ITMI20011183A1

ITMI20011183A1 - METHOD FOR THE INDUCTION OF IMMUNOSOPPRESSIVE ACTIVITY IN CELLS OF INNATE IMMUNITY

Info

Publication number: ITMI20011183A1
Application number: IT2001MI001183A
Authority: IT
Inventors: Andrea Biondi; Martino Introna; Paola Allavena; Marcello Chieppa
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 2001-06-05
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2002-12-05
Also published as: ITMI20011183A0

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: Description of the patent for industrial invention entitled:

“METODO PER L’INDUZIONE DI ATTIVITÀ IMMUNOSOPPRESSIVA IN CELLULE DELL’IMMUNITÀ’ INNATA” "METHOD FOR THE INDUCTION OF IMMUNOSUPPRESSIVE ACTIVITY IN CELLS OF INNATE IMMUNITY"

Sfondo dell’invenzione Background of the invention

Il recettore del mannosio (MR) è coinvolto nell’attività di internalizzazione di carboidrati legati a proteine ed è coinvolto nella fagocitosi di alcuni microorganismi. The mannose receptor (MR) is involved in the internalization of protein-bound carbohydrates and is involved in the phagocytosis of some microorganisms.

Il MR appartiene alla famiglia di recettori definiti C-type lectin, è un proteina transmembrana di 175 kDa comprendente 5 regioni: una porzione aminoterminale ricca in cisteina, seguita da una regione fibronettina-simile, una serie (otto) di domini tipo lectina che riconoscono i carboidrati, una porzione transmembrana e una porzione intra-citoplasmatica con la coda carbossiterminale. Nella porzione lectinica esistono siti di legame per vari tipi di carboidrati, tra i quali mannosio, N-acetilglucosamina, fucosio, maltosio, glucosio. L’affinità è più elevata per il mannosio e il fucosio, intermedia per l' Ν-acetilglucosamina e il glucosio, modesta per il galattosio. Dato che la maggior parte di questi zuccheri non è espressa normalmente sulle cellule di mammifero, e poiché il MR lega efficientemente vari microorganismi ed è coinvolto nella fagocitosi di patogeni, si pensa che questo tipo di recettore svolga un ruolo rilevante nella immunità innata e quindi nella difesa dell’organismo (Stahl and Ezekowitz 1998). The MR belongs to the family of receptors defined C-type lectin, it is a 175 kDa transmembrane protein comprising 5 regions: a cysteine-rich aminoterminal portion, followed by a fibronectin-like region, a series (eight) of lectin-type domains that recognize carbohydrates, a transmembrane portion and an intra-cytoplasmic portion with the carboxyterminal tail. In the lectin portion there are binding sites for various types of carbohydrates, including mannose, N-acetylglucosamine, fucose, maltose, glucose. The affinity is higher for mannose and fucose, intermediate for Ν-acetylglucosamine and glucose, modest for galactose. Since most of these sugars are not normally expressed on mammalian cells, and since MR efficiently binds various microorganisms and is involved in the phagocytosis of pathogens, this type of receptor is thought to play an important role in innate immunity and therefore in defense of the organism (Stahl and Ezekowitz 1998).

