ITMI20070190A1 - Leghe di titanio nanostrutturate per l'uso come biomateriali per la preparazione di dispositivi medico chirurgici - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“LEGHE DI TITANIO NANOSTRUTTURATE PER L’USO COME BIOMATERIALI PER LA PREPARAZIONE DI DISPOSITIVI MEDICO CHIRURGICI”
La presente invenzione ha per oggetto dispositivi medico-chirurgici impiantabili costituiti da leghe di titanio nanostrutturate.
PREMESSA
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di mortalità nei paesi industrializzati. Per alcune di esse, quali le patologie delle valvole cardiache, l’infarto del miocardio, l’aterosclerosi, e le ischemie del miocardio e degli arti inferiori, sono sempre più praticati interventi chirurgici che prevedono l’ausilio di dispositivi medici sostitutivi o di supporto. Esempi sono le valvole cardiache e gli stents. Comunemente impiantati in seguito ad angioplastica, un intervento che rimuove l’occlusione dei vasi dovuta alla formazione di ateromi, e che permette di mantenere il flusso sanguigno, gli stents svolgono due importanti funzioni. Da un lato favoriscono il recupero dell’endotelio, un tessuto di rivestimento dei vasi il cui funzionamento è fondamentale per il benessere dei vasi e del circolo sanguigno. Dall’altro prevengono l’eccessivo accumulo di cellule muscolari lisce nei vasi e la frequente ri-occlusione dei vasi (il processo di restenosi).
Modifiche degli stents metallici mediante il rivestimento della loro superficie con farmaci vaso-protettivi o tossici per la componente muscolare liscia (i così detti stents medicati), introdotti negli ultimi anni, hanno avuto risultati di dubbia efficacia clinica e talvolta negativi.
Problemi irrisolti degli stents tradizionali o medicati sono:
- la formazione di coaguli sanguigni, che possono provocare trombosi e quindi la necessità di somministrare farmaci anticoagulanti ai pazienti;
- la reazione da corpo estraneo o allergica al materiale con cui il dispositivo è forgiato.
Per ovviare a questi problemi, la ricerca in questo settore è indirizzata da un lato alla formulazione di leghe che non contengano metalli tossici o allergizzanti come il nichel e l' alluminio, e dall’altro alla modificazione delle superfici dei dispositivi per facilitare la biocompatibilità con le cellule (in particolare cellule endoteliali staminali o differenziate).
Molti impianti cardiovascolari e medicali vengono fabbricati mediante leghe metalliche che consentono una maggiore biocompatibilità ed emocompatibilità rispetto ad altri materiali.
I biomateriali metallici possono essere ottenuti da metalli semplici e dalla loro composizione in leghe, ottenute a partire da un metallo base con aggiunta di elementi metallici e non metallici. I biomateriali sono trattati termicamente per raggiungere determinate proprietà meccaniche e rifiniti superficialmente per giungere alla massima biocompatibilità possibile.
Questi biomateriali si caratterizzano per la loro capacità di sopportare carichi elevati senza rompersi, né deformarsi, e resistono molto bene alla fatica meccanica. Per questo motivo sono utilizzati nella produzione di dispositivi ortopedici. Tuttavia, venendo a contatto con i liquidi biologici, tendono ad usurarsi.
Il primo metallo usato come biomateriale fu il Vanadio, utilizzato per costruire placche di fissaggio per fratture ossee. In seguito fu introdotto l'Acciaio Inossidabile, più robusto e meno esposto alla corrosione del suo precedente; si trattava di una lega costituita da ferro, carbonio e, in minore percentuale, da cromo. Il principale tipo di acciaio inossidabile utilizzato è l'austenitico, che meglio si presta all'impiego clinico protesico per l'elevata resistenza alla corrosione (acciaio inox 316L, acciaio al Cr-Ni-Mo a bassissimo tenore di C).
