ITMI20000030A1 - PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN EMBRYOS OF PREDETERMINED HIGH GENETIC VALUE - Google Patents
PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN EMBRYOS OF PREDETERMINED HIGH GENETIC VALUE Download PDFInfo
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Description
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Patent application for industrial invention entitled:
"Procedimento per la produzione di embrioni non umani di sesso predeterminato ad alto valore genetico” "Process for the production of non-human embryos of predetermined sex with a high genetic value"
CAMPO DELL'INVENZIONE FIELD OF THE INVENTION
Il campo tecnico dell'invenzione è quello della fertilizzazione in vitro con materiale genetico selezionato, nel’ambito dell’industria zootecnica. TECNICA ANTERIORE The technical field of the invention is that of in vitro fertilization with selected genetic material, within the zootechnical industry. FRONT TECHNIQUE
La vasta diffusione delle pratiche di fecondazione artificiale (FA) ha permesso all’industria zootecnica di rendere più efficienti i sistemi di produzione dei capi di allevamento selezionati per caratteristiche utili. Le tecniche di preselezione dei sessi rappresentano un ulteriore ottimizzazione di questo procedimento, i cui benefìci possono riguardare allevatori interessati o alla produzione di latte o alla produzione di carne o ad entrambi, controllando i capi che, a seconda delle esigenze, vengono allevati ed immessi sul mercato. Da una parte, infatti è possibile aumentare la selezione sulla linea femminile (per la produzione di latte) o su quella maschile (per la produzione di carne) e dall’altra, risulta anche possibile controllare e ridurre i difetti genetici legati al sesso. The widespread diffusion of artificial fertilization (FA) practices has allowed the livestock industry to make the production systems of the livestock selected for useful characteristics more efficient. The techniques of preselection of the sexes represent a further optimization of this procedure, the benefits of which may concern farmers interested in milk production or meat production or both, controlling the animals that, depending on the needs, are reared and placed on the market. On the one hand, it is possible to increase the selection on the female line (for the production of milk) or on the male one (for the production of meat) and on the other hand, it is also possible to control and reduce genetic defects related to sex.
La possibilità di dividere e selezionare il materiale seminale in base alla presenza di cromosomi sessuali diversi, procedimento spesso indicato come sessaggio, interessa il mondo zootecnico per i benefici relativi alla programmazione delle nascite di vacche da rimonta aziendale o di tori da introdurre in centri genetici. Solo con l’avvento della citofluorimetria a flusso, però, le metodiche di preselezione dei gameti maschili hanno avuto uno sviluppo standardizzabile ed un’utilità industriale. The possibility of dividing and selecting seminal material based on the presence of different sex chromosomes, a procedure often referred to as sexing, interests the livestock world for the benefits related to planning the births of farm cows or bulls to be introduced in genetic centers. Only with the advent of flow cytometry, however, did the methods of preselection of male gametes have a standardizable development and industrial utility.
Il citofluorimetro a flusso e' un sistema che consiste di uno o più raggi laser che attraversano il campione, di un sistema idrodinamico che immette le cellule del campione da analizzare in un flusso di un liquido isosmotico con il campione, di una serie di rilevatori di luce (fotodiodi e/o fotomoltiplicatori) e di un computer per l'analisi dei dati in tempo reale. L'analisi si basa sulla valutazione della luce emessa dalle cellule in esame una volta che incontrano sul loro percorso il raggio laser. Tali cellule vengono preventivamente colorate con fluorocromi, sostanze che emettono una particolare fluorescenza quando investite dalla luce coerente del laser. La fluorescenza viene amplificata dai fotomoltiplicatori ed analizzata da un software in grado di ottimizzare il segnale in uscita e di renderlo interpretabile. L’estrema sensibilità del citofluorimetro consente di misurare la diversa quantità di DNA presente negli spermatozoì X rispetto a quelli Y (differenza variabile a seconda della specie) usando coloranti quali il Bisbenzimide Hoechst 33342 che si lega alle regioni ricche di adenina e timidina del DNA. The flow cytometer is a system consisting of one or more laser beams that pass through the sample, of a hydrodynamic system that introduces the cells of the sample to be analyzed in a flow of an isosmotic liquid with the sample, of a series of detectors of light (photodiodes and / or photomultipliers) and a computer for real-time data analysis. The analysis is based on the evaluation of the light emitted by the cells under examination once they encounter the laser beam on their path. These cells are previously stained with fluorochromes, substances that emit a particular fluorescence when hit by the coherent light of the laser. The fluorescence is amplified by photomultipliers and analyzed by a software capable of optimizing the output signal and making it interpretable. The extreme sensitivity of the flow cytometer makes it possible to measure the different amount of DNA present in the sperms X compared to those Y (variable difference depending on the species) using dyes such as Bisbenzimide Hoechst 33342 which binds to the adenine and thymidine-rich regions of the DNA.
In seguito, il "sorting” permette alle particelle che passano attraverso il flusso e che vengono caricate positivamente o negativamente, a seconda delle caratteristiche possedute e impostate all’inizio delle procedura di separazione attraverso la creazione di finestre (gates), di separare fisicamente cellule aventi caratteristiche quantitative di fluorescenza diverse. Due placche attirano infatti le particelle a seconda della loro carica e le deviano in due raccoglitori. Il materiale raccolto e separato può successivamente essere rianalizzato, re-immettendolo nel flusso per verificare l'efficienza della separazione. Subsequently, the "sorting" allows the particles that pass through the flow and that are positively or negatively charged, depending on the characteristics possessed and set at the beginning of the separation procedure through the creation of windows (gates), to physically separate cells having different quantitative characteristics of fluorescence. Two plates in fact attract the particles according to their charge and divert them into two collectors. The collected and separated material can subsequently be reanalyzed, re-introducing it into the flow to verify the efficiency of the separation.
Definendo il sorting in funzione della bimodalità della distribuzione di frequenza del contenuto di DNA degli spermatozoi (Johnson LA et al., 1989, Biol. Reprod. 41:199-203) e' possibile sia quantificare gli spermatozoi X ed Y che dividerli in due popolazioni, quella X e quella Y. La citofiuorimetria a flusso si e’ pertanto dimostrata valida, oltre che per l'analisi, anche per la separazione fisica degli spermatozoi (Garner D.L et al., 1983, Biol. Reprod. 28:312-321; Johnson L.A., 1991, Reprod. Dom. Anim. 26:309-314; Johnson L.A et al. 1989, Biol. Reprod. 41:199-203; Morell et al., 1988, Vet. Ree. 122:322-324), ma la sua bassa resa (107 spermi separabili in 1 ora) ne limita l'uso in ambito di fecondazione artificiale, dal momento che per ottenere una paillette di sperma bovino congelato, con una concentrazione adeguata all'uso in fecondazione artificiale, sarebbe necessaria un'intera giornata di sorting. By defining the sorting as a function of the bimodality of the frequency distribution of the DNA content of the spermatozoa (Johnson LA et al., 1989, Biol. Reprod. 41: 199-203) it is possible to both quantify the sperms X and Y and divide them into two populations, X and Y. Flow cytophiuorimetry has therefore proved to be valid, in addition to the analysis, also for the physical separation of spermatozoa (Garner D.L et al., 1983, Biol. Reprod. 28: 312- 321; Johnson L.A., 1991, Reprod. Dom. Anim. 26: 309-314; Johnson L.A et al. 1989, Biol. Reprod. 41: 199-203; Morell et al., 1988, Vet. Ree. 122: 322 -324), but its low yield (107 sperms separable in 1 hour) limits its use in the field of artificial fertilization, since to obtain a sequin of frozen bovine sperm, with a concentration suitable for use in artificial fertilization , a full day of sorting would be required.
