IT9041655A1

IT9041655A1 - PROCESS FOR ISOLATION AND EXPRESSION OF THE HUMAN NEURONOTROPHIC FACTOR BY MEANS OF RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY.

Info

Publication number: IT9041655A1
Application number: IT041655A
Authority: IT
Inventors: Tiziana Bisogno; Lanfranco Callegaro; Alessandro Negro
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1990-07-17
Filing date: 1990-07-17
Publication date: 1992-01-17
Also published as: IT1243286B; IT9041655A0

Description

BACKGROUND DELL'INVENZIONE BACKGROUND OF THE INVENTION

A. IL FATTORE NEURONOTROFICO CILIARE A. THE CHILIARY NEURONOTROPHIC FACTOR

Il ganglio ciliare (GC) contiene due popolazioni di neuroni, quelli ciliari e quelli coroidei, gli uni e gli altri colinergici. I neuroni GC innervano la muscolatura intrinseca dell'occhio nella coroide, nonché nel corpo ciliare e nell'iride. Durante lo sviluppo dell'embrione di pollo, circa metà dei neuroni GC muoiono nel momento (tra i giorni E8 e E15 di sviluppo embrionale) in cui i loro assoni stabiliscono una connessione con il territorio intraoculare di innervazione. The ciliary ganglion (GC) contains two populations of neurons, the ciliary ones and the choroid ones, one and the other cholinergic. GC neurons innervate the intrinsic musculature of the eye in the choroid, as well as in the ciliary body and iris. During the development of the chicken embryo, about half of the GC neurons die at the time (between days E8 and E15 of embryonic development) when their axons establish a connection with the intraocular territory of innervation.

Questa morte neuronaie è fortemente favorita dalla preliminare rimozione dell'occhio, mentre è significativamente ostacolata dal precedente impianto di un abbozzo oculare supplementare. This neuronal death is strongly favored by the preliminary removal of the eye, while it is significantly hampered by the previous implantation of an additional ocular sketch.

Da questa osservazione era stata formulata l'ipotesi che i territori di innervazione contengono fattori trofici per i neuroni ad essi destinati. Estratti di vari tessuti embrionali di pollo allo stadio E8, avevano rivelato una attività trofica proprio nei confronti di neuroni dissociati da gangli ciliari di embrione di pollo allo stesso stadio (Adler 1979). From this observation the hypothesis was formulated that the innervation territories contain trophic factors for the neurons destined to them. Extracts of various chicken embryonic tissues at stage E8 revealed trophic activity precisely against neurons dissociated from ciliary ganglia of chicken embryos at the same stage (Adler 1979).

A questa attività trofica successivamente è stato associato il nome di fattore neuronotrofico ciliare (CNTF) (Barbin 1982). The name ciliary neuronotrophic factor (CNTF) was subsequently associated with this trophic activity (Barbin 1982).

Un terzo dell'attività trofica del CNTF totale dell'embrione è stato trovato nell'occhio e la maggior parte di questo è stata localizzata nella coroide e nella muscolatura intrinseca dell'occhio. La purificazione di questa proteina mediante cromatografia a scambio ionico, ultracentrifugazione in gradiente di saccarosio ed elettroforesi in condizioni riducenti in SDS-PAGE ha rivelato un peso molecolare di circa 21Kd e una carica netta negativa. L'attività trofica esercitata dalla proteina purificata nei neuroni GC di pollo allo stadio E8, nei neuroni DRG di pollo allo stadio E10 e neuroni simpatetici E11 è dell'ordine di 10<-11 >10 <-12>M e quindi dello stesso ordine di grandezza di un altro fattore neuronotrof ico, il Nerve Growth Factor (NGF), purificato dalla ghiandola sottomandibolare di topo maschio, nei confronti dei suoi bersagli neuronali DRG e simpatici. One third of the trophic activity of the total embryo CNTF was found in the eye and most of this was localized in the choroid and intrinsic musculature of the eye. Purification of this protein by ion exchange chromatography, sucrose gradient ultracentrifugation and electrophoresis under reducing conditions in SDS-PAGE revealed a molecular weight of approximately 21Kd and a net negative charge. The trophic activity exerted by the purified protein in chicken GC neurons at stage E8, in chicken DRG neurons at stage E10 and sympathetic neurons E11 is of the order of 10 <-11> 10 <-12> M and therefore of the same order magnitude of another neuronotrophic factor, the Nerve Growth Factor (NGF), purified from the submandibular gland of male mice, against its DRG and sympathetic neuronal targets.

Come l'NGF, il CTNF supporta la crescita delle cellule adrenali cromoaffini in coltura sebbene le misure degli effetti di questi due fattori sugli enzimi torosina idrossilasi e feniletanolamina N-metiltransferasi differiscano. Like NGF, CTNF supports the growth of cultured chromaffin adrenal cells although measures of the effects of these two factors on the enzymes torosine hydroxylase and phenylethanolamine N-methyltransferase differ.

Il CNTF eleva l'attività ChAT in coltura di cellule retiniche di pollo indicando una risposta dei neuroni colinergici. Il CNTF non ha effetti trofici sui neuroni colinergici della regione basale pontina del cervello e non può essere considerato un fattore neuronotrofico colinergico. Dati molto recenti indicano che l'azione del CNTF non è ristretto alle cellule neuronali. Il CNTF è stato trovato indurre la differenziazione delle cellule gliali progenitrici del nervo ottico di ratto ad astrociti di tipo 2. CNTF elevates cultured ChAT activity of chicken retinal cells indicating a cholinergic neuron response. CNTF has no trophic effects on cholinergic neurons in the pontine basal region of the brain and cannot be considered a cholinergic neuronotrophic factor. Very recent data indicate that the action of CNTF is not restricted to neuronal cells. CNTF was found to induce differentiation of rat optic nerve glial progenitor cells to type 2 astrocytes.

Tra le altre attività al CNTF è associata una attività legata alla prevenzione della degenerazione di motoneuroni dopo axotomia (Sendtner 1990). Among other activities, CNTF is associated with an activity related to the prevention of motor neuron degeneration after axotomy (Sendtner 1990).

Il CNTF è stata isolato dal nervo sciatico di ratto, di cuore di bue e in cellule di neuroblastoma. In particolare Williams e co. hanno dimostrato un alto contenuto di CNTF nel nervo sciatico di ratto adulto, con una attività specifica pari a quello di pollo (20.000 TU/mg proteico). CNTF has been isolated from rat sciatic nerve, bull's heart and neuroblastoma cells. In particular Williams and co. demonstrated a high content of CNTF in the sciatic nerve of adult rats, with a specific activity equal to that of chicken (20,000 TU / mg protein).

Sono state identificate due forme di CNTF uno con un peso molecolare di circa 25 Kd e un’altro di circa 28 Kd. La purificazione all 'omogenicità di quantità di CNTF di nervo sciatico di coniglio e di ratto ha permesso la parziale sequenza aminoacidica (Lin L-F, H. 1990). Da queste conoscenze attraverso la tecnica della PCR è stato isolato il segmento genico completo codificante per il CNTF di questi due animali. (Stockli et al 1989, Lin L-F.H. et al 1989) la proteina ha rivelato un peso molecolare di 22.7 Kd e 22.8 rispettivamente con un punto isolettrico calcolato nel primo caso di 5.78 in accordo con le proteine purificate. Two forms of CNTF have been identified, one with a molecular weight of about 25 Kd and the other of about 28 Kd. The purification to homogenicity of CNTF quantities of rabbit and rat sciatic nerve allowed the partial amino acid sequence (Lin L-F, H. 1990). From this knowledge through the PCR technique, the complete gene segment coding for the CNTF of these two animals was isolated. (Stockli et al 1989, Lin L-F.H. Et al 1989) the protein revealed a molecular weight of 22.7 Kd and 22.8 respectively with an isolation point calculated in the first case of 5.78 in agreement with the purified proteins.