Esistono diversi tipi di leghe al Cobalto adatte ad essere impiantate, che si distinguono per il diverso contenuto degli elementi, ma le due più utilizzate sono le leghe CoCrMo (Cobalto-Cromo-Molibdeno) e le leghe di CoNiCrMo (Cobalto-Nickel-Cromo-Molibdeno). Quest’ultima possiede una resistenza meccanica notevolmente superiore all'altra e la rende adatta per le applicazioni nelle quali si richiedono un'elevata resistenza alla fatica meccanica e all'uso prolungato, come ad esempio nelle protesi articolari dell'anca dove, oltre alla sollecitazione funzionale di questa importante articolazione, si deve certamente evitare l'usura della protesi a distanza di tempo.
Il Titanio, l'ultimo tra i metalli in uso negli impianti, è risultato vantaggioso grazie alle sue caratteristiche di leggerezza e buone proprietà meccaniche. La variante più utilizzata è costituita dalla lega Ti6A14V (Titanio-Alluminio-Vanadio), composta dal 6,00% di Alluminio e dal 4,00% di Vanadio. Possiede una buona resistenza alla corrosione grazie alla formazione di uno strato superficiale ossidato; ha però una bassa resistenza alla corrosione per sfregamento e, per questo, non è utilizzata nelle superfici articolari. Una caratteristica importante del titanio e della sua lega TÌ6A14V (Ahmad et al., 1999), consiste nella capacità di stimolare la produzione di sostanze proteiche, sostanze mineralizzate e componenti della matrice extracellulare, che rendono questa lega molto importante per la rigenerazione ossea (Rack e Qazi, 2006). Il Nitinol, una lega di Titanio e Nichel, possiede la caratteristica importante della memoria di forma, o memoria elastica e cioè ha la capacità, a seguito di una deformazione plastica, di riassumere la forma originale con l'aumentare della temperatura. Queste particolari caratteristiche rendono questa lega particolarmente adatta alla produzione di filtri cavali (filtri per la vena cava), stent cardiovascolari o impianti ortopedici.
In condizioni fisiologiche le cellule endoteliali sono dotate di un basso indice replicativo. Tale caratteristica biologica è alla base della senescenza che colpisce questa popolazione cellulare nel corso della vita adulta, e che, nella grande maggioranza dei casi, è responsabile della perdita delle funzioni vascolari alla base di malattie cardiovascolari e neurodegenative. Nel corso di patologie croniche e in condizioni di distruzione traumatica di organi e tessuti, i piccoli vasi della microcircolazione, di cui l’endotelio è la componente cellulare esclusiva e/o prevalente, si rigenerano con difficoltà portando a perdita di funzione dell’organo che irrorano. In caso di trapianto d’organo e/o di protesi la efficacia del risultato viene garantita da una appropriata rivascolarizzazione ed endotelizzazione.
Quanto avviene in vivo viene riprodotto in laboratorio in studi in vitro su cellule endoteliali. Tali studi evidenziano come la crescita e la sopravvivenza dell’endotelio possano essere modificate dalla composizione delle superfici di coltura e dalla disponibilità di citochine pro-proliferative quali il fattore di crescita di tipo fibroblastico 2 (FGF2) noto fattore proangiogenico.
Descrizione dell’Invenzione
Si è ora trovato che l’impiego di leghe di titanio nanostrutturate, in particolare leghe a varia percentuale di titanio niobio e zirconio ottenibili per forgiatura e trattamento termico da polveri metalliche, promuove l’adesione, la crescita e la produzione di alti livelli del fattore di crescita FGF2 nelle cellule endoteliali in maniera significativa (2 e 3 volte superiore) rispetto alle leghe note in precedenza.