Nello studio del DNA degli spermatozoi risultano favoriti i citometri a flusso dotati di epi-illuminazione (frontale rispetto alle cellule) (Pinkel et al., 1982, Cytometry 1:1-9), mentre quelli con illuminazione ortogonale dovrebbero essere opportunamente modificati in modo tale da poter misurare la luce diffratta anche a 0 gradi (Johnson L.A. e Pinkel D., 1986, Cytometry 7:268-273) e non solo quella ritratta a 90 gradi come avviene solitamente. Infatti con i citofluorimetri ad illuminazione ortogonale la quantità' di luce rifratta a 90 gradi, comprendente la fluorescenza, e' maggiore nel caso che il raggio laser colpisca lo spermatozoo sulla superficie più larga, mentre e' minore nel caso che il laser colpisca lo spermatozoo sulla sua superficie stretta. Poiché’ le cellule immesse in un flusso acquisiscono un movimento rotatorio direttamente proporzionale alla velocità’ del flusso, è stato dimostrato che la posizione della testa degli spermatozoi, nel momento della intersecazione con il raggio laser, è prevalentemente con la parte sottile rivolta verso il rilevatore a 0 gradi, producendo una minore quantità di luce rifratta a 90 gradi e pertanto una minore fluorescenza (Pinkel D. et al., 1982, ibidem). Basandosi la lettura citofluorimetrica sui livelli di fluorescenza, ne consegue che la semplice intersecazione delle cellule in una data posizione con il raggio laser, può compensare in difetto un diverso livello di fluorocromatizzazione. Tale problema non esiste per i citometri che utilizzano la epi-illuminazione (con sorgente luminosa ad arco incandescente), infatti in questo caso gli spermatozoi vengono illuminati longitudinalmente e non trasversalmente, pertanto non sussiste il problema dato dalla loro conformazione piatta (Pinkel D. et al., 1982, ibidem). Nel brevetto francese FR 2699678 è descritto un metodo di sessaggio, in cui il “sorting” delle cellule avviene senza caricamento elettrico delle stesse, quindi in condizioni che si discostano concettualmente da quanto descritto finora e che può essere effettuata sul citofluorimetro adottato in tal caso (PAS III, Partec). Nel brevetto inglese GB 2145112 è descritto un metodo di sessaggio mediante citofluorimetria a flusso, che sfrutta il caricamento elettrico degli spermatozoo effettuato in un liquido di trascinamento adatto. In the study of sperm DNA, flow cytometers equipped with epi-illumination (in front of the cells) are favored (Pinkel et al., 1982, Cytometry 1: 1-9), while those with orthogonal illumination should be suitably modified in a such as to be able to measure diffracted light even at 0 degrees (Johnson L.A. and Pinkel D., 1986, Cytometry 7: 268-273) and not only that retracted at 90 degrees as usually happens. In fact, with orthogonal illumination cytofluorometers the quantity of light refracted at 90 degrees, including the fluorescence, is greater in the case that the laser beam hits the spermatozoon on the larger surface, while it is lower in the case that the laser hits the spermatozoon. on its narrow surface. Since 'the cells introduced into a flow acquire a rotational movement directly proportional to the speed' of the flow, it has been shown that the position of the sperm head, at the moment of intersection with the laser beam, is mainly with the thin part facing the detector. at 0 degrees, producing less light refracted at 90 degrees and therefore less fluorescence (Pinkel D. et al., 1982, ibidem). Basing the flow cytometric reading on the fluorescence levels, it follows that the simple intersection of the cells in a given position with the laser beam, can compensate in defect a different level of fluorochromatization. This problem does not exist for cytometers that use epi-illumination (with an incandescent arc light source), in fact in this case the spermatozoa are illuminated longitudinally and not transversely, therefore there is no problem given by their flat conformation (Pinkel D. et al., 1982, ibidem). In the French patent FR 2699678 a sexing method is described, in which the "sorting" of the cells takes place without electrical loading of the same, therefore in conditions that differ conceptually from what has been described so far and which can be carried out on the flow cytometer adopted in this case ( PAS III, Partec). In the British patent GB 2145112 a method of sexing by flow cytometry is described, which exploits the electrical loading of the spermatozoa carried out in a suitable entrainment liquid.
Un metodo di sessaggio del seme mediante citofluorimetria a flusso, basato sullo stesso principio di separazione in base alla carica, è descritto nel brevetto europeo EP 471758, che utilizza un citometro a flusso del tipo Epics V {RTM, Coulter). La metodica di sessaggio proposta in questo brevetto, si basa su una serie di modifiche migliorative del citofluorimetro (riguardanti ad esempio l’ago della cella a flusso) tali da creare un flusso di cellule orientate con la superficie maggiore perpendicolare al raggio laser. Inoltre lo strumento con illuminazione ortogonale, viene modificato in modo tale da poter acquisire la fluorescenza anche dalla luce rifratta a 0 gradi (normalmente utilizzata solo per la valutazione dimensionale delle particelle), tramite l'applicazione di un fotomoltiplicatore al posto dei normali fotodiodi, non in grado di rilevare i bassi livelli di fluorescenza. Tali modifiche rispondono a quanto proposte in Johnson L.A. e Pinkel D., 1986, Cytometry 7:268-273. Le modifiche apportate, rendendo la lettura effettuata dall'apparecchio più sensibile, rendono più problematica la standardizzazione della metodica (soprattutto la modifica riguardante la punta dell'ago). Per questo motivo sono stati approntati una serie di protocolli per tentare di ridurre al minimo la variabilità delle rilevazioni, intervenendo da un lato per eliminare la rotazione degli spermatozoi (attraverso l'eliminazione delle code degli stessi) e dall'altro per rendere massima la decompattazione del nucleo per avere una più precisa misurazione dell’intensità di fluorescenza (Metezeau P., 1991, Molecular Reprod. and Develop. 30:250-257). A method of sexing the semen by flow cytometry, based on the same principle of separation based on the charge, is described in the European patent EP 471758, which uses a flow cytometer of the Epics V (RTM, Coulter) type. The sexing method proposed in this patent is based on a series of improvements to the flow cytometer (for example concerning the flow cell needle) such as to create a flow of oriented cells with the largest surface perpendicular to the laser beam. Furthermore, the instrument with orthogonal illumination is modified in such a way as to be able to acquire the fluorescence even from light refracted at 0 degrees (normally used only for the dimensional evaluation of the particles), through the application of a photomultiplier instead of normal photodiodes, not capable of detecting low levels of fluorescence. These changes respond to what is proposed in Johnson L.A. and Pinkel D., 1986, Cytometry 7: 268-273. The modifications made, making the reading carried out by the device more sensitive, make the standardization of the method more problematic (especially the modification concerning the tip of the needle). For this reason, a series of protocols have been prepared to try to minimize the variability of the detections, intervening on the one hand to eliminate the rotation of the spermatozoa (through the elimination of the tails of the same) and on the other to maximize decompaction. of the nucleus to have a more precise measurement of the fluorescence intensity (Metezeau P., 1991, Molecular Reprod. and Develop. 30: 250-257).
Finora quindi la vasta letteratura brevettuale e scientifica esistente in merito, conferma che i metodi e le apparecchiature utilizzate per il sessaggio del seme mediante citofluorimetria a flusso, sono oggetto di continui adattamenti e perfezionamenti in vista di una sempre maggiore standardizzazione e ripetibilità dei risultati, avendo comunque tutte in comune l’utilizzo di materiale seminale fresco. So far, therefore, the vast patent and scientific literature existing on the subject confirms that the methods and equipment used for the sexing of the semen by flow cytometry are subject to continuous adaptations and improvements in view of an ever greater standardization and repeatability of the results, having however all in common the use of fresh seminal material.