Il MR è espresso su alcuni sottotipi di leucociti quali i macrofagi, le cellule dendritiche (cellule che presentano Γ antigene) e sugli endoteli di alcuni vasi, ad esempio quelli epatici. Grande interesse ha destato la scoperta che l’elevata capacità delle cellule dendritiche (DC) di endocitare carboidrati o proteine mannosilate è mediata principalmente dal MR (Sallusto et al. 1995). Le DC sono una sottopopolazione di leucociti altamente specializzata nella presentazione dell’antigene (Ag), che svolge un ruolo indispensabile nell’induzione della risposta immunitaria primaria. Caratteristiche peculiari delle DC sono la loro elevata capacità di catturare Γ antigene, processarlo in piccoli peptidi e presentarlo in modo appropriato ai linfociti T vergini. A differenza della maggior parte dei leucociti che sono circolanti nel sangue, le DC si trovano sparse nei tessuti periferici e negli organi linfoidi. Le DC tissutali sono in genere ad uno stadio immaturo e qui svolgono il compito di catturare gli eventuali antigeni con i quali vengono a contatto. Le DC localizzate negli organi linfoidi, invece, sono ad uno stadio differenziativo più maturo. Queste DC derivano da quelle dei tessuti periferici che, dopo la cattura degli antigeni, migrano negli organi linfoidi secondari, dove avverrà Γ incontro con i linfociti T vergini provenienti dal circolo sanguigno (Bancherau and Steinman 1998). MR is expressed on some subtypes of leukocytes such as macrophages, dendritic cells (cells that present Γ antigen) and on the endothelium of some vessels, for example those of the liver. Great interest has aroused the discovery that the high capacity of dendritic cells (DC) to endocytose carbohydrates or mannosylated proteins is mainly mediated by MR (Sallusto et al. 1995). DCs are a subpopulation of leukocytes highly specialized in the presentation of the antigen (Ag), which plays an indispensable role in the induction of the primary immune response. Distinctive features of DCs are their high ability to capture Γ antigen, process it into small peptides and present it appropriately to virgin T lymphocytes. Unlike most leukocytes that are circulating in the blood, DCs are found scattered in peripheral tissues and lymphoid organs. Tissue DCs are generally at an immature stage and here they perform the task of capturing any antigens with which they come into contact. The DCs located in the lymphoid organs, on the other hand, are at a more mature differentiation stage. These DCs derive from those of the peripheral tissues which, after the capture of the antigens, migrate to the secondary lymphoid organs, where they will meet the virgin T lymphocytes coming from the bloodstream (Bancherau and Steinman 1998).

La caratteristica principale delle DC allo stadio maturo è la loro potente capacità di attivare i linfociti T vergini, e di presentare l’Ag in modo specifico. Poiché la stimolazione dei linfociti T e quindi l’avvio della risposta immunitaria è mediato in modo ottimale solo dalle DC che hanno raggiunto lo stadio differenziativo di maturazione completa, grande importanza rivestono i fattori e i meccanismi implicati nel processo di maturazione. I fattori che favoriscono la maturazione terminale delle DC sono oggi almeno in parte conosciuti; un ruolo importante è svolto da citochine pro-infiammatorie quali Interi euchina-1 (IL- 1 ) e Tumor Necrosis Factor (TNF), e da componenti batterici tra i quali il Lipopolisaccaride (LPS). Inoltre alcune proteine di membrana espresse da linfociti T attivati, come il CD40L, sono in grado di attivare le DC riconoscendo su queste cellule specifici recettori di membrana (Bancherau and Steinman 1998). The main feature of DC in the mature stage is their powerful ability to activate virgin T lymphocytes, and to present the Ag in a specific way. Since the stimulation of T lymphocytes and therefore the initiation of the immune response is optimally mediated only by DCs that have reached the differentiation stage of complete maturation, the factors and mechanisms involved in the maturation process are of great importance. The factors favoring the terminal maturation of DC are now at least partially known; an important role is played by pro-inflammatory cytokines such as Interi eukina-1 (IL-1) and Tumor Necrosis Factor (TNF), and by bacterial components including Lipopolysaccharide (LPS). Furthermore, some membrane proteins expressed by activated T lymphocytes, such as CD40L, are able to activate DCs by recognizing specific membrane receptors on these cells (Bancherau and Steinman 1998).

