ITMI20002041A1 - METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE SMN1 GENE - Google Patents
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Description
TITOLARE: CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE ROMA OWNER: NATIONAL RESEARCH COUNCIL ROME
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione concerne un metodo per la determinazione quantitativa del gene SMN1, responsabile dell'atrofia muscolare spinale (SMA). The present invention relates to a method for the quantitative determination of the SMN1 gene, responsible for spinal muscular atrophy (SMA).
Più in particolare,' l'invenzione ha per oggetto un metodo di dosaggio accurato del gene SMN1, che permette, quando si confrontino i valori ottenuti con dei valori di riferimento, di identificare i portatori sani della malattia e di confermare la diagnosi nei pazienti che non presentano la delezione in omozigosi del gene stesso. More specifically, the object of the invention is a method of accurate dosage of the SMN1 gene, which allows, when comparing the values obtained with reference values, to identify healthy carriers of the disease and to confirm the diagnosis in patients who they do not have the homozygous deletion of the gene itself.
L'atrofia muscolare spinale (SMA) è una patologia neuromuscolare caratterizzata dalla degenerazione dei motoneuroni delle corna anteriori del midollo spinale che si presenta in tre forme a trasmissione autosomico recessiva classificate sulla base dell'età di insorgenza, della capacità motoria e dell'aspettativa di vita, e che si configurano come condizioni patologiche fortemente invalidanti ad esito molto spesso letale. L'incidenza complessiva alla nascita delle tre forme di SMA autosomiche recessive è di 1:10.000 nati vivi ed una frequenza degli eterozigoti di 1:50. Il locus per tutte e tre le forme di SMA è stato mappato mediante tecniche di linkage sul braccio lungo del cromosoma 5, in posizione 5qll.2-12.3 (Brzustowicz et al, Nature, 1990, 344:540-541; Melki et al., Nature, 1990, 344:767-768) . All'interno della regione candidata è stato isolato un gene definito SMN (dall'inglese "Survival Motor Neuron") che risulta specificamente deleto nei pazienti affetti da SMA. Nei soggetti sani esistono due copie altamente omologhe del gene SMN che differiscono in sole 5 posizioni nucleotidiche lungo una sequenza di circa 20.0.00 basi; in particolare, la differenza di un solo nucleotide nell'esone 7 costituisce la differenza critica tra i due geni (Lorson et al. Proc. Nati. Acad. Sci, 1999, 96: 6307-6311). Spinal muscular atrophy (SMA) is a neuromuscular disease characterized by the degeneration of the motor neurons of the anterior horns of the spinal cord that occurs in three forms of autosomal recessive transmission classified on the basis of age of onset, motor capacity and expectation of life, and which are configured as highly disabling pathological conditions with very often lethal outcome. The overall incidence at birth of the three autosomal recessive forms of SMA is 1: 10,000 live births and a heterozygote frequency of 1:50. The locus for all three forms of SMA was mapped by linkage techniques on the long arm of chromosome 5, at position 5qll.2-12.3 (Brzustowicz et al, Nature, 1990, 344: 540-541; Melki et al. , Nature, 1990, 344: 767-768). Within the candidate region, a gene called SMN (from the English "Survival Motor Neuron") has been isolated which is specifically deleted in patients with SMA. In healthy subjects there are two highly homologous copies of the SMN gene that differ in only 5 nucleotide positions along a sequence of about 20.0.00 bases; in particular, the difference of a single nucleotide in exon 7 constitutes the critical difference between the two genes (Lorson et al. Proc. Nati. Acad. Sci, 1999, 96: 6307-6311).
La copia del gene sito in posizione telomerica è detta SMN1 (o SMNt) è deleta nel 95 3⁄4 dei pazienti (Lefebvre et al., Celi, 1995, 8_0:1-11; Biros and Forrest, J. Med. Genet.,1999, ^36:1-8) mentre la delezione della coppia centromerica detta SMN2 (o SMNc) non produce effetti fenotipici noti. The copy of the gene located in the telomeric position is called SMN1 (or SMNt) is deleted in 95 3⁄4 of patients (Lefebvre et al., Celi, 1995, 8_0: 1-11; Biros and Forrest, J. Med. Genet. , 1999, ^ 36: 1-8) while the deletion of the centromeric pair called SMN2 (or SMNc) does not produce known phenotypic effects.