SOMMARIO SUMMARY
Il procedimento descritto nella presente domanda di brevetto consente di effettuare il sessaggio mediante citofluorimetria a flusso su seme congelato. Il nuovo metodo è caratterizzato da specifiche e critiche condizioni di colorazione, separazione e raccolta, che permettono una efficiente fecondazione in vitro (IVF: In Vitro Fertilization) per la produzione di embrioni di specie mammifere non umane (quali bovini, bufali, equini, ovini suini, roditori) del sesso prescelto e ad alto valore genetico, in quanto derivanti da gameti selezionati in base a caratteristiche genetiche di particolare utilità nell’industria zootecnica. Nel procedimento della presente invenzione il liquido seminale, selezionato in base alle caratteristiche genetiche dell’animale, viene congelato secondo le procedure stabilite dall'Unione Europea e può essere trasportato, dovunque sia industrialmente utile ed economicamente vantaggiosa la produzione di embrioni ad alto valore genetico. Secondo il metodo della presente invenzione il seme congelato viene rapidamente scongelato e colorato con fluorocromo di Hoechst 33342, in condizioni tali da mantenere massima la vitalità degli spermatozoi e viene quindi separato mediante citofluorimetria a flusso, in due sottopopolazioni di spermatozoi, una che porta il cromosoma Y ed una che porta il cromosoma X. A seconda delle caratteristiche genetiche di utilità per il centro di allevamento, viene quindi utilizzato Cuna o l’altra delle due sottopopolazione per la fecondazione in vitro di oociti appartenenti alla stessa specie degli spermatozoi e per la produzione di embrioni ad alto valore genetico, di sesso predeterminato. DESCRIZIONE DELLE FIGURE The process described in the present patent application allows for sexing by flow cytometry on frozen semen. The new method is characterized by specific and critical conditions of staining, separation and collection, which allow an efficient in vitro fertilization (IVF: In Vitro Fertilization) for the production of embryos of non-human mammalian species (such as cattle, buffaloes, horses, sheep). pigs, rodents) of the chosen sex and of high genetic value, as they derive from gametes selected on the basis of genetic characteristics of particular utility in the livestock industry. In the process of the present invention, the seminal fluid, selected on the basis of the genetic characteristics of the animal, is frozen according to the procedures established by the European Union and can be transported wherever the production of high genetic value embryos is industrially useful and economically advantageous. According to the method of the present invention, the frozen semen is rapidly thawed and stained with Hoechst 33342 fluorochrome, in conditions such as to maintain maximum viability of the spermatozoa and is then separated by flow cytometry, into two sperm subpopulations, one carrying the chromosome Y and one carrying the X chromosome. Depending on the genetic characteristics of utility for the breeding center, one or the other of the two subpopulations is then used for the in vitro fertilization of oocytes belonging to the same species as the spermatozoa and for the production of embryos with a high genetic value, of predetermined sex. DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1: citogramma di fluorescenza a 0 e 90 gradi. In figura 1 è rappresentato il citogramma di fluorescenza a 0 e 90 gradi con evidenziata la regione di nostro interesse. Figure 1: Fluorescence cytogram at 0 and 90 degrees. Figure 1 shows the fluorescence cytogram at 0 and 90 degrees with the region of our interest highlighted.
Figura 2: istogramma di fluorescenza a 90 gradi. In figura 2 è rappresentato Cistogramma di fluorescenza a 90 gradi. E’ visibile il gate che permette di valutare solamente gli spermatozoi colpiti dal raggio laser sulla superficie più larga e pertanto con FL1 maggiore. Figure 2: 90 degree fluorescence histogram. Figure 2 shows a 90 degree fluorescence cistogram. The gate is visible which allows to evaluate only the spermatozoa hit by the laser beam on the larger surface and therefore with greater FL1.
Figura 3: istogramma di fluorescenza a 0 gradi. In figura 3 è rappresentato Cistogramma di fluorescenza a 0 gradi degli spermatozoi con FL1 maggiore. Sono evidenziabili i due picchi la cui differenza in contenuto di DNA è pari al 3.9% nella specie bovina. Figure 3: 0 degree fluorescence histogram. Figure 3 shows a 0 degree fluorescence cistogram of spermatozoa with higher FL1. The two peaks whose difference in DNA content is equal to 3.9% in the bovine species can be seen.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
E’ stato ora trovato, ed è oggetto della presente domanda di brevetto, un metodo che consente di effettuare il sessaggio mediante citofluorimetria a flusso su seme congelato. Il nuovo metodo è caratterizzato da specifiche e critiche condizioni di colorazione, separazione e raccolta, che verranno di seguito dettagliatamente illustrate. Il seme sessato nelle condizioni descritte nella presente domanda di brevetto, è dotato di una capacità fecondante utile per una efficiente fecondazione in vitro (IVF: In Vitro Fertilization) e per la produzione di embrioni di specie mammifere non umane (quali bovini, bufali, equini, ovini suini, roditori) del sesso prescelto e ad alto valore genetico, in quanto derivanti da gameti selezionati in base a caratteristiche genetiche di particolare utilità nell'industria zootecnica. E’ evidente che il nuovo processo costituisce un notevole progresso tecnico, in quanto consente di impiegare in qualsiasi paese ed in qualsiasi momento, un seme delle caratteristiche desiderate senza le limitazioni di tempo e di luogo derivanti dalla necessità di impiegare seme fresco. It has now been found, and is the subject of this patent application, a method that allows you to perform sexing by flow cytometry on frozen semen. The new method is characterized by specific and critical conditions of staining, separation and collection, which will be illustrated in detail below. The sexed semen under the conditions described in the present patent application, is equipped with a fertilizing capacity useful for an efficient in vitro fertilization (IVF: In Vitro Fertilization) and for the production of embryos of non-human mammalian species (such as cattle, buffaloes, horses). , sheep, pigs, rodents) of the chosen sex and of high genetic value, as they derive from gametes selected on the basis of genetic characteristics of particular utility in the livestock industry. It is clear that the new process constitutes a significant technical progress, as it allows the use in any country and at any time, a seed with the desired characteristics without the limitations of time and place deriving from the need to use fresh seed.
Preferibilmente il metodo dell'invenzione viene applicato alla specie bovina, ma può essere vantaggiosamente esteso a tutte le specie mammifere di allevamento, quali ovini, suini, equini, roditori. Preferably, the method of the invention is applied to the bovine species, but it can be advantageously extended to all mammalian breeding species, such as sheep, pigs, horses, rodents.
Nel metodo della presente invenzione, il liquido seminale, raccolto nei Centri di Produzione del Seme da capi selezionati in base alle caratteristiche genetiche (ad esempio da tori, padri genetici di vacche in cui la produzione di latte è maggiore o in cui sia stata verificata l’assenza di malattie genetiche legate al sesso mediante metodiche note al tecnico del ramo), viene congelato in “paillettes” da 0.25-0.5 mi, secondo le procedure ufficialmente riconosciute dall’Unione Europea. Così conservato, il seme è trasportato, a temperatura costante e controllata, dovunque sia industrialmente utile ed economicamente vantaggiosa la produzione di embrioni ad alto valore genetico, quindi sostanzialmente senza vincoli geografici, nei vari centri di allevamento bestiame. In the method of the present invention, the seminal fluid, collected in the Seed Production Centers from animals selected on the basis of genetic characteristics (for example from bulls, genetic fathers of cows in which the milk production is greater or in which the absence of genetic diseases linked to sex by methods known to the skilled in the art), is frozen in 0.25-0.5 ml "sequins", according to the procedures officially recognized by the European Union. Preserved in this way, the semen is transported, at a constant and controlled temperature, wherever it is industrially useful and economically advantageous to produce embryos with a high genetic value, therefore substantially without geographical restrictions, in the various livestock breeding centers.
Secondo il metodo dell’invenzione il seme congelato, viene rapidamente scongelato in bagnetto termostatato, preferibilmente a 37°C per due minuti, diluito in una soluzione di tampone citrato, fino ad ottenere una concentrazione di spermatozoi pari a 20x10<6>/ml. Per soluzione di tampone citrato si intende una soluzione di seguente composizione: 109 mM Sodio Citrato Tribasico Biidrato e 2.4 mM Acido Citrico, in H20. According to the method of the invention, the frozen semen is rapidly thawed in a thermostated bath, preferably at 37 ° C for two minutes, diluted in a solution of citrate buffer, until a sperm concentration equal to 20x10 <6> / ml is obtained. By citrate buffer solution we mean a solution of the following composition: 109 mM Tribasic Sodium Citrate Dihydrate and 2.4 mM Citric Acid, in H20.
Nel metodo secondo l’invenzione, viene utilizzato materiale scongelato avente una motilità progressiva (percentuale di spermatozoi con VAP > 25 μm /sec e STR > 0.8), uguale o superiore al 40 %, secondo i parametri indicati dalla WHO (World Health Organization, 1992, Laboratory manual for thè examination of human semen and spermcervical mucus interaction). In the method according to the invention, thawed material is used having a progressive motility (percentage of spermatozoa with VAP> 25 μm / sec and STR> 0.8), equal to or greater than 40%, according to the parameters indicated by the WHO (World Health Organization, 1992, Laboratory manual for the examination of human semen and spermcervical mucus interaction).