I due diversi stadi di maturazione (DC immature e mature) possono essere distinti con l’analisi dell’espressione di molecole di superficie facilmente identificabili con reagenti commerciali. Allo stadio immaturo le DC esprimono alti livelli di molecole che sono implicate nell’attività di cattura degli antigeni, come il MR e il recettore per il frammento Fc delle immunoglobuline, e questi livelli declinano in seguito alla maturazione. Allo stadio maturo invece, esprimono alti livelli di molecole costimolatorie implicate nell’ attivazione dei linfociti T quali MHC II, CD80, CD86 e CD83. Ancora, i due diversi stadi differenziativi possono essere identificati e distinti con saggi funzionali che misurano la capacità di queste cellule di eseguire funzioni specifiche del loro stato di maturazione. Ad esempio le DC immature hanno una più elevata attività endocitica, mentre le DC mature sono più potenti nell’ attivare la proliferazione dei linfociti T e nel produrre alcune citochine. The two different stages of maturation (immature and mature DC) can be distinguished by analyzing the expression of surface molecules easily identifiable with commercial reagents. In the immature stage, DCs express high levels of molecules that are involved in the capture activity of antigens, such as the MR and the receptor for the Fc fragment of immunoglobulins, and these levels decline following maturation. At the mature stage, however, they express high levels of costimulatory molecules involved in the activation of T lymphocytes such as MHC II, CD80, CD86 and CD83. Furthermore, the two different differentiation stages can be identified and distinguished with functional assays that measure the ability of these cells to perform specific functions of their state of maturation. For example, immature DCs have a higher endocytic activity, while mature DCs are more powerful in activating the proliferation of T lymphocytes and in producing some cytokines.

Dato il ruolo cruciale che le DC svolgono nell’attivare in modo specifico i linfociti vergini, è sorto un grande interesse per l’utilizzo clinico di queste cellule in strategie terapeutiche che mirano ad aumentare, o al contrario a ridurre, l’entità della risposta immunitaria. Le DC possono essere generate in vitro con relativa facilità, grazie all’azione di fattori di crescita/differenziativi di cui oggi conosciamo la funzione sui precursori ematopoietici. Le DC possono essere differenziate da cellule staminali CD34+ o da monociti circolanti, grazie all’effetto di GM-CSF/IL-3, FLT3L, TNF, IL-4, IL-13. La disponibilità di un elevato numero di DC in vitro ha favorito la caratterizzazione funzionale delle DC e reso possibile l’utilizzo di queste cellule in vivo. Given the crucial role that DCs play in specifically activating virgin lymphocytes, great interest has arisen in the clinical use of these cells in therapeutic strategies that aim to increase, or conversely reduce, the magnitude of the response. immune. DCs can be generated in vitro with relative ease, thanks to the action of growth / differentiation factors whose function we now know on hematopoietic precursors. DCs can be differentiated from CD34 + stem cells or circulating monocytes, thanks to the effect of GM-CSF / IL-3, FLT3L, TNF, IL-4, IL-13. The availability of a high number of DCs in vitro has favored the functional characterization of DCs and made it possible to use these cells in vivo.

L’ anticorpo monoclonale (clone PAM-1) generato immunizzando i topi con macrofagi alveolari umani (Biondi et al. 1984) riconosce il recettore del mannosio espresso sulle DC (Uccini et al. 1997). L’anticorpo è ampiamente disponibile nella comunità scientifica. Le DC immature, che esprimono alti livelli di MR, risultano fortemente positive alla reattività con l’Ab PAM-1. Al contrario, le DC che hanno raggiunto la maturazione terminale hanno bassi livelli di MR e sono debolmente colorate dall’anticorpo PAM-1 (Allavena et al. 1998). The monoclonal antibody (PAM-1 clone) generated by immunizing mice with human alveolar macrophages (Biondi et al. 1984) recognizes the mannose receptor expressed on DCs (Uccini et al. 1997). The antibody is widely available in the scientific community. Immature DCs, which express high levels of MR, are strongly positive for reactivity with Ab PAM-1. Conversely, DCs that have reached terminal maturation have low levels of MR and are weakly stained by the PAM-1 antibody (Allavena et al. 1998).

L’anticorpo PAM-1 è anche in grado di bloccare funzionalmente l’interalizzazione di zuccheri che legano il MR, indicando che Γ anticorpo riconosce un dominio funzionalmente importante per l’intemalizzazione del rigando (Longoni et al. 1998). The PAM-1 antibody is also able to functionally block the internalization of sugars that bind the MR, indicating that the antibody recognizes a functionally important domain for the internalization of the stripe (Longoni et al. 1998).