Data l'elevata omologia tra SMN1 e SMN2, la diagnosi molecolare e l'identificazione dei portatori risulta particolarmente difficile. Given the high homology between SMN1 and SMN2, molecular diagnosis and carrier identification is particularly difficult.
Oltre alla delezione in omozigosi del gene SMN1, sono state descritte rare alterazioni geniche correiabili alla malattia; in particolare i pazienti SMA negativi per delezione del gene SMN1 sono considerati emizigoti "composti" cioè soggetti che presentano la delezione di un allele e una mutazione puntiforme sull'altro allele (Wirth et al., Am. J. Hum. Genet., 1999, 64:1340-1356). Negli ultimi anni sono stati messi a punto numerosi test finalizzati alla dignosi molecolare pre e post natale di SMA (Lefebvre et al., 1995, van der Steege et al. Lancet, 1995, 345:985-986; Novelli et al., Clin. Chem, 1996, 4^:643-644) ma nessuno di questi si è dimostrato utile alla individuazione di soggetti portatori sani (McAndrew et al., . J. Hum. Genet., 1997, *50:1411-1422). In particolare, data l'elevata omologia tra i due geni SMN1 e SMN2, la loro distinzione mediante tecniche di PCR risulta oggettivamente difficile e non applicabile su larga scala. In addition to the homozygous deletion of the SMN1 gene, rare gene alterations correctable to the disease have been described; in particular, SMA patients negative for deletion of the SMN1 gene are considered "compound" hemizygotes, that is subjects who have the deletion of one allele and a point mutation on the other allele (Wirth et al., Am. J. Hum. Genet., 1999 , 64: 1340-1356). In recent years, numerous tests aimed at the pre and postnatal molecular diagnosis of SMA have been developed (Lefebvre et al., 1995, van der Steege et al. Lancet, 1995, 345: 985-986; Novelli et al., Clin . Chem, 1996, 4 ^: 643-644) but none of these proved useful for the identification of healthy carriers (McAndrew et al.,. J. Hum. Genet., 1997, * 50: 1411-1422). In particular, given the high homology between the two SMN1 and SMN2 genes, their distinction by means of PCR techniques is objectively difficult and not applicable on a large scale.
Esiste quindi il bisogno di un test sensibile e riproducibile a basso costo per la determinazione quantitativa del gene SMN1, in particolare per la sua determinazione quantitativa rispetto ad un gene di controllo, in modo da poterne individuare il numero di copie . There is therefore a need for a sensitive and reproducible low-cost test for the quantitative determination of the SMN1 gene, in particular for its quantitative determination with respect to a control gene, in order to be able to identify the number of copies.
Oggetto della presente invenzione è quindi un nuovo metodo per la determinazione quantitativa del gene SMN1 . The object of the present invention is therefore a new method for the quantitative determination of the SMN1 gene.
Più in particolare, là presente invenzione concerne un nuovo metodo non radioattivo che utilizza l'analisi SSCP (dall'inglese "Single Strand Conformational Polymorphism) per la quantificazione delle copie del gene SMN1 presenti nel DNA di un soggetto esaminato, rispetto a un gene di controllo. More specifically, the present invention relates to a new non-radioactive method which uses SSCP analysis (from the English "Single Strand Conformational Polymorphism) for the quantification of copies of the SMN1 gene present in the DNA of a subject examined, with respect to a check.
Un primo oggetto della presente invenzione è quindi un metodo per la determinazione quantitativa del gene SMN1 che comprende: A first object of the present invention is therefore a method for the quantitative determination of the SMN1 gene which comprises:
(a) amplificare il DNA di un soggetto con primer specifici per l'esone 7 del gene SMN1 e contemporaneamente con primer che amplificano un esone di un opportuno gene di riferimento, utilizzando uno o più nucleotidi marcati; (a) amplifying the DNA of a subject with primers specific for exon 7 of the SMN1 gene and simultaneously with primers that amplify an exon of a suitable reference gene, using one or more labeled nucleotides;
(b) sottoporre il DNA così amplificato a SSCP; (b) subjecting the thus amplified DNA to SSCP;
(c) analizzare i gel della SSCP per determinare il rapporto quantitativo SMNl/gene di riferimento. (c) analyzing the SSCP gels to determine the quantitative SMN1 / reference gene ratio.
Più particolarmente, detto gene di riferimento è un gene di singola copia, mentre detto nucleotide marcato è fluorescinato. More particularly, said reference gene is a single copy gene, while said labeled nucleotide is fluorescinated.
