ITMI20000497A1

ITMI20000497A1 - PARTRICINE PURIFICATION PROCESS.

Info

Publication number: ITMI20000497A1
Authority: IT
Inventors: Tiberio Bruzzese; Valerio Maria Ferrari
Original assignee: Quatex Nv
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2000-03-13
Publication date: 2001-09-13
Also published as: IT1318386B1

Description

Descrizione di un’invenzione industriale nome: Description of an industrial invention named:

L'invenzione concerne un processo per la purificazione della partricina. In particolare, l'invenzione si riferisce ad un processo per la purificazione della partricina dal micelio isolato da brodi di fermentazione contenenti partricina A e/o B; l'invenzione concerne inoltre un processo per la preparazione di derivati esterei o amidici al carbossile e/o amidici all'azoto micosaminico della partricina A e/o B. The invention relates to a process for the purification of partricin. In particular, the invention relates to a process for the purification of partricin from mycelium isolated from fermentation broths containing partricin A and / or B; the invention also relates to a process for the preparation of ester or amide derivatives with carboxyl and / or amides with mycosaminic nitrogen of partricin A and / or B.

Gli antibiotici polienici costituiscono una vasta classe di sostanze a struttura macrolidica, caratterizzata da una serie di doppi legami che conferiscono alle sostanze un caratteristico spettro di assorbimento ultravioletto e ne permettono la classificazione come tetra-, penta-, esa-, ed eptaeni. I polieni sono inoltre caratterizzati da numerosi altri gruppi funzionali (p.e. ossidrili alcoolici e gruppi chetonici) e, nella grande maggioranza dei casi, da una funzione carbossilica acida e da una funzione aminica basica (appartenente ad un radicale micosaminico), che conferiscono alle sostanze proprietà anfotere . In alcuni casi è anche presente un radicale aminico aromatico. Polyene antibiotics constitute a large class of substances with a macrolide structure, characterized by a series of double bonds that give the substances a characteristic ultraviolet absorption spectrum and allow their classification as tetra-, penta-, hexa-, and heptaenes. Polyenes are also characterized by numerous other functional groups (e.g. alcoholic hydroxyls and ketone groups) and, in the vast majority of cases, by an acidic carboxylic function and a basic amino function (belonging to a mycosaminic radical), which give the substances properties amphotere. In some cases an aromatic amino radical is also present.

L'origine di tutti gli antibiotici polienici è di natura fermentativa, in quanto prodotti come metaboliti da numerosi microorganismi, come gli actinomiceti e in particolare gli streptomiceti. Un poliene di particolare interesse è rappresentato dall'eptaene partricina, prodotto per fermentazione di particolari ceppi di Streptomyces aureofaciens, ad esempio il ceppo NRRL 3878 (US Pat.3,773,925), o suoi ceppi mutati e/o di selezione ed isolamento naturale. L'interesse per la partricina risiede nella sua potentissima azione antifungina che si esplica ad ampio spettro su numerosi ceppi patogeni di Candida , Criptococcus , Aspergillus ed altri, costituendo tra l'altro una indispensabile materia prima di base per la preparazione di derivati semisintetici di elevato interesse clinicoterapeutico per la loro efficacia contro numerose patologie (US 3,780,173, US 5,298,495). The origin of all polyene antibiotics is of a fermentative nature, as they are produced as metabolites by numerous microorganisms, such as actinomycetes and in particular streptomycetes. A polyene of particular interest is represented by heptaene partricin, produced by fermentation of particular strains of Streptomyces aureofaciens, for example the strain NRRL 3878 (US Pat.3,773,925), or its mutated strains and / or of natural selection and isolation. The interest in partricin lies in its very powerful antifungal action which is expressed in a broad spectrum on numerous pathogenic strains of Candida, Criptococcus, Aspergillus and others, constituting among other things an indispensable basic raw material for the preparation of highly synthetic semisynthetic derivatives. clinicotherapeutic interest for their efficacy against numerous pathologies (US 3,780,173, US 5,298,495).

Occorre comunque rilevare che la partricina, come sostanzialmente tutti gli altri antibiotici polienici, presenta l'inconveniente — dovuto alla sua stessa origine fermentativa — di essere dotata di una scarsa purezza. Il processo fermentativo, infatti, è accompagnato dalla formazione numerosi altri metaboliti, tutti in piccola percentuale e con modeste differenze strutturali, ma che tuttavia nel loro complesso riducono sensibilmente la purezza dei componenti principali, la partricina A e B dove la forma A, a differenza della B, presenta un N-metile su un radicale aminofenilico . La stessa situazione si riscontra quando, attraverso l'impiego di microorganismi selezionati o di ceppi mutati di Streptomyces, si procede alla fermentazione dei soli componenti A o B. A tutto ciò, si aggiunge ovviamente la difficoltà dovuta agli usuali inquinanti derivanti dai brodi di fermentazione, che per loro stessa natura devono contenere come nutrienti le più svariate fonti di carboidrati e di materiale azotato assimilabile (zuccheri, amidi, lieviti, farine, ecc.), nonché sali minerali e d'ammonio , oligoelementi, tamponi ed altro. However, it should be noted that partricin, like substantially all other polyene antibiotics, has the drawback - due to its own fermentation origin - of being endowed with poor purity. The fermentation process, in fact, is accompanied by the formation of numerous other metabolites, all in small percentages and with modest structural differences, but which, however, as a whole, significantly reduce the purity of the main components, partricin A and B where form A, unlike of B, has an N-methyl on an aminophenyl radical. The same situation occurs when, through the use of selected microorganisms or mutated strains of Streptomyces, only components A or B are fermented. To all this, we obviously add the difficulty due to the usual pollutants deriving from fermentation broths. , which by their very nature must contain as nutrients the most varied sources of carbohydrates and assimilable nitrogenous material (sugars, starches, yeasts, flours, etc.), as well as mineral and ammonium salts, trace elements, buffers and more.

Un altro inconveniente, anche esso comune a tutti gli altri polieni, deriva dalla complessità della struttura della partricina stessa (Index Merck, 12a Ed., n.7181), ricca di numerosi gruppi funzionali, che compromette la selettività di reazione nel corso della preparazione di derivati semiidrolisi dell'anello macrolidico per azione dell'acqua, ossidazione causata dall'ossigeno atmosferico, isomerizzazione indotta dalla luce, polimerizzazione, ecc.). Another drawback, also common to all other polyenes, derives from the complexity of the structure of the partricin itself (Index Merck, 12th Ed., N.7181), rich in numerous functional groups, which compromises the selectivity of the reaction during the preparation. of semi-hydrolysis derivatives of the macrolide ring by the action of water, oxidation caused by atmospheric oxygen, light-induced isomerization, polymerization, etc.).

Un ulteriore effetto penalizzante e di ostacolo allo sviluppo di derivati sintetici, è rappresentato dalla scarsissima solubilità della partricina e degli altri polieni sia in acqua che nei più comuni solventi organici (etere etilico, acetone, metilene cloruro, metanolo, ecc.): tutto ciò porta inevitabilmente all'impiego di solventi altobollenti e fortemente polari (dimetilsolfossido, formamide, ecc.) e condizioni di reazione inappropriate, con conseguenti difficoltà di manipolazione, di eliminazione di solventi residui, di recupero di prodotti e solventi e, in definitiva, a minore purezza, a riduzione di rese ed aumento di costi. In rapporto alla presenza di impurezze e inquinanti, le moderne tecniche analitiche, di maggiore specificità e sensibilità come l'analisi HPLC, la cromatografia in gel permeazione, ecc., risultano poi fortemente penalizzanti, data l'oggettiva richiesta di elevata purezza per i prodotti ad uso farmaceutico. A further penalizing effect and an obstacle to the development of synthetic derivatives is represented by the very poor solubility of partricin and other polyenes both in water and in the most common organic solvents (ethyl ether, acetone, methylene chloride, methanol, etc.): all this inevitably leads to the use of high-boiling and highly polar solvents (dimethylsulfoxide, formamide, etc.) and inappropriate reaction conditions, with consequent difficulties in handling, elimination of residual solvents, recovery of products and solvents and, ultimately, less purity, to reduce yields and increase costs. In relation to the presence of impurities and pollutants, the modern analytical techniques, of greater specificity and sensitivity such as HPLC analysis, gel permeation chromatography, etc., are then strongly penalizing, given the objective request for high purity for the products. for pharmaceutical use.