L'analisi comparativa delle sequenze del CNTF di ratto e coniglio ha rivelato una altissima omologia sia in sequenza aminoacidica che nucleotidica. L'analisi al computer ha permesso la determinazione di alcuni domini di questa molecola maggiormente conservati e questo ha permesso l'identificazione e l'isolamento di una porzione significativa del segmento genico umano, corrispondente all*80% della sequenza completa, utilizzando la tecnica dello PCR e alcuni oligonucleotidi sintetizzati proprio in questi domini. Questa porzione di sequenza genica e la corrispondente sequenza aminoacidica sono state descritte nella domanda di brevetto N° 41557A/90. ;;B. LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE ;Le tecniche utilizzate per isolare proteine con attività biologiche prevedono convenzionalmente l’isolamento della proteina stessa tramite sistemi di purificazione da liquidi biologici, ma non sempre le quantità di proteina che si possono ottenere ne permettono i successivi usi per studiarne le strutture, le funzioni e soprattutto le applicazioni. Il caso del CNTF è uno di questi esempi, infatti al momento è stato purificato solo una minima quantità di CNTF di ratto, coniglio, bue e pollo ed è noto l'isolamento della proteina umana da cellule di neuroblastoma. ;Ai fini di ottenere quindi delle quantità apprezzabili di proteina, si possono utilizzare le tecnologie del DNA ricombinante per clonare la proteina stessa in vettori di espressione. ;La tecnologia del DNA ricombinante permette di costruire serie di vettori che sono in grado di esprimere proteine di interesse in larga quantità. La tecnologia del DNA ricombinante permette ai biologi molecolari l'assemblaggio di sequenze di DNA ai fini di creare delle molecole ibride capaci di produrre la proteina di interesse. Il metodo fa uso di varie reazioni come tagli con enzimi di restrizione, l'unione dei frammenti così ottenuti con ligasi, la sintesi chimica di oligonucleotidi da assemblare ed altre metodologie disponibili dei diversi laboratori nel settore (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Laboratory NY, 1982). ;Al fine di ottenere alti livelli di espressione, bisogna che gli elementi di DNA da assemblare presentino delle informazioni essenziali. Per esempio, una origine di replicazione, una selezione per antibiotici, un promotore di espressione, attivatori della trascrizione del gene di interesse ed altre caratteristiche note ai cultori della materia in oggetto. La combinazione di questi elementi in modo opportuno dà origine ad un plasmide, se il gene di interesse è inserito naturalmente rispetto alle sequenze regolatorie della trascrizione e della traduzione e il risultante plasmide viene definito di espressione. Il plasmide o vettore di trasmissione è così in grado di esprimere la proteina in cellule ospiti, che possono essere di origine eucariota o procariota. La proteina può quindi essere ricavata attraverso un sistema di purificazione. Gli elementi (promotori) che controllano naturalmente l'espressione di molti geni come ad esempio i fattori di crescita, non sono molto forti nella loro espressione e vengono attivati solo in opportune condizioni naturali che spesso non sono conosciute. A questo fine si utilizzano promotori di cui si conosce l'attività, ad esempio virus della serie Papovavirus, oppure altre sequenze geniche promotrici conosciute. Gli elementi che si utilizzano per alti livelli di espressione sono quindi una combinazione di DNA di diversa origine (eucariota, batterica, virale etc.) costituito alla fine da porzioni geniche diverse legate a formare un ibrido. L'attività di trascrizione di un gene dipende dalle oppurtune distanze tra le sequenze regolatorie e codificanti. Fatta questa premessa, uno dei migliori modi che le sequenze regolatorie hanno di lavorare opportunamente è che il gene introdotto sia posto nella stessa identica posizione del gene naturale. Un sistema usato è quello che le sequenze regolatorie comprendano anche alcuni aminoacidi delle sequenze codificanti. L'unione con il gene introdotto dà origine ad una proteina fusa che viene successivamente rimossa e che è possibile ottenere ai più alti valori biologici. Se non si utilizza la tecnica delle proteine di fusione, le tecnologie convenzionali per l'ottenimento di geni situati nelle strette vicinanze delle sequenze regolatorie dipendono dall'esistenza di opportuni siti di restrizione che ne permettano il clonaggio. Se non esistono siti compatibili nelle vicinanze bensì siti diversi, è possibile ottenere l’unione dei segmenti con la sintesi di un oligonucleotide (linker) che contiene il siffatto sito di restrizione. Se non esistono siti di restrizione nelle vicinanze tali da permettere l'uso dei linker, allora si utilizza la tecnica di delezione del DNA con Ball31 o SI. Questa possibilità non permette una delezione precisa e ogni volta bisogna controllare tramite un sequenziamento diversi cloni per vedere qual è quello più opportuno. Questi sistemi sono molto limitati per il biologo molecolare. Una strategia alternativa è l'utilizzo della tecnica della PCR (Saiki et al 1988). Con questa tecnica è possibile amplificare fino a 1 x 10<6 >un segmento genico. Il principio si basa sull'utilizzo di due oligonucleotidi, ciascuno dei quali si può appaiare precisamente su uno dei filamenti di DNA da amplificare. La distanza che intercorre tra i due oligonucleotidi rispetto alla sequenza genica presa in esame dà le dimensioni della molecola da produrre. Questi due oligonucleotidi vengono costruiti in modo tale che all'interno della loro sequenza vi sia un sito di restrizione che ne permetta il successivo clonaggio. Questo sito di restrizione è presente naturalmente oppure viene costruito ad hoc degenerando il minimo numero di basi. Questo approccio, che si può definire di mutagenesi sito-diretta, permette di costruire dei siti di restrizione nelle posizioni che il biologo molecolare decide a priori. La costruzione di siti compatibili con altri segmenti genici permette da una parte un facile clonaggio ma soprattutto apre la possibilità di unire in modo mirato diversi segmenti genetici. Si può definire questa tecnica come clonazione attraverso la mutagenesi diretta. Mediante questa tecnica sono stati preparati altri vettori per l'ottenimento, mediante la tecnica del DNA ricombinante, di altri fattori neuronotrof ici. Tali vettori sono descritti nelle domande di brevetto N° 48564A/89 e N° 41538A/90. ;;;RIASSUNTO DELL'INVENZIONE ;A fronte delle conoscenze associabili alle tecnologie del DNA ricombinate la presente invenzione è relativa alla identificazione della sequenza di basi, alla correlazione con gli aminoacidi corrispondenti del CNTF umano, alla sua produzione in forma completa in quantità sufficienti ed omogenee tali da poter essere impiegate per iniziare a condurre esperimenti in forma singola o con altre molecole o manufatti associabili con il nome di biomateriali in vitro e in vivo. Tali esperimenti sono prerequisiti per la messa in commercio. ;Oggetto della presente invenzione sono pure le preparazioni farmaceutiche comprendenti, come sostanze attive, uno o più dei nuovi complessi tra il fattore di crescita CNTF e un ganglioside naturale o uno dei suoi derivati o analoghi semisintetici o un suo sale oppure loro associazioni con altri fattori di crescita o con polisaccaridi naturali o modificati chimicamente o trasformati in manufatti definibili come biomateriali. Tali preparazioni farmaceutiche possono essere destinate all'uso orale, topico, rettale, parenterale, locale, inalatorio, intracerebrale. Esse sono quindi in forma solida o semisolida, per esempio confetti, compresse, creme, opercoli gelatinosi, capsule, supposte, capsule di gelatina molle, gel, membrane, tubicini. Per l'uso parenterale ed intracerebrale si possono usare forme predestinate alla somministrazione intramuscolare, sottocutanea o atte a infusioni o iniezioni endovenose o intracerebrali e si possono quindi presentare come soluzioni dei composti attivi e come polveri liofilizzate dei composti attivi da unirsi ad uno o più recipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, convenienti per gli usi suddetti e di osmolarità compatibile con i liquidi fisiologici Per l'uso locale entrano in considerazione preparazioni in forma di creme o unguenti per uso topico o nebulizzanti; per l'uso inalatorio entrano in considerazione preparazioni in forma di spray, per esempio spray nasali. ;Le preparazioni dell'invenzione possono essere destinate alla somministrazione all'uomo o all'animale. Esse contengono di preferenza da 0.01% al 10% di componente attivo per le soluzioni, gli spray, gli unguenti e le creme e dall'1% al 100% e preferibilmente da 5% al 50% del composto attivo per i preparati in forma solida. Il dosaggio da somministrarsi dipenderà dall'indicazione, dall'effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta. ;L'invenzione comprende pure l'uso terapeutico di tutti i nuovi complessi dei gangliosidi o dei derivati dell'acido ialuronico o dei suoi derivati con il fattore di crescita CNTF per le indicazioni già sopra menzionate. I dosaggi giornalieri all'uomo per via iniettiva (sottocutanea