L'amplificazione del passaggio (a) è condotta secondo le normali tecniche note all'esperto del ramo quali la reazione a catena della polimerasi (PCR) mediante diluizione del DNA con tamponi, aggiunta dei primer opportuni, di polimerasi e dei nucleotidi; è essenziale inserire nella PCR anche uno o più nucleotidi marcati, ad esempio fluorescinati o radioattivi, al fine di sfruttarne la fluorescenza o la radioattività nelle successive analisi. The amplification of step (a) is carried out according to the normal techniques known to the skilled in the art such as the polymerase chain reaction (PCR) by diluting the DNA with buffers, adding the suitable primers, polymerase and nucleotides; it is essential to include in the PCR also one or more labeled nucleotides, for example fluorescinated or radioactive, in order to exploit their fluorescence or radioactivity in subsequent analyzes.
Un nucleotide fluorescente particolarmente vantaggioso, secondo la presente invenzione, è il Cy5™-dCTP. A particularly advantageous fluorescent nucleotide, according to the present invention, is Cy5 ™ -dCTP.
Come primer per l'esone 7 del gene SMN1, può essere utilizzato qualsiasi primer atto ad amplificare detto esone in modo specifico. As primer for exon 7 of the SMN1 gene, any primer capable of amplifying said exon in a specific way can be used.
Preferibilmente, l'esone 7 è amplificato con i primer Rlll e 541C960, descritti da Lefebvre et al., 1995. Preferably, exon 7 is amplified with primers R111 and 541C960, described by Lefebvre et al., 1995.
L'espressione "opportuno gene di riferimento" indica, nella presente invenzione, un gene di cui è certa l'esistenza di una copia singola, come ad esempio il gene del retinoblastoma (RB). Nel caso in cui quest'ultimo sia effettivamente impiegato come gene di riferimento nel metodo dell'invenzione, i primer Rbexl3F (5'-ATTACACAGTATCCTCGACA-3') e Rbexl3R (S'-TATACGAACTGGAAAGATGC-3') sono preferibilmente utilizzati per amplificare l'esone 13 del gene RB. The expression "suitable reference gene" indicates, in the present invention, a gene of which the existence of a single copy is certain, such as for example the retinoblastoma (RB) gene. If the latter is actually used as a reference gene in the method of the invention, the primers Rbexl3F (5'-ATTACACAGTATCCTCGACA-3 ') and Rbexl3R (S'-TATACGAACTGGAAAGATGC-3') are preferably used to amplify the exon 13 of the RB gene.
I prodotti della PCR sono caricati su gel per effettuare la SSCP secondo le procedure ben note, in particolare seguendo le istruzioni fornite dal produttore a seconda dei kit utilizzati, o seguendo i protocolli disponibili in letteratura. The PCR products are loaded onto gels to perform SSCP according to well-known procedures, in particular following the instructions provided by the manufacturer depending on the kits used, or following the protocols available in the literature.
Preferibilmente, si inseriscono in ogni corsa elettroforètica dei campioni di controllo, ad esempio i campioni di un soggetto con delezione in omozigosi del gene SMN1 e l'amplificato del solo esone del gene di riferimento per facilitare 1'interpretazione della SSCP. L'elettroforesi è condotta sugli apparati ben noti all'esperto del ramo; può ad esempio essere utilizzato il GenePhor Electroforesis Unit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), ma altri apparati possono ugualmente essere impiegati. Preferably, control samples are inserted in each electrophoretic run, for example the samples of a subject with homozygous deletion of the SMN1 gene and the amplification of only the exon of the reference gene to facilitate the interpretation of the SSCP. Electrophoresis is carried out on apparatuses well known to the skilled in the art; for example, the GenePhor Electroforesis Unit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) can be used, but other devices can also be used.
I gel sono quindi analizzati con gli strumenti convenzionali, per la determinazione quantitativa del gene SMN1 in rapporto al gene di controllo. The gels are then analyzed with conventional tools, for the quantitative determination of the SMN1 gene in relation to the control gene.