L' US 3,773,925 descrive un processo in cui il mezzo di fermentazione viene acidificato e dove il micelio è raccolto per filtrazione, sospeso in un appropriato solvente, usualmente in butanolo, regolando il pH a 9,2-10,2 usualmente con idrossido di ammonio, ed in seguito separando la fase butanolica, lavata con acidi acquosi e concentrata sotto vuoto, ottenendo per raffreddamento un precipitato di partricina che viene purificato per lavaggio con solventi organici o con procedimenti cromatografici US 3,773,925 describes a process in which the fermentation medium is acidified and where the mycelium is collected by filtration, suspended in an appropriate solvent, usually in butanol, adjusting the pH to 9.2-10.2 usually with ammonium hydroxide. , and then separating the butanol phase, washed with aqueous acids and concentrated under vacuum, obtaining by cooling a precipitate of partricin which is purified by washing with organic solvents or with chromatographic procedures

L'US 4,014,994 descrive un metodo secondo il quale il brodo di fermentazione della partricina è trattato direttamente con un agente tensioattivo anionico o cationico in modo da portare la partricina in soluzione nella fase acquosa, e quindi il micelio esausto viene allontanato e la partricina recuperata dal filtrato acquoso per aggiunta di sali di metalli alcalino-terrosi e/o per aggiunta di un agente tensioattivo dotato di carica opposta al precedente. US 4,014,994 describes a method according to which the partricin fermentation broth is treated directly with an anionic or cationic surfactant so as to bring the partricin into solution in the aqueous phase, and then the exhausted mycelium is removed and the partricin recovered from the aqueous filtrate by addition of alkaline earth metal salts and / or by addition of a surfactant with opposite charge to the previous one.

Per quanto riguarda i derivati della partricina, l'US 3,780,173 descrive la preparazione del corrispondente metil estere per trattamento di una soluzione di partricina, usualmente dimetilsolfossido, con un debole eccesso di soluzione eterea di diazometano e quindi l'isolamento del prodotto per precipitazione con etere o altri solventi. La partricina metil estere è quindi purificata con miscele di solventi o con procedimenti cromatografici. As regards the derivatives of partricin, US 3,780,173 describes the preparation of the corresponding methyl ester by treating a solution of partricin, usually dimethylsulfoxide, with a weak excess of ethereal solution of diazomethane and then the isolation of the product by precipitation with ether or other solvents. The partricin methyl ester is then purified with mixtures of solvents or with chromatographic procedures.

L'US 5,296,597 riporta la preparazione di derivati amidici ottenuti sciogliendo la partricina in dimetilacetamide ed addizionando nell'ordine l'amina desiderata e il difenilfosforazidato come attivante del carbossile della partricina. Al termine della reazione il prodotto è precipitato con acqua, purificato e sottoposto a cromatografia su colonna. US 5,296,597 reports the preparation of amide derivatives obtained by dissolving partricin in dimethylacetamide and adding in the order the desired amine and diphenylphosphorazidate as activator of the partricin carboxyl. At the end of the reaction the product is precipitated with water, purified and subjected to column chromatography.

Inoltre, l'US 5,298,495 descrive la preparazione di tipici derivati N-sostituiti sul gruppo aminico della micosamina, usualmente di derivati amidici. A tale scopo la partricina o un suo carbossi-derivato (per esempio un estere o una amide) vengono sciolti in dimetilacetamide e fatti reagire con un acido idoneo (p.e. l'acido dimetilaminoacetico) opportunamente attivato con reattivi noti nella sintesi organica, per es. mediante difenilfosforazidato, edl in presenza di basi organiche terziarie. Dopo reazione, il prodotto è isolato per precipitazione con solventi e purificato per cromatografia su gel di silice, preferibilmente a media pressione, oppure per distribuzione in controcorrente secondo Craig, o con altre tecniche note nella sintesi organica (trattamento con solventi, cristallizzazione, cromatografia HPLC preparativa in fase inversa, ecc .). Furthermore, US 5,298,495 describes the preparation of typical N-substituted derivatives on the amino group of mycosamine, usually of amide derivatives. For this purpose, partricin or a carboxy-derivative thereof (for example an ester or an amide) are dissolved in dimethylacetamide and reacted with a suitable acid (e.g. dimethylaminoacetic acid) suitably activated with reactants known in organic synthesis, e.g. by diphenylphosphorazidate, edl in the presence of tertiary organic bases. After reaction, the product is isolated by precipitation with solvents and purified by chromatography on silica gel, preferably at medium pressure, or by countercurrent distribution according to Craig, or with other techniques known in organic synthesis (treatment with solvents, crystallization, HPLC chromatography reverse phase preparation, etc.).

Occorre comunque rilevare che, nonostante le precauzioni adottate, le metodiche analitiche più sensibili e specifiche, come la HPLC e la cromatografia in gel permeazione, rivelano sovente una purezza non accettabile per l'impiego farmaceutico e comunque insufficiente, tutto ciò essendo riconducibile alle ragioni sopra illustrate . However, it should be noted that, despite the precautions taken, the most sensitive and specific analytical methods, such as HPLC and gel permeation chromatography, often reveal a purity that is not acceptable for pharmaceutical use and in any case insufficient, all of which can be traced back to the above reasons. illustrated.

Secondo un primo aspetto, l'invenzione concerne un processo per la purificazione della partricina dal micelio isolato da brodi di fermentazione contenenti partricina A e/o B, che comprende, ad una temperatura minore di 80°C, preferibilmente pari a 10-50°C, in particolare 20-40°C: According to a first aspect, the invention relates to a process for the purification of partricin from mycelium isolated from fermentation broths containing partricin A and / or B, which comprises, at a temperature lower than 80 ° C, preferably equal to 10-50 ° C, especially 20-40 ° C:

a) il lavaggio del micelio in presenza di almeno un solvente organico miscibile con acqua e bassobollente, regolando il pH a 7,5-9,5; a) washing the mycelium in the presence of at least one organic solvent miscible with water and low boiling, adjusting the pH to 7.5-9.5;

b) l'estrazione, dal micelio risultante, della partricina A e/o B, in presenza di almeno un solvente organico miscibile con acqua e bassobollente, regolando il pH a 10,5-11,8; c) la precipitazione della partricina A e/o B mediante regolazione del pH a 7,5-9,5 e della temperatura a 0-10°C. b) the extraction, from the resulting mycelium, of partricin A and / or B, in the presence of at least one organic solvent miscible with water and low boiling, adjusting the pH to 10.5-11.8; c) the precipitation of partricin A and / or B by adjusting the pH to 7.5-9.5 and the temperature at 0-10 ° C.

Secondo un aspetto preferito, il processo dell'invenzione comprende inoltre: According to a preferred aspect, the process of the invention further comprises:

d) la solubilizzazione della partricina A e/o B risultante dalla fase c) in presenza di almeno un solvente organico miscibile con acqua e bassobollente; d) the solubilization of the partricin A and / or B resulting from step c) in the presence of at least one organic solvent miscible with water and low boiling;

e) l'isolamento della partricina A e/o B risultante . e) the isolation of the resulting partricin A and / or B.

Il solvente presenta preferibilmente un punto di ebollizione fra 40 e 80°C ed è selezionato dal gruppo costituito da alcoli e chetoni alifatici e da tetraidrofurano, in particolare metanolo, etanolo, isopropanolo, acetone o tetraidrofurano. Secondo un altro aspetto preferito, il solvente organico nelle fasi a), b) e d) è in miscela con acqua. The solvent preferably has a boiling point between 40 and 80 ° C and is selected from the group consisting of aliphatic alcohols and ketones and tetrahydrofuran, in particular methanol, ethanol, isopropanol, acetone or tetrahydrofuran. According to another preferred aspect, the organic solvent in steps a), b) and d) is mixed with water.

In particolare, il pH nella fase a) è regolato a 7,5-8,5, nella fase b) a 11,0-11,5 e nella fase c) a 8,0-9,0. In particular, the pH in step a) is adjusted to 7.5-8.5, in step b) to 11.0-11.5 and in step c) to 8.0-9.0.

Si è sorprendentemente trovato che il processo dell'invenzione permette di produrre partricina A e/o B con buone rese ed elevata purezza; risulta infatti possibile evitare la formazione di elevate quantità di sottoprodotti o di prodotti di degradazione o di polimerizzazione senza che siano necessarie prolungate fasi di purificazione, con conseguenti e ovvi riduzioni sensibili della resa ed elevamento dei costi, al fine di raggiungere una purezza idonea per gli usi farmaceutici. It has surprisingly been found that the process of the invention allows to produce partricin A and / or B with good yields and high purity; it is in fact possible to avoid the formation of high quantities of by-products or degradation or polymerization products without the need for prolonged purification phases, with consequent and obvious significant reductions in yield and higher costs, in order to achieve a purity suitable for the pharmaceutical uses.

