ITBO20130600A1

ITBO20130600A1 - FLUOROGENIC AND PHOTO-ADJUSTABLE MARKER BASED ON PERILENDIIMMIDI REPLACED WITH POLYETERAMMINE FOR FLUORESCENT MARKING IN DIFFERENT COLORS OF BIOLOGICAL CELLS.

Info

Publication number: ITBO20130600A1
Application number: IT000600A
Authority: IT
Inventors: Marco Montalti
Original assignee: Marco Montalti
Priority date: 2013-11-04
Filing date: 2013-11-04
Publication date: 2015-05-05

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

‘MARCATORE FLUOROGENICO E FOTO-REGOLABILE BASATO SU PERILENDIIMMIDI SOSTITUITE CON POLIETERAMMINE CHE CONSENTE DI OTTENERE LA MARCATURA FLUORESCENTE IN DIVERSI COLORI DI CELLULE BIOLOGICHE.’ 'FLUOROGENIC AND PHOTO-ADJUSTABLE MARKER BASED ON PERILENDIIMMIDES REPLACED WITH POLYETHERAMINE THAT ALLOWS TO OBTAIN THE FLUORESCENT MARKING IN DIFFERENT COLORS OF BIOLOGICAL CELLS.'

Campo di applicazione. La presente invenzione si inserisce nel campo degli agenti chimici utilizzati per marcare, rendendoli fluorescenti, alcuni sistemi target come per esempio le cellule biologiche. In generale tali marcatori vengono utilizzati per marcare interamente le cellule o solo specifici compartimenti cellulari e hanno importanti applicazioni in aree di grande impatto economico come per esempio la produzione alimentare ed il controllo della salute umana. Field of application. The present invention falls within the field of chemical agents used to mark certain target systems such as biological cells by making them fluorescent. In general, these markers are used to mark cells entirely or only specific cellular compartments and have important applications in areas of great economic impact such as food production and human health control.

Stato dell’arte State of the art

Vantaggi dei marcatori fluorogenici. Alcuni particolari marcatori sono detti fluorogenici in quanto sono materiali che diventano intensamente fluorescenti quando sono adsorbiti dai loro targets ma sono debolmente Advantages of fluorogenic markers. Some particular markers are called fluorogenic as they are materials that become intensely fluorescent when adsorbed by their targets but are weakly

fluorescenti quando non sono adsorbiti dai loro targets e si trovano per esempio dispersi in ambiente acquoso. I marcatoti fluorogenici offrono molti vantaggi quali, per esempio, l’ottenimento di un elevato rapporto segnale rumore sia in microscopia che nei saggi fluorimetrici anche senza operare alcun lavaggio delle cellule dopo la marcatura. (D1, Hori, Y.; Kikuchi, K. “Protein labeling with fluorogenic probes for no-wash live-cell imaging of proteins.” Current Opinion in Chemical Biology 2013, 17, 644-50). fluorescent when they are not adsorbed by their targets and are for example dispersed in an aqueous environment. Fluorogenic markers offer many advantages such as, for example, obtaining a high signal-to-noise ratio both in microscopy and in fluorometric assays even without washing the cells after labeling. (D1, Hori, Y .; Kikuchi, K. “Protein labeling with fluorogenic probes for no-wash live-cell imaging of proteins.” Current Opinion in Chemical Biology 2013, 17, 644-50).

Vantaggi della colorazione fluorescente a più colori. Per alcune applicazioni è vantaggioso marcare con fluorescenza di colore diverso diversi target come per esempio diverse cellule biologiche o diversi compartimenti cellulari allo scopo, per esempio, di distinguerli mediante l’uso di filtri ottici o di analizzatori spettrali. Advantages of multi-color fluorescent dyeing. For some applications it is advantageous to mark different targets with different color fluorescence such as different biological cells or different cell compartments in order, for example, to distinguish them through the use of optical filters or spectral analyzers.

Vantaggi della fotoregolazione della fluorescenza. Per alcune applicazione è vantaggioso attivare o modificare il colore della fluorescenza dei marcatori dopo il loro adsorbimento da parte dei targets mediante irradiazione con una intensa luce visibile per esempio allo scopo di causare una variazione di colorazione di diverse cellule biologiche o diversi compartimenti cellulari per esempio allo scopo di distinguere i diversi target in base alla variazione di colore o al colore ottenuto dopo irradiazione controllata usando specifici filtri di emissione o analizzatori spettrali. Advantages of fluorescence photoregulation. For some applications it is advantageous to activate or modify the color of the fluorescence of the markers after their adsorption by the targets by irradiation with an intense visible light, for example in order to cause a variation in the staining of different biological cells or different cellular compartments, for example at the aim to distinguish the different targets based on the color variation or the color obtained after controlled irradiation using specific emission filters or spectral analyzers.

Vantaggi delle perilendiimmidi (PDI). Le PDI sono composti fluorescenti molto utili per le loro proprietà fotofisiche, fotochimiche e chimiche e vengono utilizzati per esempio in elettronica molecolare e per la fotovoltaica organica. In particolare le PDI sono molecole molto emittenti con rese quantiche di fluorescenza che in molti casi sono 0.9-1.0 in soluzione di solventi organici. Inoltre le PDI emettono e possono essere eccitate nel visibile. In particolare possono essere eccitate con le più comuni sorgenti utilizzate per le misure e l’imaging di fluorescenza come per esempio lampade, diodi laser e laser a ioni argon o kripton. La maggior parte delle PDI, in assenza di additivi, non sono solubili né disperdibili in ambiente acquoso. Questo limite può essere superato mediante la funzionalizzazione dell’unità PDI con catene idrofiliche per esempio sugli azoti immidici. Per esempio in D2 [Heek, T., C. Fasting, et al. "Highly fluorescent water-soluble polyglycerol-dendronized perylene bisimide dyes." Chemical Communications 2010, 46, 1884-1886] è riportato come preparare alcune PDI funzionalizzate covalentemente con catene polietilenglicoliche (PEG) ramificate di diversa dimensione. Queste PDI sono disperdibili in acqua in forma di nano-aggregati aventi una debole fluorescenza rossa quando i PEG hanno bassa massa molare mentre le molecole con sostituenti più ingombranti non aggregano e mostrano una intensa fluorescenza verde. In un altro esempio [D3, Heek, T., J. Nikolaus, et al. "An Amphiphilic Perylene Imido Diester for Selective Cellular Imaging." Bioconjugate Chemistry 2013, 24, 153-158.] i nanoaggregati di un derivato anfifilico di una PDI vengono utilizzati come marcatori fluorogenici sfruttando la loro disaggregazione nelle cellule per Advantages of perylenedimides (PDI). PDIs are very useful fluorescent compounds for their photophysical, photochemical and chemical properties and are used for example in molecular electronics and organic photovoltaics. In particular, PDIs are very emitting molecules with quantum yields of fluorescence which in many cases are 0.9-1.0 in organic solvent solution. In addition, POIs emit and can be excited in the visible. In particular, they can be excited with the most common sources used for fluorescence measurements and imaging such as lamps, laser diodes and argon or krypton ion lasers. Most PDI, in the absence of additives, are neither soluble nor dispersible in an aqueous environment. This limit can be overcome by functionalising the PDI unit with hydrophilic chains, for example on imide nitrogen. For example in D2 [Heek, T., C. Fasting, et al. "Highly fluorescent water-soluble polyglycerol-dendronized perylene bisimide dyes." Chemical Communications 2010, 46, 1884-1886] it is reported how to prepare some covalently functionalized PDIs with branched polyethylene glycol (PEG) chains of different sizes. These PDIs are dispersible in water in the form of nano-aggregates having a weak red fluorescence when the PEGs have low molar mass while the molecules with more bulky substituents do not aggregate and show an intense green fluorescence. In another example [D3, Heek, T., J. Nikolaus, et al. "An Amphiphilic Perylene Imido Diester for Selective Cellular Imaging." Bioconjugate Chemistry 2013, 24, 153-158.] The nanoaggregates of an amphiphilic derivative of a PDI are used as fluorogenic markers by exploiting their disaggregation in cells to

ottenere la marcature fluorescente verde di alcuni compartimenti. In un altro esempio [D4, Zhu, L., W. Wu, et al. "Reversibly Photoswitchable Dual-Color Fluorescent Nanoparticles as New Tools for Live-Cell Imaging." Journal of the American Chemical Society 2007, 129, 3524-3526.] la fluorescenza di nanoparticelle polimeriche contenenti una PDI viene foto-regolata e convertita reversibilmente da verde a rossa sfruttando la foto-isomerizzazione di una seconda molecola, non appartenente alla famiglia delle PDI, che in una delle due forme isomeriche si comporta da accettore di energia di eccitazione nei confronti della PDI spegnendone l’emissione verde e dando emissione sensibilizzata rossa. obtain the green fluorescent markings of some compartments. In another example [D4, Zhu, L., W. Wu, et al. "Reversibly Photoswitchable Dual-Color Fluorescent Nanoparticles as New Tools for Live-Cell Imaging." Journal of the American Chemical Society 2007, 129, 3524-3526.] The fluorescence of polymeric nanoparticles containing a PDI is photo-regulated and reversibly converted from green to red by exploiting the photo-isomerization of a second molecule, not belonging to the PDI family , which in one of the two isomeric forms acts as an excitation energy acceptor towards the PDI, turning off its green emission and giving red sensitized emission.