o intramuscolare o intracerebrale) variano da 0.05 mg a 5 mg di sostanza attiva per kg di peso corporeo. ;;;DESCRIZIONE DETTAGLIATA ;Di seguito viene descritto dettagliatamente come è stato preparato l'oggetto della presente invenzione. Queste descrizioni, mentre servono ad illustrarla, non sono da considerare limitative dell'invenzione, e tutte le variazioni che sarebbero evidenti all’esperto nell'arte sono da considerare in essa comprese. ;Alcune delle reazioni note al biologo molecolare sono descritte in (Molecular Cloning: Sambrook J. et al 1989). ;Gli attacchi sulle catene del DNA con gli enzimi di restrizione sono stati eseguiti come dalle specifiche delle case produttrici. In generale 1 μg di plasmide è stato tagliato con 1 U di enzima in 20 μl di soluzione, la temperatura e il tempo di incubazione dipendevano dall'enzima usato, in generale 1 hr a 37°C. Dopo incubazione, i plasmidi e i segmenti genetici sono stati purificati sempre in un gel di Agarosio LMP Agarose (BRL - USA) in 40 mM Tris HC1, 20 mM Sodio Acetato, 1 mM EDTA e quindi eluiti dall'agarosio con il kit GENECLEAN (BIO 101 Inc, La Jolla, CA - USA). ;Per le ligasi è stata usata la ligasi T4 alla concentrazione di 1 U per 0.5 pg di DNA in una reazione di 20 pi a 13°C per 12 ore. Le analisi per confermare la corretta sequenza nel plasmide sono state effettuate trasformando sempre in cellule HB101 e i trasformanti selezionati in piastre di Agarosio in LB (Luria Bertani) medium con antibiotico ampicillina 50 pg/ml. I plasmidi contenuti nelle HB101 sono stati cresciuti in LB, 100 pg/ml di ampicillina e sono stati purificati, sia per le piccole che le grandi preparazioni, con il kit dello Quiagen (DIAGEN GmbH, Dusseldorf - Germania Federale). I vettori di clonaggio sono stati preparati dalle cellule batteriche con il metodo dello Quiagen. Il DNA per il Southern blot è stato preparato nel seguente modo da placenta umana a termine. Un pezzo 0.4 cm<3 >di villi corrali e stato sminuzzato con un paio di forbici e sospeso in 700 pi di 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS. A questo, sono stati successivamente aggiunti 35 pi di proteinase (K 100 μg/ml) ed è stato incubato per una notte a 55°C. Sono quindi stati aggiunti 20 μl di una soluzione a 13 μg/ml di RNAase A ed è stato incubato per altre 2 ore. Sono state poi eseguite due estrazioni con fenolo e due con cloroformio. Il DNA è stato poi fatto precipitare su un capillare di vetro per aggiunta di 1 volume di isopropanolo. A questo punto sono stati eseguiti alcuni passaggi con etanolo al 70% e al 100% ed è stato fatto asciugare. Il DNA è stato sciolto in tampone (10 mM Tris/HCl pH 7.4, 1 mM EDTA), lasciandolo in lenta agitazione in provetta. A questo punto il DNA veniva digerito con alcuni enzimi di restrizione a 37°c O/N. Successivamente i digesti venivano separati in un gel di Agarosio al 0.8% in TAE (Tris Acetato EDTA). Il gel veniva lavato 2 volte in 0.1 M HC1 e 1.5 M NaCl, due volte in 1M NaOH 1.5 NaCl e due volte in 2M TRIS pH 7.4 0.6 M NaCl quindi trasferito O/N su nitrocellulosa (Hyboud N Amersham). Il filtro di nitrocellulosa veniva esposto per 3 minuti a raggi ultravioletti. Quindi preibridizzato in 50% Formammide, 5 x Denhardt's, 5XSSC, lmg/ml di DNA di sperma di salmone e 42° per 2h. L'ibridazione era eseguita tutta la notte in 50% Formammide 5 x Denhardt's, 5 x SSC, 0.250 ug/ml di DNA di sperma di salmone a 10% Sodio destrano solfato. Il filtro era lavato in 0.1% SDS 2 x SSC per 2h a 65° e quindi esposto ad autoradiografia. ;Tutti gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati su un sintetizzatore di oligonucleotide in fase solida con il metodo dei fosforamiditi seguendo le procedure standard dell'apparecchio 380B DNA Synthesizer (Applied Biosystems - USA). Sono stati trattati a 55°C per 12 ore in NH3 e quindi portati a secco in una centrifuga a vuoto. Sono stati risospesi in ammonio acetato 2.5 M e quindi precipitati con 3 volumi di etanolo freddo (~20°C). Sono stati rilavati con etanolo freddo all'80% e risospesi in acqua. La concentrazione degli oligonucleotidi era valutata allo spettrofotometro. La procedura di amplificazione è stata eseguita su un Perkin Elmer Cetus DNA Termal Cycler Amplificator ed i reagenti usati per l'amplificazione erano quelli del relativo kit DNA AMplyfer (Perkin Elmer-Cetus) . Brevemente, è stata usata una miscela con 200 μM di ogni oligonucleotide, 0.5 |iM di ogni nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP e 0.1 μg di DNA umano e buffer di reazione in una miscela totale di 100 μl con 0.5 U di TAQ polimerasi, il tutto ricoperto con olio di paraffina per non permettere l'evaporazione. La reazione di amplificazione è stata condotta impostando lo strumento per 25 cicli nel caso di DNA fago purificato. Il ciclo impostato era il seguente: 1 min. a 94°C, 2 min. a 45°C, 3 min. a 72°C.o con alcune modifiche quando la sequenza da amplificare era più lunga. ;;RECUPERO DELLA SEQUENZA COMPLETA DEL CNTF UMANO ;A partire dalla disponibilità della sequenza genica per il CNTF umano riportato nella precedente domanda di brevetto N°41557A/90 è stato possibile recuperare il segmento genico completo per il CNTF umano. Per recuperare questo segmento genico abbiamo analizzato una serie di librerie umane per la porzione del CNTF precedentemente isolato. ;Le librerie utilizzate sono reperibili in commercio. Più precisamente sono state impiegate due librerie, una genomica umana di leucociti in EMBL-3 , e l’altra di messaggeri (cDNA) di retina umana in fago lambda gtll. ;;ANALISI DI UNA LIBRERIA IN EMBL-3 PER IL CNTF UMANO ;Le strategie per isolare il fago che contiene il ricombinante per il fattore di crescita ciliare (CNTF) umano consistono nel determinare una omologia nucleotidica con una sonda radioattiva preparata dal gene di CNTF. Le metodologie per l'analisi di librerie sono ampiamente descritte in: (Sambrook J. et al 1989). Brevemente abbiamo piastrato 800.000 ricombinanti in 4 piastre di 20 x 20 cm e sono state eseguite delle repliche con nitrocellulosa. La nitrocellulosa era preibridizzata per 2h in 5 x SSC 5 x Danhardt's e 50% Formammide a 42°. ;Successivamente veniva ibridizzata in una soluzione analoga a quella per la preibridazione più 10% sodio detrano solfato per una notte. La sonda marcata con 32p era preparata con il kit "random primer" della Boehringer dal frammento Apa-Sall del plasmide pGEM7 del precedente brevetto. La nitrocellulosa veniva lavata a 50°C in 0.2 x SSC e 0.1% SDS per 30 min e per 4 volte e quindi in 2 x SSC a temperatura ambiente. In seguito le 4 repliche venivano esposte per autoradiografia con un film Kodak XR-5 ray con uno schermo intensificatore. Venti spot autoradiografia erano ottenuti con ibridazione per il clone di CNTF. Ognuno di questi cloni veniva esaminato per la presenza del CNTF mediante la tecnica della PCR e impiegando gli oligonucleotidi Apal e Sali del precedente brevetto. Questa analisi rivela la presenza di 7 cloni positivi. A questo punto abbiamo esaminato questi cloni per la presenza del CNTF completo tramite la tecnica dello PCR utilizzando le informazioni valevoli in (Stdckli et al 1989, Lin L-F.H. Science 1989). Abbiamo sintetizzato due oligonucleotidi,il primo basato sui primi nucleotidi del CNTF di coniglio ed esattamente con questa sequenza: ;; ;; In questo oligonucleotide sono state mutate alcune dosi al 5' per rendere più semplice il clonaggio infatti è stato aggiunto un sito Ncol. ;Il secondo oligonucleotide è stato posizionato sulla sequenza del CNTF umano sopra un sito naturale HindlII per facilitare i successivi clonaggi ed esattamente con questa sequenza ; ;; ;; L'amplificazione condotta rivela la presenza nel gel di Agarosio al 1% di una banda da 1500bp, questa banda purificata è stata trattata con T4 DNA chinasi e quindi è stata purificata con Agarosio/Geneclean ;Successivamente è stata tagliata HindlII e clonata nel plasmide pGEM7 tra siti Smal e HindlII dando origine al plasmide pGEM7 CNTFh. ;Questo clone sequenziato con il metodo Sanger 1983 rivela la presenza di sequenze analoghe al CNTF umano, di ratto e di coniglio. ;A questo punto il clone fagico che porta questa sequenza veniva purificato all'omogeneità rivelando un inserto di 14Kb. Questo fago veniva sequenziato per le sequenze codificanti il CNTF da cui la sequenza in Fig. 1. ;; ;; Fig. 1 Sequenza nucleotidica delle porzioni codificanti del CNTF umano da libreria genomica umana in EMBL-3. ;Questa sequenza genica del CNTF umano riportato comprende la porzione genica precedentemente descritta nella domanda di brevetto N° 41557A/90. ;;ANALISI DI UNA LIBRERIA IN FAGO DI RETINA UMANA PER IL CNTF ;Le strategie convenzionali per isolare il o i cloni per una determinata proteina da una libreria in gtlO (Sambrook J. et al 1989) fanno uso di sonde genetiche radioattive che siano omologhe alla sequenza che si intende isolare oppure, in mancanza di sonde genetiche omologhe, può esserci l'uso di anticorpi per la proteina di interesse. Allora la libreria da costruire e da cui isolare successivamente il clone sarà una libreria di espressione, ad es. gt11. ;Con l'avvento di nuove tecniche, la strategia di screening di una libreria