Gli spermatozoi sono quindi colorati con il colorante vitale Bisbenzimide Hoechst 33342, in condizioni tali da mantenere ottimale la vitalità degli spermatozoi, ottenute aggiungendo il colorante ad concentrazione finale di almeno 100 μg/ml e per un tempo non superiore a 20’, ad una temperatura compresa tra 30°C e 38°C, preferibilmente per un tempo di 15’ ad una temperatura di 35°C. Opzionalmente, dopo la colorazione, gli spermatozoi possono essere trattati con soluzioni di lavaggio o con soluzioni di diluizione del colorante. Nel metodo dell’invenzione, al campione viene aggiunto tampone citrato in rapporto 1:3. Il sessaggio degli spermatozoi viene effettuato mediante citofluorimetria a flusso, su apparecchiature modificate secondo quanto descritto in Johnson L.A., Pinkel D. (1986) Cytometry 7:268-273, quali ad esempio lo strumento Epics V (Coulter). Nel metodo dell’invenzione il citometro a flusso è preferibilmente il FACS-Vantage (Becton Dickinson), modificato con kit standard aggiuntivo che rispecchia le modifiche proposte da (Johnson L.A., Pinkel D. (1986) Cytometry 7:268-273) ed è equipaggiato di laser, di rivelatore consistente in un fotomoltiplicatore per la rilevazione della fluorescenza a 0° e di opportuni filtri. Il campione viene fatto fluire nel citofluorimetro in una soluzione TALP Ca<++ >FREE senza aggiunta di BSA, utilizzato come liquido di trascinamento o “sheath fluid". Per soluzione TALP Ca<++ >FREE è intesa una soluzione di composizione: NaCI 6000 mg, KCI 230 g, Na2HP0440 mg, MgCI2-6H20310 mg, Hepes 4760 mg, lattato di sodio 60% 3700 μΙ, Kanamicina 75 mg, piruvato di sodio 110 mg, PVA 1000 mg, NaHC03 420 mg, NaOH 420 mg, H20 sterile 1000 ml; pH 7.4 ; mOsm=284. The spermatozoa are then stained with the vital dye Bisbenzimide Hoechst 33342, in conditions such as to maintain optimal vitality of the spermatozoa, obtained by adding the dye to a final concentration of at least 100 μg / ml and for a time not exceeding 20 ', at a temperature comprised between 30 ° C and 38 ° C, preferably for a time of 15 'at a temperature of 35 ° C. Optionally, after staining, spermatozoa can be treated with wash solutions or dye dilution solutions. In the method of the invention, citrate buffer is added to the sample in a ratio of 1: 3. The sexing of the spermatozoa is performed by flow cytometry, on equipment modified as described in Johnson L.A., Pinkel D. (1986) Cytometry 7: 268-273, such as the Epics V (Coulter) instrument. In the method of the invention the flow cytometer is preferably the FACS-Vantage (Becton Dickinson), modified with an additional standard kit that reflects the modifications proposed by (Johnson L.A., Pinkel D. (1986) Cytometry 7: 268-273) and is equipped with a laser, a detector consisting of a photomultiplier for the detection of fluorescence at 0 ° and suitable filters. The sample is made to flow in the flow cytometer in a TALP Ca <++> FREE solution without the addition of BSA, used as entrainment liquid or "sheath fluid". For TALP Ca <++> FREE solution a solution of composition is intended: NaCI 6000 mg, KCI 230 g, Na2HP0440 mg, MgCI2-6H20310 mg, Hepes 4760 mg, 60% sodium lactate 3700 μΙ, Kanamycin 75 mg, sodium pyruvate 110 mg, PVA 1000 mg, NaHC03 420 mg, NaOH 420 mg, H20 sterile 1000 ml; pH 7.4; mOsm = 284.
Il flusso degli spermatozoi viene mantenuto pari a circa 1500 cellule/sec. L'entità della fluorescenza è proporzionale al contenuto di DNA di ogni gamete, maggiore negli spermatozoi che portano il cromosoma X rispetto a quelli che portano il cromosoma Y. Tale differenza è variabile nelle diverse specie di mammifero ed è comunque apprezzabile dallo strumento nelle condizioni descritte. Il rilevamento della fluorescenza assorbita avviene facendo passare singolarmente ogni spermatozoo attraverso un canale illuminato con luce UV di lunghezza d’onda preferibilmente compresa tra 333-364 nm, e rilevando il segnale acquisito su due diversi fotomoltiplicatori (FL1, FL2, FL3). The sperm flow is maintained at about 1500 cells / sec. The amount of fluorescence is proportional to the DNA content of each gamete, greater in the spermatozoa carrying the X chromosome than those carrying the Y chromosome. This difference is variable in the different mammal species and is however appreciable by the instrument in the conditions described . The detection of the absorbed fluorescence takes place by passing each sperm individually through a channel illuminated with UV light with a wavelength preferably between 333-364 nm, and detecting the acquired signal on two different photomultipliers (FL1, FL2, FL3).
La lettura del segnale di fluorescenza emesso dai campioni viene effettuata mediante software CellQuest, adattato al sistema operativo MacOS 7.5.3 che acquisisce ed analizza i dati, e lo sperma, separato nelle due popolazioni X e Y in tampone TALP Ca<++ >FREE, viene raccolto in provette rivestite di BSA, ottenute preferibilmente mediante incubazione delle stesse in una soluzione di TALP Ca<+ >FREE, contenente il 5% di BSA, per almeno 8 ore. The reading of the fluorescence signal emitted by the samples is carried out using CellQuest software, adapted to the MacOS 7.5.3 operating system which acquires and analyzes the data, and the sperm, separated into the two populations X and Y in TALP Ca <++> FREE buffer. , is collected in BSA-coated tubes, preferably obtained by incubating them in a solution of TALP Ca <+> FREE, containing 5% of BSA, for at least 8 hours.
Gli spermatozoi cosi raccolti vengono concentrati, ad esempio mediante centrifugazione a 400xg ed utilizzati per la fecondazione in vitro (IVF), effettuata su oociti primari non maturi (non ovulati) raccolti ad esempio mediante “ovum pick-up” in vivo, o da animali macellati da poco, maturati in vitro in terreni adatti, diversi a seconda della specie degli oociti, quali il terreno M199 additivato con ormoni e siero fetale bovino, o con altri sieri o fattori di crescita dipendenti dalla specie animale e che sono comunque noti al tecnico del ramo, ed in condizioni di temperatura ed atmosfera controllate. Gli oociti così maturati possono essere trattati, ad esempio con jaluronidasi, per eliminare cellule contaminanti o di rivestimento dell’oocita. La fecondazione avviene secondo metodi noti al tecnico del ramo: in particolare viene preferita la metodologia descritta in Galli C et al in: Atti XXIX Simposio Internazionale di Zootecnia: Animal production and Biotechnology, 1994, 185-189, in cui gli oociti vengono incubati in un terreno adatto alla capacitazione degli spermatozoi ed alla fecondazione con gli spermatozoi sessati ad un rapporto oociti/spermatozoi di 1/5000 in un volume finale di 50 μl per 18 ore in incubatore a C02 5%/aria, in terreno nutritivo adatto allo sviluppo dell’embrione, fino al raggiungimento dello stadio di blastocisti. Preferibilemente il terreno di sviluppo dell’embrione è il terreno SOF, di composizione: CaCI22H2O 25.1 mg, MgCI2-6H2O 10 mg, NaCI 580 mg, KCI 53.84 mg, KH2P04 16.2 mg, NaHC03220 mg, piruvato di sodio 3.6 mg, Hepes 476 mg, Penicillina 6.3mg, Streptomicina 5 mg, lattato di sodio 60% 47 μl, D-glucosio 27 mg, BSA fraz. V (fatty acid free) 1600 mg, Glutammina 14.6 mg, Non essential aminoacids 1 mi, Essential aminoacids 2 ml, H20 sterile 97 ml; pH 7.2 , mOsm=280. Lo zigote viene quindi messo a crescere in un sistema di co-coltura con cellule somatiche, che possono essere diverse a seconda della specie di provenienza degli oociti. Nel procedimento della presente invenzione, la co-coltura dell’oocita, bovino, fecondato è effettuata in presenza di un tappeto di cellule ottenute dall'epitelio tubarico di una bovina. Alternativamente, lo zigote può essere coltivato in terreno sintetico in sospensione. L’embrione così ottenuto può essere congelato o essere direttamente re-impiantato in madri surrogate per le fasi successive di sviluppo. Alternativamente, lo zigote può essere analizzato per la verifica del sesso. The spermatozoa collected in this way are concentrated, for example by centrifugation at 400xg and used for in vitro fertilization (IVF), carried out on unripe (non-ovulated) primary oocytes collected for example by "ovum pick-up" in vivo, or from animals recently slaughtered, matured in vitro in suitable media, different according to the species of oocytes, such as M199 medium with additives with hormones and fetal bovine serum, or with other serums or growth factors dependent on the animal species and which are in any case known to the technician branch, and in controlled temperature and atmosphere conditions. The oocytes thus matured can be treated, for example with hyaluronidase, to eliminate contaminating or oocyte lining cells. Fertilization occurs according to methods known to those skilled in the art: in particular, the methodology described in Galli C et al in: Proceedings XXIX International Symposium of Zootechnology: Animal production and Biotechnology, 1994, 185-189, is preferred, in which the oocytes are incubated in a medium suitable for the capacitation of spermatozoa and for fertilization with sexed spermatozoa at an oocyte / spermatozoa ratio of 1/5000 in a final volume of 50 μl for 18 hours in an incubator at 5% C02 / air, in a nutrient medium suitable for the development of embryo, until it reaches the blastocyst stage. Preferably, the development medium of the embryo is SOF medium, of composition: CaCI22H2O 25.1 mg, MgCI2-6H2O 10 mg, NaCI 580 mg, KCI 53.84 mg, KH2P04 16.2 mg, NaHC03220 mg, sodium pyruvate 3.6 mg, Hepes 476 mg , Penicillin 6.3mg, Streptomycin 5mg, 60% sodium lactate 47 μl, D-glucose 27 mg, BSA fraz. V (fatty acid free) 1600 mg, Glutamine 14.6 mg, Non essential aminoacids 1 ml, Essential aminoacids 2 ml, H20 sterile 97 ml; pH 7.2, mOsm = 280. The zygote is then grown in a co-culture system with somatic cells, which can be different depending on the species of origin of the oocytes. In the process of the present invention, the co-culture of the fertilized bovine oocyte is carried out in the presence of a carpet of cells obtained from the tubal epithelium of a bovine. Alternatively, the zygote can be grown in suspended synthetic soil. The embryo thus obtained can be frozen or be directly re-implanted in surrogate mothers for the subsequent stages of development. Alternatively, the zygote can be analyzed for sex verification.