Secondo un aspetto particolarmente vantaggioso, l'invenzione concerne un metodo per la determinazione quantitativa del gene SMN1 che comprende: According to a particularly advantageous aspect, the invention relates to a method for the quantitative determination of the SMN1 gene which comprises:
(a') amplificare il DNA di un soggetto mediante PCR con i primer Rlll e 541C960 e contemporaneamente con i primer Rbexl3F e Rbexl3R utilizzando Cy™-dCTP come nucleotide marcato; (a ') amplifying the DNA of a subject by PCR with primers R111 and 541C960 and simultaneously with primers Rbex13F and Rbex13R using Cy ™ -dCTP as the labeled nucleotide;
(b') sottoporre il DNA così amplificato a SSCP inserendo campioni di controllo, costituiti da un campione di un soggetto con delezione in omozigosi del gene SMN1 e l'amplificato del solo esone 13 di RB; (b ') subjecting the DNA thus amplified to SSCP by inserting control samples, consisting of a sample of a subject with homozygous deletion of the SMN1 gene and the amplified of only exon 13 of RB;
(c') analizzare i gel della SSCP e determinare il rapporto quantitativo SMN1/RB. (c ') analyze the SSCP gels and determine the quantitative SMN1 / RB ratio.
I risultati del metodo dell'invenzione, quando confrontati con valori di controllo permettono di identificare i soggetti eterozigoti, cioè i soggetti portatori della delezione di una.sola copia di SMN1, che rappresentano i portatori sani della malattia SMA. L'espressione "valori di controllo" si riferisce ai dosaggi ricavati da soggetti eterozigoti e omozigoti accertati per il gene SMN1, effettuati mediante il metodo dell'invenzione. The results of the method of the invention, when compared with control values, allow to identify the heterozygous subjects, that is the subjects carrying the deletion of a single copy of SMN1, which represent the healthy carriers of the SMA disease. The expression "control values" refers to the assays obtained from heterozygous and homozygous subjects ascertained for the SMN1 gene, carried out by means of the method of the invention.
Lo stesso confronto rende possibile la conferma della diagnosi clinica di SMA nei pazienti che non mostrano la delezione in omozigosi del gene SMNl, ma che sono tuttavia degli "emizigoti composti" presentando la delezione di SMNl su di un cromosoma e una mutazione puntiforme sull'altro allele. The same comparison makes it possible to confirm the clinical diagnosis of SMA in patients who do not show the homozygous deletion of the SMN1 gene, but who are nevertheless "compound hemizygotes" presenting the SMN1 deletion on one chromosome and a point mutation on the other. allele.
Il metodo di dosaggio dell'invenzione è particolarmente semplice da riprodurre anche su larga scala e, mediante il confronto con i valori di controllo, rende possibile lo screening di un ampio numero di soggetti al fine di identificare i portatori di una patologia tanto grave come la SMA. The dosage method of the invention is particularly simple to reproduce even on a large scale and, by comparing it with the control values, makes it possible to screen a large number of subjects in order to identify the carriers of such a serious pathology as SMA.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l'invenzione ha per oggetto l'uso della SSCP per la determinazione quantitativa del gene SMNl. According to another of its aspects, the invention relates to the use of the SSCP for the quantitative determination of the SMN1 gene.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l'invenzione concerne un metodo per l'individuazione di eterozigoti del gene SMNl che comprende: According to another of its aspects, the invention relates to a method for identifying heterozygotes of the SMN1 gene which comprises:
(a'') amplificare il DNA di un soggetto con promotori (primer) specifici per l'esone 7 del gene SMNl e contemporaneamente con promotori (primer) che amplificano un opportuno esone di un gene di riferimento, utilizzando uno o più nucleotidi marcati; (a '') amplifying the DNA of a subject with specific promoters (primers) for exon 7 of the SMN1 gene and simultaneously with promoters (primers) that amplify a suitable exon of a reference gene, using one or more labeled nucleotides;
(b/') sottoporre il DNA così amplificato a SSCP; (b / ') subjecting the thus amplified DNA to SSCP;
(c'') analizzare i gel della SSCP per determinare il rapporto quantitativo SMNl/gene di riferimento (d'') confrontare il risultato dell'analisi con i valori di riferimento. (c '') analyze the SSCP gels to determine the quantitative SMN1 / reference gene ratio (d '') compare the result of the analysis with the reference values.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l'invenzione concerne un metodo per 1'individuazione di portatori sani di SMA che comprende le fasi da (a'') a (d'') sopra riportate. According to another of its aspects, the invention relates to a method for identifying healthy carriers of SMA which comprises the above steps (a '') to (d '').