Il problema tecnico che la presente invenzione risolve è di fornire un marcatore per la colorazione fluorescente di cellule biologiche che presenti simultaneamente le seguenti caratteristiche: The technical problem solved by the present invention is to provide a marker for the fluorescent staining of biological cells which simultaneously exhibits the following characteristics:

a) Il marcatore è basato su PDI a) The marker is based on POI

b) Il marcatore è disperdibile in ambiente acquoso in forma di nanoaggregati non fluorescenti b) The marker is dispersible in an aqueous environment in the form of non-fluorescent nanoaggregates

c) Il marcatore è efficacemente adsorbito da cellule biologiche in dispersione acquosa. c) The marker is effectively adsorbed by biological cells in aqueous dispersion.

d) Il marcatore diventa intensamente fluorescente una volta adsorbito dalle cellule biologiche d) The marker becomes intensely fluorescent once adsorbed by biological cells

e) Il marcatore impartisce una fluorescenza alle cellule biologiche o ai diversi compartimenti cellulari il cui colore dipende dal dosaggio del marcatore. e) The marker imparts a fluorescence to biological cells or to different cell compartments whose color depends on the dosage of the marker.

f) Il marcatore impartisce una fluorescenza alle cellule biologiche o ai diversi compartimenti cellulari il cui colore cambia dopo irradiazione in modo diverso a seconda delle caratteristiche della cellula o del compartimento cellulare. f) The marker imparts a fluorescence to biological cells or to different cell compartments whose color changes after irradiation in different ways depending on the characteristics of the cell or cell compartment.

Allo stato dell’arte ad esempio in D3 sono resi disponibili marcatori che hanno simultaneamente le caratteristiche a), b), c), d) ma non le caratteristiche e), f). Nel caso di D4 viene reso disponibile un marcatore basato su PDI che impartisce una colorazione fluorescente ad alcuni compartimenti cellulari che può essere convertita da irradiazione da verde a rosso e viceversa. In D4 non viene però riportata alcuna considerazione riguardo all’effetto dell’ambiente biologico circostante sul processo di cambiamento di colore. E’ comunque prevedibile che tale effetto sia nullo essendo le molecole che ne sono responsabili protette da tale ambiente in quanto incluse in una particella polimerica. Questo significa che in base a D4 non è possibile stabilire se il marcatore descritto nel documento abbia la caratteristica indicata come f) ma risulta sicuramente evidente che il marcatore descritto in D4 non è fluorogenico. Inoltre la strategia proposta per la fotoregolazione della fluorescenza in D4 non è adatta ad ottenere un marcatore con la proprietà f). E’ anche evidente che il problema che viene risolto dalla presente invenzione non può essere At the state of the art, for example, in D3, markers are made available that simultaneously have the characteristics a), b), c), d) but not the characteristics e), f). In the case of D4, a PDI-based marker is made available which imparts a fluorescent staining to some cellular compartments which can be converted from green to red irradiation and vice versa. However, no consideration is given in D4 regarding the effect of the surrounding biological environment on the color change process. However, it is foreseeable that this effect will be zero since the molecules that are responsible for it are protected from this environment as they are included in a polymer particle. This means that on the basis of D4 it is not possible to establish whether the marker described in the document has the characteristic indicated as f) but it is certainly evident that the marker described in D4 is not fluorogenic. Furthermore, the proposed strategy for photoregulation of fluorescence in D4 is not suitable for obtaining a marker with the property f). It is also evident that the problem that is solved by the present invention cannot be

risolto in modo ovvio sulla base delle conoscenze contenute nello stato dell’arte. solved in an obvious way on the basis of the knowledge contained in the state of the art.

BREVE DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile basato su PDI per la marcatura fluorescente di cellule biologiche avente la formula chimica 1 dove R è una polieterammina. In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker based on PDI for the fluorescent labeling of biological cells having the chemical formula 1 where R is a polyetheramine.

O O O O

R NN R R NN R

O O O O

formula chimica 1 chemical formula 1

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile descritto dalla formula chimica 1 avente la formula chimica 2: In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker described by the chemical formula 1 having the chemical formula 2:

NH NH NH NH

O2O2

j O O2j O O2

OzOz

H2NNN NH H2NNN NH

O2i O O O2i O O

lx O lx O

yy

O O O O

formula chimica 2 chemical formula 2

Dove i+j+l+x+y+z=2-100 Where i + j + l + x + y + z = 2-100

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile descritto dalla formula chimica 1 avente la formula chimica 3: In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker described by the chemical formula 1 having the chemical formula 3:

formula chimica 3 chemical formula 3

Dove i+j+l+x+y+z=2-300 Where i + j + l + x + y + z = 2-300

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile descritto dalla formula chimica 1 avente la formula chimica 4: In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker described by the chemical formula 1 having the chemical formula 4:

formula chimica 4 chemical formula 4

Dove x+y=2-200 Where x + y = 2-200

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile descritto dalla formula chimica 1 avente la formula chimica 5: In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker described by the chemical formula 1 having the chemical formula 5:

Formula Chimica 5 Chemical Formula 5

Dove x+y=2-50 Where x + y = 2-50

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile descritto dalla formula chimica 1 avente la formula chimica 6: In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker described by the chemical formula 1 having the chemical formula 6:

formula chimica 6 chemical formula 6

Dove i+j+l+x+y+z=2-200 Where i + j + l + x + y + z = 2-200

In alcuni aspetti dell’invenzione il marcatore con formula chimica 1 è disperso in ambiente acquoso come per esempio PBS dove forma, vantaggiosamente, dei nano aggregati non fluorescenti. In alcuni aspetti la presente invenzione, la dispersione in ambiente acquoso del marcatore di formula chimica 1 viene incubata con cellule biologiche e, vantaggiosamente, le cellule biologiche diventano fortemente fluorescenti a causa dell’adsorbimento del marcatore medesimo. Vantaggiosamente In some aspects of the invention, the marker with chemical formula 1 is dispersed in an aqueous environment such as PBS where it advantageously forms non-fluorescent nano aggregates. In some aspects of the present invention, the dispersion in aqueous environment of the marker of chemical formula 1 is incubated with biological cells and, advantageously, the biological cells become strongly fluorescent due to the adsorption of the same marker. Advantageously

in alcuni aspetti della presente invenzione più del 90% del marcatore di formula chimica 1 viene adsorbito dalle cellule biologiche. in some aspects of the present invention more than 90% of the chemical formula 1 marker is adsorbed by biological cells.

In alcuni aspetti della presente invenzione la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 in ambiente acquoso ha una concentrazione tale che le cellule biologiche incubate con essa presentano una forte fluorescenza verde. In alcuni aspetti della presente invenzione la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 in ambiente acquoso ha una concentrazione tale che le cellule biologiche incubate con essa presentano una forte fluorescenza rossa. In alcuni aspetti della presente invenzione le cellule biologiche incubate con la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 in ambiente acquoso vengono irradiate con forte luce visibile ottenendo vantaggiosamente un cambiamento di colore della fluorescenza. Vantaggiosamente in alcuni aspetti dell’invenzione irradiando con intensa luce visibile le cellule che dopo incubazione con la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 mostrano fluorescenza rossa si ottiene il cambiamento di colore della fluorescenza di alcuni o tutti i compartimenti cellulari da rosso a giallo o da rosso a verde. Vantaggiosamente il tipo e l’entità di tale cambiamento di colore della fluorescenza è in alcuni casi diverso nei diversi compartimenti cellulari e nelle diverse cellule e può essere controllato cambiando il tipo, l’intensità ed il tempo di irradiamento. In alcuni aspetti dell’invenzione il tipo e l’entità di tale cambiamento di colore in determinate condizioni di irradiamento consentono di riconoscere specifici compartimenti cellulari. In alcuni aspetti dell’invenzione le cellule biologiche marcate con il marcatore di In some aspects of the present invention the dispersion of nanoaggregates of the marker of chemical formula 1 in aqueous environment has a concentration such that the biological cells incubated with it exhibit a strong green fluorescence. In some aspects of the present invention the dispersion of nanoaggregates of the marker of chemical formula 1 in aqueous environment has a concentration such that the biological cells incubated with it exhibit a strong red fluorescence. In some aspects of the present invention the biological cells incubated with the dispersion of nanoaggregates of the marker of chemical formula 1 in an aqueous environment are irradiated with strong visible light, advantageously obtaining a color change of the fluorescence. Advantageously in some aspects of the invention by irradiating with intense visible light the cells which after incubation with the dispersion of nanoaggregates of the chemical formula 1 marker show red fluorescence, the color change of the fluorescence of some or all cellular compartments from red to yellow is obtained. or red to green. Advantageously, the type and extent of this fluorescence color change is in some cases different in the different cell compartments and in the different cells and can be controlled by changing the type, intensity and time of irradiation. In some aspects of the invention, the type and extent of this color change under certain irradiation conditions make it possible to recognize specific cellular compartments. In some aspects of the invention, the biological cells marked with the marker of

formula chimica 1 sono cellule di lieviti. In alcuni aspetti dell’invenzione le cellule biologiche sono cellule di Saccharomyces cerevisiae. chemical formula 1 are yeast cells. In some aspects of the invention, the biological cells are Saccharomyces cerevisiae cells.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Figura 1. Spettro di massa della polieterammina J Figure 1. Mass spectrum of polyetheramine J

Figura 2. Spettro di massa di un esempio di marcatore fluorogenico e fotoregolabile indicato come P. Figure 2. Mass spectrum of an example of a fluorogenic and photoregulating marker referred to as P.