mediante sonda genetica radioattiva può essere occulata tramite l'uso della PCR. ;Nel nostro caso, avendo isolato la sequenza genomica del CNTF e quindi conoscendone la sua sequenza, abbiamo costruito due oligonucleotidi per recuperare il gene senza aggiungere basi al segmento 5' e 3* del gene stesso. Un primo oligonucleotide chiamato Ncol è situato al 5’ del gene ed ha la seguente sequenza: Comparative analysis of the CNTF sequences of rats and rabbits revealed a very high homology in both amino acid and nucleotide sequences. Computer analysis allowed the determination of some more conserved domains of this molecule and this allowed the identification and isolation of a significant portion of the human gene segment, corresponding to 80% of the complete sequence, using the technique of PCR and some oligonucleotides synthesized in these domains. This portion of the gene sequence and the corresponding amino acid sequence have been described in the patent application No. 41557A / 90. ;; B. RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY; The techniques used to isolate proteins with biological activities conventionally provide for the isolation of the protein itself through purification systems from biological liquids, but the quantities of protein that can be obtained do not always allow its subsequent uses to study its structures, functions and above all applications. The case of CNTF is one of these examples, in fact at the moment only a minimal amount of CNTF from rat, rabbit, ox and chicken has been purified and the isolation of human protein from neuroblastoma cells is known. In order to therefore obtain appreciable quantities of protein, recombinant DNA technologies can be used to clone the protein itself into expression vectors. ; Recombinant DNA technology allows for the construction of vector arrays that are capable of expressing proteins of interest in large quantities. Recombinant DNA technology allows molecular biologists to assemble DNA sequences in order to create hybrid molecules capable of producing the protein of interest. The method makes use of various reactions such as cuts with restriction enzymes, the union of the fragments thus obtained with ligases, the chemical synthesis of oligonucleotides to be assembled and other methods available from the various laboratories in the sector (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning . A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Laboratory NY, 1982). In order to achieve high levels of expression, the DNA elements to be assembled must present essential information. For example, an origin of replication, a selection for antibiotics, an expression promoter, activators of the transcription of the gene of interest and other characteristics known to the experts of the subject in question. The combination of these elements in an appropriate way gives rise to a plasmid, if the gene of interest is inserted naturally with respect to the regulatory sequences of transcription and translation and the resulting plasmid is defined as expression. The plasmid or transmission vector is thus able to express the protein in host cells, which can be of eukaryotic or prokaryotic origin. The protein can then be obtained through a purification system. The elements (promoters) that naturally control the expression of many genes such as growth factors, are not very strong in their expression and are activated only in suitable natural conditions that are often not known. For this purpose, promoters whose activity is known are used, for example viruses of the Papovavirus series, or other known promoter gene sequences. The elements that are used for high levels of expression are therefore a combination of DNA of different origin (eukaryotic, bacterial, viral etc.) constituted at the end by different gene portions linked to form a hybrid. The transcription activity of a gene depends on the appropriate distances between the regulatory and coding sequences. Having said that, one of the best ways that regulatory sequences have to work properly is that the introduced gene is placed in the exact same position as the natural gene. One system used is that the regulatory sequences also include some amino acids of the coding sequences. The union with the introduced gene gives rise to a fused protein which is subsequently removed and which can be obtained at the highest biological values. If the fusion protein technique is not used, conventional technologies for obtaining genes located in the close vicinity of the regulatory sequences depend on the existence of suitable restriction sites that allow their cloning. If there are no compatible sites nearby but different sites, it is possible to obtain the union of the segments with the synthesis of an oligonucleotide (linker) that contains such a restriction site. If there are no restriction sites nearby that allow the use of linkers, then the DNA deletion technique with Ball31 or SI is used. This possibility does not allow a precise deletion and each time it is necessary to check different clones by sequencing to see which is the most appropriate. These systems are very limited for the molecular biologist. An alternative strategy is the use of the PCR technique (Saiki et al 1988). With this technique it is possible to amplify up to 1 x 10 <6> a gene segment. The principle is based on the use of two oligonucleotides, each of which can be paired precisely on one of the DNA strands to be amplified. The distance between the two oligonucleotides with respect to the gene sequence under consideration gives the size of the molecule to be produced. These two oligonucleotides are constructed in such a way that within their sequence there is a restriction site that allows their subsequent cloning. This restriction site is present naturally or is built ad hoc by degenerating the minimum number of bases. This approach, which can be defined as site-directed mutagenesis, allows the construction of restriction sites in the positions that the molecular biologist decides a priori. The construction of sites compatible with other gene segments allows on the one hand an easy cloning but above all opens the possibility of combining different genetic segments in a targeted way. This technique can be defined as cloning through direct mutagenesis. By means of this technique other vectors have been prepared for obtaining, by means of the recombinant DNA technique, other neuronotrophic factors. These vectors are described in patent applications N ° 48564A / 89 and N ° 41538A / 90. ;;; SUMMARY OF THE INVENTION; Given the knowledge associated with recombinant DNA technologies, the present invention relates to the identification of the sequence of bases, to the correlation with the corresponding amino acids of the human CNTF, to its production in complete form in sufficient quantities and homogeneous such that they can be used to start conducting experiments in single form or with other molecules or artifacts that can be associated with the name of biomaterials in vitro and in vivo. Such experiments are prerequisites for placing on the market. The object of the present invention are also pharmaceutical preparations comprising, as active substances, one or more of the new complexes between the growth factor CNTF and a natural ganglioside or one of its derivatives or semisynthetic analogues or a salt thereof or their associations with other factors. of growth or with natural or chemically modified polysaccharides or transformed into artifacts that can be defined as biomaterials. These pharmaceutical preparations can be intended for oral, topical, rectal, parenteral, local, inhalation, intracerebral use. They are therefore in solid or semi-solid form, for example sugared almonds, tablets, creams, gelatinous capsules, capsules, suppositories, soft gelatin capsules, gels, membranes, tubes. For parenteral and intracerebral use, forms predestined for intramuscular or subcutaneous administration or suitable for intravenous or intracerebral infusions or injections can be used and can therefore be presented as solutions of the active compounds and as lyophilized powders of the active compounds to be joined to one or more containers. o diluents acceptable from the pharmaceutical point of view, suitable for the above uses and of osmolarity compatible with physiological liquids. For local use, preparations in the form of creams or ointments for topical use or nebulizers are considered; for inhalation use preparations in the form of sprays, for example nasal sprays, are considered. The preparations of the invention can be intended for administration to humans or animals. They preferably contain from 0.01% to 10% of active component for solutions, sprays, ointments and creams and from 1% to 100% and preferably from 5% to 50% of the active compound for preparations in solid form . The dosage to be administered will depend on the indication, the desired effect and the chosen route of administration. The invention also includes the therapeutic use of all the new complexes of the gangliosides or of the derivatives of hyaluronic acid or of its derivatives with the growth