Riassunto dell’invenzione Summary of the invention

È stato dimostrato che cellule dendritiche generate in vitro a partire da precursori monocitari esprimono elevati livelli del recettore per il mannosio riconosciuto in modo specifico dall’anticorpo monoclonale PAM-1. E stato sorprendentemente riscontrato che l’esposizione in vitro di cellule dendritiche all’ anticorpo PAM-1 in appropriate condizioni sperimentali, stimola queste cellule attraverso il recettore per il mannosio e induce in queste cellule uno stato di attivazione particolare. Questo particolare stato di attivazione è caratterizzato dall’espressione di molecole di superficie e dell’acquisizione di funzioni normalmente associate allo stadio di maturazione terminale delle cellule dendritiche; nel contempo, le cellule dendritiche stimolate con PAM-1 sono incapaci di produrre interleuchina-12, un fattore solubile importante per la stimolazione dei linfociti T e producono invece citochine soppressive, quali IL- 10. La produzione di IL- 10 e la mancanza di IL- 12 comporta che i linfociti T che vengono a contatto con le cellule dendritiche trattate con PAM-1 diventino iporesponsivi ad una stimolazione antigenica quando ripetutamente stimolati. L’induzione di uno stato di attivazione funzionale delle cellule dendritiche ottenuta stimolando il recettore per il mannosio con PAM-1 è a tutt’oggi un fenomeno nuovo. È pertanto oggetto della presente invenzione l’uso dell’anticorpo PAM-1 per l’attivazione di cellule dendritiche che esprimono il recettore per il mannosio. È inoltre oggetto della presente invenzione l’uso di qualunque reagente che riconoscendo i domini riconosciuti da PAM-1 ne induce lo stesso stato di attivazione funzionale. It has been shown that dendritic cells generated in vitro from monocyte precursors express high levels of the mannose receptor specifically recognized by the PAM-1 monoclonal antibody. It was surprisingly found that the in vitro exposure of dendritic cells to the PAM-1 antibody under appropriate experimental conditions stimulates these cells through the mannose receptor and induces a particular state of activation in these cells. This particular state of activation is characterized by the expression of surface molecules and the acquisition of functions normally associated with the terminal maturation stage of dendritic cells; at the same time, dendritic cells stimulated with PAM-1 are unable to produce interleukin-12, a soluble factor important for the stimulation of T lymphocytes and instead produce suppressive cytokines, such as IL-10. The production of IL-10 and the lack of IL-12 causes T lymphocytes that come in contact with PAM-1 treated dendritic cells to become hyporesponsive to antigenic stimulation when repeatedly stimulated. The induction of a state of functional activation of the dendritic cells obtained by stimulating the mannose receptor with PAM-1 is still a new phenomenon. Therefore, the subject of the present invention is the use of the PAM-1 antibody for the activation of dendritic cells that express the mannose receptor. The subject of the present invention is also the use of any reagent which, recognizing the domains recognized by PAM-1, induces the same state of functional activation.

Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention

L’ anticorpo PAM-1 è stato generato immunizzando topi BalbC con macrofagi alveolari umani (Biondi et al. 1984) e caratterizzato come reagente che riconosce in modo specifico il recettore per il mannosio (Uccini et al. The PAM-1 antibody was generated by immunizing BalbC mice with human alveolar macrophages (Biondi et al. 1984) and characterized as a reagent that specifically recognizes the mannose receptor (Uccini et al.

1997). Questo anticorpo è funzionalmente attivo nel bloccare il legame di uno zucchero (destrano) al recettore per il mannosio (Longoni et al. 1998). L’ anticorpo è stato purificato su colonne di immunoaffinità secondo metodiche correnti e controllato per essere privo di endotossina. 1997). This antibody is functionally active in blocking the binding of a sugar (dextran) to the mannose receptor (Longoni et al. 1998). The antibody was purified on immunoaffinity columns according to current methods and checked to be free of endotoxin.