Si è del tutto inaspettatamente trovato che impiegando il metodo della presente invenzione si ottengono embrioni di specie mammifere non umane, con buona efficienza, anche partendo da seme congelato. It has been completely unexpectedly found that by using the method of the present invention, embryos of non-human mammalian species are obtained, with good efficiency, even starting from frozen semen.
PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART
La presente invenzione viene qui descritta secondo i seguenti esempi intesi a scopo illustrativo e non limitativo. The present invention is described here according to the following examples intended for illustrative and non-limiting purposes.
Strumentazione Instrumentation
Il FACS-Vantage (BD) è equipaggiato con i seguenti accessori: 1) Laser: primo laser: Coherent Innova 300C ad argon con filtri per l'emissione a 333.6-363.8 nm, raffreddato ad acqua, secondo laser: Coherent Innova 70 Spectrum basato su una miscela di gas (kripton ed argon) con filtri per emettere nella luce visibile, raffreddato ad acqua; 2) Rivelatori: un fotomoltiplicatore (PMT) per la rilevazione della fluorescenza a 0 gradi (FL2) in sostituzione del fotodiodo, quattro fotomoltiplicatori Hamamatsu per la rilevazione a 90 gradi dello scatter (SS) e di tre fluorescenze contemporaneamente (FL1, FL2, FL3); 3) Filtri: filtro dicroico scatter 8/90, filtro band pass scatter 488/10, dicroico 560 short pass, filtro band pass 424/44 per FL1 (UV), filtro band pass 424/44 per FL2 (UV); 4) Software: CelIQUEST per l'acquisizione e l'analisi dei dati, su sistema operativo MacOS 7.5.3. The FACS-Vantage (BD) is equipped with the following accessories: 1) Laser: first laser: Argon Coherent Innova 300C with filters for emission at 333.6-363.8 nm, water cooled, second laser: Coherent Innova 70 Spectrum based on a mixture of gases (krypton and argon) with filters to emit in visible light, water-cooled; 2) Detectors: a photomultiplier (PMT) for the detection of the 0 degree fluorescence (FL2) in place of the photodiode, four Hamamatsu photomultipliers for the 90 degree detection of the scatter (SS) and of three fluorescences at the same time (FL1, FL2, FL3 ); 3) Filters: 8/90 scatter dichroic filter, 488/10 scatter band pass filter, 560 short pass dichroic filter, 424/44 band pass filter for FL1 (UV), 424/44 band pass filter for FL2 (UV); 4) Software: CelIQUEST for data acquisition and analysis, on MacOS 7.5.3 operating system.
L’apparecchio è modificato mediante: The device is modified by:
1. kit standard aggiuntivo: Fotomoltiplicatore Forward Scatter, che permette la sostituzione del fotodiodo che raccoglie il segnale luminoso a 0 gradi (forward scatter) con un fotomoltiplicatore in grado di raccogliere e completare tutte le informazioni della fluorescenza emessa dagli spermatozoi incrocianti il raggio laser. 1. additional standard kit: Forward Scatter photomultiplier, which allows the replacement of the photodiode that collects the light signal at 0 degrees (forward scatter) with a photomultiplier capable of collecting and completing all the information of the fluorescence emitted by the spermatozoa crossing the laser beam.
2. installazione dell’ago modificato che permette di orientare una quantità maggiore degli spermatozoi nello stesso verso. L’installazione dell’ago ha previsto il suo inserimento all’interno di una nuova testa: MacroSORT™ head con modificazioni anche del sistema idraulico ed elettronico. 2. installation of the modified needle that allows you to direct a greater quantity of spermatozoa in the same direction. The installation of the needle required its insertion inside a new head: MacroSORT ™ head with modifications also to the hydraulic and electronic system.
Le modifiche descritte al FACS Vantage rispecchiano quanto proposto da Johnson LA and Pinkel D in Cytometry 7:268-273, 1986 e sono commercialmente disponibili come kit aggiuntivi per il FACS Vantage. Questa metodica modificata permette di ottenere un citogramma in cui si evidenziano varie sottopopolazioni di spermatozoo ottenute in seguito al diverso orientamento assunto dagli spermatozoi nel loro scorrimento davanti al raggio laser. La sottopopolazione di nostro interesse è quella che, essendo composta dagli spermatozoi che incrociano il raggio laser perpendicolarmente, permette una analisi più accurata della bimodalità dovuta al diverso contenuto di DNA. In figura 1 sono riportati i citogrammi FL2 (fluorescenza “forward scatter")/FL1 ottenuti per selezionare la regione con più alta fluorescenza in FL1. In figura 2 e 3 sono invece riportati gli istogrammi della fluorescenza in FL1 ed FL2, effettuati sulla regione precedentemente selezionata per la verifica della bimodalità della distribuzione. In figura 3 vengono evidenziate le due sottopopolazioni di spermatozoi che vengono poi separate fisicamente. La finestra utile per il sortaggio è quella che seleziona le due code dell'istogramma bimodale della fluorescenza in FL2: la coda a sinistra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma Y (< contenuto di DNA, <fluorescenza), mentre quella a destra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma X (> contenuto di DNA, > maggiore fluorescenza). The modifications described to the FACS Vantage mirror what was proposed by Johnson LA and Pinkel D in Cytometry 7: 268-273, 1986 and are commercially available as add-on kits for the FACS Vantage. This modified method allows to obtain a cytogram in which various subpopulations of spermatozoa obtained following the different orientation assumed by the spermatozoa in their flow in front of the laser beam are highlighted. The subpopulation of our interest is that which, being composed of spermatozoa crossing the laser beam perpendicularly, allows a more accurate analysis of the bimodality due to the different DNA content. Figure 1 shows the FL2 (forward scatter fluorescence) / FL1 cytograms obtained to select the region with the highest fluorescence in FL1. selected to verify the bimodality of distribution. Figure 3 highlights the two subpopulations of spermatozoa which are then physically separated. The window useful for sorting is the one that selects the two tails of the bimodal histogram of fluorescence in FL2: the tail a left corresponds to sperm with Y chromosome (<DNA content, <fluorescence), while the right corresponds to sperm with X chromosome (> DNA content,> higher fluorescence).
Soluzioni utilizzate. Solutions used.
Bisbenzimide Hoechst 33342 (5 mg/ml): Tyrode's solution 400μl, Hoechst 33342 (Sigma) 2 mg. Aliquotato in Eppendorf e conservato a -20°C. Bisbenzimide Hoechst 33342 (5 mg / ml): Tyrode's solution 400μl, Hoechst 33342 (Sigma) 2 mg. Aliquoted in Eppendorf and stored at -20 ° C.
Sterilizzata con filtro 0.22 μm piu' prefiltro. Aliquotata in 1 mi stock e conservata in azoto liquido. Sterilized with 0.22 μm filter plus prefilter. Aliquoted in 1 ml stock and stored in liquid nitrogen.