L’invenzione ha pertanto per oggetto dispositivi medico-chirurgici impiantabili costituiti da leghe di titanio nanostrutturate. Esempi di tali dispositivi comprendono dispositivi cardiovascolari, in particolare stents e valvole cardiache, filtri cavali, dispositivi ortopedici (fissatori, protesi e simili), odontoiatrici e, in linea di massima, dispositivi impiantabili in situazioni in cui sia desiderabile un’azione di promozione della proliferazione di cellule endoteliali e dell’angiogenesi. Altro esempio di applicazione dell’invenzione è l’uso dei dispositivi suddetti per favorire la produzione endoteliale di fattori di crescita proangiogenici, quali FGF2, in condizioni patologiche ed in cui la ri-vascolarizzazione sia carente (ad esempio diabete, insufficienza circolatoria e malattie genetiche).
L’efficienza delle leghe secondo l’invenzione è stata valutata mediante prove biologiche che misurano l’indice proliferativo delle cellule endoteliali e le loro funzioni, quali produzione e organizzazione delle proteine del citoscheletro, produzione di molecole responsabili dell’azione vasodilatante e di fattori di crescita.
Il metodo di produzione non impone limiti alle composizioni chimiche che consentono la sostituzione di elementi in lega potenzialmente dannosi per il corpo umano, con elementi alternativi garanti di assoluta biocompatibilità. I risultati raggiunti sono stati conseguiti dall’ unione della tecnologia delle leghe di titanio nano strutturate con i processi di forgiatura e di trattamento termico che ne ottimizzano anche le caratteristiche meccaniche.
La realizzazione e caratterizzazione delle leghe nanostrutturate a base di titanio (Ti) è stata effettuata dalla Richiedente.
Leghe di Ti biocompatibili preferite sono quelle a base di TiNbZr (in particolare le composizioni Til3Nbl3Zr e Til3Nbl3Zr), prodotte con una struttura di dimensione nanometrica, ovverosia una dimensione cristallina minore di 100 nm. Queste leghe sono state confrontate con la lega attualmente in commercio, Ti6A14V, prodotta sia nella struttura commerciale (standard) che nella struttura nanometrica. Tale struttura è stata ottenuta grazie ad un innovativo processo produttivo che, mediante meccanofabbricazione, porta alla produzione di leghe costituite da cristalli di dimensioni nanometriche (circa 20 nm).
La meccanofabbricazione ad alta energia utilizzata per la produzione di polveri metalliche con struttura nanometrica è effettuata ad esempio per mezzo dell’ apparecchiature descritta in EP 665770.
Dalle analisi ai raggi X della lega Til3Nbl3Zr è emerso che il materiale prodotto è costituito da Ti nelle sue due fasi a e β. Mediante l’analisi della differenza di densità tra le polveri e il materiale è emerso che la lega prodotta ha un buon grado di compattazione. Confrontando i dati relativi alle prove meccaniche su Til3Nbl3Zr nanostrutturato emergono valori di durezza maggiori rispetto alla lega TÌ6A14V sia nanostrutturata che standard.
Sono state svolte delle prove di forgiatura, al fine di verificare le caratteristiche di lavorabilità a caldo e di ottimizzare i parametri necessari per il processo di stampaggio.
Sono state individuate le temperature di riscaldo più adeguate per entrambi i materiali in esame (940°C per il Ti6A14V nanostrutturato e 850°C per il Ti13Nb11Zr nanostrutturato); in particolare il Ti13Nb11Zr ha evidenziato particolari doti di scorrevolezza e deformabilità.
Le indagini microstrutturali eseguite sui materiali forgiati evidenziano per entrambe le leghe analizzate una maggiore compattezza ed una maggiore omogeneità nella distribuzione dei grani.
Le proprietà meccaniche dei nuovi materiali nano strutturati, sottoposti a processo di forgiatura, sono per entrambi i materiali migliori delle stesse rilevate sui materiali in condizione non trattate ed in particolare, per quanto riguarda il Ti13Nb11Zr, il materiale ha evidenziato un notevole miglioramento in termini di minore fragilità.