factor CNTF for the indications already mentioned above. Human daily dosages by injection (subcutaneous or intramuscular or intracerebral) vary from 0.05 mg to 5 mg of active substance per kg of body weight. ;;; DETAILED DESCRIPTION; The following is a detailed description of how the object of the present invention was prepared. These descriptions, while they serve to illustrate it, are not to be considered limitative of the invention, and all the variations that would be evident to the skilled in the art are to be considered included therein. ; Some of the reactions known to the molecular biologist are described in (Molecular Cloning: Sambrook J. et al 1989). ; The attacks on the DNA chains with the restriction enzymes were performed according to the specifications of the manufacturers. In general 1 μg of plasmid was cut with 1 U of enzyme in 20 μl of solution, the incubation temperature and time depended on the enzyme used, in general 1 hr at 37 ° C. After incubation, the plasmids and the genetic segments were always purified in a gel of Agarose LMP Agarose (BRL - USA) in 40 mM Tris HC1, 20 mM Sodium Acetate, 1 mM EDTA and then eluted from the agarose with the GENECLEAN kit (BIO 101 Inc, La Jolla, CA - USA). ; For the ligases, the T4 ligase at a concentration of 1 U per 0.5 pg of DNA was used in a reaction of 20 µl at 13 ° C for 12 hours. The analyzes to confirm the correct sequence in the plasmid were carried out by transforming HB101 cells and the selected transformants in agarose plates in LB (Luria Bertani) medium with antibiotic ampicillin 50 pg / ml. The plasmids contained in HB101 were grown in LB, 100 pg / ml of ampicillin and were purified, both for small and large preparations, with the Quiagen kit (DIAGEN GmbH, Dusseldorf - Federal Germany). The cloning vectors were prepared from bacterial cells by the Quiagen method. DNA for the Southern blot was prepared in the following manner from full-term human placenta. A 0.4 cm <3> piece of corral villi was comminuted with a pair of scissors and suspended in 700 µl of 50 mM Tris / HCl pH 7.8, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS. To this, 35 µl of proteinase (K 100 μg / ml) was subsequently added and it was incubated overnight at 55 ° C. Then 20 μl of a solution at 13 μg / ml of RNAase A was added and it was incubated for an additional 2 hours. Two extractions with phenol and two with chloroform were then performed. The DNA was then precipitated on a glass capillary by adding 1 volume of isopropanol. At this point a few steps were performed with 70% and 100% ethanol and it was allowed to dry. The DNA was dissolved in buffer (10 mM Tris / HCl pH 7.4, 1 mM EDTA), leaving it in slow stirring in a test tube. At this point the DNA was digested with some restriction enzymes at 37 ° C O / N. Subsequently the digests were separated in a 0.8% Agarose gel in TAE (Tris Acetate EDTA). The gel was washed twice in 0.1 M HC1 and 1.5 M NaCl, twice in 1M NaOH 1.5 NaCl and twice in 2M TRIS pH 7.4 0.6 M NaCl then transferred O / N on nitrocellulose (Hyboud N Amersham). The nitrocellulose filter was exposed to ultraviolet rays for 3 minutes. Then pre-hybridized in 50% Formamide, 5 x Denhardt's, 5XSSC, 1mg / ml of salmon sperm DNA and 42 ° for 2h. Hybridization was performed overnight in 50% Formamide 5 x Denhardt's, 5 x SSC, 0.250 µg / mL salmon sperm DNA at 10% Sodium dextran sulfate. The filter was washed in 0.1% SDS 2 x SSC for 2h at 65 ° and then exposed to autoradiography. ; All oligonucleotides were synthesized on a solid phase oligonucleotide synthesizer by the phosphoramidite method following the standard procedures of the 380B DNA Synthesizer apparatus (Applied Biosystems - USA). They were treated at 55 ° C for 12 hours in NH3 and then dried in a vacuum centrifuge. They were resuspended in 2.5 M ammonium acetate and then precipitated with 3 volumes of cold ethanol (~ 20 ° C). They were rewashed with cold 80% ethanol and resuspended in water. The concentration of the oligonucleotides was evaluated on the spectrophotometer. The amplification procedure was performed on a Perkin Elmer Cetus DNA Termal Cycler Amplificator and the reagents used for the amplification were those of the relative DNA AMplyfer kit (Perkin Elmer-Cetus). Briefly, a mixture with 200 μM of each oligonucleotide, 0.5 | iM of each nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP and 0.1 μg of human DNA and reaction buffer was used in a total mixture of 100 μl with 0.5 U of TAQ polymerase. , all covered with paraffin oil to prevent evaporation. The amplification reaction was conducted by setting the instrument for 25 cycles in the case of purified phage DNA. The set cycle was as follows: 1 min. at 94 ° C, 2 min. at 45 ° C, 3 min. at 72 ° C or with some modifications when the sequence to be amplified was longer. ;; RECOVERY OF THE COMPLETE HUMAN CNTF SEQUENCE; Starting from the availability of the gene sequence for the human CNTF reported in the previous patent application N ° 41557A / 90 it was possible to recover the complete gene segment for the human CNTF. To recover this gene segment we analyzed a series of human libraries for the previously isolated portion of the CNTF. ; The libraries used are commercially available. More precisely, two libraries were used, one of human leukocyte genomics in EMBL-3, and the other of human retinal messengers (cDNA) in phage lambda gtll. ;; ANALYSIS OF AN EMBL-3 LIBRARY FOR HUMAN CNTF; Strategies to isolate the phage containing the recombinant human ciliary growth factor (CNTF) consist in determining a nucleotide homology with a radioactive probe prepared from the CNTF gene . The methodologies for library analysis are widely described in: (Sambrook J. et al 1989). We briefly plated 800,000 recombinants in 4 plates of 20 x 20 cm and replicates were performed with nitrocellulose. The nitrocellulose was pre-hybridized for 2h in 5 x SSC 5 x Danhardt's and 50% Formamide at 42 °. It was subsequently hybridized in a solution similar to that for prehybridization plus 10% sodium deduct sulfate overnight. The 32p-labeled probe was prepared with the Boehringer "random primer" kit from the Apa-Sall fragment of the pGEM7 plasmid of the previous patent. The nitrocellulose was washed at 50 ° C in 0.2 x SSC and 0.1% SDS for 30 min and for 4 times and then in 2 x SSC at room temperature. The 4 replicas were then exposed by autoradiography with a Kodak XR-5 ray film with an intensifier screen. Twenty spot autoradiography were obtained with hybridization to the CNTF clone. Each of these clones was examined for the presence of CNTF by means of the PCR technique and using the Apal and Sali oligonucleotides of the previous patent. This analysis reveals the presence of 7 positive clones. At this point we have examined these clones for the presence of the complete CNTF by PCR technique using the information valid in (Stdckli et al 1989, Lin L-F.H. Science 1989). We synthesized two oligonucleotides, the first based on the first nucleotides of the rabbit CNTF and exactly with this sequence: ;; ;; In this oligonucleotide some doses at 5 'have been changed to make cloning easier, in fact an Ncol site has been added. ; The second oligonucleotide was placed on the human CNTF sequence over a natural HindlII site to facilitate subsequent cloning and exactly with this sequence; ;; ;; The amplification carried out reveals the presence in the 1% Agarose gel of a 1500bp band, this purified band was treated with T4 DNA kinase and then purified with Agarose / Geneclean; HindlII was then cut and cloned in the pGEM7 plasmid between Smal and HindlII sites giving rise to the plasmid pGEM7 CNTFh. ; This clone sequenced with the Sanger 1983 method reveals the presence of sequences analogous to human, rat and rabbit CNTF. ; At this point the phage clone carrying this sequence was purified to homogeneity revealing a 14Kb insert. This phage was sequenced for the sequences encoding the CNTF hence the sequence in Fig. 1. ;; ;; Fig. 1 Nucleotide sequence of the coding portions of human CNTF from human genomic library in EMBL-3. This gene sequence of the reported human CNTF comprises the gene portion previously described in the patent application No. 41557A / 90. ;; ANALYSIS OF A HUMAN RETINA PHAGO LIBRARY FOR CNTF; Conventional strategies for isolating the clone (s) for a given protein from a gtlO library (Sambrook J. et al 1989) make use of radioactive genetic probes that are homologous to sequence to be isolated or, in the absence of homologous genetic probes, there may be the use of antibodies for the protein of interest. Then the library to be built and from which to subsequently isolate the clone will be an expression library, eg. gt11. With the advent of new techniques, the strategy of screening a library using a radioactive genetic probe can be hidden through the use of PCR. ; In our case, having isolated the CNTF genomic sequence and therefore knowing its sequence, we have constructed two oligonucleotides to recover the gene without adding bases to the 5 'and 3 * segment of the gene itself. A first oligonucleotide called Ncol is located at 5 'of the gene and has the following sequence:

