte cellulare indotta da Aβ in modo dose-dipendente. La vitalità cellulare è stata controllata utilizzando il saggio con MTT. Come mostratonel lavoro precedente, negli esperimenti in vitro le concentrazioni saggiate sono state diluite 10 volte, poiché esse mostravano un’elevata tossicità alla diluizione usata in CE (dati non mostrati). Tuttavia, negli esperimenti con beta-amiloide, il rapporto tra peptide e analita è stato sempre mantenuto come in CE. We therefore investigated the effects of these two molecules at different concentrations on the viability of the same neuroblastoma cell line (IMR32) used previously <28>, which is sensitive to Aβ-induced cell death in a dose-dependent manner. Cell viability was checked using the MTT assay. As shown in the previous work, in the in vitro experiments the tested concentrations were diluted 10 times, since they showed high toxicity at the dilution used in EC (data not shown). However, in the experiments with beta-amyloid, the relationship between peptide and analyte was always maintained as in CE.
In accordo con il loro profilo farmacologico e tossicologico, entrambi il mitoxantrone e il pixantrone inducono una significativa perdita della vitalità cellulare (figura 7 (a) e 7 (b)). Questi farmaci mostrano un diverso andamento di tossicità alle diluizioni saggiate. Il mitoxantrone induce una significativa perdita della vitalità cellulare in modo dose-dipendente: aumentando la concentrazione, il composto sembra essere più tossico sulle cellule IMR32 (mitoxantrone 10 µM: 46,5% ± 7,3; mitoxantrone 20 µM: 54,9% ± 0,4). Al contrario, la tossicità indotta dal pixantrone è dose-indipendente. In accordance with their pharmacological and toxicological profile, both mitoxantrone and pixantrone induce a significant loss of cell viability (figure 7 (a) and 7 (b)). These drugs show a different trend in toxicity at the dilutions tested. Mitoxantrone induces a significant loss of cell viability in a dose-dependent manner: by increasing the concentration, the compound appears to be more toxic on IMR32 cells (mitoxantrone 10 µM: 46.5% ± 7.3; mitoxantrone 20 µM: 54.9% ± 0.4). In contrast, pixantrone-induced toxicity is dose-independent.
Poiché il pixantrone sembra essere globalmente meno tossico del mitoxantrone ed è in grado di interferire con le specie a peso molecolare più elevato di Aβ1-42con una cinetica più veloce del mitoxantrone, è stato valutato il ruolo biologico del pixantrone sulla tossicità indotta da Aβ1-42. In accordo coi risultati precedenti<28>, una soluzione 10 µM di Aβ1-42ha mostrato un chiaro grado di tossicità (perdita della vitalità cellulare: 40,5% ± 1.4) (figura 7 (c)). La co-incubazione di Aβ1-42e di pixantrone risulta in una perdita della vitalità cellulare minore rispetto a quella indotta dal peptide da solo (Aβ1-4210 µM /pixantrone 5 µM: 26,1% ± 3.9; Aβ1-4210 µM/pixantrone 20 µM: 26,3% ± 6,1). Questa ridotta vulnerabilità delle cellule IMR32 con peptide beta-amiloide in presenza di pixantrone potrebbe essere verosimilmente imputabile al fatto che il pixantrone è impegnato nel sequestrare la specie tossica beta-amiloide anziché esercitare la sua azione tossica. Since pixantrone appears to be globally less toxic than mitoxantrone and is able to interfere with higher molecular weight species than Aβ1-42 with faster kinetics than mitoxantrone, the biological role of pixantrone on Aβ1-42 induced toxicity was evaluated. . In agreement with the previous results <28>, a 10 µM solution of Aβ1-42 showed a clear degree of toxicity (loss of cell viability: 40.5% ± 1.4) (figure 7 (c)). Aβ1-42e co-incubation of pixantrone results in less loss of cell viability than that induced by the peptide alone (Aβ1-4210 µM / pixantrone 5 µM: 26.1% ± 3.9; Aβ1-4210 µM / pixantrone 20 µM: 26.3% ± 6.1). This reduced vulnerability of IMR32 cells with beta-amyloid peptide in the presence of pixantrone could possibly be attributable to the fact that pixantrone is engaged in sequestering the toxic beta-amyloid species rather than exerting its toxic action.
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(41) Gervais, F.; Paquette, J.; Morissette, C.; Krzywkowski, P., Yu, M.; Azzi, M.; Lacombe, D.; Kong, X.; Aman, A.; Laurin, J.; Szarek, W.A.; Tremblay, P.; Neurobiol Aging. 2007, 28, 537-547. (41) Gervais, F .; Paquette, J .; Morissette, C .; Krzywkowski, P., Yu, M .; Azzi, M .; Lacombe, D .; Kong, X .; Aman, A .; Laurin, J .; Szarek, W.A .; Tremblay, P .; Neurobiol Aging. 2007, 28, 537-547.
(42) Carazzone, C.; Colombo, R.; Quaglia. M.; Mangione, P.; Raimondi, S.; Giorgetti, S.; Caccialanza, G.; Bellotti, V.; De Lorenzi, E. Electrophoresis 2008, in press. (42) Carazzone, C .; Colombo, R .; Quail. M .; Mangione, P .; Raimondi, S .; Giorgetti, S .; Caccialanza, G .; Bellotti, V .; De Lorenzi, E. Electrophoresis 2008, in press.
(43) Jain, K.K. Expert. Opin. Inv. Drug 2000, 9, 1139-1149. (43) Jain, K.K. Expert. Opin. Inv. Drug 2000, 9, 1139-1149.
(44) Ackermans, M.T.; Everaerts, F.M.; Beckers, J.L. J. Chromatogr. 1991, 549, 345-355. (44) Ackermans, M.T .; Everaerts, F.M .; Beckers, J.L. J. Chromatogr. 1991, 549, 345-355.
(45) Kato, M.; Kinoshita, H.; Enokita, M.; Hori, Y.; Hashimoto, T.; Iwatsubo, T.; Toyo’oka, T. Anal Chem. 2007, 79,4887-4891. (45) Kato, M .; Kinoshita, H .; Enokita, M .; Hori, Y .; Hashimoto, T .; Iwatsubo, T .; Toyo'oka, T. Anal Chem. 2007, 79.4887-4891.
(46) Pollack, S.J.; Sadler II; Hawtin, S.R.; Tailor, V.J.; Shearman, M.S. Neurosci Lett. 1995, 197, 211-214. (46) Pollack, S.J .; Sadler II; Hawtin, S.R .; Tailor, V.J .; Shearman, M.S. Neurosci Lett. 1995, 197, 211-214.
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