Sono stati eseguiti test per verificare l’effetto di trattamenti termici, successivi alla fase di forgiatura, quali tempra, distensione e STA (Solution Treatment and Aging) a diverse temperature.
In questo modo è stato possibile migliorare ulteriormente le proprietà meccaniche dei materiali.
I materiali sono stati forgiati a caldo sottoforma di barre, dalle quali si sono ottenuti dischetti o quadrati che sono stati lavati, impacchettati e sterilizzati mediante raggi β per i test biologici.
In tutti gli studi riportati sono state utilizzate cellule endoteliali del microcircolo, sede principale del rimodellamento vascolare e del processo di angiogenesi, isolate dalle venule post-capillari delle coronarie bovine (CVEC, coronary venular endothelial cells) (Schelling et al., 1988). Le CVEC vengono coltivate in piastre da 10 cm di diametro, rivestite con gelatina all’l% (p/v in acqua) e mantenute in coltura con Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Milano), contenente 1000 mg/ml di D-glucosio. Al terreno vengono aggiunti 100 μg/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina e 2 mM di L-glutammina. Per mimare e consentire le migliori condizioni di crescita, al mezzo di coltura viene aggiunto siero, Bovine Calf Serum (BCS) (Hyclone, Logan, UT), in concentrazione pari al 10% del volume totale (medium completo). Le cellule vengono mantenute in incubatore umidificato alla temperatura di 37°C ed in presenza del 5% di CO2fino al raggiungimento della confluenza. Le CVEC sono quindi propagate, mediante distacco con tripsina/EDTA, diluendole 1:3 ogni 48 ore.
In condizioni di confluenza le CVEC presentano inibizione da contatto, hanno morfologia poligonale e di cellule fortemente appiattite. Una morfologia fusata o puntiforme è invece indice di sofferenza cellulare.
La loro identificazione è possibile grazie alla presenza dell'antigene Fattore VIII, all'incorporazione di LDL-acetilate e all’ espressione del recettore di membrana integrina ανβ3.
Tra le caratteristiche biochimiche salienti di questa linea cellulare, che confermano la natura di cellula endoteliali, sono la produzione di FGF-2 (Hawker and Granger, 1992), la produzione di nitrossido (Wu e Meininger, 1993) e di prostaciclina, in risposta ai mediatori dell’ infiammazione come bradichinina (Bachetti e Morbidelli, 2000).
Test di sopravvivenza cellulare
Per determinare la capacità delle cellule di sopravvivere/proliferare sui biomateriali è stata utilizzato il test di vitalità del MTT (Tonello et al., 2003). Questo saggio è un metodo indiretto per valutare la crescita e proliferazione cellulare in quanto è un test colorimetrico che si basa sulla capacità delle cellule metabolicamente attive di trasformare, mediante la succinico deidrogenasi mitocondriale, il composto solubile 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich) in un sale del formazano insolubile che può essere determinato spettrofotometricamente. La densità ottica misurata alla lunghezza d’onda di 540 nm è proporzionale alla quantità di cellule vitali presenti nel campione e quindi è un indice della citotossicità del materiale. Per tale saggio le CVEC sono state seminate alla concentrazione di 10.000 cellule/pozzetto (in un volume di 500 μ1) sui biomateriali in multipozzetti da 48. È stata valutata la vitalità a 1, 4 e 7 giorni di distanza dalla semina delle cellule, cambiando il medium a metà incubazione per i campioni destinati ai 7 giorni. 4 ore prima dello scadere dei tempi dell’ esperimento, viene sostituito il terreno di coltura con del medium privo di rosso-fenolo, che altrimenti andrebbe a interferire con la misurazione spettrofotometrica, e viene aggiunta la soluzione 5 mg/ml di MTT, ottenuta solubilizzando il sale in terreno privo di rosso-fenolo, in modo tale da avere una concentrazione finale di 1,2 mM. Le cellule vengono incubate a 37°C e durante questo periodo metabolizzano MTT nel derivato insolubile. Alla scadere delle 4 ore viene rimosso il medium ed il sale di formazano viene solubilizzato con DMSO (dimetilsolfossido) e la sua concentrazione determinata mediante lettura spettrofotometrica a 540 nm (Spectrafluor, Tecan). I risultati ottenuti ai differenti tempi di incubazione sono riportati come assorbanza (Abs) a 540 nm.