Figura 3. Spettri di assorbimento (coefficiente di assorbimento molare) di P in cloroformio (linea tratteggiata) e in PBS (linee continue) a diverse concentrazioni. Figure 3. Absorption spectra (molar absorption coefficient) of P in chloroform (dashed line) and in PBS (solid lines) at different concentrations.

Figura 4. Spettri corretti di fluorescenza (�ecc= 488 nm) di P in cloroformio (linea tratteggiata, l’intensità è stata divisa per 10) e in PBS (linee continue)a diverse concentrazioni. Figure 4. Corrected fluorescence spectra (�ecc = 488 nm) of P in chloroform (dashed line, the intensity was divided by 10) and in PBS (solid lines) at different concentrations.

Figura 5. Distribuzione dimensionale dei nanoaggregati di P in PBS ottenuta mediante Dynamic Light Scattering (DLS). Figure 5. Size distribution of P nanoaggregates in PBS obtained by Dynamic Light Scattering (DLS).

Figura 6. Immagine dei nanoaggregati di P in PBS ottenuta al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Figure 6. Image of P nanoaggregates in PBS obtained by transmission electron microscope (TEM).

Figura 7. Tempi di vita dello stato eccitato emittente (quadrati bianchi) e resa quantica di fluorescenza (cerchi neri) in funzione della concentrazione per P in PBS. Figure 7. Life times of the emitting excited state (white squares) and quantum yield of fluorescence (black circles) as a function of the concentration for P in PBS.

Figura 8. Percentuale di P adsorbito da cellule di Saccharomyces Cerevisiae (1 mg/ml) in PBS dopo incubazione in funzione della concentrazione di P. Figure 8. Percentage of P adsorbed by Saccharomyces Cerevisiae cells (1 mg / ml) in PBS after incubation as a function of P.

Figura 9. Immagine (scomposta nelle tre componenti di colore R, G, B) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-6>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10X. Figure 9. Image (broken down into the three color components R, G, B) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at a concentration of 1x10 <-6> M obtained under a fluorescence microscope at 10X magnification .

Figura 10. Immagine (scomposta nelle tre componenti di colore R, G, B) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-6>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100X. Figure 10. Image (decomposed into the three color components R, G, B) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at 1x10 <-6> M concentration obtained under a fluorescence microscope at 100X magnification .

Figura 11. Immagine (scomposta nelle tre componenti di colore R, G, B) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-5>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10X. Figure 11. Image (decomposed into the three color components R, G, B) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at 1x10 <-5> M concentration obtained under a fluorescence microscope at 10X magnification .

Figura 12. Immagine (scomposta nelle tre componenti di colore R, G, B) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-5>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100X. Figure 12. Image (broken down into the three color components R, G, B) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at 1x10 <-5> M concentration obtained under a fluorescence microscope at 100X magnification .

Figura 13. Spettri normalizzati di fluorescenza (�ecc=488 nm) delle sospensioni di Saccharomyces cerevisiae in PBS (1 mg/ml) dopo Figure 13. Normalized fluorescence spectra (�ecc = 488 nm) of suspensions of Saccharomyces cerevisiae in PBS (1 mg / ml) after

incubazione con P a concentrazione 1x10<-6>M (linea continua) e 1x10<-5>M (linea tratteggiata). incubation with P at concentrations 1x10 <-6> M (solid line) and 1x10 <-5> M (dashed line).

Figura 14. Immagini (componente R) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-5>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100X registrate a tempi diversi durante l’irradiamento con un intensa sorgente blue. Figure 14. Images (R component) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at 1x10 <-5> M concentration obtained under a fluorescence microscope with 100X magnification recorded at different times during irradiation with an intense blue spring.

Figura 15. Immagini (componente G) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-5>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100X registrate a tempi diversi durante l’irradiamento con un intensa sorgente blu. Figure 15. Images (component G) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at 1x10 <-5> M concentration obtained under a fluorescence microscope with 100X magnification recorded at different times during irradiation with an intense blue spring.

Figura 16. Immagini (componente B) delle cellule di Saccharomyces cerevisiae (1 mg/ml) dopo incubazione con P in PBS a concentrazione 1x10<-5>M ottenuta al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100X registrate a tempi diversi durante l’irradiamento con un intensa sorgente blu. Figure 16. Images (component B) of Saccharomyces cerevisiae cells (1 mg / ml) after incubation with P in PBS at 1x10 <-5> M concentration obtained under a fluorescence microscope with 100X magnification recorded at different times during irradiation with an intense blue spring.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Nella parte seguente viene riportata una descrizione dettagliata della presente invenzione anche facendo riferimento ai disegni allegati. In the following part a detailed description of the present invention is reported also with reference to the attached drawings.

Si precisa che qui come nel resto della descrizione della presente invenzione le forme singolari “un”, “uno”, “una”, “il”, “lo”, “la” vanno intese come sottintendere anche le corrispondenti forme plurali a meno che non venga espressamente indicato il contrario. It should be noted that here, as in the rest of the description of the present invention, the singular forms "a", "one", "one", "the", "lo", "the" are to be understood as implying also the corresponding plural forms unless the contrary is not expressly indicated.

Si precisa, inoltre, che, a meno di indicazioni specifiche, tutti i termini (inclusi i termini tecnici e scientifici) usati nella descrizione della presente invenzione hanno il significato riconosciuto comunemente da una persona che abbia una competenza ordinaria nel contesto in cui la presente invenzione di colloca. It is also specified that, unless specifically indicated, all the terms (including technical and scientific terms) used in the description of the present invention have the meaning commonly recognized by a person who has ordinary competence in the context in which the present invention of places.

Si precisa inoltre che i termini che trovano definizione nei comuni dizionari vanno intesi avere il significato ad essi riconosciuto nel contesto in cui la presente invenzione si colloca. It is also specified that the terms that are defined in common dictionaries must be understood to have the meaning recognized to them in the context in which the present invention is placed.

Per polieterammina si intende un polimero lineare o ramificato contenente due o più gruppi etere e una o più ammine primarie terminali. By polyetheramine is meant a linear or branched polymer containing two or more ether groups and one or more terminal primary amines.

Per ambiente acquoso si intende qualunque soluzione, miscela, dispersione o sospensione composta da acqua per almeno il 50% del suo peso. By aqueous environment we mean any solution, mixture, dispersion or suspension composed of water for at least 50% of its weight.

Per PBS si intende una soluzione salina di tampone fosfato a pH fisiologico. PBS refers to a saline solution of phosphate buffer at physiological pH.

In alcuni aspetti la presente invenzione riguarda un marcatore fluorogenico e fotoregolabile basato su PDI per la marcatura fluorescente In some aspects the present invention relates to a fluorogenic and photoregulating marker based on PDI for fluorescent labeling.

di cellule biologiche avente la formula chimica 1 dove R è una polieterammina. of biological cells having the chemical formula 1 where R is a polyetheramine.

O O O O

R NN R R NN R

O O O O

formula chimica 1 chemical formula 1

NH2NH NH2NH

O2O2

j O O Ozj O O Oz

H2NNN NH H2NNN NH

O O x O2i O O O x O2i O

l yl y

O O O O

formula chimica 2 chemical formula 2

Dove i+j+l+x+y+z=2-100 Where i + j + l + x + y + z = 2-100

formula chimica 3 chemical formula 3

Dove i+j+l+x+y+z=2-300 Where i + j + l + x + y + z = 2-300

formula chimica 4 chemical formula 4

Dove x+y=2-200 Where x + y = 2-200

Formula Chimica 5 Chemical Formula 5

Dove x+y=2-50 Where x + y = 2-50

formula chimica 6 chemical formula 6

Dove i+j+l+x+y+z=2-200 Where i + j + l + x + y + z = 2-200

In alcuni aspetti dell’invenzione il marcatore con formula chimica 1 è disperso in ambiente acquoso come per esempio PBS dove forma, vantaggiosamente, dei nanoaggregati non fluorescenti. In alcuni aspetti la presente invenzione la dispersione in ambiente acquoso del marcatore di formula chimica 1 viene incubata con cellule biologiche e, vantaggiosamente, le cellule biologiche diventano fortemente fluorescenti a causa dell’adsorbimento del marcatore medesimo. Vantaggiosamente in alcuni aspetti della presente invenzione più del 90% del marcatore di formula chimica 1 viene adsorbito dalle cellule biologiche. In some aspects of the invention, the marker with chemical formula 1 is dispersed in an aqueous environment such as PBS where it advantageously forms non-fluorescent nanoaggregates. In some aspects the present invention the dispersion in aqueous environment of the marker of chemical formula 1 is incubated with biological cells and, advantageously, the biological cells become strongly fluorescent due to the adsorption of the same marker. Advantageously, in some aspects of the present invention more than 90% of the chemical formula 1 marker is adsorbed by biological cells.