Secondo un ulteriore aspetto, la partricina A e/o B risultante dalla fase c) o e) viene sottoposta a reazione al carbossile e/o all'azoto micosaminico in modo da ottenere un derivato mono- e/o disostituito, estereo o amidico al carbossile e/o amidico all'azoto micosaminico della partricina A e/o B. According to a further aspect, the partricin A and / or B resulting from step c) or e) is subjected to a reaction to the carboxyl and / or mycosaminic nitrogen so as to obtain a mono- and / or disubstituted, ester or starch derivative to the carboxyl and / or mycosamin nitrogen amide of partricin A and / or B.

La reazione è svolta in presenza di un solvente organico avente un punto di ebollizione compreso fra 40 e 120°C; il solvente, preferibilmente, è selezionato dal gruppo costituito da alcoli e chetoni alifatici, cloruro di metilene, tetraidrofurano e piridina in particolare è metanolo, etanolo, isopropanolo, acetone, cloruro di metilene, tetraidrofurano o piridina. The reaction is carried out in the presence of an organic solvent having a boiling point between 40 and 120 ° C; the solvent is preferably selected from the group consisting of aliphatic alcohols and ketones, methylene chloride, tetrahydrofuran and pyridine in particular is methanol, ethanol, isopropanol, acetone, methylene chloride, tetrahydrofuran or pyridine.

In particolare, l'esterificazione al carbossile comprende l'addizione di un diazoalcano, preferibilmente diazometano, veicolato con etere etilico o tetraidrofurano, alla partricina A e/o B, mentre l'amidazione al carbossile e/o all'azoto micosaminico comprende l'addizione di un attivante del carbossile (ad esempio difenilfosforazidato o un fenolo alogeno- o nitro- sostituito o la N-idrossisuccinimide, in particolare pentaclorofenolo o la N-idrossisuccinimide) e, rispettivamente, l'amina (ad esempio dimetilaminoetilamina) e/o l'acido (ad esempio acido dimetilaminoacetico) desiderati . In particular, the esterification to the carboxyl comprises the addition of a diazoalkane, preferably diazomethane, conveyed with ethyl ether or tetrahydrofuran, to partricin A and / or B, while the amidation to the carboxyl and / or mycosamine nitrogen comprises the addition of a carboxyl activator (e.g. diphenylphosphorazidate or a halogen- or nitro-substituted phenol or N-hydroxysuccinimide, in particular pentachlorophenol or N-hydroxysuccinimide) and, respectively, amine (e.g. dimethylaminoethylamine) and / or l desired acid (e.g. dimethylaminoacetic acid).

Il processo dell'invenzione permette inoltre, qualora s'intenda ottenere un derivato disostituito, estereo o amidico al carbossile e/o amidico all'azoto micosaminico della partricina A e/o B, di evitare l'isolamento del mono- derivato precedentemente prodotto. The process of the invention also allows, when it is intended to obtain a disubstituted derivative, ester or amide with carboxyl and / or amide with mycosaminic nitrogen of partricin A and / or B, to avoid the isolation of the previously produced mono-derivative.

Preferibilmente, all'attivante è addizionato un condensante, ad esempio una carbodiimide quale la dicicloesilcarbodiimide . Preferably, a condenser is added to the activator, for example a carbodiimide such as dicyclohexylcarbodiimide.

Secondo un altro aspetto preferito, il derivato della partricina A e/o B viene disciolto in uno dei solventi detti e successivamente precipitato in presenza di un solvente (ad esempio cloruro di metilene, etere etilico, acqua) miscibile con la miscela risultante o, in alternativa, per concentrazione parziale a temperatura e pressione ridotte . According to another preferred aspect, the derivative of partricin A and / or B is dissolved in one of the said solvents and subsequently precipitated in the presence of a solvent (for example methylene chloride, ethyl ether, water) miscible with the resulting mixture or, in alternative, for partial concentration at reduced temperature and pressure.

Preferibilmente, il derivato disciolto è trattato per percolazione o per agitazione con una resina basica forte, a scambio ionico, o con gel di silice, o con ossido di alluminio attivo. Preferably, the dissolved derivative is treated by percolation or agitation with a strong basic resin, ion exchange, or with silica gel, or with active aluminum oxide.

Ciascuna fase del processo dell'invenzione, secondo condizioni particolarmente preferite, viene effettuata in presenza di un antiossidante, in atmosfera di azoto e lontano dalla luce diretta. Secondo il processo dell'invenzione, il micelio isolato dai brodi di fermentazione, che può essere utilizzato ancora umido o preventivamente essiccato, viene trattato con una miscela costituita da uno degli usuali solventi organici miscibili con acqua e bassobollenti, opzionalmente in miscela con acqua. L'uso di solventi polari altobollenti (dimetilsolfossido, formamide, dimetilformamide, ecc.) e/o di solventi immiscibili con acqua (metilene cloruro) o solo parzialmente miscibili (butanolo), non è pertanto necessario. La sospensione miceliare viene quindi portata a pH debolmente basico, p.e. 7-9,5 , usualmente 7,5-8,5 e preferibilmente a pH 8 circa, per aggiunta di una base organica, p.e. dietilamina, tenuta in agitazione per 0,5-2 ore ad una temperatura preferibilmente pari a 20-40°C e quindi filtrata: la soluzione, per effetto del solvente organico/acquoso, contiene la maggior parte delle impurezze organiche derivanti dalla fermentazione (grassi, ecc.) e, per effetto del pH, contiene molti dei polieni di struttura affine e a carattere più prettamente acido, che altrimenti sarebbero coprecipitati nelle successive fasi di estrazioneprecipitazione, e viene pertanto scartata. Il micelio lavato e depurato viene successivamente estratto con analoga miscela solvente e, preferibilmente, con lo stesso alcalinizzante, ma portando il pH fino a 10,5-11,8, preferibilmente 11,0-11,5. Each step of the process of the invention, according to particularly preferred conditions, is carried out in the presence of an antioxidant, in a nitrogen atmosphere and away from direct light. According to the process of the invention, the mycelium isolated from the fermentation broths, which can be used still wet or previously dried, is treated with a mixture consisting of one of the usual organic solvents miscible with water and low boiling, optionally mixed with water. The use of high-boiling polar solvents (dimethylsulfoxide, formamide, dimethylformamide, etc.) and / or solvents immiscible with water (methylene chloride) or only partially miscible (butanol), is therefore not necessary. The mycelial suspension is then brought to a slightly basic pH, e.g. 7-9.5, usually 7.5-8.5 and preferably at pH 8 approximately, by addition of an organic base, e.g. diethylamine, stirred for 0.5-2 hours at a temperature preferably equal to 20-40 ° C and then filtered: the solution, due to the effect of the organic / aqueous solvent, contains most of the organic impurities deriving from fermentation (fats , etc.) and, due to the pH effect, it contains many of the polyenes with a similar structure and a more purely acidic character, which would otherwise be co-precipitated in the subsequent extraction-precipitation steps, and is therefore discarded. The washed and purified mycelium is subsequently extracted with a similar solvent mixture and, preferably, with the same alkalizing agent, but bringing the pH up to 10.5-11.8, preferably 11.0-11.5.

Dopo filtrazione ed allontanamento del micelio esausto, la soluzione viene trattata con acidi minerali, p.e. acido cloridrico, od organici fino a pH 7,5-9,5, cioè sostanzialmente allo stesso pH della precedente fase di purificazione, ottenendo così la precipitazione della partricina in condizioni di elevata purezza. La sospensione viene tenuta per 4-24 ore a 0-10°C, quindi il prodotto viene raccolto per filtrazione, lavato a fondo ed essiccato in stufa sotto vuoto e a temperatura ridotta (<40°C, ad esempio 25-30°C o temperatura ambiente). Secondo un aspetto preferito, la partricina viene ricristallizzata e/o purificata con procedimenti similari, utilizzando ad esempio miscele acetone/acqua, metanolo/acqua, tetraidrofurano/acqua, ecc. e procedendo alla solubilizzazione regolando il pH a 10,5-11,8, ad esempio mediante basi organiche, preferibilmente a 11,0-11,5, filtrazione delle soluzioni risultanti per allontanare eventuali materiali insolubili, e riprecipitazione mediante regolazione del pH a 7,5 - 9,5, preferibilmente 8-9, ad esempio con acidi minerali. After filtration and removal of the exhausted mycelium, the solution is treated with mineral acids, e.g. hydrochloric acid, or organic acids up to pH 7.5-9.5, i.e. substantially at the same pH as the previous purification step, thus obtaining the precipitation of partricin in conditions of high purity. The suspension is kept for 4-24 hours at 0-10 ° C, then the product is collected by filtration, washed thoroughly and dried in an oven under vacuum and at reduced temperature (<40 ° C, for example 25-30 ° C or room temperature). According to a preferred aspect, the partricin is recrystallized and / or purified with similar processes, using for example acetone / water, methanol / water, tetrahydrofuran / water, etc. mixtures. and proceeding with the solubilization by adjusting the pH to 10.5-11.8, for example by means of organic bases, preferably at 11.0-11.5, filtration of the resulting solutions to remove any insoluble materials, and reprecipitation by adjusting the pH to 7 , 5 - 9.5, preferably 8-9, for example with mineral acids.