Analisi della morfologia e adesione cellulare
Le cellule endoteliali sono particolarmente sensibili agli stimoli dell’ ambiente circostante e alterazioni di esso provocano modifiche della morfologia poligonale e capacità adesiva delle cellule con alterazioni delle proprietà angiogenetiche. In base a queste premesse, lo studio dell’adesione e della morfologia delle cellule endoteliali rappresenta un indice della biocompatibilità del materiale in esame. Sebbene le tecniche di microscopia sono in generale utilizzate a tal scopo, si è preferito utilizzare la microscopia a scansione elettronica sia classica (SEM, Scanning Electron Microscope) che ambientale (ESEM, Environmental Scanning Elettron Microscope) in quanto permettono anche di evidenziare le strutture nanometriche dei materiali.
Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) e a Scansione Ambientale (ESEM)
Per valutare il grado di adesione e la morfologia mediante SEM (Philips XL20, Olanda), le cellule endoteliali sono state seminate alla concentrazione di 7.500 cellule su ciascun materiale in esame posto in un multipozzetto da 24 e incubate a 37°C. Il controllo è rappresentato dalle cellule seminate su vetrini copri-oggetto di 1 cm. Dopo incubazione le cellule vengono lavate per tre volte, 5 minuti a lavaggio, con tampone fosfato (PBS, Phosphate Buffered Saline) con Ca e Mg per rimuovere completamente il medium e in seguito fissate con glutaraldeide al 2,5% in cacodilato di sodio 100 nM per 1 ora a 4°C (Pezzatini et al., 2006). I campioni vengono poi lavati per 18 ore con tampone di cacodilato di sodio 100 nM e poi post-fissati con OsO41% in Cacodilato di Na 200 nM a 4°C per 2 ore. Dopo fissazione, i campioni vengono disidratati con diluizioni seriali di etanolo e poi essiccati per sublimazione sottovuoto con terz-butanolo. Le cellule, previo rivestimento con oro 100% mediante sputter-coater, vengono osservate al SEM e le immagini acquisite.
Per l’analisi all’ESEM è stato seguito lo stesso protocollo di crescita cellulare, mentre il processamento dei campioni dopo incubazione segue steps diversi. Infatti, le cellule dopo esser state lavate con PBS per tre volte vengono fissate con glutaraldeide al 2,5% in tampone PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio i campioni vengono lavati per tre volte, 5 minuti per ogni lavaggio, con PBS ed immediatamente osservati al microscopio elettronico.
Immunofluorescenza
Per valutare l’espressione e la localizzazione di proteine importanti per la morfologia, adesione e proliferazione dell’endotelio e quindi implicate nella risposta angiogenetica delle cellule ai materiali in studio, sono state effettuate analisi di immunofluorescenza. In particolare, è stata studiata l’espressione e organizzazione delle proteine del cito scheletro, (β-actina) e delle proteine dell’adesione (integrina ανβ3). Inoltre, è stata valutata l’espressione di parametri biochimici importanti per la funzionalità endoteliale ed angiogenetica quali il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-2), la nitrossido sintetasi endoteliale costitutiva (ecNOS) e la ciclossigenasi-2 (COX-2).
Le CVEC sono state seminate in terreno contenente 10% siero ad una densità di 7.500 cellule/pozzetto in multipozzetti da 24 sul cui fondo sono stati appoggiati i dischetti delle leghe in studio. Le cellule sono state lasciate crescere per 4 giorni a 37°C (Pezzatini et al, 2006).