L’induzione di uno stato di maturazione in cellule dendritiche ottenuto attraverso la stimolazione del recettore per il mannosio non è mai stato descritto in precedenza. Il recettore per il mannosio è un recettore implicato nell’endocitosi di carboidrati e di proteine mannosilate e finora è stato considerato soltanto quale struttura di membrana che trasporta sostanze da internalizzare nel citoplasma. L’evidenza che il recettore per il mannosio possa causare attivazione di cellule che esprimono il MR è un fenomeno nuovo. È noto che un recettore di membrana può essere attivato con un anticorpo specifico che mima l’ingaggio del rigando naturale. Tuttavia l’entità della stimolazione dipende dalle caratteristiche dell’ anticorpo e soprattutto dall’epitopo specifico riconosciuto dall’ anticorpo. The induction of a state of maturation in dendritic cells obtained through the stimulation of the mannose receptor has never been previously described. The mannose receptor is a receptor involved in the endocytosis of carbohydrates and mannosylated proteins and has so far been considered only as a membrane structure that carries substances to be internalized in the cytoplasm. The evidence that the mannose receptor can cause activation of cells that express MR is a new phenomenon. It is known that a membrane receptor can be activated with a specific antibody that mimics the engagement of the natural stripe. However, the extent of the stimulation depends on the characteristics of the antibody and above all on the specific epitope recognized by the antibody.

Lo stato di attivazione funzionale delle DC indotto dall’ anticorpo PAM-1 è tuttavia particolare, in quanto queste cellule non sono in grado di produrre IL- 12, una citochina che ha grande importanza nell’ avvio della risposta immunitaria. Inoltre le DC trattate con PAM-1 producono maggiori quantità di IL- 10, una citochina immunosoppressiva che riduce fortemente la risposta immune e infiammatoria. Ne consegue che i linfociti T venuti a contatto con DC trattate con PAM-1, dopo una iniziale risposta proliferativa, diventano iporesponsivi ad ulteriori stimolazioni antigeniche. The state of functional activation of DCs induced by the PAM-1 antibody is however particular, as these cells are unable to produce IL-12, a cytokine that has great importance in initiating the immune response. In addition, DCs treated with PAM-1 produce greater quantities of IL-10, an immunosuppressive cytokine that strongly reduces the immune and inflammatory response. It follows that the T lymphocytes that come into contact with DC treated with PAM-1, after an initial proliferative response, become hyporesponsive to further antigenic stimulations.

L’ anticorpo PAM-1 quindi attiva in modo unico le DC, in quanto queste cellule acquisiscono proprietà immunosoppressive, antiinfiammatorie e tollerogeniche. The PAM-1 antibody therefore activates DCs in a unique way, as these cells acquire immunosuppressive, anti-inflammatory and tolerogenic properties.

Esempio 1 Example 1

Capacità unica dell’ anticorpo PAM-1 di attivare le cellule dendritiche. Questo esperimento è stato effettuato per verificare e valutare la capacità dell’anticorpo PAM-1 di indurre l’espressione di molecole di superficie associate alla maturazione di DC. Unique ability of the PAM-1 antibody to activate dendritic cells. This experiment was carried out to verify and evaluate the ability of the PAM-1 antibody to induce the expression of surface molecules associated with the maturation of DC.