Per la particolare natura della partricina, risulta vantaggioso, come è noto all'esperto del settore, condurre tutte le fasi operative in penombra e comunque lontano dalla luce solare diretta (<50 lux), in presenza di un antiossidante (p. es. acido ascorbico/sodio ascorbato) e di preferenza in atmosfera di azoto, ed evitando inoltre fasi di riscaldamento eccessivo (T< 40°C). Due to the particular nature of partricin, it is advantageous, as is known to the expert in the sector, to carry out all the operational phases in dim light and in any case away from direct sunlight (<50 lux), in the presence of an antioxidant (eg acid. ascorbic / sodium ascorbate) and preferably in a nitrogen atmosphere, and also avoiding excessive heating phases (T <40 ° C).

L'intero procedimento risulta rapido ed agevole e porta ad elevata resa e purezza ed a costi ridotti. La partricina così ottenuta, in virtù dell'elevata purezza, può inoltre essere vantaggiosamente impiegata nella preparazione dei vari derivati portando, conseguentemente, a composti notevolmente più puri e con rese superiori rispetto a quanto finora ottenibile attuando i processi noti. The whole process is quick and easy and leads to high yield and purity and reduced costs. The partricin thus obtained, by virtue of its high purity, can also be advantageously used in the preparation of the various derivatives, consequently leading to considerably purer compounds and with higher yields than what can be obtained up to now by implementing known processes.

Tra i vari derivati ottenibili, particolare interesse rivestono i derivati al carbossile della partricina, in particolare gli esteri e le amidi, e/o i derivati all'azoto aminico (micosaminico), rappresentati anche essi da amidi (N-acilderivati) . In molti casi, ma in particolare per le amidi, sono specialmente preferiti i derivati a loro volta sostituiti con gruppi basici. Nel caso più frequente, i reagenti per ottenere gli esteri al carbossile sono rappresentati dal diazometano e dai diazoalcani in genere; i reagenti per ottenere le amidi al carbossile sono rappresentati da un attivante del carbossile stesso come il difenilfosforazidato oppure da un fenolo polialogeno oppure poli-nitro-sostituito abbinati ad un condensante, come una carbodiimide (portando in oppure ancora da altri attivanti noti della sintesi organica, come la N-idrossisuccinimide, e dall' amina necessaria; i reagenti per ottenere le amidi all'azoto micosaminico sono rappresentati dall'acido necessario e da un suo attivante del carbossile come sopra definito. Among the various derivatives obtainable, the carboxyl derivatives of partricin are of particular interest, in particular esters and starches, and / or derivatives to amine nitrogen (mycosaminic), also represented by starches (N-acyl derivatives). In many cases, but in particular for starches, derivatives which are themselves substituted with basic groups are especially preferred. In the most frequent case, the reagents for obtaining the carboxyl esters are represented by diazomethane and diazoalkanes in general; the reagents for obtaining the carboxyl starches are represented by an activator of the carboxyl itself such as diphenylphosphorazidate or by a polyhalogen or poly-nitro-substituted phenol combined with a condenser, such as a carbodiimide (bringing in or still other known activators of organic synthesis , such as N-hydroxysuccinimide, and the necessary amine; the reagents to obtain the mycosaminic nitrogen starches are represented by the necessary acid and its activator of the carboxyl as defined above.

Nel caso dei derivati disostituiti, al carbossile ed all'azoto aminico, l'ordine di reazione non è discriminante. In the case of the disubstituted derivatives, to the carboxyl and to the amino nitrogen, the reaction order is not discriminating.

Un caso particolare e preferenziale è costituito da una iniziale reazione dell'azoto micosaminico della partricina con un acido attivato mediante condensazione con un poli-clorof enolo per dare un N-derivato della partricina e rilascio dell 'attivante, dalla ricondensazione in situ dell 'attivante con il carbossile della partricina, e dalla successiva condensazione con una amina per dare alla fine la desiderata diamide (all'azoto ed al carbossile) della partricina. A particular and preferential case is constituted by an initial reaction of the mycosaminic nitrogen of partricin with an acid activated by condensation with a poly-chlorophenol to give an N-derivative of partricin and release of the activator, from the in situ recondensation of the activator. with the carboxyl of partricin, and by the subsequent condensation with an amine to finally give the desired diamide (to nitrogen and carboxyl) of partricin.

Secondo un esempio di realizzazione preferito dell'invenzione, i derivati disostituiti, esterei o amidici, della partricina, possono essere ottenuti, ad esempio, facendo reagire i derivati monosostituiti al carbossile, preferibilmente in soluzione piridinica con pentaclorofenil esteri di acidi variamente sostituiti, in particolare aminosostituiti, per ottenere i corrispondenti acilderivati sull'azoto micosaminico (amidi). La reazione e la successiva purificazione sono condotte in accordo con il processo descritto nell' US 5,298,495 incorporato come riferimento nella presente descrizione. According to a preferred embodiment of the invention, the disubstituted ester or amide derivatives of partricin can be obtained, for example, by reacting the monosubstituted derivatives with the carboxyl, preferably in a pyridine solution with pentachlorophenyl esters of variously substituted acids, in particular aminosubstituted, to obtain the corresponding acyl derivatives on mycosaminic nitrogen (starches). The reaction and the subsequent purification are carried out in accordance with the process described in US 5,298,495 incorporated by reference in the present description.

Si è inoltre riscontrato che possono essere ottenuti ulteriori vantaggi conducendo le varie reazioni di sostituzione al carbossile e/o al gruppo aminico della micosamina in condizioni particolari. Anche in questo caso, l'impiego di solventi fortemente polari ed altobollenti, come il dimetilsolfossido, la formamide, la dimetilacetamide, ecc. , così frequentemente utilizzati per l'elevato potere solvente, anche verso le sostanze polieniche, nella chimica organica come pure nei documenti menzionati, è risultato superfluo e spesso svantaggioso. Viceversa, è risultato possibile l'impiego dei normali solventi aventi un punto di ebollizione fra 40 e 120°C come gli alcoli inferiori C1-C3, i solventi clorurati, il tetraidrofurano e l'acetone, fino alla piridina, da soli o in miscela tra loro per aumentarne il potere solvente. Anche una moderata quantità di acqua è utilizzabile nelle reazioni, se compatibile con la stabilità dei reagenti, come pure la presenza di basi organiche, come la trietilamina, o altri alcali (dietilamina, ammoniaca, ecc. , se compatibili con gli altri reagenti) , utili come accettori di acidi, come catalizzatori o semplicemente per aumentare la solubilità della partricina, specialmente quando il carbossile è tuttora libero. It has also been found that further advantages can be obtained by carrying out the various substitution reactions at the carboxyl and / or amine group of mycosamine under particular conditions. Also in this case, the use of highly polar and high boiling solvents, such as dimethylsulfoxide, formamide, dimethylacetamide, etc. , so frequently used due to their high solvent power, even towards polyene substances, in organic chemistry as well as in the documents mentioned, has proved superfluous and often disadvantageous. Conversely, it was possible to use normal solvents with a boiling point between 40 and 120 ° C such as lower C1-C3 alcohols, chlorinated solvents, tetrahydrofuran and acetone, up to pyridine, alone or in a mixture. between them to increase their solvent power. Even a moderate amount of water can be used in the reactions, if compatible with the stability of the reagents, as well as the presence of organic bases, such as triethylamine, or other alkalis (diethylamine, ammonia, etc., if compatible with the other reagents), useful as acceptors of acids, as catalysts or simply to increase the solubility of partricin, especially when the carboxyl is still free.