Dopo incubazione, le cellule sono lavate per 3 volte, ogni lavaggio di 5 minuti, con PBS contenente Ca e Mg e fissate in acetone a -20°C per 5 minuti. I vetrini sono stati quindi lavati con PBS per 3 volte e incubati per 45 minuti con PBS-BSA 3% a temperatura ambiente, in modo da bloccare i legami aspecifici. Successivamente le cellule sono state incubate per 18 ore a 4°C con l' anticorpo primario contro la proteina da esaminare, opportunamente diluito in PBS-BSA 0,5% e per la marcatura delle proteine intracellulari è stato utilizzato PBS addizionato di TWEEN 20 0,05% per permeabilizzare la membrana citoplasmatica (Tab. 1). Dopo incubazione con l’anticorpo primario, i vetrini sono stati lavati per 3 volte per 5 minuti con PBS-BSA 0,5% e poi incubati per un’ora a temperatura ambiente con l' anticorpo secondario coniugato con il fluoroforo. Gli anticorpi secondari utilizzati sono “anti-mouse” coniugato con fluoresceina (FITC) (1:50, Sigma- Aldrich) o coniugato con rodamina (TRITC) (1:50, Sigma- Aldrich) o “anti-rabbit” coniugato con rodamina (1:50, Sigma- Aldrich) diluiti in PBS-BSA 0,5%. Al termine dell’incubazione, l' anticorpo secondario è stato rimosso con 3 lavaggi con PBS-BSA 0,5%. I controlli negativi sono stati ottenuti omettendo il trattamento dei campioni con l' anticorpo primario.
Proteina Anticorpo Diluizione Ditta monoclonale
Citoscheletro 1:40 Sigma-Aldrich anti-β-actina
monoclonale Chemicon Adesione anti- integrina 1:40 International, CA, ανβ3 USA Upstate monoclonale
1:50* Biotechnology, NY, anti-FGF-2
USA
Parametri
biochimici e di monoclonale BD Biosciences,
1:30*
angiogenesi anti-ecNOS Milano, Italia monoclonale Cayman Chemical,
1:50*
anti-COX-2 MI, USA Tabella 1: Schema delle proteine e i relativi anticorpi analizzate mediante immunofluorescenza. * per questi marker è previsto il protocollo di permeabilizzazione della membrana citoplasmatica
I vetrini sono stati montati con Mowioll 4-88 (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) sui vetrini portaoggetti e le cellule osservate al microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse TE300 all’ ingradimento 40x. Per ogni campione sono stati fotografati vari campi scelti a caso.
L’intensità della fluorescenza delle immagini acquisite è stata quantificata utilizzando il software Image J 1,33u (Pezzatini et al, 2006). Sono state scelte 3 immagini fra quelle acquisite e sono state automaticamente convertite in scala di grigi. In ciascuna di esse sono state evidenziate 10 cellule a caso e per ciascuna è stata misurata l’area, la media dell’intensità e il minimo e massimo valore di grigio. I dati sono stati riportati come media+SEM delle medie dell’intensità di grigio registrate per le cellule selezionate per ogni campione esaminato.
Analisi statistica
Ogni punto sperimentale è valutato, per ciascun esperimento, in triplicato e riportato come media ± SEM (Errore Standard della Media) dei valori ottenuti in tutti gli esperimenti eseguiti. I dati sono stati analizzati tramite Student t test. Valori con p<0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
RISULTATI
La nanomeccanofabbricazione delle leghe di titanio favorisce l’endotelizzazione
La biocompatibilità delle leghe Til3Nbl3Zr e Ti6A14V nanostrutturate per le cellule endoteliali del microcircolo (CVEC) è stata valutata rispetto alla lega commerciale Ti6A14V e alle condizioni standard di crescita cellulare su polistirene per colture cellulari o vetro (per le indagini in immunofluorescenza e SEM).