TALP Ca<+ >FREE: NaCI 6000 ma. KCI 230 mg, Na2HP04 40 mg, MgCI2-6H20 310 mg, Hepes 4760 mg, lattato di sodio 60% 3700 μΙ, Kanamicina 75 mg, piruvato di sodio 110 mg, PVA 1000 mg, NaHC03 420 mg, NaOH 420 mg, H20 sterile 1000 ml; pH 7.4 ; mOsm=284. Aliquotata in 25 mi stock e conservata a 4°C. TALP Ca <+> FREE: NaCI 6000 ma. KCI 230 mg, Na2HP04 40 mg, MgCI2-6H20 310 mg, Hepes 4760 mg, sodium lactate 60% 3700 μΙ, Kanamycin 75 mg, sodium pyruvate 110 mg, PVA 1000 mg, NaHC03 420 mg, NaOH 420 mg, H20 sterile 1000 ml; pH 7.4; mOsm = 284. Aliquoted in 25 ml stock and stored at 4 ° C.
TALP wash: NaCI 7300 mg, KCI 235 mg, Na2HP04 47 mg, MgCI2-6H20 100 mg, NaHC03 168 mg, Hepes 2380 mg, lattato di sodio 60% 1900 μl, Kanamicina 75 mg, piruvato di Sodio 110 mg, CaCI2-2H20 390 mg, BSA fraz.V 6000 mg, H2O sterile 1000 ml; pH 7.5, mOsm=280. Aliquotata in 25 ml stock e conservata a 4°C. TALP wash: NaCI 7300 mg, KCI 235 mg, Na2HP04 47 mg, MgCI2-6H20 100 mg, NaHC03 168 mg, Hepes 2380 mg, 60% sodium lactate 1900 μl, Kanamycin 75 mg, Sodium pyruvate 110 mg, CaCI2-2H20 390 mg, BSA fraction V 6000 mg, sterile H2O 1000 ml; pH 7.5, mOsm = 280. Aliquoted in 25 ml stock and stored at 4 ° C.
SOF: CaCI, 2H,O 25.1 mg, MgCI2-6H2O 10 mg, NaCI580 mg, KCI 53.84 mg, KH2PO4 16.2 mg, NaHCO3 220 mg, piruvato di sodio 3.6 mg, Hepes 476 mg, Penicillina 6.3 mg, Streptomicina 5 mg, lattato di sodio 60% 47 μl, D-glucosio 27 mg, BSA fraz. V (fatty acid free) 1600 mg, Glutammina 14.6 mg, Non essential aminoacids 1 ml, Essential aminoacids 2 ml, H2O sterile 97 ml; pH 7.2 , mOsm=280. Sterilizzata con filtro 0.22 μm piu’ prefiltro. Aliquotata in 0.5 mi stock e conservata in azoto liquido. SOF: CaCI, 2H, O 25.1 mg, MgCI2-6H2O 10 mg, NaCI580 mg, KCI 53.84 mg, KH2PO4 16.2 mg, NaHCO3 220 mg, sodium pyruvate 3.6 mg, Hepes 476 mg, Penicillin 6.3 mg, Streptomycin 5 mg, lactate sodium 60% 47 μl, D-glucose 27 mg, BSA fraz. V (fatty acid free) 1600 mg, Glutamine 14.6 mg, Non essential aminoacids 1 ml, Essential aminoacids 2 ml, sterile H2O 97 ml; pH 7.2, mOsm = 280. Sterilized with 0.22 μm filter plus prefilter. Aliquoted in 0.5 ml stock and stored in liquid nitrogen.
Lacmoide 1%: Lacmoid 100 mg, H20 sterile 5.5 ml, Acido acetico glaciale 4.5 ml. Filtrata con filtro 0.8 pm. Lacmoid 1%: Lacmoid 100 mg, sterile H20 5.5 ml, Glacial acetic acid 4.5 ml. Filtered with 0.8 pm filter.
Esempio 1: Prove di vitalità e di diluizione dei campioni dopo colorazione con Hoechst 33342. Example 1: Viability and dilution tests of the samples after staining with Hoechst 33342.
Sono state provate varie concentrazioni di Bisbenzimide Hoechst 33342: 5 μg/ml finali, 10 μg/ml finali e 100 pg/ml finali, con i tempi di incubazione di 15, 60, 120, 240 e 300 minuti e<1 >stato evidenziato che con 100 μg/ml. E’ stata valutata la vitalità di spermatozoi scongelati secondo quanto descritto nell'esempio 2, dopo i diversi tempi di incubazione alle diverse concentrazioni finali di colorante: la vitalità risulta massima dopo una colorazione di 15 minuti con 100 μg/ml di Bisbenzimide Hoechst 33342. Various concentrations of Bisbenzimide Hoechst 33342 were tested: final 5 μg / ml, final 10 μg / ml and final 100 pg / ml, with incubation times of 15, 60, 120, 240 and 300 minutes and <1> was highlighted than with 100 μg / ml. The viability of thawed spermatozoa was evaluated as described in example 2, after the different incubation times at the different final concentrations of dye: viability is maximum after 15 minutes staining with 100 μg / ml of Bisbenzimide Hoechst 33342.
Il campione di spermatozoi colorati è stato quindi diluito con diverse soluzioni quali: PBS, Tyrode's solution ed un tampone citrato (109 mM Sodio Citrato Tribasico Biidrato e 2.4 mM Acido Citrico). Solo quest'ultimo si e’ dimostrato in grado di dissolvere il mestruo di congelamento permettendo la migliore definizione delle popolazioni da valutare. The stained sperm sample was then diluted with different solutions such as: PBS, Tyrode's solution and a citrate buffer (109 mM Tribasic Sodium Citrate Dihydrate and 2.4 mM Citric Acid). Only the latter has been shown to be able to dissolve the freezing period allowing the best definition of the populations to be assessed.
Come liquido di trascinamento sono state testate diverse soluzioni come PBS, Tris pH 7 e TALP Ca<++ >free pH 7.4: si e’ evidenziato che quest'ultima dava buoni risultati sia dal punto di vista di stabilita’ di flusso che di vitalità degli spermatozoi, ma soprattutto non interferiva nella fase di fertilizzazione in vitro (IVF) in cui viene sempre utilizzata TALP. Different solutions were tested as entrainment liquid such as PBS, Tris pH 7 and TALP Ca <++> free pH 7.4: it was shown that the latter gave good results both from the point of view of flow stability and viability. spermatozoa, but above all it did not interfere in the in vitro fertilization (IVF) phase in which TALP is always used.
Il liquido di trascinamento (TALP Ca<++ >free pH 7.4) ed il tampone citrato non vengono additivati con BSA, migliorando in tal modo la stabilità del flusso e conseguentemente la correttezza del "sorting”. In presenza di BSA infatti sono evidenziabili spermatozoi con teste attaccate (doppiette) indice di alterazioni della membrana cellulare, che non sono evidenziabili senza di BSA. The entrainment liquid (TALP Ca <++> free pH 7.4) and the citrate buffer are not added with BSA, thus improving the stability of the flow and consequently the correctness of the "sorting". In the presence of BSA, in fact, spermatozoa are evident. with attached heads (doublets) indicating cell membrane alterations, which are not detectable without BSA.
Per il recupero degli spermatozoi sortati sono state confrontate due modalità di raccolta: in provette con mestruo a base di Tris e tuorlo d’uovo con e senza BSA o in provette rivestite (saturate) di BSA mediante incubazione per una notte con TALP Ca<++ >free pH 7.4 addizionata di BSA al 5%. I risultati migliori sono stati ottenuti raccogliendo gli spermatozoi in TALP Ca<++ >free pH 7.4, in provette saturate con BSA che mantiene ottimale la vitalità degli spermatozoi e che non interferisce nelle successive fasi della ÌVF, contrariamente ai metodi dell’arte nota (ad es. con mestruo a base di Tris e tuorlo d’uovo con e senza BSA) che, pur conservando una buona vitalità degli spermatozoi, non permetteva un facile recupero degli stessi nelle prime fasi della fecondazione in vitro (IVF). Two methods of collection were compared for the recovery of the sorted spermatozoa: in tubes with Tris-based menstruation and egg yolk with and without BSA or in tubes coated (saturated) with BSA by incubation for one night with TALP Ca <+ +> free pH 7.4 added with 5% BSA. The best results were obtained by collecting the spermatozoa in TALP Ca <++> free pH 7.4, in test tubes saturated with BSA which maintains the optimal vitality of the spermatozoa and which does not interfere in the subsequent phases of the IVF, contrary to the methods of the known art ( for example with Tris-based menstruation and egg yolk with and without BSA) which, while retaining a good vitality of the spermatozoa, did not allow an easy recovery of the same in the early stages of in vitro fertilization (IVF).