L'esempio che segue illustra l'invenzione ma non intende limitarla in alcun modo. The following example illustrates the invention but is not intended to limit it in any way.
ESEMPIO 1 EXAMPLE 1
METODO PER LA VALUTAZIONE QUANTITATIVA DEL RAPPORTO SMN1/RB METHOD FOR THE QUANTITATIVE EVALUATION OF THE SMN1 / RB RATIO
Il DNA dei soggetti esaminati è stato preparato da linfociti di sangue periferico con il metodo di estrazione fenolo-cloroformio. La concentrazione del DNA gnomico è stata stabilita confrontandola con un marcatore di peso molecolare su di un gel di agarosio allo 0,8%. The DNA of the subjects examined was prepared from peripheral blood lymphocytes by the phenol-chloroform extraction method. The concentration of the gnomic DNA was established by comparing it with a molecular weight marker on a 0.8% agarose gel.
E' stata eseguita una PCR multipla semi-quantitativa basata su tre diluizioni seriali per ciascun soggetto. L'esone 7 del gene SMN1 è stato amplificato con i primer Rlll e 541C960 e con i primer Rbexl3F e Rbexl3R che amplificano l'esone 13 del gene del retinoblastoma (RB). Le condizioni della PCR sono state le seguenti: 3 diluizioni seriali di ciascun DNA (40 ng, 80 ng, 160 ng) sono state amplificate in 50 microlitri di miscela contenente tampone di reazione IX e 1,5 nM di MgCl2 (Promega Madison, WI), 25 pmol di ciascun primer, 1 U Taq DNA polimerasi (Promega), 50 microM di ciascun dATP, dGTP, dTTP e una miscela 50 microM di dCTP contenente 0,75 microi (1,0 mM) di Cy™-5-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) e 1,75 microi di dCTP (1,0 mM). Le reazioni sono state sottoposte a 24 cicli di PCR così composti: 1' 94°C, 1' 55°C, l'72°C. a reazione ultimata, 8 microi di ciascun amplificato sono stati caricati su gel di agarosio al 2% contenente 1 microg/ml di bromuro di etidio. Le immagini del gel sono state acquisite con un'apparecchiatura gel doc 1000 UV (Biorad, Hercules, CA) e sono state misurate le intensità delle bande per confermare il carattere quantitativo della PRC. Su questa base due dei tre prodotti di PCR multipli sono stati selezionati e caricati su gel di SSCP. A semi-quantitative multiple PCR was performed based on three serial dilutions for each subject. SMN1 gene exon 7 was amplified with Rll1 and 541C960 primers and Rbexl3F and Rbexl3R primers that amplify exon 13 of the retinoblastoma (RB) gene. The PCR conditions were as follows: 3 serial dilutions of each DNA (40 ng, 80 ng, 160 ng) were amplified in 50 microliters of mixture containing reaction buffer IX and 1.5 nM of MgCl2 (Promega Madison, WI ), 25 pmol of each primer, 1 U Taq DNA polymerase (Promega), 50 microM of each dATP, dGTP, dTTP and a 50 microM mixture of dCTP containing 0.75 microi (1.0 mM) of Cy ™ -5- dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) and 1.75 microi of dCTP (1.0 mM). The reactions were subjected to 24 cycles of PCR composed as follows: 1 '94 ° C, 1' 55 ° C, 72 ° C. at the end of the reaction, 8 microi of each amplification were loaded on 2% agarose gel containing 1 microg / ml of ethidium bromide. Gel images were acquired with a doc 1000 UV gel apparatus (Biorad, Hercules, CA) and the intensities of the bands were measured to confirm the quantitative character of the PRC. On this basis two of the three multiple PCR products were selected and loaded onto SSCP gels.