Le leghe sono state caratterizzate per la loro potenziale citotossicità e per la loro capacità di sostenere/indurre proliferazione endoteliale valutando la vitalità cellulare in funzione del tempo di crescita mediante il saggio colorimetrico MTT. Le leghe non sono risultate citotossiche. Inoltre, le superfici nano strutturate promuovono la crescita endoteliale e aumentano significativamente (p<0,05) la sopravvivenza e la proliferazione cellulare dopo 4 e 7 giorni di crescita, tempo al quale l’intera superficie dei dischetti di leghe nanostrutturate è ricoperta da cellule endoteliali.
In Ligura è riportata la % di vitalità delle cellule endoteliali cresciute sulle leghe rispetto al controllo, in cui le cellule sono cresciute su polistirene. Le cellule endoteliali sono incubate per 1, 4 e 7 giorni con le leghe di titanio in terreno al 10% siero e la vitalità è misurata utilizzando il test di MTT. I dati sono riportati come medie ± SEM di n=5 esperimenti svolti in duplicato. * p<0,05 vs Ti6A14V.
Come è evidenziato in tabella 2, dopo 7 giorni in coltura il numero di cellule endoteliali presenti sui dischetti nano strutturati aumenta di 7 volte rispetto al controllo e di 2 volte rispetto alle leghe standard.
Numero di cellule/campione p vs controllo Controllo 2x10<4>
Ti6A14V standard 7x10<4><0,05* Ti6A14V nano 1,56x10<5><0,01** Til3Nbl3Zr nano 1,53x10<5><0,01** Tabella 2: Proliferazione endoteliale su dischetti di lega metallica dopo 7 giorni in coltura. Il numero totale di cellule è stato calcolato sulla base dell’ attività metabolica misurata mediante MTT assay e rielaborata mediante una curva di calibrazione (assorbanza a 540 nm/numero di cellule). N=5 esperimenti svolti in duplicato.
La morfologia cellulare, valutata tramite microscopia SEM delle CVEC dopo 4 giorni di incubazione sulle leghe dimostra l' acquisizione di una normale morfologia poligonale endoteliale con buona adesione al substrato, connessioni tra cellule adiacenti e il raggiungimento e mantenimento della confluenza. Sulle leghe, rispetto al controllo si osserva anche un aumento del numero di cellule a conferma dei dati ottenuti con il test MTT.
L’espressione e localizzazione deH’integrina ανβ3 di membrana, coinvolta nell’adesione e sopravvivenza endoteliale, e dell’organizzazione delle proteine strutturali (β-actina) del cito scheletro, è stata valutata mediante reazioni di immunofluorescenza, dopo 4 giorni di crescita delle cellule sui campioni.
Le leghe di titanio non alterano la capacità di adesione delle cellule endoteliali e l’espressione e localizzazione deH’integrina ανβ3 è mantenuta. Infatti, si osserva l’organizzazione dell’integrina nei contatti focali a livello della membrana citoplasmatica, sia nel controllo che nelle leghe.
Nelle cellule in coltura, la β-actina si localizza alla periferia del citoplasma formando un denso anello periplasmatico. Quando le cellule vengono fatte crescere sulle leghe nano strutturate, l’actina si riorganizza a formare le fibre di stress con disposizione transcitoplasmatica, documentando l’attivazione dell’endotelio in senso mitogenico da parte del biomateriale.
Questi risultati, indicano che le leghe di titanio favoriscono l’adesione e la proliferazione cellulare, e che le leghe nano strutturate hanno una maggior capacità di indurre nell’endotelio l’attivazione di un fenotipo dotato di alta capacità replicativa.