Tra i vari sistemi solventi proposti, preferibili sono quelli a base di cloruro di metilene/metanolo come pure la piridina. I volumi di solvente sono generalmente moderati, anche considerando che le reazioni possono essere condotte anche in parziale sospensione, ottenendosi poi soluzione completa con il procedere della reazione per la maggiore solubilità dei prodotti. In altri casi è possibile far reagire una soluzione completa di partricina o di un suo carbossi o N-derivato ed ottenere poi una sospensione del prodotto richiesto, meno solubile o non solubile nella stessa miscela solvente man mano che la reazione procede: questa situazione è particolarmente utile in quanto sottrae il prodotto stesso ad ulteriore reazione e formazione di sottoprodotti. In tutti i casi le reazioni procedono speditamente, con rese e purezza elevate. Come nelle fasi precedentemente descritte, risulta preferibile la limitazione della luce, dell'ossigeno atmosferico, delle temperature elevate e la presenza di antiossidanti secondo quanto noto all'esperto del settore. Among the various solvent systems proposed, those based on methylene chloride / methanol as well as pyridine are preferable. The solvent volumes are generally moderate, also considering that the reactions can also be carried out in partial suspension, thus obtaining a complete solution as the reaction proceeds due to the greater solubility of the products. In other cases it is possible to make a complete solution of partricin or its carboxy or N-derivative react and then obtain a suspension of the required product, less soluble or insoluble in the same solvent mixture as the reaction proceeds: this situation is particularly useful as it removes the product itself from further reaction and formation of by-products. In all cases the reactions proceed rapidly, with high yields and purity. As in the steps described above, it is preferable to limit light, atmospheric oxygen, high temperatures and the presence of antioxidants according to what is known to those skilled in the art.

A reazione ultimata, i prodotti vengono isolati per eliminazione parziale o totale del solvente o di uno dei componenti della miscela solvente, e/o per precipitazione mediante aggiunta di un solvente insolubilizzante , tipicamente di acqua o su scala di laboratorio di etere etilico, o altri. At the end of the reaction, the products are isolated by partial or total elimination of the solvent or of one of the components of the solvent mixture, and / or by precipitation by adding an insolubilizing solvent, typically water or on a laboratory scale of ethyl ether, or other .

La purificazione dei prodotti viene preferibilmente ottenuta mediante dissoluzione in miscele metilene cloruro/metanolo in vari rapporti, e con presenza opzionale di limitate quantità di acqua e/o basì organiche, e successiva evaporazione del cloruro di metilene a temperatura e pressione ridotte e precipitazione nel metanolo residuo se in fase adeguatamente concentrata, oppure per aggiunta di acqua o altro solvente insolubilizzante. Processi di purificazione specifici possono essere utilizzati in casi particolari, ad esempio il trattamento in sospensione con resine a scambio ionico di tipo basico forte (p.e. quelle a matrice ammonico-quaternaria) , per eliminare eventuali prodotti iniziali (partricina o partricina N-sostituita) , oppure il trattamento con gel di silice o con ossido di alluminio attivo per l'adsorbimento di materiale polimerico. The purification of the products is preferably obtained by dissolving in methylene chloride / methanol mixtures in various ratios, and with the optional presence of limited quantities of water and / or organic bases, and subsequent evaporation of the methylene chloride at reduced temperature and pressure and precipitation in the methanol. residue if in a suitably concentrated phase, or by adding water or other insolubilizing solvent. Specific purification processes can be used in particular cases, for example the suspension treatment with ion exchange resins of strong basic type (e.g. those with ammonium-quaternary matrix), to eliminate any initial products (partricin or N-substituted partricin), or the treatment with silica gel or with active aluminum oxide for the adsorption of polymeric material.

I seguenti esempi illustrano l'invenzione, senza limitarla . The following examples illustrate the invention, without limiting it.

PURIFICAZIONE DELLA PARTRICINA PURIFICATION OF PARTRICIN

Esempio 1 Example 1

1. Caricare in un reattore 625 1 di miscela acetone/acqua 80:20 v/v ed aggiungere 250 kg di micelio secco proveniente dalla fermentazione di microorganismi selezionati del ceppo NRRL 3878 di Streptomyces aureofaciens sostanzialmente in accordo con il processo dell'US 3773925 e contenente 12,5 kg teorici di partricina A, lavorando al riparo dalla luce ed in atmosfera di azoto. Portare il pH della sospensione a 8-8.1 per aggiunta di dietilamina. Lasciare sotto agitazione per 1 ora a 28-30°C e filtrare su pressoilitro, spremendo il pannello con azoto. Lavare il pannello con 250 1 di miscela acetone/acqua 80:20 v/v corretta a pH 8-8.1 con dietilamina e spremere con azoto. Le soluzioni ottenute vengono scartate. 1. Load into a reactor 625 1 of 80:20 v / v acetone / water mixture and add 250 kg of dry mycelium from the fermentation of selected microorganisms of strain NRRL 3878 of Streptomyces aureofaciens substantially in accordance with the process of US 3773925 and containing 12.5 kg theoretical of partricin A, working away from light and in a nitrogen atmosphere. Bring the pH of the suspension to 8-8.1 by adding diethylamine. Leave under stirring for 1 hour at 28-30 ° C and filter through a pressurizer, squeezing the panel with nitrogen. Wash the panel with 250 1 of acetone / water mixture 80:20 v / v corrected to pH 8-8.1 with diethylamine and squeeze with nitrogen. The solutions obtained are discarded.

2. Caricare nel reattore 1000 1 miscela acetone/acqua /dietilamina 80:15:5 v/v/v aggiungere il micelio umido, purificato come sopra descritto. Agitare per 1 ora a 28-30°C, correggendo il pH della miscela a 10.9-11.1 con dietilamina, se necessario. Filtrare su pressofiltro e lavare il pannello con 250 1 di miscela di acetone/acqua/dietilamina 80:15:5, quindi spremere con azoto. 2. Load in the reactor 1000 1 acetone / water / diethylamine 80: 15: 5 v / v / v mix add the wet mycelium, purified as described above. Shake for 1 hour at 28-30 ° C, adjusting the pH of the mixture to 10.9-11.1 with diethylamine if necessary. Filter through a pressure filter and wash the panel with 250 1 of acetone / water / diethylamine 80: 15: 5 mixture, then squeeze with nitrogen.

II micelio esausto viene scartato, il filtrato e le acque di lavaggio riunite vengono portate gradualmente a pH 8,0-8,1 con HC1 6N, mantenendo sotto agitazione sotto 30°C, al riparo dalla luce ed in atmosfera inerte. Raffreddare, a 5°C e mantenere per 18-24 ore senza agitazione, quindi filtrare, lavare con 181 di acetone e spremere con azoto, quindi essiccare sotto vuoto a 25-30°C per 48 ore ed al riparo dalla luce. Si ottengono circa 10 kg di partricina A di elevata purezza. The exhausted mycelium is discarded, the filtrate and the pooled washing waters are gradually brought to pH 8.0-8.1 with 6N HCl, maintaining under stirring below 30 ° C, protected from light and in an inert atmosphere. Cool to 5 ° C and keep for 18-24 hours without shaking, then filter, wash with 181 of acetone and squeeze with nitrogen, then vacuum dry at 25-30 ° C for 48 hours and protected from light. About 10 kg of high purity partricin A are obtained.

Esempio 2 Example 2

Sospendere 375 kg di micelio umido, proveniente dalla fermentazione utilizzata nell'esempio 1, isolato al termine del processo fermentativo e contenente circa 10 kg di partricina A, in 500 lt di acetone e proseguire quindi come nell'Esempio 1, sia per quanto riguarda la fase 1. di purificazione che la fase 2. di estrazione e recupero. Al termine, la partricina A viene isolata con una resa (80%) ed una purezza simili a quelle ottenute secondo Esempio 1. Suspend 375 kg of wet mycelium, coming from the fermentation used in Example 1, isolated at the end of the fermentation process and containing about 10 kg of partricin A, in 500 liters of acetone and then continue as in Example 1, both as regards the step 1. of purification and step 2. of extraction and recovery. At the end, the partricin A is isolated with a yield (80%) and a purity similar to those obtained according to Example 1.

Esempio 3 Example 3

Sospendere 270 kg di micelio, proveniente dalla fermentazione utilizzata nell'esempio 1, contenente circa 13,5 kg di partricina A in 540 1 di miscela etanolo 95% / acqua 85 : 15 v/v, quindi aggiungere dietilamina fino a pH 8,0 e lasciare sotto agitazione per 1 ora a 28-30°C. Dopo filtrazione e lavaggio con 270 1 di miscela etanolo 95% / acqua 85 : 15 corretta a pH 8,0 con dietilamina, si isola il micelio opportunamente depurato. Si sospende il micelio umido in 1000 1 di etanolo 95% /acqua/dietilamina 80 : 15 : 5 v/v/v e si mantiene la sospensione, pH 10,7-10,9, in agitazione per 1 ora. Suspend 270 kg of mycelium, coming from the fermentation used in example 1, containing about 13.5 kg of partricin A in 540 1 of 95% ethanol / water 85: 15 v / v mixture, then add diethylamine up to pH 8.0 and leave under stirring for 1 hour at 28-30 ° C. After filtration and washing with 270 1 of 95% ethanol / water 85: 15 mixture corrected to pH 8.0 with diethylamine, the suitably purified mycelium is isolated. The wet mycelium is suspended in 1000 1 of 95% ethanol / water / diethylamine 80: 15: 5 v / v / v and the suspension, pH 10.7-10.9, is kept under stirring for 1 hour.