Cellule dendritiche sono state differenziate in vitro da monociti purificati da sangue periferico umano e coltivate in vitro per 6 giorni in terreno RPMI 1640 10% FCS con citochine, GM-CSF (50 ng/ml) e IL- 13 (20 ng/ml) secondo metodiche ormai ben stabilite (Allavena et al. 1998). Queste cellule hanno le caratteristiche di cellule dendritiche allo stadio immaturo, come già descritto (Allavena et al. 1998). L’aggiunta alle cellule (5xl05/ml) al 6° giorno di coltura dell’anticorpo PAM-1 purificato, alle dosi di 1 μg/ml per 24h a 37°C, ha indotto uno stato di attivazione della maturazione, valutato sperimentalmente come nuova espressione di molecole di superficie (CD86 e CD83), assenti nelle cellule dendritiche immature, e normalmente associate allo stadio maturo indotto ad esempio da fattori infiammatori quali LPS (Fig. 1). L’utilizzo di un reagente simile, cioè un diverso anticorpo anti-recettore del mannosio (19.2) di origine murina e dello stesso tipo di sottoclasse immunoglobulinica (IgGl) non aveva questo effetto, confermando la specificità dell’azione di PAM-1. Dendritic cells were differentiated in vitro from monocytes purified from human peripheral blood and cultured in vitro for 6 days in RPMI 1640 10% FCS medium with cytokines, GM-CSF (50 ng / ml) and IL-13 (20 ng / ml) according to well established methods (Allavena et al. 1998). These cells have the characteristics of dendritic cells in the immature stage, as already described (Allavena et al. 1998). The addition to the cells (5xl05 / ml) on the 6th day of culture of the purified PAM-1 antibody, at doses of 1 μg / ml for 24h at 37 ° C, induced a state of activation of the maturation, experimentally evaluated as new expression of surface molecules (CD86 and CD83), absent in immature dendritic cells, and normally associated with the mature stage induced for example by inflammatory factors such as LPS (Fig. 1). The use of a similar reagent, that is, a different anti-mannose receptor antibody (19.2) of murine origin and of the same type of immunoglobulin subclass (IgGl) did not have this effect, confirming the specificity of the action of PAM-1.

Esempio 2 Example 2

Capacità dell’ anticorpo PAM-1 di attivare funzionalmente la capacità stimolatoria di cellule dendritiche. Ability of the PAM-1 antibody to functionally activate the stimulatory capacity of dendritic cells.

Questo esperimento è stato effettuato per verificare e valutare la capacità dell’anticorpo PAM-1 di attivare funzionalmente le cellule dendritiche in un saggio di reazione leucocitaria mista (MLR) con linfociti T allogenici. In questo esperimento le cellule dendritiche immature (5x105/ml) ottenute come nell’ esempio 1, sono coltivate in terreno RPMI 1640 10% FCS e trattate con dosi decrescenti di PAM-1 (1, 0.1, 0.01μg/ml) per 24h a 37°C. Alla fine dell’incubazione le cellule dendritiche vengono raccolte, lavate con PBS e cocoltivate con linfociti T di un soggetto diverso (allogenico) da quello utilizzato per la coltura di cellule dendritiche. La cocoltura utilizza linfociti T a concentrazioni fisse (200.000/pozzetto, piastre da coltura a 96 pozzetti) e numeri decrescenti di cellule dendritiche in proporzioni tali da avere un rapporto di cellule dendritiche pari al 10%, 3% e 1% di cellule dendritiche rispetto ai linfociti T. La cocoltura viene protratta per 5 g a 37°C e viene valutata la proliferazione dei linfociti T (le cellule dendritiche non proliferano in quanto precedentemente irradiate) mediante incorporazione di 3H-timidina. I risultati ottenuti riportati in Fig. 2 mostrano che le cellule dendritiche pretrattate con PAM-1 sono in grado di far proliferare i linfociti T in modo più efficiente delle cellule dendritiche immature. La Fig. 2 inoltre mostra che questo effetto è dose-dipendente, ed è ancora presente alla dose di 0.1 μg/ml di PAM-1, ma scompare alla dose inferiore di 0.01 μg/ml. This experiment was carried out to verify and evaluate the ability of the PAM-1 antibody to functionally activate dendritic cells in a mixed leukocyte reaction (MLR) assay with allogeneic T lymphocytes. In this experiment the immature dendritic cells (5x105 / ml) obtained as in example 1, are cultured in RPMI 1640 10% FCS medium and treated with decreasing doses of PAM-1 (1, 0.1, 0.01μg / ml) for 24h to 37 ° C. At the end of the incubation, the dendritic cells are collected, washed with PBS and co-cultured with T lymphocytes of a different subject (allogeneic) from the one used for dendritic cell culture. The coculture uses T lymphocytes at fixed concentrations (200,000 / well, 96-well culture plates) and decreasing numbers of dendritic cells in proportions such as to have a ratio of dendritic cells of 10%, 3% and 1% of dendritic cells to to T lymphocytes. The coculture is continued for 5 g at 37 ° C and the proliferation of T lymphocytes (dendritic cells do not proliferate as previously irradiated) is evaluated by incorporation of 3H-thymidine. The results obtained reported in Fig. 2 show that dendritic cells pretreated with PAM-1 are able to proliferate T lymphocytes more efficiently than immature dendritic cells. Fig. 2 also shows that this effect is dose-dependent, and is still present at the dose of 0.1 μg / ml of PAM-1, but disappears at the lower dose of 0.01 μg / ml.