In alcuni aspetti della presente invenzione la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 in ambiente acquoso ha una In some aspects of the present invention the dispersion of nanoaggregates of the marker of chemical formula 1 in aqueous environment has a

concentrazione tale che le cellule biologiche incubate con essa presentano una forte fluorescenza verde. In alcuni aspetti della presente invenzione la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 in ambiente acquoso ha una concentrazione tale che le cellule biologiche incubate con essa presentano una forte fluorescenza rossa. In alcuni aspetti della presente invenzione le cellule biologiche incubate con la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 in ambiente acquoso vengono irradiate con forte luce visibile ottenendo vantaggiosamente un cambiamento di colore della fluorescenza. Vantaggiosamente in alcuni aspetti dell’invenzione irradiando con intensa luce visibile le cellule che dopo incubazione con la dispersione di nanoaggregati del marcatore di formula chimica 1 mostrano fluorescenza rossa si ottiene il cambiamento di colore della fluorescenza di alcuni o tutti i compartimenti cellulari da rosso a giallo o da rosso a verde. Vantaggiosamente il tipo e l’entità di tale cambiamento di colore della fluorescenza è in alcuni casi diverso nei diversi compartimenti cellulari e nelle diverse cellule e può essere controllato cambiando il tipo, l’intensità ed il tempo di irradiamento. In alcuni aspetti dell’invenzione il tipo e l’entità di tale cambiamento di colore in determinate condizioni di irradiamento consentono di riconoscere specifici compartimenti cellulari. In alcuni aspetti dell’invenzione le cellule biologiche marcate con il marcatore di formula chimica 1 sono cellule di lieviti. In alcuni aspetti dell’invenzione le cellule biologiche sono cellule di Saccharomyces cerevisiae. concentration such that the biological cells incubated with it exhibit a strong green fluorescence. In some aspects of the present invention the dispersion of nanoaggregates of the marker of chemical formula 1 in aqueous environment has a concentration such that the biological cells incubated with it exhibit a strong red fluorescence. In some aspects of the present invention the biological cells incubated with the dispersion of nanoaggregates of the marker of chemical formula 1 in an aqueous environment are irradiated with strong visible light, advantageously obtaining a color change of the fluorescence. Advantageously in some aspects of the invention by irradiating with intense visible light the cells which after incubation with the dispersion of nanoaggregates of the chemical formula 1 marker show red fluorescence, the color change of the fluorescence of some or all cellular compartments from red to yellow is obtained. or red to green. Advantageously, the type and extent of this fluorescence color change is in some cases different in the different cell compartments and in the different cells and can be controlled by changing the type, intensity and time of irradiation. In some aspects of the invention, the type and extent of this color change under certain irradiation conditions make it possible to recognize specific cellular compartments. In some aspects of the invention, the biological cells marked with the chemical formula 1 marker are yeast cells. In some aspects of the invention, the biological cells are Saccharomyces cerevisiae cells.

In generale le PDI presentano una intensa fluorescenza verde quando vengono solubilizzate in forma di molecole individuali. Tuttavia a causa di In general, PDIs exhibit intense green fluorescence when solubilized in the form of individual molecules. However due to

forti interazioni �-�� molte PDI aggregano in solventi polari e sono insolubili e in molti casi non disperdibili in ambiente acquoso. La presenza di gruppi ingombranti come sostituenti degli azoti immidici limita o impedisce l’aggregazione. La presenza di gruppi polari terminali (per esempio ammine o ossidrili) in tali sostituenti ingombranti aumenta la solubilità delle PDI in ambiente acquoso. In un aspetto della presente invenzione le PDI sostituite con polieterammine con formula Chimica 1 sono vantaggiosamente ingombrate e presentano ammine primarie come gruppi terminali. L’ingombro dei sostituenti e la protonazione in condizioni fisiologiche delle ammine conferiscono alle polieterammine con formula chimica 1 una parziale solubilità in ambiente acquoso ma allo stesso tempo non impediscono completamente l’aggregazione consentendo la formazione di nanoaggregati non fluorescenti come risultato delle interazioni �-��. In alcuni aspetti della presente invenzione, utilizzando un dosaggio opportuno di polieterammina di formula chimica 1 tali nanoaggregati, costituiti da molecole moderatamente lipofile, vengono adsorbiti da cellule biologiche in forma di molecole individuali che danno la tipica fluorescenza verde. In alcuni aspetti dell’invenzione utilizzando un dosaggio opportuno di polieterammina di formula chimica 1 tali nanoaggregati costituiti da molecole moderatamente lipofile, vengono adsorbiti da cellule biologiche in forma di aggregati più piccoli che danno la tipica fluorescenza rossa. Secondo un aspetto della presente invenzione la colorazione delle cellule biologiche che presentano una tale fluorescenza rossa viene modificata, almeno in alcuni compartimenti cellulari quando le cellule vengono irradiate con una intensa radiazione strong interactions �-�� many PDIs aggregate in polar solvents and are insoluble and in many cases not dispersible in an aqueous environment. The presence of bulky groups as substituents of the imide nitrogens limits or prevents aggregation. The presence of terminal polar groups (for example amines or hydroxyls) in such bulky substituents increases the solubility of the PDIs in an aqueous environment. In one aspect of the present invention, the PDIs substituted with polyetheramines with chemical formula 1 are advantageously cluttered and have primary amines as terminal groups. The bulk of the substituents and the protonation of the amines under physiological conditions give the polyetheramines with chemical formula 1 a partial solubility in aqueous environment but at the same time do not completely prevent the aggregation allowing the formation of non-fluorescent nanoaggregates as a result of the �-� interactions �. In some aspects of the present invention, using a suitable dosage of polyetheramine of chemical formula 1 these nanoaggregates, consisting of moderately lipophilic molecules, are adsorbed by biological cells in the form of individual molecules which give the typical green fluorescence. In some aspects of the invention, using an appropriate dosage of polyetheramine of chemical formula 1, these nanoaggregates consisting of moderately lipophilic molecules are adsorbed by biological cells in the form of smaller aggregates that give the typical red fluorescence. According to an aspect of the present invention, the staining of biological cells exhibiting such a red fluorescence is modified, at least in some cellular compartments when the cells are irradiated with intense radiation

visibile. Secondo un aspetto dell’invenzione la variazione di colore permette di distinguere e riconoscere alcuni compartimenti cellulari. Il meccanismo che provoca il cambiamento di colore è la parziale fotodegradazione dei piccoli aggregati fluorescenti del marcatore di formula chimica 1 all’interno dei compartimenti cellulari, aggregati che sono meno fotostabili delle molecole isolate dello stesso composto. Tale parziale fotodegradazione provoca la disgregazione e la comparsa della tipica emissione verde delle molecole individuali di PDI. Fluorescenze di altri colori come l’arancione e il giallo si osservano come combinazioni delle fluorescenze degli aggregati e delle molecole individuali. La velocità di cambiamento del colore della fluorescenza nei diversi compartimenti cellulari è diversa perché risente della natura e dalle proprietà dell’ambiente in cui si trova il marcatore. Uno dei parametri che rende più veloce il cambiamento di colere è la presenza nell’ambiente cellulare di sostanze fortemente ossidanti o riducenti risultanti da processi metabolici o regolatori della cellula medesima in quanto queste sostanze intervengono nella fotodegradazione. visible. According to one aspect of the invention, the color variation makes it possible to distinguish and recognize some cellular compartments. The mechanism that causes the color change is the partial photodegradation of the small fluorescent aggregates of the chemical formula 1 marker within the cellular compartments, aggregates that are less photostable than the isolated molecules of the same compound. This partial photodegradation causes the disintegration and the appearance of the typical green emission of the individual PDI molecules. Fluorescences of other colors such as orange and yellow are observed as combinations of the fluorescences of the aggregates and individual molecules. The rate of change of the color of the fluorescence in the different cellular compartments is different because it is affected by the nature and properties of the environment in which the marker is located. One of the parameters that makes the change in cholera faster is the presence in the cellular environment of strongly oxidizing or reducing substances resulting from metabolic or regulatory processes of the cell itself as these substances intervene in photodegradation.