Gli SSCP sono stati seguiti con il Kit GeneGel Excel 12.5/24 (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) secondo le istruzioni del produttore e 1'elettroforesi è stata condotta su GenePhor Electrophoresis Unit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont/ UK). Il campione di un soggetto con una delezione in omozigosi del gene SMN1 e l'amplificato del solo esone 13 di RB sono stati inseriti in ogni corsa per facilitare l'interpretazione del pattern degli SSCP. I gel sono stati analizzati su di uno strumento Storiti 860 (Molecular Dynamics, Little Chalfont, UK) e il rapporto SMN1/RB è stato quantificato con il software ImageQuant 5.0 (Molecular Dynamics, Little Chalfont, UK). La media delle due osservazioni di ciascun soggetto è stata considerata il miglior valore del rapporto SMNl/RB. The SSCPs were followed up with the GeneGel Excel 12.5 / 24 Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) according to the manufacturer's instructions and electrophoresis was performed on the GenePhor Electrophoresis Unit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont / UK). The sample of a subject with a homozygous deletion of the SMN1 gene and the amplification of the RB exon 13 alone were inserted in each run to facilitate the interpretation of the SSCP pattern. The gels were analyzed on a Storiti 860 instrument (Molecular Dynamics, Little Chalfont, UK) and the SMN1 / RB ratio was quantified with ImageQuant 5.0 software (Molecular Dynamics, Little Chalfont, UK). The average of the two observations of each subject was considered the best value of the SMN1 / RB ratio.
CONFRONTO DEI RISULTATI SMN1/RB DEI SOGGETTI ESAMINATI CON PARAMETRI DI RIFERIMENTO COMPARISON OF SMN1 / RB RESULTS OF THE SUBJECTS EXAMINED WITH REFERENCE PARAMETERS
Soggetti Subjects
È stato eseguito uno studio su 56 portatori sani di SMA e su 20 soggetti non affetti di controllo. Al fine di escludere la presenza di eventi di delezione de novo, sono stati classificati come portatori solo i genitori di almeno due figli affetti da SMA con delezione SMN accertata. I soggetti scelti come controllo erano i fratelli sani di pazienti SMA selezionati sulla base dell'assenza accertata con analisi di "linkage" degli aplotipi a rischio. Inoltre sette pazienti SMA privi della delezione SMN1 ed i rispettivi genitori sono stati inclusi nello studio per verificare il loro stato di emizigoti "composti". Questi pazienti rientravano nei criteri diagnostici per la SMA prossimale definiti dal Consorzio Internazionale per le SMA. Il DNA dei soggetti è stato prelevato e trattato come descritto nel METODO sopra riportato. A study was performed on 56 healthy SMA carriers and 20 unaffected control subjects. In order to exclude the presence of de novo deletion events, only parents of at least two children affected by SMA with confirmed SMN deletion were classified as carriers. The subjects chosen as controls were the healthy siblings of SMA patients selected on the basis of the ascertained absence with linkage analysis of the haplotypes at risk. In addition, seven SMA patients without SMN1 deletion and their parents were included in the study to verify their "compound" hemizygotic status. These patients met the diagnostic criteria for proximal SMA defined by the International Consortium for SMA. The subjects' DNA was collected and treated as described in the METHOD reported above.
Analisi dei risultati Analysis of the results
Nei 56 individui portatori di SMA e nei 20 controlli è stato eseguito il dosaggio di SMN1/RB al fine di verificare l'affidabilità del metodo nel dosare l'SMNl. la media del rapporto SMN1/RB /- DS è risultata essere 0,75+/- 0,23 per i soggetti non eterozigoti e 0,39+/-0,09 per i portatori con differenza significativa tra i due gruppi. 54 soggetti eterozigoti su 56 sono risultati compatibili con la presenza di una singola copia dell'esone 7 di SMN1. i rimanenti due pazienti avevano valori di SMN1/RB compatibili con una duplice copia di SMN1, ipotizzabile sullo stesso cromosoma. La sensibilità e la specificità del test sono risultate rispettivamente del 96,43⁄4 e del 983⁄4. In the 56 individuals with SMA and in the 20 controls, the SMN1 / RB assay was performed in order to verify the reliability of the method in assaying SMN1. the mean of the SMN1 / RB / - SD ratio was found to be 0.75 +/- 0.23 for non-heterozygous subjects and 0.39 +/- 0.09 for carriers with significant difference between the two groups. 54 out of 56 heterozygous subjects were compatible with the presence of a single copy of SMN1 exon 7. the remaining two patients had SMN1 / RB values compatible with a double copy of SMN1, hypothesized on the same chromosome. The sensitivity and specificity of the test were found to be 96.43⁄4 and 983⁄4 respectively.
Il metodo dell'invenzione permette quindi di dosare con elevata sensibilità e specificità le quantità di gene SMN1 presenti nel DNA di un dato soggetto. The method of the invention therefore allows the quantities of SMN1 gene present in the DNA of a given subject to be determined with high sensitivity and specificity.
Claims (7)
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