Esempio 2: Sessaggio del seme e separazione delle sottopopolazioni recanti il cromosoma X ed Y. Example 2: Sexing of the semen and separation of the subpopulations bearing the X and Y chromosome.
Preparazione dei campioni scongelati. Preparation of thawed samples.
Il materiale seminale bovino congelato viene scongelato in bagnomaria termostatato a 37°C per 2 minuti ed una aliquota di almeno 200 spermatozoi viene valutata, per quanto riguarda i parametri cinetici con il sistema CASA Hamilton Thorne mod. IVOS cosi’ settato: FRAME ACQUIRED=30, MINIMUM CONTRAST= 5 , MINIMUM CELL SIZE=25, THRESHOLD STRAIGHTNESS=80, MEDIUM VAP CUT-OFF=25.0, LOW VAP CUT-OFF=24.9, LOW VSL CUT-OFF=20.0, NON MOTILE HEAD SIZE=60, NON MOTILE HEAD INTENSITY=50, 0.19 < STATIC SIZE LIMITS < 5.55, 0.52 < STATIC INTENSITÀ LIMITS < 10.00, 0 < STATIC ELONGATION LIMITS < 60. The frozen bovine seminal material is thawed in a thermostated water bath at 37 ° C for 2 minutes and an aliquot of at least 200 spermatozoa is evaluated, as regards the kinetic parameters with the CASA Hamilton Thorne mod. IVOS set as follows: FRAME ACQUIRED = 30, MINIMUM CONTRAST = 5, MINIMUM CELL SIZE = 25, THRESHOLD STRAIGHTNESS = 80, MEDIUM VAP CUT-OFF = 25.0, LOW VAP CUT-OFF = 24.9, LOW VSL CUT-OFF = 20.0, NON MOTILE HEAD SIZE = 60, NON MOTILE HEAD INTENSITY = 50, 0.19 <STATIC SIZE LIMITS <5.55, 0.52 <STATIC INTENSITY LIMITS <10.00, 0 <STATIC ELONGATION LIMITS <60.
Il seme è stato passato in citofluorimetria a flusso (sessato) solo se avente una motilità' progressiva (percentuale di spermatozoi con VAP > 25 μm/sec e STR > 0.8), superiore al 40 %, secondo i parametri indicati da World Health Organization. The semen was passed in flow cytometry (sexed) only if it had a progressive motility (percentage of spermatozoa with VAP> 25 μm / sec and STR> 0.8), higher than 40%, according to the parameters indicated by the World Health Organization.
Il seme è stato diluito in un tampone citrato (109 mM Sodio Citrato Tribasico Biidrato e 2.4 mM Acido Citrico) fino ad ottenere una concentrazione di spermatozoi pari a 20x10<6>/ml. Viene aggiunta un’aliquota di Bisbenzimide Hoechst 33342 (5 mg/ml in Tyrode's solution) per ottenere una concentrazione finale dello stesso di 100 μg/ml. Il campione viene poi incubato a 35°C per 15 minuti. Per la valutazione della fluorescenza e la successiva separazione degli spermatozoi, il campione viene fatto fluire nello strumento utilizzando, come liquido di trascinamento, TALP Ca<++ >free pH 7.4 senza aggiunta di BSA. The semen was diluted in a citrate buffer (109 mM Tribasic Sodium Citrate Dihydrate and 2.4 mM Citric Acid) until a sperm concentration of 20x10 <6> / ml was obtained. An aliquot of Bisbenzimide Hoechst 33342 (5 mg / ml in Tyrode's solution) is added to obtain a final concentration of the same of 100 μg / ml. The sample is then incubated at 35 ° C for 15 minutes. For the evaluation of the fluorescence and the subsequent separation of the spermatozoa, the sample is made to flow into the instrument using, as entrainment liquid, TALP Ca <++> free pH 7.4 without addition of BSA.
Analisi della fluorescenza Fluorescence analysis
Mediante un laser ad argon Innova 300C impostato a potenza di 150 mW, gli spermatozoi fluorocromatizzati vengono quindi eccitati con luce ultravioletta a 333.6-363.8 nm. Using an Innova 300C argon laser set at a power of 150 mW, the fluorochromatized spermatozoa are then excited with ultraviolet light at 333.6-363.8 nm.
Dalle cellule fatte fluire alla velocità di 1500-2000 cellule/sec, si procede con l'acquisizione della fluorescenza emessa, sia a 0 gradi che a 90 gradi, i dati vengono acquisiti in citogrammi ed istogrammi a 1024 canali, valutando in modo particolare: From the cells made to flow at the speed of 1500-2000 cells / sec, we proceed with the acquisition of the emitted fluorescence, both at 0 degrees and at 90 degrees, the data are acquired in cytograms and histograms at 1024 channels, evaluating in particular:
a) il citogramma FL1 (fluorescenza a 90 gradi) / FL2 (fluorescenza a 0 gradi) per selezionare la regione con maggiore fluorescenza in FL2 (spermatozoi che fluiscono davanti al raggio laser con la superficie maggiore). a) the FL1 (90 degree fluorescence) / FL2 (0 degree fluorescence) cytogram to select the region with the greatest fluorescence in FL2 (spermatozoa flowing in front of the laser beam with the largest surface area).
b) l’istogramma della fluorescenza in FL2 della sottopopolazione precedentemente definita per la verifica della bimodalità. b) the histogram of the FL2 fluorescence of the subpopulation previously defined for the verification of bimodality.
In questo modo e’ possibile raccogliere ed integrare tutte le informazioni della fluorescenza emessa nelle diverse direzioni dagli spermatozoi incrocianti il raggio laser con la superficie maggiore (di piatto). In this way it is possible to collect and integrate all the information of the fluorescence emitted in the different directions by the spermatozoa crossing the laser beam with the largest surface (flat).
In questo modo e’ possìbile raccogliere ed integrare tutte le informazioni della fluorescenza emessa nelle diverse direzioni dagli spermatozoi incrocianti il raggio laser con la superficie maggiore (di piatto). In this way it is possible to collect and integrate all the information of the fluorescence emitted in the different directions by the spermatozoa crossing the laser beam with the largest surface (flat).
La definizione delle sottopopolazioni da sodare avviene mediante gates che selezionano le due code dell'istogramma bimodale della fluorescenza in FL2: la coda a sinistra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma Y (minore contenuto di DNA e quindi minore fluorescenza) mentre la coda a destra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma X (maggiore contenuto di DNA e quindi maggiore fluorescenza). The definition of the subpopulations to be sodaed takes place by means of gates that select the two tails of the bimodal histogram of fluorescence in FL2: the tail on the left corresponds to the spermatozoa with Y chromosome (lower DNA content and therefore lower fluorescence) while the tail on the right corresponds to the spermatozoa with X chromosome (higher DNA content and therefore higher fluorescence).
Raccolta delle sottopopolazioni Xe Y di spermatozoi. Collection of X and Y subpopulations of spermatozoa.
Gli spermatozoi sortati secondo la procedura descritta in precedenza, e raccolti in provette rivestite di BSA, vengono poi concentrati tramite centrifugazione a 400xg per 10 minuti e, dopo l’eliminazione del surnatante, viene misurato il volume del pellet. The spermatozoa sorted according to the procedure described above, and collected in BSA-coated tubes, are then concentrated by centrifugation at 400xg for 10 minutes and, after elimination of the supernatant, the volume of the pellet is measured.
Esempio 3: Verifica del sessaggio del seme. Example 3: Verification of semen sexing.
La verifica del sessaggio del seme e' stata effettuata sul materiale sodato con rianalisi citofluorimetrica o con metodi genetico-molecolari. Nel primo caso il materiale sodato raccolto viene rianalizzato tramite citofluorimetria a flusso e, tramite software, e' possibile sovrapporre gli istogrammi della fluorescenza FL2 ottenuta dagli spermatozoi X ed Y. The verification of the sexing of the semen was carried out on the soda material with flow cytometric reanalysis or with genetic-molecular methods. In the first case, the collected soda material is reanalyzed by flow cytometry and, by means of software, it is possible to superimpose the histograms of the FL2 fluorescence obtained from the X and Y spermatozoa.