ESEMPI EXAMPLES

Il composto P con formula chimica 2 Compound P with chemical formula 2

NH2NH NH2NH

O j O O2O j O O2

OzOz

H2NNN NH H2NNN NH

O i O O O2 lxyO i O O O2 lxy

O O O O

formula chimica 2 chemical formula 2

Dove, nel caso di P, i+j+l+x+y+z=9-10 è stato sintetizzato partendo dalla 3,4,9,10-perilene dianidride tetracarbossilica (PDATC) e dalla polieterammina Jeffammina T-403 (Huntsmann) indicata con J (vedi formula chimica J). Where, in the case of P, i + j + l + x + y + z = 9-10 was synthesized starting from 3,4,9,10-perylene tetracarboxylic dianhydride (PDATC) and from polyetheramine Jeffamine T-403 (Huntsmann ) indicated with J (see chemical formula J).

Formula chimica J Chemical formula J.

Tutti i reagenti ed i solventi, ad eccezione di J, sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich ed usati senza ulteriore purificazione. La purezza e la distribuzione di massa della Jeffammina J sono state investigate mediante HPLC-massa (Agilent Technologies-Bruker LC-MSD Ion-Trap 1100 series ESI and APCI sources, m/z 50-4000 mass range) e<1>H NMR (Varian Mercury Plus 400 MHz). Il campione di J utilizzato è risultato avere una purezza superiore al 95%. All reagents and solvents, except J, were purchased from Sigma-Aldrich and used without further purification. The purity and mass distribution of Jeffamine J were investigated by HPLC-mass (Agilent Technologies-Bruker LC-MSD Ion-Trap 1100 series ESI and APCI sources, m / z 50-4000 mass range) and <1> H NMR (Varian Mercury Plus 400 MHz). The sample of J used was found to have a purity greater than 95%.

<1>H NMR (CD3OD, 400 MHz): � (ppm) 8.71-8.61 (m, 8H, arom CH); 4.40-4.33 (m, 2H, NCHCH3); 3.65-2.95 (m, 46H, CH2CH(CH3)O+OCH2+CH(CH3)NH2); 1.59 (d, 6H, NCH(CH3), J=6.7 Hz); 1.40 (s, 4H, CH3CH2); 1.2-0.85 (m, 36H,C(CH3)HO+C(CH3)HNH2+CH2CH3). <1> H NMR (CD3OD, 400 MHz): � (ppm) 8.71-8.61 (m, 8H, arom CH); 4.40-4.33 (m, 2H, NCHCH3); 3.65-2.95 (m, 46H, CH2CH (CH3) O + OCH2 + CH (CH3) NH2); 1.59 (d, 6H, NCH (CH3), J = 6.7 Hz); 1.40 (s, 4H, CH3CH2); 1.2-0.85 (m, 36H, C (CH3) HO + C (CH3) HNH2 + CH2CH3).

Lo spettro ESI massa di J (figura 1) è costituito da tre gruppi di picchi corrispondenti alle tre diverse forme protonate di J ovvero JH<+>, JH<2+>The ESI mass spectrum of J (figure 1) consists of three groups of peaks corresponding to the three different protonated forms of J, namely JH <+>, JH <2+>

2e JH<3+>2e JH <3+>

3. La distribuzione delle masse, ovvero la frazione di ciascun isomero costituzionale con uno stesso n=a+b+c, è stata ricavata dai segnali corrispondenti a ciascun isomero. Il valore medio della massa è 460 g/mol (prossimo alla massa molare media di 440 g/mol dichiarata dal produttore Huntsmann). L’indice di polidispersione è 1.02. In particolare gli isomeri n=5 e n=6 costituiscono circa il 60% del totale e sono presenti in quantità simile. Gli isomeri n=4 e n=7 circa il 30 % e quelli n=3 e n=8 circa il 5%. Gli isomeri con n<3 e n>8 sono presenti solo in tracce. 3. The distribution of the masses, that is the fraction of each constitutional isomer with the same n = a + b + c, was obtained from the signals corresponding to each isomer. The average mass value is 460 g / mol (close to the average molar mass of 440 g / mol declared by the manufacturer Huntsmann). The polydispersion index is 1.02. In particular, the isomers n = 5 and n = 6 constitute about 60% of the total and are present in similar quantities. The isomers n = 4 and n = 7 about 30% and those n = 3 and n = 8 about 5%. Isomers with n <3 and n> 8 are present only in traces.

Sintesi di P Summary of P.

Per evitare la formazione di polimeri contenenti più di un gruppo PDI un forte eccesso di J è stato utilizzato per la reazione. 100 mg di PDATC (massa molare 392.32 g/mol, 0.25 mmol) sono stati pesati in una beuta da 250 ml insieme a 2500 mg di J (massa molare media 460 g/mol, circa 5.4 mmol) e 15 ml di glicole etilenico. La miscela è stata sonicata per 1 minuto in un sonicatore Bandelin SONOREX Digital 10P per frantumare finemente la PDATC che rimane indisciolta mentre J si scioglie perfettamente nel glicole etilenico. La beuta è stata poi introdotta in un forno a microonde commerciale Panasonic NN-F369W e irradiata alla potenza di 900 W per cinque minuti interrompendo il riscaldamento ogni minuto ed agitando manualmente la miscela. Dopo l’irradiamento con le microonde, la PDATC si è sciolta perfettamente e la miscela è diventa limpida ed intensamente colorata in rosso-viola. Per valutare la quantità di To avoid the formation of polymers containing more than one PDI group a large excess of J was used for the reaction. 100 mg of PDATC (molar mass 392.32 g / mol, 0.25 mmol) was weighed in a 250 ml flask together with 2500 mg of J (mean molar mass 460 g / mol, approximately 5.4 mmol) and 15 ml of ethylene glycol. The mixture was sonicated for 1 minute in a Bandelin SONOREX Digital 10P sonicator to finely crush the undissolved PDATC while J dissolves perfectly in the ethylene glycol. The flask was then placed in a Panasonic NN-F369W commercial microwave oven and irradiated at 900 W power for five minutes, stopping the heating every minute and stirring the mixture manually. After irradiation with microwaves, the PDATC has dissolved perfectly and the mixture becomes clear and intensely colored in red-violet. To evaluate the amount of

prodotto ottenuto 0.010 ml di miscela di reazione sono stati diluiti in 10 ml di etanolo e si è registrato lo spettro di assorbimento. Lo spettro ha mostrato la tipica banda strutturata di assorbimento della PDI con massimo a 526 nm cui è corrisposto un valore di assorbanza di 1.33. Essendo il coefficiente di assorbimento molare della PDI tipicamente 8x10<4>M cm<-1>a questa lunghezza d’onda si è calcolata la concentrazione della miscela di reazione (c=0.017 M) che corrisponde a quella attesa nel caso di completa conversione della PDATC in PDI. Per isolare il prodotto 150 ml di acqua deionizzata sono stati aggiunti alla miscela di reazione e la soluzione finale è stata riscaldata a 80 °C per 20 minuti con piastra riscaldante sotto agitazione. Il prodotto di reazione in queste condizioni precipita in forma di solido viola scuro appiccicoso sulle pareti della beuta e sull’ancoretta magnetica utilizzata per l’agitazione. Il liquido rimanente, contenente l’eccesso di J non reagita viene eliminato e il solido appiccicoso lavato con acqua calda (80° C) ed asciugato in stufa per 1 ora a 80 °C. Il solido viola è perfettamente solubile in cloroformio e altri solventi organici ed è stato caratterizzato mediante<1>H NMR e HPLC massa mostrando una purezza superiore al 95%. La resa della reazione è stata calcolata pesando il prodotto ottenuto e corrisponde a circa 95 %. obtained product 0.010 ml of reaction mixture were diluted in 10 ml of ethanol and the absorption spectrum was recorded. The spectrum showed the typical structured absorption band of the PDI with a maximum at 526 nm which corresponded to an absorbance value of 1.33. Since the molar absorption coefficient of the PDI is typically 8x10 <4> M cm <-1> at this wavelength the concentration of the reaction mixture has been calculated (c = 0.017 M) which corresponds to that expected in the case of complete conversion of the PDATC in POI. To isolate the product 150 ml of deionized water was added to the reaction mixture and the final solution was heated to 80 ° C for 20 minutes with a hot plate under stirring. The reaction product under these conditions precipitates in the form of a sticky dark purple solid on the walls of the flask and on the magnetic stir bar used for stirring. The remaining liquid, containing the excess of unreacted J is eliminated and the sticky solid washed with hot water (80 ° C) and dried in an oven for 1 hour at 80 ° C. The purple solid is perfectly soluble in chloroform and other organic solvents and has been characterized by <1> H NMR and mass HPLC showing a purity greater than 95%. The reaction yield was calculated by weighing the product obtained and corresponds to about 95%.