che contiene al suo interno un sito di restrizione Ncol naturale, il quale facilita il successivo clonaggio. Il secondo oligonucleotide chiamato EcoRI ha la seguente sequenza: which contains within it a natural Ncol restriction site, which facilitates subsequent cloning. The second oligonucleotide called EcoRI has the following sequence:

Questo oligonucleotide contiene al suo interno il sito di restrizione non naturale EcoRI. This oligonucleotide contains within it the non-natural restriction site EcoRI.

Con questi due oligonucleotidi è stata condotta una amplificazione PCR da lμl da una libreria di retina umana equivalente a 3x10<6 >cloni diversi (determinati dalla diluzione seriale della libreria, i cicli impostati erano 30 con la tecnica descritta precedentemente). L'amplificato ottenuto è stato prima trattato con T4 DNA chinasi e quindi purificato con Agarosio/BIOlOl. With these two oligonucleotides a lμl PCR amplification was performed from a human retinal library equivalent to 3x10 <6> different clones (determined by the serial dilution of the library, the cycles set were 30 with the technique described above). The amplified obtained was first treated with T4 DNA kinase and then purified with Agarose / BIOlOl.

E' stato successivamente tagliato EcoRI e ripurificato con Agarosio/BIOlOl e clonato nel plasmide pGEM7 tra siti Smal e EcoRI dando origine al plasmide pGEM7CNTFh. EcoRI was subsequently cut and repurified with Agarose / BIOlOl and cloned in the plasmid pGEM7 between Smal and EcoRI sites giving rise to the plasmid pGEM7CNTFh.

La sequenza di questo clone è riportata in Fig. 2 e rivela rispetto al clone genomico uno splicing dopo 114bp dallo start codon. The sequence of this clone is shown in Fig. 2 and reveals a splicing 114bp from the start codon with respect to the genomic clone.

Fig. 2 Sequenza nucleotidica della porzione codificante il CNTF umano da libreria di retina umana in gt11. Fig. 2 Nucleotide sequence of the portion encoding the human CNTF from human retinal library in gt11.

In seguito alle informazioni relative alle sequenze nucleotiche riportate in Fig. 1 e Fig. 2 la sequenza aminoacidica contigua della proteina CNTF umano è riportata in Fig. 3. Da questo ne deriva che la proteina presenta un Peso Molecolare di 22,8 kdaltons ed un punto isoelettrico calcolato di 6,02. Following the information relating to the nucleotic sequences shown in Fig. 1 and Fig. 2, the contiguous amino acid sequence of the human CNTF protein is shown in Fig. 3. From this it follows that the protein has a Molecular Weight of 22.8 kdaltons and a calculated isoelectric point of 6.02.

Fig. 3 Sequenza aminoacidica della porzione del CNTF umano. Fig. 3 Amino acid sequence of the human CNTF portion.

VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO PER IL CNTF UMANO VECTOR OF PROKYOTIC EXPRESSION FOR THE HUMAN CNTF

Il cDNA del CNTF umano clonato nel plasmide pGEM7 CNTFh tra i siti SmoI e EcoRI è stato modificato tramite la PCR in modo che la proteina possa essere trascritta più efficacemente. E' stato sintetizzato un nuovo oligonucleotide Ncol (2) dove sono state cambiate alcune basi in modo che i codoni che codificano gli aminoacidi siamo quelli di preferenza dell'E.coli e altre basi sono state combiate tenendo in considerazione la stabilità del messaggero in relazione alla regione Shine-Dalgarno del vettore di espressione. The human CNTF cDNA cloned in the pGEM7 CNTFh plasmid between the SmoI and EcoRI sites was modified by PCR so that the protein can be transcribed more effectively. A new Ncol (2) oligonucleotide has been synthesized where some bases have been changed so that the codons encoding the amino acids are those preferably E. coli and other bases have been combined taking into account the stability of the messenger in relation to the Shine-Dalgarno region of the expression vector.

La sequenza di questo oligonucleotide è la seguente: The sequence of this oligonucleotide is as follows:

L'amplificato ottenuto tramite PCR con gli oligonucleotidi Ncol (2) e EcoRI precedentemente descritto è stato clonato nel plasmide pJLA602 tra i siti Ncol e EcoRI (Fig. 4.) The amplified obtained by PCR with the previously described Ncol (2) and EcoRI oligonucleotides was cloned into the pJLA602 plasmid between the Ncol and EcoRI sites (Fig. 4.)

In questo modo il CNTF umano è sotto il controllo del promotore del fago lambda PL e pR e del repressore CI In this way the human CNTF is under the control of the promoter of the lambda phage PL and pR and of the repressor CI

Questo plasmide di espressione è stato transfettato in diverse linee E. coli tra cui 71/18 e CAG628 per ottenere l’espressione della proteina. This expression plasmid was transfected into several E. coli lines including 71/18 and CAG628 to obtain the expression of the protein.

Fig. 4 Vettore di espressione procariotico relativo all'espressione del CNTF umano. Fig. 4 Prokaryotic expression vector related to human CNTF expression.

CRESCITA BATTERICA E PROPAGAZIONE BACTERIAL GROWTH AND PROPAGATION

Una colonia di E. coli di 71/18 contenente il plasmide pJLA602CNTF è stato inoculato in 5 mi di LB medium in crescita contenente 30μg/ml di ampicillina. Le cellule erano cresciute per una notte a 30°C. Una aliquota di questo era diluita 1/100 in M9 contenente 20μg/ml di ampicillina. Le cellule erano cresciute in fermentazione fino ad una assorbenza di 0.4 OD a 550nm. A 71/18 colony of E. coli containing the pJLA602CNTF plasmid was inoculated in 5ml of LB growing medium containing 30μg / ml of ampicillin. The cells had grown overnight at 30 ° C. An aliquot of this was diluted 1/100 in M9 containing 20μg / ml of ampicillin. The cells had grown in fermentation to an absorbency of 0.4 OD at 550nm.