Esempio 3 Example 3

Capacità dell’anticorpo PAM-1 di inibire lendocitosi di cellule dendritiche Ability of the PAM-1 antibody to inhibit endocytosis of dendritic cells

Questo esperimento è stato effettuato per valutare la capacità di PAM-1 di inibire l’endocitosi di DC in un saggio di interalizzazione di albumina legata ad un tracciante fluorescente. La capacità endocitica di cellule dendritiche è mediata, oltre che dal recettore per il mannosio, anche da movimenti attivi della membrana cellulare. L’ interalizzazione di albumina fluorescente (Fitc-Alb) avviene con questo meccanismo, che è indipendente dall’attività del recettore per il mannosio. In questo esperimento cellule dendritiche allo stadio immaturo sono state coltivate per differenziazione da monociti, come descritto nell’ esperimento 1. Le cellule dendritiche (5xl05/ml) sono state trattate con PAM-1 (1 μg/ml) per 24 h a 37°C. Alla fine dell’incubazione sono state raccolte, lavate con PBS e incubate 1 h a 37°C con 1 mg/ml di Fitc-Albumina. Sono state successivamente lavate e analizzate al FACS per la determinazione della fluorescenza incorporata dalle cellule. I risultati riportati nella Fig.3 mostrano che le cellule dendritiche pretrattate con PAM- 1 hanno una attività endocitica minore rispetto alle cellule immature non trattate. Poiché le cellule mature perdono la capacità di internalizzare la Fitc-Alb, come infatti succede nel gruppo di cellule trattate con LPS, questi risultati indicano che il trattamento con PAM-1 ha indotto una attivazione funzionale delle cellule dendritiche tipica dello stadio differenziativo maturo. This experiment was performed to evaluate the ability of PAM-1 to inhibit DC endocytosis in an albumin interalization assay linked to a fluorescent tracer. The endocytic capacity of dendritic cells is mediated not only by the mannose receptor but also by active movements of the cell membrane. The integration of fluorescent albumin (Fitc-Alb) occurs with this mechanism, which is independent of the activity of the mannose receptor. In this experiment immature stage dendritic cells were cultured by differentiation from monocytes, as described in experiment 1. Dendritic cells (5xl05 / ml) were treated with PAM-1 (1 μg / ml) for 24 h at 37 ° C . At the end of the incubation they were collected, washed with PBS and incubated for 1 h at 37 ° C with 1 mg / ml of Fitc-Albumin. They were subsequently washed and analyzed at FACS for the determination of the fluorescence incorporated by the cells. The results reported in Fig. 3 show that PAM-1 pretreated dendritic cells have less endocytic activity than untreated immature cells. Since mature cells lose the ability to internalize Fitc-Alb, as indeed happens in the group of cells treated with LPS, these results indicate that treatment with PAM-1 induced functional activation of dendritic cells typical of the mature differentiation stage.