Dopo filtrazione e lavaggio del pannello con 200 1 della stessa miscela solvente, le soluzioni riunite vengono precipitate in accordo con il procedimento della fase 2. dell'Esempio 1, ottenendo la partricina A con resa e purezza similari. After filtration and washing of the panel with 200 1 of the same solvent mixture, the combined solutions are precipitated according to the procedure of step 2. of Example 1, obtaining partricin A with similar yield and purity.

Esempio 4 Example 4

Sospendere 312,5 kg di micelio, proveniente dalla fermentazione utilizzata nell'esempio 1, contenente circa 15,5 kg di partricina A in 6251 di miscela metanolo/acqua 80 : 20 v/v, quindi correggere con dietilamina fino a pH 8,0 e proseguire secondo il procedimento dell'Esempio 1, utilizzando la miscela metanolo/acqua 80:20 nell'intera fase di depurazione 1. e metanolo/acqua/dietilamina 85 : 10 : 5 durante la fase di estrazione e recupero 2. Anche in questo caso si isola la partricina A con rese e purezza paragonabili. Suspend 312.5 kg of mycelium, coming from the fermentation used in example 1, containing about 15.5 kg of partricin A in 6251 of 80: 20 v / v methanol / water mixture, then correct with diethylamine up to pH 8.0 and continue according to the procedure of Example 1, using the methanol / water 80:20 mixture in the entire purification step 1. and methanol / water / diethylamine 85: 10: 5 during the extraction and recovery step 2. Also in this case, partricin A is isolated with comparable yields and purity.

Esempio 5 Example 5

Si procede secondo il procedimento indicato in qualsiasi degli Esempi 1-4, ma utilizzando un micelio proveniente dalla fermentazione di microorganismi, selezionati e non, del ceppo utilizzato nell'esempio 1 contenente partricina (un prodotto costituito da partricina A e partricina B in vari rapporti, ma usualmente prossimo a 1:1) oppure partricina B. Al termine del procedimento, si isola in modo analogo una partricina della stessa composizione contenuta nel micelio, si lava con cloruro di metilene: metanolo 7:3 e si essicca a 25°C per 48 ore. One proceeds according to the procedure indicated in any of the Examples 1-4, but using a mycelium coming from the fermentation of microorganisms, selected or not, of the strain used in example 1 containing partricin (a product consisting of partricin A and partricin B in various ratios , but usually close to 1: 1) or partricin B. At the end of the procedure, a partricin of the same composition contained in the mycelium is similarly isolated, washed with methylene chloride: methanol 7: 3 and dried at 25 ° C for 48 hours.

Esempio 6 Example 6

Preparare una miscela di 24 1 di tetraidrofurano, 4,3 1 di acqua e 1,21 di dietilamina, riscaldare a 30-35°C ed aggiungere 1,2 kg di partricina A, ottenute mediante il processo dell'esempio 1, sotto agitazione e mantenendo la miscela sotto azoto ed al riparo dalla luce. Giunti a soluzione, si chiarifica per filtrazione, si diluisce con 10,81 di acqua ottenendo una soluzione a pH 11,0-11,2. Sempre in atmosfera inerte, si aggiunge acido cloridrico 6N a porzioni e sotto agitazione fino a pH 8,0-8.3 ottenendo incipiente precipitazione. Si ferma l'agitazione e si raffredda a 4-8°C, mantenendo alla stessa temperatura ed a riposo per 18-24 ore. Il precipitato è raccolto per filtrazione su pressoiiltro, lavato con poco solvente ed essiccato in stufa sotto vuoto a 25-30°C per 18-24 ore, lontano dalla luce. Prepare a mixture of 24 1 of tetrahydrofuran, 4.3 1 of water and 1.21 of diethylamine, heat to 30-35 ° C and add 1.2 kg of partricin A, obtained by the process of Example 1, under stirring and keeping the mixture under nitrogen and protected from light. Once in solution, it is clarified by filtration, diluted with 10.81 of water obtaining a solution at pH 11.0-11.2. Still in an inert atmosphere, 6N hydrochloric acid is added in portions and under stirring up to pH 8.0-8.3 obtaining incipient precipitation. The stirring is stopped and the mixture is cooled to 4-8 ° C, keeping it at the same temperature and at rest for 18-24 hours. The precipitate is collected by filtration on a pressure filter, washed with a little solvent and dried in an oven under vacuum at 25-30 ° C for 18-24 hours, away from light.

Si ottengono così 0,84 kg di partricina A purificata (resa 70%), dotata di elevata purezza (>92%) all'analisi HPLC. Thus 0.84 kg of purified partricin A (yield 70%) are obtained, with high purity (> 92%) by HPLC analysis.

Esempio 7 Example 7

Preparare una miscela di 19,2 lt di acetone, 15,21 di acqua e 2,4 1 di dietilamina, riscaldare a 30-35° C ed aggiungere 0,8 kg di partricina A risultante dall'esempio 1, mantenendo al riparo dalla luce, sotto azoto, e sotto agitazione, fino a dissoluzione completa o fino a soluzione opalescente (5-10 min.)- Dopo filtrazione chiarificante, la soluzione avente pH 11,2-11,4 viene trattata sotto agitazione ancora a 30°C ed in atmosfera inerte, con acido cloridrico 6N fino a pH 9,0 - 9,2, in modo da ottenere incipiente precipitazione. Si lascia raffreddare a 4-8°C senza agitazione e si lascia a riposo alla stessa temperatura per 18-24 ore. Si filtra il precipitato su pressofiltro, si lava con 5 1 di acetone e si essicca in stufa sotto vuoto a 25-30°C per 18-24 ore, lontano dalla luce. Prepare a mixture of 19.2 liters of acetone, 15.21 of water and 2.4 1 of diethylamine, heat to 30-35 ° C and add 0.8 kg of partricin A resulting from example 1, keeping away from the light, under nitrogen, and stirring, until complete dissolution or opalescent solution (5-10 min.) - After clarifying filtration, the solution having pH 11.2-11.4 is treated under stirring again at 30 ° C and in an inert atmosphere, with 6N hydrochloric acid up to pH 9.0 - 9.2, in order to obtain incipient precipitation. It is left to cool to 4-8 ° C without stirring and is left to rest at the same temperature for 18-24 hours. The precipitate is filtered through a pressure filter, washed with 5 1 of acetone and dried in an oven under vacuum at 25-30 ° C for 18-24 hours, away from light.

Si ottengono così 0,58 kg di partricina A purificata (resa 72,5%), dotata all'analisi HPLC di purezza molto elevata (>95%). In this way 0.58 kg of purified partricin A are obtained (yield 72.5%), endowed with the HPLC analysis of very high purity (> 95%).

PREPARAZIONE E PURIFICAZIONE DI DERIVATI AL CARBOSSILE PREPARATION AND PURIFICATION OF CARBOXY DERIVATIVES

Esempio 8 Example 8

Una soluzione di 20 g di partricina risultante dall'esempio 5 in 200 mi di piridina contenente 1% di acqua e di dietilamina, è addizionata di una quantità stechiometrica di diazometano in soluzione eterea al 2%, per gorgogliamento o gocciolamento sotto lenta agitazione e mantenendo la temperatura a 18-20°C. Durante tutta la reazione si mantiene la miscela in atmosfera di azoto e al riparo dalla luce. Quando la reazione è completa, come evidenziato dall'assenza di ulteriore sviluppo di azoto dal diazometano, l'etere è evaporato sotto vuoto e il prodotto è precipitato per aggiunta di 2 I di acqua, addizionata di 0,2% di sodio ascorbato, raccolto per filtrazione, lavato ripetutamente con acqua ed essiccato sotto vuoto a 25-30°C per 18-24 ore al riparo dalla luce. Si ottengono così circa 20 g di partricina metil estere grezzo, ma già dotato dì buona purezza cromatografica. A solution of 20 g of partricin resulting from example 5 in 200 ml of pyridine containing 1% of water and diethylamine, is added with a stoichiometric quantity of diazomethane in 2% ethereal solution, by bubbling or dripping under slow stirring and maintaining the temperature at 18-20 ° C. Throughout the reaction the mixture is kept in a nitrogen atmosphere and protected from light. When the reaction is complete, as evidenced by the absence of further nitrogen development from diazomethane, the ether is evaporated under vacuum and the product is precipitated by adding 2 I of water, added with 0.2% of sodium ascorbate, collected by filtration, repeatedly washed with water and dried under vacuum at 25-30 ° C for 18-24 hours away from light. About 20 g of crude partricin methyl ester are thus obtained, but already endowed with good chromatographic purity.