A questo punto la temperatura del fermentatore era portata velocemente a 42°C. Le cellule erano ulteriormente cresciute per 3<h >dopo di che venivano centrifugate e risospese in Tris/HCl pH8.0 lOmM EDTA e pronte quindi per le successive estrazioni. At this point the temperature of the fermenter was quickly raised to 42 ° C. The cells were further grown for 3 <h> after which they were centrifuged and resuspended in Tris / HCl pH8.0 lOmM EDTA and then ready for subsequent extractions.

VETTORE DI ESPRESSIONE BUCARIOTICO PER IL CNTF UMANO BUCARIOTIC EXPRESSION VECTOR FOR THE HUMAN CNTF

La sequenza codificante il CNTF umano è stata inserita in un plasmide di espressione eucariotico PSVT7 (Sambrook J. et al 1989). The human CNTF coding sequence was inserted into a PSVT7 eukaryotic expression plasmid (Sambrook J. et al 1989).

A questo fine è stato utilizzato il DNA dal clone genomico EMBL-3. Sono stati sintetizzati due nuovi oligonucleotidi , il primo posizionato al 5' e il secondo al 3' del gene. La sequenza di questi oligonucleotidi è la seguente: DNA from the EMBL-3 genomic clone was used for this purpose. Two new oligonucleotides were synthesized, the first positioned at the 5 'and the second at the 3' of the gene. The sequence of these oligonucleotides is as follows:

Questi due oligonucleotidi contengono altresì due siti di restrizione non naturali EcoRI e Sali per facilitare i sucessivi clonaggi. These two oligonucleotides also contain two non-natural restriction sites EcoRI and Salts to facilitate subsequent cloning.

L'amplificato ottenuto dopo PCR contiene quindi la sequenza codificante il primo esone, il primo introne e la sequenza codificante il secondo esone. Il frammento di circa 1900bp è stato purificato in Agarosio e poi Geneclean e quindi tagliato EcoRI-SalI e clonato in una reazione di ligasi nel vettore pSVT7 tra i siti EcoRI e Sali. The amplificate obtained after PCR therefore contains the sequence encoding the first exon, the first intron and the sequence encoding the second exon. The approximately 1900bp fragment was purified in Agarose and then Geneclean and then EcoRI-SalI cut and cloned in a ligase reaction in the pSVT7 vector between the EcoRI and Sali sites.

Il vettore di espressione ottenuto è dato in Fig.5. The expression vector obtained is given in Fig. 5.

Fig. 5 Vettore di espressione eucariotico relativo all'espressione del CNTF umano. Fig. 5 Eukaryotic expression vector related to human CNTF expression.

TRANSFEZ IONE TRANSIENTE CON LIPOSOMI IN CELLULE DI OVAIO DI CRICETO (CHO) TRANSIENT TRANSFECTION WITH LIPOSOMES IN HAMSTER OVAR CELLS (CHO)

Le cellule CHOKI erano cresciute con 5% di siero fetale bovino, il giorno prima della transfezione erano state tripsinizzate e rimpiastrate affinchè il giorno dopo raggiungessero l'80% della confluenza. Il DNA plasmidico pSVhCNTF è stato diluito alla concentrazione di 10 μg di DNA in 50 μl di H20 a cui si sono aggiunti 50 μl di Lipofectin (GIBCO), il tutto in un tubo di polistirene. Dopo 15 minuti di attesa questa mistura veniva aggiunta alle cellule che erano state precedentemente lavate con medium OPTI-MEM (GIBCO). Le cellule erano incubate in questo modo per 8 ore, e successivamente il medium normale compreso di siero fetale bovino era aggiunto per continuare la crescita. L'attività biologica è stata voluta impiegando il metodo descritto (Stockli et al. The CHOKI cells were grown with 5% fetal bovine serum, the day before the transfection they were trypsinized and replated to reach 80% confluence the next day. The pSVhCNTF plasmid DNA was diluted to a concentration of 10 μg of DNA in 50 μl of H20 to which 50 μl of Lipofectin (GIBCO) were added, all in a polystyrene tube. After 15 minutes of waiting this mixture was added to the cells which had previously been washed with OPTI-MEM medium (GIBCO). Cells were incubated in this manner for 8 hours, and thereafter normal medium including fetal bovine serum was added to continue growth. The biological activity was desired using the method described (Stockli et al.

1989) . 1989).

Brevemente gangli ciliari di pollo sono stati Incubati con medium di colture oppure lisati di cellule CHOKI transfettati con plasmidi di espressione che portano o meno il CNTF umano. Briefly chicken ciliary ganglia were incubated with culture medium or CHOKI cell lysates transfected with expression plasmids carrying or not human CNTF.

Solo il lisato di cellule di CHOKI transfettate con il plasmide pSVhCNTF, che porta la sequenza genica del CNTF umano, è in grado di mantenere la sopravvivenza dei gangli ciliari (Fig. 6). Only the lysate of CHOKI cells transfected with the pSVhCNTF plasmid, which carries the human CNTF gene sequence, is able to maintain the survival of the ciliary ganglia (Fig. 6).

Fig. 6 Attività biologica del CNTF umano espresso da cellule eucariote (CHO) sui gangli ciliari di pollo. Fig. 6 Biological activity of human CNTF expressed by eukaryotic cells (CHO) on chicken ciliary ganglia.

DETERMINAZIONE DELL'UNICITÀ DEL GENE DEL CNTF UMANO NEL GENOMA UMANO DETERMINATION OF THE UNIQUENESS OF THE HUMAN CNTF GENE IN THE HUMAN GENOME

Per stabilire che il gene del CNTF da noi isolato è unico nel genomo umano viene eseguito un Southern blot da 10 μg di DNA da placenta umana digeriti a complezione con vari enzimi di restrizione. To establish that the CNTF gene we isolate is unique in the human genome, a Southern blot of 10 μg digested human placenta DNA is performed in addition to various restriction enzymes.

La sonda usata per la marcatura era quella relativa al CNTF umano inizialmente clonato e descritto nella domanda di brevetto N° 41557A/90 che veniva marcata con 32P con il kit random primer della Boehringer. L'ibridazione era eseguita con 20 x 10<6 >cpm e una volta lavato veniva esposto per autoradiografia. Dopo due giorni di esposizione singole bande erano visibili quando il DNA era stato tagliato con HindlII, Ncol, EcoRl, Xholl, PstI suggerendo la presenza di un singolo gene. The probe used for the labeling was that relating to the human CNTF initially cloned and described in the patent application N ° 41557A / 90 which was labeled with 32P with the Boehringer random primer kit. Hybridization was performed with 20 x 10 <6> cpm and once washed it was exposed for autoradiography. After two days of exposure single bands were visible when DNA had been cut with HindlII, Ncol, EcoR1, Xholl, PstI suggesting the presence of a single gene.

COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

La formulazione delle composizioni farmaceutiche contenenti la molecola CNTF umano derivata dal DNA ricombinante, descritta a questo riguardo senza e possibilmente anche con gangliosidi, fosfolipidi, acido ialuronìco, comprende metodi già conosciuti per la preparazione di composizioni accettabili dal punto di vista farmaceutico, somministrabili al paziente, le quali permettono che una quantità effettiva della molecola CNTF sia combinata in una miscela con un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. Veicoli adatti e la loro formulazione comprendente altre proteine sono descritte, per esempio, nel libro "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Questi veicoli comprendono somministrazione rettale con eccipienti lipofilici, ad esempio, idrosolubili, autoemulsivi di tipo glicogelatina o altro. In queste preparazioni, il fattore di crescita CNTF ottenuto da DNA ricombinante può essere presente in quantità varianti fra lo 0.01% e l'1% in peso dell'intero eccipiente. Le supposte possono contenere, senza essere limitate ad esse, quantità idonee di acetilsalicilato. The formulation of the pharmaceutical compositions containing the human CNTF molecule derived from recombinant DNA, described in this regard without and possibly also with gangliosides, phospholipids, hyaluronic acid, comprises methods already known for the preparation of compositions acceptable from the pharmaceutical point of view, which can be administered to the patient. , which allow an effective amount of the CNTF molecule to be combined in a blend with a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and their formulation comprising other proteins are described, for example, in the book "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). These vehicles include rectal administration with lipophilic excipients, for example, water-soluble, self-emulsifying of the glycogelatine or other type. In these preparations, the growth factor CNTF obtained from recombinant DNA can be present in quantities ranging from 0.01% to 1% by weight of the entire excipient. The suppositories may contain, but are not limited thereto, suitable quantities of acetylsalicylate.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DEL POLIPEPTIDE RICOMBI-NANTE CNTF UMANO DETAILED DESCRIPTION OF THE HUMAN CNTF RICOMBI-NANTE POLYPEPTIDE

La struttura della molecola qui preparata è stata studiata per alcuni dettagli da tecniche di biochimica delle proteine e struttura genica. The structure of the molecule prepared here has been studied in some detail by protein biochemistry and gene structure techniques.