Esempio 4 Example 4

Capacità dell’ Ab PAM-1 di attivare la produzione di IL- 10 in PC DC immature vengono seminate in piastre da coltura da 24 pozzetti alla concentrazione di 1x106/ml in 1 ml di RPMI 1640+10% FCS e incubate con PAM-1 (1 ug/ml) per 24 ore a 37°C. Altri gruppi di DC non erano trattate o erano stimolati con LPS da solo, LPS Interferone γ, o combinazioni di PAM-1 e LPS o PAM-1 e IFN γ. Alla fine dell’ incubazione i sumatanti privi di cellule sono stati raccolti e analizzati per il contenuto di IL- 10 e IL- 12 con metodo ELISA. Come mostrato nella figura 4 le DC trattate con PAM-1 producono livelli più alti di IL- 10 rispetto alle DC non trattate. Inoltre la quantità di IL- 12 prodotta è ancora superiore se oltre allo stimolo di PAM-1 si associa uno stimolo infiammatorio come LPS. Ab PAM-1 ability to activate IL-10 production in immature PC DCs are seeded in 24-well culture plates at a concentration of 1x106 / ml in 1 ml of RPMI 1640 + 10% FCS and incubated with PAM-1 (1 ug / ml) for 24 hours at 37 ° C. Other DC groups were either untreated or stimulated with LPS alone, LPS Interferon γ, or combinations of PAM-1 and LPS or PAM-1 and IFN γ. At the end of the incubation, the cell-free sumpatants were collected and analyzed for the content of IL-10 and IL-12 with the ELISA method. As shown in Figure 4, DCs treated with PAM-1 produce higher levels of IL-10 than untreated DCs. Furthermore, the quantity of IL-12 produced is even higher if, in addition to the PAM-1 stimulus, an inflammatory stimulus such as LPS is associated.

Negli stessi surnatanti è stata misurata la presenza di IL- 12. PAM-1, pur inducendo uno stato attivatorio nelle DC, non stimola la produzione di IL- 12 e riduce fortemente quella indotta da LPS. Poiché la produzione di IL- 12 è regolata in modo negativo da IL-10, era lecito supporre che l’elevata quantità di IL-10 stimolata da PAM-1 spegnesse la produzione di IL-12. L’aggiunta alle cellule di un anticorpo neutralizzante IL-10 ha dimostrato che, annullando l’effetto di IL-10, la produzione di IL-12 in cellule trattate con LPS+PAM-1 era effettivamente più elevata. In conclusione questi risultati indicano che PAM-1 stimola nelle DC la capacità di produrre IL-10 ma non IL-12. La produzione di IL-10, inoltre, ha un effetto negativo sulla produzione di IL-12. In the same supernatants the presence of IL-12 was measured. PAM-1, although inducing an activating state in DCs, does not stimulate the production of IL-12 and strongly reduces that induced by LPS. Since the production of IL-12 is negatively regulated by IL-10, it was safe to assume that the high amount of IL-10 stimulated by PAM-1 shut down the production of IL-12. The addition of an IL-10 neutralizing antibody to the cells showed that, by canceling the effect of IL-10, the production of IL-12 in cells treated with LPS + PAM-1 was actually higher. In conclusion, these results indicate that PAM-1 stimulates the ability to produce IL-10 but not IL-12 in DCs. The production of IL-10 also has a negative effect on the production of IL-12.

Claims

CLAIMS 1. Use of substances capable of recognizing the molecular domain of the mannose receptor of dendritic cells recognized by the monoclonal antibody PAM-1, activating the receptor itself, for the preparation of immunosuppressive, anti-inflammatory or tolerogenic drugs.

2. Use according to claim 1 in which the substance is the PAM-1 antibody.

3. Use of substances capable of recognizing the molecular domain of the mannose receptor recognized by the PAM-1 monoclonal antibody for the in vitro functional activation of dendritic cells.

4. An in vitro method for the functional activation and stimulation of interleukin 10 production by dendritic cells, which includes contacting a cell culture with a substance capable of recognizing the molecular domain of the mannose receptor recognized by the PAM-1 monoclonal antibody and thus activating the receptor itself.

A method according to claim 4 wherein the dendritic cells are contacted with Γ PAM-1 antibody.

6. Use of dendritic cells obtainable from claims 4-5 for the preparation of immunosuppressive, anti-inflammatory or tolerogenic medicaments.