Il prodotto ottenuto viene sciolto a 30°C in 20 volumi (400 mi) di una miscela di metilene cloruro/metanolo/acqua 89 : 10 : 1 v/v/v, e la soluzione è filtrata, trattata per 2 ore sotto agitazione con 8 g di resina basica forte a scambio anionico sospesa in 8 mi di metanolo e quindi filtrata. Si corregge il pH a 7,5 con poco HC1 metanolico e si concentra quindi la soluzione per distillazione a pressione ridotta fino a piccolo volume, finché sostanzialmente tutto il metilene cloruro è eliminato, quindi si raffredda a 4-8°C per 2-4 ore e si raccoglie l'abbondante precipitato formatosi per filtrazione. Si lava il prodotto solido ripetutamente con miscela metilene cloruro/metanolo 89 : 11 a porzioni e quindi con acetone, e alla fine si essicca in stufa sotto vuoto a 25°C per 18-24 ore, ottenendo la partricina metil estere purificata con elevata resa (84%) e purezza (94,2%) cromatografica (analisi HPLC). The product obtained is dissolved at 30 ° C in 20 volumes (400 ml) of a mixture of methylene chloride / methanol / water 89: 10: 1 v / v / v, and the solution is filtered, treated for 2 hours under stirring with 8 g of strong basic anion exchange resin suspended in 8 ml of methanol and then filtered. The pH is corrected to 7.5 with a little methanol HCl and the solution is then concentrated by distillation at reduced pressure to a small volume, until substantially all the methylene chloride is eliminated, then it is cooled to 4-8 ° C for 2-4 hours and the abundant precipitate formed by filtration is collected. The solid product is washed repeatedly with methylene chloride / methanol mixture 89: 11 in portions and then with acetone, and at the end it is dried in an oven under vacuum at 25 ° C for 18-24 hours, obtaining the purified partricin methyl ester with high yield. (84%) and chromatographic purity (94.2%) (HPLC analysis).

Il prodotto (15 g) è ulteriormente disciolto in 1,5 1 di una miscela di metilene cloruro/ metanolo/acqua/dietilamina 90 : 10 : 1 : 0,25 e trattato sotto agitazione ed a temperatura ambiente con 30-45 g di silica gel, sotto azoto e lontano dalla luce. Dopo 1 ora di agitazione, la silice è allontanata per filtrazione e la soluzione è concentrata a 25°C ed a pressione ridotta fino a piccolo volume. Il residuo è ripreso con 1,51 di acqua, la sospensione è corretta con HC1 attorno alla neutralità, ed il precipitato è raccolto per filtrazione ed essiccato sotto vuoto a 25-30°C per 24 ore lontano dalla luce, ottenendo con elevata resa (92%) la partricina metil estere altamente purificata (96,2%) al duplice controllo cromatografico HPLC e GPC. The product (15 g) is further dissolved in 1.5 1 of a mixture of methylene chloride / methanol / water / diethylamine 90: 10: 1: 0.25 and treated under stirring and at room temperature with 30-45 g of silica gel, under nitrogen and away from light. After 1 hour of stirring, the silica is removed by filtration and the solution is concentrated at 25 ° C and under reduced pressure down to a small volume. The residue is taken up with 1.51 of water, the suspension is corrected with HC1 around neutrality, and the precipitate is collected by filtration and dried under vacuum at 25-30 ° C for 24 hours away from light, obtaining with high yield ( 92%) highly purified partricin methyl ester (96.2%) by double checking HPLC and GPC chromatography.

Esempio 9 Example 9

Una sospensione di 20 g di partricina (A+B) risultante dall'esempio 5 in 400 ml di metanolo è lontano dalla luce ed in atmosfera di azoto, con una quantità stechiometrica di soluzione circa 0.3% di diazometano in tetraidrofurano. La temperatura della miscela viene mantenuta a 18-20°C. Con il procedere della reazione, il solido passa gradualmente in soluzione mentre l'agitazione viene proseguita per 2 ore. Dopo filtrazione, il filtrato è concentrato a temperatura e pressione ridotte ed il prodotto è precipitato per aggiunta di circa 0,5 1 di etere (o alternativamente con 1,51 di acqua). La partricina metil estere così ottenuta, viene raccolta per filtrazione, lavata a fondo con etere (o con acqua), essiccata come usuale e purificata secondo il procedimento dell’Esempio 8. A suspension of 20 g of partricin (A + B) resulting from example 5 in 400 ml of methanol is far from light and in a nitrogen atmosphere, with a stoichiometric amount of a solution of about 0.3% of diazomethane in tetrahydrofuran. The temperature of the mixture is maintained at 18-20 ° C. As the reaction proceeds, the solid gradually passes into solution while stirring is continued for 2 hours. After filtration, the filtrate is concentrated at reduced temperature and pressure and the product is precipitated by adding about 0.5 1 of ether (or alternatively with 1.51 of water). The methyl ester partricin thus obtained is collected by filtration, thoroughly washed with ether (or water), dried as usual and purified according to the procedure of Example 8.

Esempio 10 Example 10

10 g di partricina risultante dall 'esempio 5 vengono sciolti in 1 1 di miscela metanolo/acqua/dietilamina 85:10:5 e trattati con una quantità stechiometrica di diazometano in soluzione eterea a circa il 2%, sotto lenta agitazione e mantenendo la temperatura a 18-20°C. Durante la reazione la miscela è tenuta in atmosfera di azoto ed al riparo dalla luce. Al termine, il solvente è parzialmente evaporato sotto vuoto e la precipitazione della partricina metil estere è completata per aggiunta di acqua. Il successivo isolamento e la purificazione vengono condotti in accordo con il procedimento dell'Esempio 8. 10 g of partricin resulting from example 5 are dissolved in 1 1 of methanol / water / diethylamine 85: 10: 5 mixture and treated with a stoichiometric quantity of diazomethane in an ethereal solution at about 2%, under slow stirring and maintaining the temperature at 18-20 ° C. During the reaction the mixture is kept in a nitrogen atmosphere and protected from light. At the end, the solvent is partially evaporated under vacuum and the precipitation of the partricin methyl ester is completed by adding water. The subsequent isolation and purification are carried out in accordance with the procedure of Example 8.

PREPARAZIONE E PURIFICAZIONE DI DERIVATI ALL'AZOTO MICOSAMINICO PREPARATION AND PURIFICATION OF MYCOSAMINE NITROGEN DERIVATIVES

Esempio 11 Example 11

650 g di partricina A 2-dimetilaminoetil-amide, preparata partendo dalla partricina secondo il processo descritto nell'US 5,296,597, vengono disciolti in 4 litri di piridina contenente 6 g di sodio ascorbato e la soluzione, mantenuta lontano dalla luce e con gorgogliamento di azoto, viene addizionata sotto agitazione ed a porzioni con 250 g di pentaclorofenil estere dell'acido dimetilaminoacetico (ottenuto per condensazione con dicicloesilcarbodiimide in metilene cloruro). Si lascia in reazione per 14-24 ore a temperatura ambiente (20-25°C), sempre in atmosfera di azoto, e al termine si filtra e si versa in 50 1 di acqua (contenente 5 g di sodio ascorbato) tenuta a 10°C e sotto lenta agitazione. Si filtra il precipitato su pressoiiltro, si lava con 101 di acqua e poi con 10 1 di metanolo e quindi si essicca in stufa sotto vuoto a 25-30°C per 18 ore, tenendo al riparo dalla luce. Si ottiene così con elevata resa la richiesta N-dimetilaminoacetil-partricina A 2-dimetilaminoetilamide grezza, ma già dotata di buona purezza cromatografica. 650 g of partricin A 2-dimethylaminoethyl-amide, prepared starting from partricin according to the process described in US 5,296,597, are dissolved in 4 liters of pyridine containing 6 g of sodium ascorbate and the solution, kept away from light and with nitrogen bubbling , is added under stirring and in portions with 250 g of pentachlorophenyl ester of dimethylaminoacetic acid (obtained by condensation with dicyclohexylcarbodiimide in methylene chloride). It is left to react for 14-24 hours at room temperature (20-25 ° C), again in a nitrogen atmosphere, and at the end it is filtered and poured into 50 1 of water (containing 5 g of sodium ascorbate) kept at 10 ° C and under slow stirring. The precipitate is filtered on a pressure filter, washed with 101 of water and then with 10 1 of methanol and then dried in an oven under vacuum at 25-30 ° C for 18 hours, keeping it away from light. The required crude N-dimethylaminoacetyl-partricin A 2-dimethylaminoethylamide is thus obtained with high yield, but already endowed with good chromatographic purity.