<1>H NMR (CD3OD, 400 MHz): � (ppm) 3.60 (m, 3H, CH2CH(CH3)O; 3.10-3.50 (m, 18H, OCH2); 3.06-2.92 (m, 3H, CH(CH3)NH2); 1.40 (s, 2H, CH3CH2); 1.11 (d, 9H,CH(CH3)O, J=6.2 Hz); 1.02 (d, 9H, CH(CH3)N J=6.5 Hz); 0.81-0.89 (m, 3H, CH2CH3). <1> H NMR (CD3OD, 400 MHz): � (ppm) 3.60 (m, 3H, CH2CH (CH3) O; 3.10-3.50 (m, 18H, OCH2); 3.06-2.92 (m, 3H, CH (CH3 ) NH2); 1.40 (s, 2H, CH3CH2); 1.11 (d, 9H, CH (CH3) O, J = 6.2 Hz); 1.02 (d, 9H, CH (CH3) N J = 6.5 Hz); 0.81-0.89 (m, 3H, CH2CH3).

Lo spettro ESI massa di P (figura 2) è costituito da quattro gruppi di picchi corrispondenti alle quattro diverse forme protonate di P ovvero PH+, PH<2+>The ESI mass spectrum of P (figure 2) is made up of four groups of peaks corresponding to the four different protonated forms of P i.e. PH +, PH <2+>

2, PH<3+>2, PH <3+>

3e PH<4+>3e PH <4+>

4. La distribuzione delle masse può essere ricavata sommando i segnali corrispondenti a ciascun isomero indicato con n=i+j+l+x+y+z secondo la formula chimica 2. Il valore medio della massa è circa 1170 g/mol e l’indice id polidispersione 1.01. In particolare gli isomeri n=9, n=10 e n=11 costituiscono circa il 75% del totale. Gli isomeri n=8 e n=12 circa il 20 % e quelli n=7 e n=13 circa il 5%. Gli n<7 e n>13 sono presenti solo in tracce. La massa non mostra tracce di dimeri o trimeri contenenti due o tre unità PDI legate covalentemente dimostrando che l’utilizzo di un eccesso di J consente di evitare la formazione di queste specie. 4. The distribution of the masses can be obtained by adding the signals corresponding to each isomer indicated with n = i + j + l + x + y + z according to the chemical formula 2. The average value of the mass is about 1170 g / mol and l 'polydispersion index 1.01. In particular, the isomers n = 9, n = 10 and n = 11 make up about 75% of the total. The isomers n = 8 and n = 12 about 20% and those n = 7 and n = 13 about 5%. The n <7 and n> 13 are present only in traces. The mass does not show traces of dimers or trimers containing two or three PDI units covalently linked, demonstrating that the use of an excess of J allows to avoid the formation of these species.

Caratterizzazione fotofisica di P. Photophysical characterization of P.

Gli spettri di assorbimento UV-Vis sono stati registrati con uno spettrofotometro Perkin Elmer P40. The UV-Vis absorption spectra were recorded with a Perkin Elmer P40 spectrophotometer.

Gli spettri di fluorescenza sono stati acquisiti con uno spettrofotometro Edinburgh FLS920 dotato di un fotomoltiplicatore Hamamatsu R928P. Lo stesso strumento connesso ad una scheda PCS900 è stato utilizzato per misurare i tempi di vita mediante la tecnica Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC). Le rese quantiche di fluorescenza (errore, ± 10%) sono state misurate usando N,N′-Bis(2,5-di-ter-butilfenil)-3,4,9,10-perilendicarbossiimmide (Aldrich) in soluzione di CHCl3comeriferimento (Φ = 0.99). Gli spettri di fluorescenza sono stati corretti per gli effetti di Fluorescence spectra were acquired with an Edinburgh FLS920 spectrophotometer equipped with a Hamamatsu R928P photomultiplier. The same instrument connected to a PCS900 board was used to measure life times using the Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) technique. Quantum fluorescence yields (error, ± 10%) were measured using N, N′-Bis (2,5-di-tert-butylphenyl) -3,4,9,10-perylenedicarboxyimide (Aldrich) in CHCl3 solution. (Φ = 0.99). The fluorescence spectra were corrected for the effects of

filtro interno secondo metodi convenzionali (Handbook of Photochemistry, 3rd ed., Eds. M. Montalti, A. Credi, L. Prodi, M. T. Gandolfi. CRC Taylor & Francis, Boca Raton, 2006). internal filter according to conventional methods (Handbook of Photochemistry, 3rd ed., Eds. M. Montalti, A. Credi, L. Prodi, M. T. Gandolfi. CRC Taylor & Francis, Boca Raton, 2006).

Gli spettri di assorbimento e fluorescenza del prodotto purificato sono stati registrati in soluzione di cloroformio. Lo spettro del coefficiente di assorbimento molare ε di P in cloroformio è mostrato in figura 3 e presenta la tipica banda di assorbimento strutturata del cromoforo PDI con massimo a 526 nm cui corrisponde un valore di ε = 8x10<4>M cm<-1>. Analogamente lo spettro di fluorescenza di P in cloroformio eccitato a 488 nm è mostrato in figura 4 e presenta la tipica banda di emissione strutturata del PDI con massimo a 536 nm e resa quantica di fluorescenza Φ=0.9. Il decadimento dello stato eccitato emittente è monoesponenziale e ha un tempo di vita ��= 3.7 ns. The absorption and fluorescence spectra of the purified product were recorded in chloroform solution. The spectrum of the molar absorption coefficient ε of P in chloroform is shown in figure 3 and presents the typical structured absorption band of the chromophore PDI with a maximum at 526 nm which corresponds to a value of ε = 8x10 <4> M cm <-1> . Similarly, the fluorescence spectrum of P in chloroform excited at 488 nm is shown in figure 4 and presents the typical structured emission band of the PDI with maximum at 536 nm and fluorescence quantum yield Φ = 0.9. The decay of the emitting excited state is monoexponential and has a life time �� = 3.7 ns.

Dimostrazione che P si disperde in PBS in forma di nanoaggregati non fluorescenti. Demonstration that P disperses in PBS in the form of non-fluorescent nanoaggregates.

Per studiare l’aggregazione di P in in ambiente acquoso a pH fisiologico abbiamo preparato una serie di dispersioni di P in PBS con una concentrazione di P che varia da 1x10<-6>M a 1.2x10<-4>M. Abbiamo osservato che il coefficiente di assorbimento molare di queste soluzioni cambia con la concentrazione come mostrato in figura 3, inoltre lo spettro in PBS risulta ad ogni concetrazione, meno intenso e più allargato di quello misurato in cloroformio. Questo fenomeno si verifica quando i cromofori aggregano in soluzione essendo la distorsione dello spettro To study the aggregation of P in an aqueous environment at physiological pH we have prepared a series of dispersions of P in PBS with a concentration of P ranging from 1x10 <-6> M to 1.2x10 <-4> M. We have observed that the molar absorption coefficient of these solutions changes with the concentration as shown in figure 3, moreover the spectrum in PBS is less intense and broader than that measured in chloroform at each concentration. This phenomenon occurs when the chromophores aggregate in solution being the distortion of the spectrum

dovuta all’interazione fra i sistemi � delle molecole aggregate mediante stacking. La presenza di nanoaggregati con diametro medio d=109 nm e pdi=0.19 è confermato da misure di dynamic light scattering DLS (Malver Z Nanosizer), come mostrato in figura 5, e da misure di transmission electron microscopy (TEM), come mostrato in figura 6. due to the interaction between the systems � of the molecules aggregated by stacking. The presence of nanoaggregates with mean diameter d = 109 nm and pdi = 0.19 is confirmed by dynamic light scattering DLS (Malver Z Nanosizer) measurements, as shown in figure 5, and by transmission electron microscopy (TEM) measurements, as shown in figure 6.

Gli spettri di fluorescenza corretti per gli effetti di filtro interno e di riassorbimento delle dispersioni di P in PBS con concentrazioni da 1x10<-6>M a 1.2x10<-4>M sono mostrati in figura 4. Gli spettri di fluorescenza in PBS mostrano, come in cloroformio, la tipica banda strutturata del PDI non aggregato, la forma di questa banda in PBS non dipende dalla concetrazione, il massimo della banda è però shiftato a 545 nm nelle dispersioni acquose a causa della maggiore polarità del solvente. Inoltre come mostrato in figura 4 in PBS l’emissione è notevolemente più debole che in cloroformio e come mostrato in figura 7 la resa quantica di fluorescenza Φ decresce al crescere della concentrazione di P. Anche lo spettro di eccitazione di P in PBS registrato a 590 nm (non riportato) ha una forma che non dipende dalla concentrazione di P e mostra la tipica struttura vibrazionale delle PDI non aggregate. Parallelamente il decadiemento dello stato eccitato emittente di P in PBS è monoesponenziale e, come mostrato in figura 7, è indipendente dalla concentrazione, inoltre tale tempo di vita è circa 4.2 ns, un valore simile a quello registrato in cloroformio. Queste osservazioni dimostrano in modo inequivocabile che la debole emissione residua delle dispersioni di P in PBS è dovuta ad una piccola frazione di molecole di P non aggregate Fluorescence spectra corrected for internal filtering and reabsorption effects of P dispersions in PBS with concentrations from 1x10 <-6> M to 1.2x10 <-4> M are shown in Figure 4. Fluorescence spectra in PBS show , as in chloroform, the typical structured band of the non-aggregated PDI, the shape of this band in PBS does not depend on the concentration, the maximum of the band is however shifted to 545 nm in the aqueous dispersions due to the greater polarity of the solvent. Moreover, as shown in figure 4 in PBS the emission is considerably weaker than in chloroform and as shown in figure 7 the quantum yield of fluorescence Φ decreases as the concentration of P increases. Also the excitation spectrum of P in PBS recorded at 590 nm (not reported) has a shape that does not depend on the P concentration and shows the typical vibrational structure of non-aggregated PDIs. At the same time, the decay of the emitting excited state of P in PBS is monoexponential and, as shown in figure 7, is independent of the concentration, furthermore this life time is about 4.2 ns, a value similar to that recorded in chloroform. These observations unequivocally demonstrate that the weak residual emission of the P dispersions in PBS is due to a small fraction of non-aggregated P molecules.

mentre i nanoaggregati di P dispersi in PBS sono sostanzialmente non fluorescenti ovvero hanno una resa quantica di fluorescenza inferiore allo 0.1%. while the nanoaggregates of P dispersed in PBS are substantially non-fluorescent or have a quantum yield of fluorescence lower than 0.1%.