E’ stato inoltre utilizzato un approccio basato su PCR (polymerase Chain reaction) di tipo quantitativo. Tale sistema si basa sull'amplificazione di almeno due frammenti di DNA, uno posto su un cromosoma autosomico (sempre presente negli spermatozoi) e l'altro posto solo sul cromosoma sessuale. Dopo l'amplificazione dei marcatori fluorocromatizzati frammenti viene eseguita una elettroforesi che consente di discriminarli in base alla loro velocità di spostamento in un gel di agarosio a cui e’ applicata una data differenza di potenziale. Alla fine della corsa elettroforetica i frammenti vengono colorati e fotografati. Il frammento di DNA relativo al cromosoma autosomico sarà sempre presente, mentre quello legato al cromosoma sessuale sarà tanto più evidente quanto maggiore e’ la quantità di spermatozoi X o Y presente nel campione. Questo e’ un aspetto molto importante da considerare infatti, con il sessaggio del seme, e’ possibile raggiungere un livello di "arricchimento" di spermi di un dato sesso non inferiore al 75%. A quantitative PCR (polymerase Chain reaction) approach was also used. This system is based on the amplification of at least two DNA fragments, one placed on an autosomal chromosome (always present in spermatozoa) and the other placed only on the sex chromosome. After the amplification of the fluorochromatized markers fragments, an electrophoresis is performed which allows them to be discriminated based on their speed of movement in an agarose gel to which a given potential difference is applied. At the end of the electrophoretic run the fragments are colored and photographed. The DNA fragment relating to the autosomal chromosome will always be present, while the one linked to the sex chromosome will be all the more evident the greater the quantity of X or Y spermatozoa present in the sample. This is a very important aspect to consider, in fact, with the sexing of the semen, it is possible to reach a level of "enrichment" of sperms of a given sex of no less than 75%.
I risultati ottenuti con entrambi i metodi dimostrano che l'arricchimento degli spermatozoi recanti il cromosoma X o quello Y è sempre superiore o uguale al 75%. The results obtained with both methods show that the enrichment of spermatozoa bearing the X or Y chromosome is always greater than or equal to 75%.
Esempio 4: Fecondazione in vitro e crescita preimpianto deali ovociti fecondati. Example 4: In vitro fertilization and pre-implantation growth of fertilized oocytes.
La fecondazione in vitro degli ovociti maturati in vitro è stata effettuata sostanzialmente come descritto in: Galli C., Aleandri R., Lazzari G. (1994). Atti del XXIX Simposio Internazionale di Zootecnia: Animai production and Biotechnology, 185-189. Da 500 μl di soluzione per IVF, lasciata ad equilibrare in incubatore a C02 5% a 38°C per un minimo di 30 minuti, viene prelevata un'aliquota, pari al volume del pellet di spermatozoi sessati e precedentemente misurato (Esempio 2), che viene sostituita dallo stesso. Con tale soluzione si preparano gocce da 50 μl che vengono poi ricoperte con olio minerale caldo, precedentemente messo ad equilibrare in incubatore a CO2 5% a 38°C per circa una notte. In ognuna di queste gocce vengono posti 5 ovociti maturi e denudati, mediante jaluronidasi, del cumulo ooforo. The in vitro fertilization of the in vitro matured oocytes was carried out substantially as described in: Galli C., Aleandri R., Lazzari G. (1994). Proceedings of the XXIX International Symposium of Zootechnics: Animai production and Biotechnology, 185-189. From 500 μl of IVF solution, left to equilibrate in an incubator at 5% C02 at 38 ° C for a minimum of 30 minutes, an aliquot is taken, equal to the volume of the previously measured sexed sperm cell pellet (Example 2), which is replaced by the same. With this solution, 50 μl drops are prepared which are then covered with hot mineral oil, previously equilibrated in a 5% CO2 incubator at 38 ° C for about one night. In each of these drops 5 mature and denuded oocytes are placed, by means of hyaluronidase, of the cumulus oophorus.
Dopo incubazione in incubatore a CO25% a 38°C per 18 ore, gli ovociti vengono posti in TALP wash e liberati dagli spermatozoi e dalle cellule della corona radiata tramite azione meccanica con vortex. After incubation in an incubator at 25% CO at 38 ° C for 18 hours, the oocytes are placed in TALP wash and freed from the spermatozoa and from the corona radiata cells by mechanical action with vortexing.
Alcuni di tali ovociti fecondati vengono posti su di un vetrino lavato in etanolo e vengono poi chiusi con un vetrino coprioggetto, per verificare ('avvenuta fecondazione. Dopo una notte in fissativo (etanolo:acido acetico 3:1), i vetrini vengono colorati con Lacmoide 1% per capillarità’ e subito risciacquati con acido acetico 45%. In tal modo e' possibile verificare al microscopio l’avvenuta fecondazione tramite la ricerca dei due pronuclei (maschile e femminile) e della coda dello spermatozoo penetrato o, nel caso l’ovocita non sia stato fecondato, l’avvenuta maturazione dello stesso attraverso la presenza di una metafase con un globulo polare. Some of these fertilized oocytes are placed on a slide washed in ethanol and are then closed with a coverslip, to verify ('fertilization has occurred. After a night in fixative (ethanol: acetic acid 3: 1), the slides are stained with Lacmoid 1% by capillarity and immediately rinsed with 45% acetic acid. In this way it is possible to verify under the microscope that fertilization has taken place by searching for the two pronuclei (male and female) and the tail of the penetrated spermatozoon or, in the case of oocyte has not been fertilized, the maturation of the same occurred through the presence of a metaphase with a polar globule.
Dopo la fase di fecondazione e il denudamento degli ovociti con vortex, si procede alla messa in coltura degli stessi in medium SOF. Per tale pratica, un giorno prima occcorre preparare in opportuni contenitori (four-wells) due microgocce da 20μl di tale medium ricoperte di olio minerale. Queste devono essere quindi poste ad equilibrare per un giorno in incubatore a ad una temperatura di 38°C. Gli ovociti denudati vengono quindi posti nella prima goccia di lavaggio e solo quelli non ancora divisi (quelli eventualmente in divisione dopo 18 h indicano un’attivazione partenogenetica) vengono subito trasferiti nella seconda goccia in numero di circa 20 per goccia e riposti in incubatore ad 02. Il giorno seguente è già possibile osservare la prima divisione degli ovociti fecondati (CLEAVAGE) e quelli non divisi vengono spostati nella goccia laterale di lavaggio. Due giorni dopo si procede alla sostituzione del medium aggiungendo alla goccia di coltura 20μΙ di SOF equilibrata in incubatore e aspirandone poi un uguale quantitativo. Dopo ulteriori due giorni di coltura in medium SOF, questo viene sostituito con lo stesso procedimento con medium M199 sempre con l'accortezza di averlo lasciato ad equilibrare. Tale medium supporterà lo sviluppo degli embrioni fino allo stadio di blastocisti che viene raggiunto nei due successivi giorni. After the fertilization phase and the denudation of the oocytes with vortexing, they are cultured in SOF medium. For this practice, one day before it is necessary to prepare two micro-drops of 20μl of this medium covered with mineral oil in suitable containers (four-wells). These must then be left to equilibrate for one day in an incubator at a temperature of 38 ° C. The denuded oocytes are then placed in the first drop of washing and only those not yet divided (those eventually dividing after 18 h indicate parthenogenetic activation) are immediately transferred to the second drop in a number of about 20 per drop and placed in an incubator at 02 The following day it is already possible to observe the first division of the fertilized oocytes (CLEAVAGE) and those that are not divided are moved to the lateral wash drop. Two days later, the medium is replaced by adding 20μΙ of SOF equilibrated in an incubator to the drop of culture and then aspirating an equal quantity. After a further two days of cultivation in SOF medium, this is replaced with the same procedure with M199 medium, always with the foresight to have left it to equilibrate. This medium will support the development of the embryos up to the blastocyst stage which is reached in the next two days.
I risultati delle IVF effettuate sono riportate nella tabella X. The results of the IVFs performed are shown in Table X.
Tabella X Table X
N. spermatozoi/ovocita N. ovociti N. ovociti fecondati % fecondazioni Spermi X 34 12 35.3 Spermi Y 35 14 40.0 N. spermatozoa / oocyte N. oocytes N. fertilized oocytes% fertilizations Sperms X 34 12 35.3 Sperms Y 35 14 40.0
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