Allo scopo di utilizzare questi materiali nella produzione di protesi è necessario verificare se influenzano le funzioni vascolari e se inducono un processo infiammatorio o trombogenico. Quindi l’endotelio è stato valutato nella sua capacità di mantenere la funzione vasodilatante e vasoprotettiva (come ecNOS) e di non acquisire capacità pro-infiammatorie e trombogeniche (come la ciclossigenasi-2, COX-2) quando cresciuto su leghe nanostrutturate. I due marker differenziativi sono stati valutati tramite immunofluorescenza a 4 giorni di crescita, documentando che nelle cellule endoteliali cresciute sulle leghe nanostrutturate si ha un aumento significativo, nella zona perinucleare, dell’espressione della ecNOS, mentre non si osserva induzione della COX-2 rispetto al controllo.
Una delle caratteristiche dell’endotelio in proliferazione è l’induzione di un fenotipo angiogenetico, caratterizzato dalla overespressione di citochine e fattori di crescita come FGF-2. Quando le cellule endoteliali vengono fatte crescere per 4 giorni sulle leghe nanostrutturate si osserva un incremento altamente significativo dell’espressione di FGF-2 (Tabella 3).
FGF -2/cellula (Intensità di fluorescenza) SEM P Controllo 3,6x10<5>9,8x10<3>Ti6A14V 7,4x10<5>7,3x10<3><0,01§ standard
Ti6A14V nano 9,3x10<5>9,9x10<3><0,01# Ti13Nbl3Zr 9,6x10<5>8x10<3><0,01# nano
Tabella 3. Intensità di fluorescenza della proteina FGF-2 in CVEC cresciute sul materiale per 4 giorni. L’intensità della fluorescenza della proteina è stata quantificata su singola cellulala utilizzando il programma ImageJ su un campione di 30 cellule (media ± SEM). § vs la condizione di controllo; # vs Ti6A14V standard.
In particolare, dalle immagini ottenute con immunofluorescenza, si osserva che la fluorescenza di FGF-2 è citoplasmatica, prevalentemente localizzata nella zona perinucleare e aumentata significativamente quando le cellule sono cresciute sulle leghe e in particolare sulle leghe nanostrutturate. Infatti l’espressione di FGF2 misurata sulla singola cellula mediante fluorescenza, raddoppia rispetto al controllo sulle leghe standard, e triplica se le leghe sono nanostrutturate.
In conclusione, i dati dimostrano che leghe nanostrutturate sia a composizione standard (Ti6A14V) che innovativa (Til3Nbl3Zr) promuovono in maniera significativa le funzioni dell’endotelio vascolare. Fe cellule endoteliali aderiscono e proliferano su tali substrati, incrementando l’espressione e la produzione di fattori di crescita proangiogenici e dei marcatori tipici della endotelizzazione e della funzionalità endoteliale.
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Claims (7)
- RIVENDICAZIONI 1. Dispositivi medico-chirurgici impiantabili costituiti da leghe di titanio nanostrutturate.
- 2. Dispositivi secondo la rivendicazione 1 scelti fra dispositivi cardiovascolari, in particolare stents e valvole cardiache, filtri cavali, dispositivi ortopedici, odontoiatrici e dispositivi impiantabili in situazioni in cui sia desiderabile un’azione di promozione della proliferazione di cellule endoteliali, di angiogenesi e in cui si voglia favorire la produzione di fattori di crescita proangiogenici quali FGF2.
- 3. Dispositivi secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui le leghe di titanio sono leghe di TiNbZr.
- 4. Dispositivi secondo la rivendicazione 3 in cui le leghe sono scelte fra Til3Nbl3Zr e Til3Nbl3Zr.
- 5. Dispositivi secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui la dimensione cristallina delle leghe di titanio è minore di 100 nm, preferibilmente di circa 20 nm.
- 6. Dispositivi secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui le leghe di titanio sono ottenute mediante processi di forgiatura e di trattamento termico.
- 7. Uso di leghe di titanio nanostrutturate per la preparazione di dispositivi medicali in grado di promuovere le funzioni dell’endotelio vascolare.
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