Dimostrazione che P in forma di nanoaggregati viene efficacemente adsorbito da cellule biologiche in ambiente acquoso. Demonstration that P in the form of nanoaggregates is effectively adsorbed by biological cells in an aqueous environment.

Una sospensione in PBS di cellule di lievito Saccharomyces Cerevisiae, è stata preparata agitando mediante vortex 100 mg di lievito in 10 ml di PBS. 0.25 ml di tale sospensione sono stati aggiunti a 2.25 ml di ciascuna dispersione di P in PBS con concentrazione di P compresa fra 1x10<-6>M e 1.2x10<-4>M. Le sospensioni risultanti risultanti contententi P e 1 mg/ml di lievito sono state agitate mediante vortex per 1 minuto ciascuna all’interno di provette Eppendorf e lasciate ad incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Le sospensioni risultanti sono state centrifugate per 5 minuti a 1000 rpm. Il surnatante è stato quindi trasferito in cuvette da fotometria e lo spettro di assorbimento è stato registrato e confrontato con quello della medesima disperione registrato prima che venisse aggiunto il lievito. La diminuzione relativa dell’assorbanza a 498 nm dovuta all’adsorbimento di P da parte del lievito è stata utilizzata per calcolare la percentuale di P adsorbita alle diverse concentrazioni di P dando i risultati mostrati in figura 8. Convenientemente per concentrazioni di P comprese fra 1x10<-6>e 1x10<-5>M oltre il 90 % di P viene adsorbito dalle cellule. A suspension in PBS of Saccharomyces Cerevisiae yeast cells was prepared by vortexing 100 mg of yeast in 10 ml of PBS. 0.25 ml of this suspension was added to 2.25 ml of each dispersion of P in PBS with a concentration of P between 1x10 <-6> M and 1.2x10 <-4> M. The resulting suspensions containing P and 1 mg / ml of yeast were shaken by vortexing for 1 minute each inside Eppendorf tubes and left to incubate at room temperature for 30 minutes. The resulting suspensions were centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. The supernatant was then transferred to photometry cuvettes and the absorption spectrum was recorded and compared with that of the same dispersion recorded before the yeast was added. The relative decrease in absorbance at 498 nm due to the adsorption of P by the yeast was used to calculate the percentage of P adsorbed at the different concentrations of P giving the results shown in figure 8. Conveniently for P concentrations between 1x10 <-6> and 1x10 <-5> M over 90% of P is adsorbed by the cells.

Dimostrazione che P diventa intensamente fluorescente una volta adsorbito dalle cellule biologiche e che P impartisce una Proof that P becomes intensely fluorescent once adsorbed by biological cells and that P imparts a

fluorescenza alle cellule biologiche o ai diversi compartimenti cellulari il cui colore dipenda dal dosaggio di P utilizzato. fluorescence to biological cells or to different cell compartments whose color depends on the P dosage used.

Una sospensione in PBS di cellule di lievito Saccharomyces Cerevisiae, è stata preparata agitando mediante vortex 100 mg di lievito in 10 ml di PBS. 0.25 ml di tale sospensione sono stati aggiunti a 2.25 ml di ciascuna dispersione di P in PBS con concentrazione di P compresa fra 1x10<-6>e 1.2x10<-4>M. Le sospensioni risultanti risultanti contententi P e 1 mg/ml di lievito sono state agitate mediante vortex per 1 minuto ciascuna all’interno di provette Eppendorf e lasciate ad incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Ciascuna sospensione è stata quindi agitata mediante vortex per 1 minuto per ottenere una sospensione omogenea e subito dopo 0.1 ml della stessa sono stati posti direttamente su un vetrino da miscroscopio e osservate su di un microscopio invertito a fluorescenza Olympus IX 71. Ciascun campione è stato osservato mediante un cubo per fluorescenza (set filtri Chroma 11001v2 blue) e una lampada a xenon (Edinburgh, 450 W). L’intensità della lampada è stata ridotta di 1000 volte mediante un filtro assorbitivo Thorlabs NE30B e le immagini registrate mediante una CCD a colori Basler Scout scA640-70gc. In tutti i casi si è osservata un’intensa fluorescenza proveniente dalle cellule ed un segnale estremamente basso proveniente dalla soluzione circostante le cellule. In particolare nel caso del campione a concetrazione di P 1x10<-6>M si osserva sia ad un ingrandimento di 10X (obbiettivo Olympus UPLFLN10X2) che ad un ingrandimento 100X (obbiettivo Olympus UPLFLN 100XO2) una colorazione verde intensa della fluorescenza delle cellule (figura 9 e figura 10) mentre nel caso del campione con A suspension in PBS of Saccharomyces Cerevisiae yeast cells was prepared by vortexing 100 mg of yeast in 10 ml of PBS. 0.25 ml of this suspension was added to 2.25 ml of each dispersion of P in PBS with a concentration of P between 1x10 <-6> and 1.2x10 <-4> M. The resulting suspensions containing P and 1 mg / ml of yeast were shaken by vortexing for 1 minute each inside Eppendorf tubes and left to incubate at room temperature for 30 minutes. Each suspension was then vortexed for 1 minute to obtain a homogeneous suspension and immediately thereafter 0.1 ml of the suspension was placed directly on a microscope slide and observed on an Olympus IX 71 inverted fluorescence microscope. Each sample was observed. using a fluorescence cube (Chroma 11001v2 blue filter set) and a xenon lamp (Edinburgh, 450 W). Lamp intensity was reduced by 1000 times using a Thorlabs NE30B absorbing filter and images recorded using a Basler Scout scA640-70gc color CCD. In all cases, intense fluorescence was observed from the cells and an extremely low signal from the solution surrounding the cells. In particular, in the case of the sample with a concentration of P 1x10 <-6> M, an intense green staining of the fluorescence of the cells is observed both at a magnification of 10X (Olympus UPLFLN10X2 objective) and at a magnification 100X (Olympus UPLFLN 100XO2 objective). 9 and figure 10) while in the case of the sample with

concentrazione 1x10<-5>M di P si osserva ad entrambi gli ingrandimenti una colorazione rossa intensa delle cellule (figura 11 e figura 12). In particolare in figura 9 è mostrata un’immagine RGB del campione a concentrazione di P 1x10<-6>M acquisita al microscopio con ingrandimento 10X scomposta nelle tre componenti R (rossa), G (verde) e B (blue); figura 9 mostra chiaramente che la componente G della fluorescenza delle cellule (chiaramente individuabili in figura) è più intensa della componente R mentre la componente B è quasi nulla. Il software di analisi grafica Image J è stato utilizzato per individuare automaticamente le cellulle e calcolare il valore medio delle componenti R, G e B di ciascuna cellula. Il software ha individuato in figura 9, 139 oggetti (cellule o piccoli gruppi di cellule) di cui 137 hanno componenti R, G e B corrispondenti al colore verde nello spazio dei colori CIE. In figura 10 è mostrata un’immagine RGB del campione a concentrazione di P 1x10<-6>M acquisita al microscopio con ingrandimento 100X scomposta nelle tre componenti R (rossa), G (verde) e B (blue); anche in questo caso la componente G è predominante. 1x10 <-5> M concentration of P, an intense red staining of the cells is observed at both magnifications (Figure 11 and Figure 12). In particular, Figure 9 shows an RGB image of the sample with a concentration of P 1x10 <-6> M acquired under a microscope with 10X magnification broken down into the three components R (red), G (green) and B (blue); Figure 9 clearly shows that the G component of the fluorescence of the cells (clearly identifiable in the figure) is more intense than the R component while the B component is almost zero. The Image J graphical analysis software was used to automatically identify the cells and calculate the average value of the R, G and B components of each cell. The software has identified in figure 9, 139 objects (cells or small groups of cells) of which 137 have components R, G and B corresponding to the color green in the CIE color space. Figure 10 shows an RGB image of the sample with a concentration of P 1x10 <-6> M acquired under the microscope with 100X magnification broken down into the three components R (red), G (green) and B (blue); also in this case the G component is predominant.