Essendo l'invenzione cosi descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'invenzione, e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell'ambito delle rivendica zioni : Since the invention is thus described, it is clear that these methods can be modified in various ways. These modifications are not to be considered as divergences from the spirit and perspectives of the invention, and all those modifications which would appear evident to an expert in the field are included in the scope of the claims:

1. Il segmento isolato di DNA umano, che rappresenta essenzialmente la sequenza del DNA che codifica il fattore neuronotrof ico ciliare umano (CNTF) . 1. The isolated segment of human DNA, which essentially represents the DNA sequence encoding human ciliary neuronotrophic factor (CNTF).

"formulazioni di deposito" iniettabili. injectable "depot formulations".

In base a quanto sopra, la formulazione farmaceutica comprende, sebbene non in maniera esclusiva, soluzioni di fattore di crescita CNTF o sue polveri liofilizzate in associazione a uno o più veicoli o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, e contenuti in mezzi tamponati a pH idoneo, ed isosmotici con i liquidi fisiologici. Nel caso di preparazioni liofilizzate, possono essere utilizzati eccipienti di sostegno come per esempio, ma non esclusivamente, mannitolo o glicina, e saranno fornite idonee soluzioni tamponate del volume desiderato in modo da ottenere adeguate soluzioni tamponate isotoniche aventi il pH desiderato. Soluzioni simili possono essere usate per le composizioni farmaceutiche della molecola CNTF ottenuta da DNA ricombinante in soluzioni isotoniche del volume desiderato e includono, ma non esclusivamente, l'uso di soluzioni tamponate fisiologiche con fosfato o citrato a concentrazioni idonee in modo da ottenere ogni volta preparazioni farmaceutiche isotoniche del pH desiderato, per esempio, pH neutro. Based on the foregoing, the pharmaceutical formulation comprises, although not exclusively, solutions of growth factor CNTF or lyophilized powders thereof in association with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and contained in pH buffered media. suitable, and isosmotic with physiological fluids. In the case of lyophilized preparations, support excipients such as, but not exclusively, mannitol or glycine can be used, and suitable buffered solutions of the desired volume will be provided in order to obtain adequate isotonic buffered solutions having the desired pH. Similar solutions can be used for the pharmaceutical compositions of the CNTF molecule obtained from recombinant DNA in isotonic solutions of the desired volume and include, but not exclusively, the use of physiological buffered solutions with phosphate or citrate at suitable concentrations in order to obtain preparations each time isotonic pharmaceuticals of the desired pH, for example, neutral pH.

La formulazione farmaceutica comprende inoltre, ma senza essere limitata ad esse, supposte per la The pharmaceutical formulation further includes, but is not limited to, suppositories for the

Claims

rectal administration with lipophilic excipients, for example, water-soluble, self-emulsifying of the glycogelatine type or other. In these preparations, the growth factor CNTF obtained from recombinant DNA can be present in quantities ranging from 0.01% to 1% by weight of the entire excipient. The suppositories may contain, but are not limited thereto, suitable quantities of acetylsalicylate. DETAILED DESCRIPTION OF THE HUMAN CNTF RICOMBI-NANTE POLYPEPTIDE The structure of the molecule prepared here has been studied in some detail by protein biochemistry and gene structure techniques. Since the invention is thus described, it is clear that these methods can be modified in various ways. These modifications are not to be considered as divergences from the spirit and perspectives of the invention, and all those modifications which would appear evident to an expert in the field are included in the scope of the claims: 1. The isolated segment of human DNA, which essentially represents the DNA sequence encoding human ciliary neuronotrophic factor (CNTF). injectable "depot formulations". Based on the foregoing, the pharmaceutical formulation comprises, although not exclusively, solutions of growth factor CNTF or lyophilized powders thereof in association with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and contained in pH buffered media. suitable, and isosmotic with physiological fluids. In the case of lyophilized preparations, support excipients such as, but not exclusively, mannitol or glycine can be used, and suitable buffered solutions of the desired volume will be provided in order to obtain adequate isotonic buffered solutions having the desired pH. Similar solutions can be used for the pharmaceutical compositions of the CNTF molecule obtained from recombinant DNA in isotonic solutions of the desired volume and include, but not exclusively, the use of physiological buffered solutions with phosphate or citrate at suitable concentrations in order to obtain preparations each time isotonic pharmaceuticals of the desired pH, for example, neutral pH. The pharmaceutical formulation further comprises, but is not limited to, suppositories for the 2. The isolated DNA of claim 1, which consists of the nucleotide sequence in Fig. 1 and 2. 3. The isolated DNA of claim 1, which encodes the amino acid sequence of Fig.3. The isolated DNA of claims 1-3, which represents the region from the gene encoding the human ciliary neuronotrophic factor (CNTF). 5. The isolated DNA referred to in claims 1-4, which represents the amino acid sequence essential for obtaining the polypeptide of the human ciliary neuronotrophic factor (CNTF), in the biologically active form. 6. The isolated DNA of claims 1-4, which represents the nucleotide sequence essential for the expression process of human ciliary neuronotrophic factor (CNTF) in host cells. 7. A process for preparing the DNA segment of claim 1. 8. A process of claim 6, where the host cell is of prokaryotic origin. 9. A recombinant cell line according to claim 8, which is defined as Escherichia coli. 10. A process of claim 6, where the host cell is of eukaryotic origin. 11. A recombinant cell line according to claim 10 which is defined as hamster ovary (CHO) cells. 12. A process as claimed in claims 5-11 for obtaining human ciliary neuronotrophic factor (CNTF), free from contaminating human proteins. 13. A process according to claim 12, which allows the production of pharmaceutical preparations also in association with other biological molecules or their derivatives. 14. A process as claimed in claims 12 and 13, wherein in the pharmaceutical preparation one or more of the new complexes between the growth factor CNTF and a natural ganglioside or a derivative or semisynthetic analogue thereof or a salt thereof are present as active substances. 15. A process as claimed in claims 12 and 13 where active substances are present in the pharmaceutical preparation one or more of the new complexes between the growth factor CNTF and a natural polysaccharide or its derivative or semisynthetic analogue or an article thereof. 16. A process of claim 15, where the polysaccharide is hyaluronic acid. 17. A process as per claims 15 and 16 where the CNTF is associated with an artifact called a biomaterial. 18. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation is intended for administration to man or animal. 19. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation is administrable by parental route. 20. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation can be administered intracerebrally. 21. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation can be administered orally. 22. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation can be administered rectally. 23. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation can be administered locally or topically. 24. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation can be administered by inhalation. 25. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation is to be used for the maintenance of the nervous function. 26. A process of claims 13-15, where the pharmaceutical preparation is to be used for the prevention of the loss of nervous function. 27. A process according to claims 13-15, where the pharmaceutical preparation can be used for the recovery of the nervous function in acute or chronic pathological conditions. 28. A process according to claim 27, where the pathological conditions are of an acute type such as cerebrovascular, infectious, inflammatory, compressive, metabolic deficiencies. 29. A process referred to in claim 27, where the pathological conditions are of the chronic neurodegerative type, even in late stages of acute pathologies. 30. The use of a pharmaceutical form according to claims 13-15 for the treatment of neuropathological conditions caused by the aging of the nervous system or of diseases that attack the immune system. 31. The use of a pharmaceutical form according to claims 13-15 for the modulation of the immune system