A scopo di purificazione, si sospende il solido in 12 1 di metanolo contenente 5 g di sodio ascorbato e si lascia sotto agitazione a 25°C in atmosfera di azoto per 1 ora. Si filtra quindi su pressoilitro, si lava il solido con 31 di metanolo e sì essicca a 25-30°C sotto vuoto per 24 ore ed al riparo dalla luce, ottenendo il prodotto richiesto in forma purificata . For purification purposes, the solid is suspended in 12 1 of methanol containing 5 g of sodium ascorbate and left under stirring at 25 ° C in a nitrogen atmosphere for 1 hour. It is then filtered on a pressure liter, the solid is washed with 31 of methanol and dried at 25-30 ° C under vacuum for 24 hours and protected from light, obtaining the required product in purified form.

Il prodotto purificato viene ulteriormente sospeso in 14 1 di metanolo, quindi si aggiungono 54 1 di metilene cloruro e si lascia sotto agitazione a 25°C in atmosfera d'azoto sino a dissoluzione completa. Dopo opzionale filtrazione chiarificante, la soluzione viene percolata su colonna cromatografica ( 0 20 cm, h 25 cm) contenente 6,5 kg di alluminio ossido attivo basico. Si raccoglie l'eluato intensamente colorato in giallo/giallo-arancio e si concentra a pressione ridotta a temperatura massima di 35°C per eliminare il metilene cloruro e parte del metanolo. Dopo ulteriore diluizione con metanolo e nuova evaporazione per allontanare completamente il metilene cloruro, si ottiene formazione di abbondante precipitato. The purified product is further suspended in 14 1 of methanol, then 54 1 of methylene chloride are added and it is left under stirring at 25 ° C in a nitrogen atmosphere until complete dissolution. After optional clarification filtration, the solution is percolated on a chromatographic column (0 20 cm, h 25 cm) containing 6.5 kg of basic active aluminum oxide. The intensely colored yellow / yellow-orange eluate is collected and concentrated under reduced pressure at a maximum temperature of 35 ° C to eliminate methylene chloride and part of the methanol. After further dilution with methanol and further evaporation to completely remove the methylene chloride, the formation of an abundant precipitate is obtained.

La sospensione viene raffreddata e tenuta sotto lenta agitazione per 1-2 ore per completare la precipitazione, quindi il solido viene raccolto per filtrazione, lavato con metanolo ed essiccato in stufa sotto vuoto a 25-30°C per 18-24 ore, lontano dalla luce. Si ottiene così con alte rese la richiesta N-dimetilaminoacetil-partricina A 2-dimetilaminoetilamide in forma altamente purificata (96,0%) come risulta dal duplice controllo cromatografico HPLC e GPC. The suspension is cooled and kept under slow stirring for 1-2 hours to complete the precipitation, then the solid is collected by filtration, washed with methanol and dried in a vacuum oven at 25-30 ° C for 18-24 hours, away from the light. The required N-dimethylaminoacetyl-partricin A 2-dimethylaminoethylamide in highly purified form (96.0%) is thus obtained with high yields as shown by the double chromatographic control HPLC and GPC.

Esempio 12 Example 12

La partrìcina A risultante dall'esempio 7 viene fatta reagire in soluzione piridinica con il pentaclorofenil estere dell'acido dimetìlaminoacetico applicando il procedimento dell'Esempio 11, per ottenere la corrispondente N-dimetilaminoacetil-partricina A. The partricin A resulting from example 7 is reacted in a pyridine solution with the pentachlorophenyl ester of dimethylaminoacetic acid by applying the procedure of Example 11, to obtain the corresponding N-dimethylaminoacetyl-partricin A.

Al termine della reazione, la miscela è addizionata direttamente di un condensante (dicicloesilcarbodìimide), cosicché il pentaclorofenolo rilasciato nella prima reazione viene nuovamente condensato sul carbossile della partricina A, portando alla corrispondente N-dimetilaminoacetil-partricina A pentaclorofenil estere. Dopo isolamento del prodotto, oppure per diretta aggiunta di dimetilaminoetilamina, la reazione sul carbossile attivato, porta rapidamente alla richiesta N-dimetilaminoacetil-partricina A 2-dimetilaminoetilamide con elevata resa (86,0%) e purezza (97,2%). Il prodotto viene quindi isolato e purificato ancora in accordo con il procedimento dell'Esempio 11 ottenendo resa e purezza analoghe. At the end of the reaction, the mixture is directly added with a condenser (dicyclohexylcarbodimide), so that the pentachlorophenol released in the first reaction is condensed again on the carboxyl of partricin A, leading to the corresponding N-dimethylaminoacetyl-partricin A pentachlorophenyl ester. After isolation of the product, or by direct addition of dimethylaminoethylamine, the reaction on the activated carboxyl rapidly leads to the request N-dimethylaminoacetyl-partricin A 2-dimethylaminoethylamide with high yield (86.0%) and purity (97.2%). The product is then isolated and purified again in accordance with the procedure of Example 11 obtaining similar yield and purity.

Claims

CLAIMS 1. Process for the purification of partricin from mycelium isolated from fermentation broths containing partricin A and / or B, which includes, at a temperature of 10-50 ° C: a) washing the mycelium in the presence of at least one organic solvent miscible with water and low boiling, adjusting the pH to 7.5-9.5; b) the extraction, from the resulting mycelium, of partricin A and / or B, in the presence of at least one organic solvent miscible with water and low boiling, adjusting the pH to 10.5-11.8; c) the precipitation of partricin A and / or B by adjusting the pH to 7.5-9.5 and the temperature at 0-10 ° C.

A process according to claim 1, which comprises: d) the solubilization of the partricin A and / or B resulting from step c) in the presence of at least one organic solvent miscible with water and low boiling; e) the isolation of the resulting partricin A and / or B.

A process according to claim 1 or 2, wherein the solvent has a boiling point between 40 and 80 ° C.

4. A process according to any one of the preceding claims, wherein the solvent is selected from the group consisting of aliphatic alcohols and ketones and of tetrahydrofuran.

A process according to any one of the preceding claims, wherein the solvent is methanol, ethanol, isopropanol, acetone or tetrahydrofuran.

A process according to any one of the preceding claims, in which the organic solvent in steps a), b) and d) is mixed with water.

A process according to any one of the preceding claims, wherein the pH in steps a) is adjusted to 7.5-8.5, in step b) to 11.0-11.5 and in step c) to 8, 0-9.0.

A process according to any one of the preceding claims, in which the mycelium, before step a), is dry or wet.

9. A process according to any one of the preceding claims, in which the partricin A and / or B resulting from step c) or e) is subjected to reaction to the carboxyl and / or mycosaminic nitrogen so as to obtain a mono and / or derivative of - substituted, ester or amide to the carboxyl and / or amide to the mycosaminic nitrogen of partricin A and / or B.

10. A process according to claim 9, in which the reaction is carried out in the presence of an organic solvent having a boiling point between 40 and 120 ° C.

A process according to claim 9 or 10, wherein the solvent is selected from the group consisting of aliphatic alcohols and ketones, methylene chloride, tetrahydrofuran and pyridine.

A process according to any one of claims 9 to 11, wherein the solvent is methanol, ethanol, isopropanol, acetone, methylene chloride, tetrahydrofuran or pyridine.

A process according to any one of claims 9 to 12, wherein the carboxyl esterification comprises the addition of a diazoalkane to partricin A and / or B.

14. A process according to claim 13, wherein the diazoalkane is diazomethane.

A process according to any one of claims 9 to 14, wherein the amidation to the carboxyl and / or mycosamin nitrogen comprises the addition of a carboxyl activator and, respectively, the amine and / or the acid desired.

16. A process according to claim 15, wherein the amine is dimethylaminoethylamine.

A process according to claim 15 or 16, wherein the activator is diphenylphosphorazidate or a halogen- or nitro-substituted phenol or N-hydroxysuccinimide.

18. A process according to claim 17, wherein the activator is pentachlorophenol or N-hydroxysuccinimide.

19. A process according to any one of claims 15 to 18, wherein a condenser is added to the activator.

20. A process according to claim 19, wherein the condensant is dicyclohexylcarbodiimide.

21. A process according to any one of claims 9 to 20, which comprises the dissolution of the derivative of partricin A and / or B in a solvent according to any of claims 10 to 12 and its subsequent precipitation in the presence of a miscible solvent with the resulting mixture or by partial concentration at reduced temperature and pressure.

22. A process according to claim 21 wherein the dissolved derivative is treated by percolation or stirring with a strong basic, ion-exchange resin, or with silica gel, or with active aluminum oxide.

23. A process according to any one of the preceding claims, in which each step is carried out in the presence of an antioxidant, in a nitrogen atmosphere and away from direct light.