In figura 11 è mostrata un’immagine RGB del campione a concentrazione di P 1x10<-5>M acquisita al microscopio con ingrandimento 10X scomposta nelle tre componenti R, G e B; figura 11 mostra chiaramente che la componente R della fluorescenza delle cellule (chiaramente individuabili in figura) è più intensa della componente G mentre la componente B è quasi nulla. Il software di analisi grafica Image J è stato utilizzato per individuare automaticamente le cellulle e calcolare il valore medio delle componenti R, G e B di ciascuna cellula. Il software ha individuato in Figure 11 shows an RGB image of the sample with a concentration of P 1x10 <-5> M acquired under a microscope with 10X magnification broken down into the three components R, G and B; Figure 11 clearly shows that the R component of the cell fluorescence (clearly identifiable in the figure) is more intense than the G component while the B component is almost zero. The Image J graphical analysis software was used to automatically identify the cells and calculate the average value of the R, G and B components of each cell. The software identified in

figura 11, 107 oggetti (cellule o piccoli gruppi di cellule) tutti con componenti R, G e B corrispondenti al colore rosso nello spazio dei colori CIE. In figura 12 è mostrata un’immagine RGB del campione a concentrazione di P 1x10<-5>M acquisita al microscopio con ingrandimento 100X scomposta nelle tre componenti R, G e B; anche in questo caso la componente R è predominante. figure 11, 107 objects (cells or small groups of cells) all with components R, G and B corresponding to the red color in the CIE color space. Figure 12 shows an RGB image of the sample with a concentration of P 1x10 <-5> M acquired under the microscope with 100X magnification broken down into the three components R, G and B; also in this case the R component is predominant.

Utilizzando l’obbiettivo 100X, che avendo apertura numerica NA 1.3 permette di acquisire immagini a bassa profondità di campo, è possibile mettere a fuoco selettivamente sezioni delle celule con profondità di circa 100 nm e osservare che l’emissione delle cellule proviene anche dal citoplasma indicando la penetrazione di P all’interno della cellula medesima. Inoltre è possibile osservare che la colorazione è più intensa in corrispondenza di alcuni compartimenti cellulari o alcune membrane e che quindi la fluorescenza fornisce informazioni riguardo all’anatomia della cellula e alla proprietà chimiche locali. Per caratterizzare spettralmente le emissioni dei due campioni cellulari incubati con P 1x10<-6>M e 1x10<-5>M si cono registrati gli spettri di fluorescenza eccitando a 488 nm. Gli spettri sono mostrati in figura 13 e mostrano chiaramente il primo (P 1x10<-6>M) un picco nel verde ed il secondo (P 1x10<-5>M)una forte componente nel rosso. Using the 100X objective, which having NA 1.3 numerical aperture allows to acquire images at low depth of field, it is possible to selectively focus sections of the cells with a depth of about 100 nm and observe that the emission of the cells also comes from the cytoplasm indicating the penetration of P into the cell itself. It is also possible to observe that the staining is more intense in correspondence with some cellular compartments or some membranes and that therefore the fluorescence provides information about the anatomy of the cell and the local chemical properties. To spectrally characterize the emissions of the two cell samples incubated with P 1x10 <-6> M and 1x10 <-5> M, the fluorescence spectra were recorded by exciting at 488 nm. The spectra are shown in figure 13 and clearly show the first (P 1x10 <-6> M) a peak in the green and the second (P 1x10 <-5> M) a strong component in the red.

Dimostrazione che P impartisce una fluorescenza alle cellule biologiche o ai diversi compartimenti cellulari il cui colore cambia dopo intensa irradiazione in modo diverso a seconda delle caratteristiche della cellula o del compartimento cellulare. Demonstration that P imparts a fluorescence to biological cells or to different cell compartments whose color changes after intense irradiation in a different way depending on the characteristics of the cell or cell compartment.

Durante l’osservazione al microscopio a fluorescenza dei campioni descritti nella sezione precedente (ovvero ottenuti incubando una sospensione di Saccharomyces Cerevisiae con P in PBS a diverse concentrazioni nell’intervallo 1x10<-6>-1.2x10<-4>M) e attenuando l’intensità della lampada di eccitazione (450 W) di 1000 volte mediante l’utilizzo di un filtro, non si sono registrate variazioni significative di intensità o colore delle immagini di fluorescenza almeno nell’arco di 10 minuti. Al contrario quando analoghe sospensioni sono state osservate al microscopio a fluorescenza rimuovendo il filtro attenuatore utilizzato per l’eccitazione, a causa della intensa irradiazione, si sono osservate in tutti i casi variazioni di colorazione o intensità della fluorescenza delle cellule in tempi dell’ordine di qualche minuto. In particolare per quanto riguarda il campione di cellule a concentrazione di P c=1x10<-5>M la colorazione di alcuni compartimenti cellulari è passato gradualmente da rosso ad arancione a giallo e quindi a verde. Un esempio di questo cambiamento di colore è mostrato nelle figura 14 15 e 16 dove sono riportate le immagini registrate nelle condizioni sopra descritte (eccitazione non attenuata) dopo 0, 20, 40, 60, 80 e 100 secondi di irradiazione scomposte nelle tre componenti R, G, e B rispettivamente. In particolare in figura 14 e figura 15 sono riportate rispettivamente le immagini delle componenti R e G e si può vedere come in alcuni compartimenti cellulari la componente R tenda gradualemente a scomparire mentre la componente G diventa più intensa. La componente B mostrata in figura 16 è invece sempre molto debole. In figura 13 si può notare che dopo 100 s di irradiazione è possibile individuare alcuni compartimenti che mostrano intensa During fluorescence microscopic observation of the samples described in the previous section (i.e. obtained by incubating a suspension of Saccharomyces Cerevisiae with P in PBS at different concentrations in the range 1x10 <-6> -1.2x10 <-4> M) and attenuating the 'Excitation lamp intensity (450 W) of 1000 times by using a filter, there were no significant variations in intensity or color of the fluorescence images in at least 10 minutes. On the contrary, when similar suspensions were observed under the fluorescence microscope by removing the attenuator filter used for the excitation, due to the intense irradiation, in all cases, variations in staining or intensity of the fluorescence of the cells were observed in times of the order of a few minutes. In particular, as regards the sample of cells with a concentration of P c = 1x10 <-5> M, the staining of some cellular compartments gradually passed from red to orange to yellow and then to green. An example of this color change is shown in figures 14 15 and 16 which show the images recorded under the conditions described above (unattenuated excitation) after 0, 20, 40, 60, 80 and 100 seconds of irradiation broken down into the three components R , G, and B respectively. In particular in figure 14 and figure 15 the images of the R and G components are shown respectively and it can be seen how in some cellular compartments the R component gradually tends to disappear while the G component becomes more intense. The component B shown in figure 16 is instead always very weak. In figure 13 it can be seen that after 100 s of irradiation it is possible to identify some compartments that show intense

fluorescenza verde, altri che mostrano intensa fluorescenza rosso-arancio altri che mostrano fluorescenza molto debole verde o rossa. In particolare la fluorescenza della membrana cellulare esterna e del citosol scompare rapidamente durante l’irradiazione mentre i mitocondri si colorano di intensa fluorescenza verde. green fluorescence, others showing intense red-orange fluorescence, others showing very weak green or red fluorescence. In particular, the fluorescence of the outer cell membrane and cytosol rapidly disappears during irradiation while the mitochondria are colored with intense green fluorescence.

Claims

CLAIMS 1 A fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides for the fluorescent labeling of biological cells selected from the group consisting of the compounds represented by Chemical Formula 1: Chemical Formula 1 where R is selected from the group of substituents consisting of polyethermonoamines, polyetherdiamines, polyether tetramines, polyether polyamines.

2 The fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claim 1 having the Chemical Formula 2: NH2NH O j O O2 Oz H2NNN NH O O O x O2 the Y O O Chemical Formula 2 Where i + j + l + x + y + z = 2-100.

3 The fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claim 1 having the Chemical Formula 3: Chemical Formula 3 where i + j + l + x + y + z = 2-300.

4 The fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claim 1 having the Chemical Formula 4: Chemical Formula 4 Where x + y = 2-200.

5 The fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claim 1 having the Chemical Formula 5: Chemical Formula 5 Where x + y = 2-50.

6 The fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claim 1 having the Chemical Formula 6: Chemical Formula 6 Where i + j + l + x + y + z = 2-200.

7 A dispersion of the fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claims 1-6 for the fluorescent labeling of biological cells.

8 A dispersion of the fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claims 1-6 for the fluorescent labeling of biological cells which are yeast cells.

9 A dispersion of the fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claims 1-6 for the fluorescent labeling of biological cells which are cells of the yeast Saccharomyces Cerevisiae.

10 A kit comprising a dispersion of the fluorogenic and photoregulating marker based on perylene diimides according to claims 7-9 for the fluorescent labeling of cells.