IT9021564A1 - PROCESS FOR THE PURIFICATION OF HUMAN BETA-INTERFERONE RECOMBINANT BETA-INTERFERONE SO PURIFIED AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THAT CONTAIN IT. - Google Patents
PROCESS FOR THE PURIFICATION OF HUMAN BETA-INTERFERONE RECOMBINANT BETA-INTERFERONE SO PURIFIED AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THAT CONTAIN IT. Download PDFInfo
- Publication number
- IT9021564A1 IT9021564A1 IT021564A IT2156490A IT9021564A1 IT 9021564 A1 IT9021564 A1 IT 9021564A1 IT 021564 A IT021564 A IT 021564A IT 2156490 A IT2156490 A IT 2156490A IT 9021564 A1 IT9021564 A1 IT 9021564A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- process according
- solution
- rhu
- cho
- interferon
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 5
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 17
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 13
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 13
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 9
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 6
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 5
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 claims description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 claims description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Descrizione dell'Invenzione Industriale dal titolo: Processo per la purificazione di Beta-Interferone umano ricombinante, Beta-Interferone cosi purificato e composizioni farmaceutiche che lo contengono. Description of the Industrial Invention entitled: Process for the purification of recombinant human Beta-Interferon, thus purified Beta-Interferon and pharmaceutical compositions containing it.
Campo dell'invenzione Field of the invention
E’ descritto un processo per la purificazione di rHu-IFN β ricombinante costituito da tre stadi cromatografici in successione in cui si utilizzano le seguenti fasi stazionarie : particelle di vetro a porosità controllata (CPG), resine polimeriche a scambio ionico, resine polimeriche capaci di complessare metalli pesanti (MCC). A process for the purification of recombinant rHu-IFN β is described consisting of three chromatographic steps in succession in which the following stationary phases are used: controlled porosity glass particles (CPG), ion exchange polymeric resins, polymeric resins capable of complexing heavy metals (MCC).
Stato dell'arte State of the art
Il Beta-Interferone umano (HU-IFN β) è una glicoproteina di peso molecolare MW 23.000 daltons, la cui sequenza amminoacidica è stata determinata da K.Hosoi et al. Human Beta-Interferon (HU-IFN β) is a glycoprotein with a molecular weight of MW 23,000 daltons, whose amino acid sequence was determined by K. Hosoi et al.
[J.Interferon res. 8 , pag. 375 - 384 (1988)] mentre quella glucosidica è stata riportata da Y.Kagawa et al. [J.Biol.Chem., 263. pag. 17508 - 17515 (1988)]. [J. Interferon res. 8, p. 375 - 384 (1988)] while the glucosidic one was reported by Y. Kagawa et al. [J.Biol.Chem., 263. pag. 17508 - 17515 (1988)].
E' una proteina secreta dai fibroblasti in risposta ad un’infezione virale, batterica o all'esposizione a cellule, macromolecole e RNA estranei. In particolare inibisce la proliferazione delle cellule infettate ed ha un'attività stimolatoria sul sistema immunitario. L'attività specifica antivirale di Hu-IFN 8 omogeneo è ritenuta essere compresa tra 3 x 10 e 1 x 10 iu/mg (unità internazionali per milligrammi di proteina totale) (vedi US-A-4289 689 ed EP-A-94672). It is a protein secreted by fibroblasts in response to viral or bacterial infection or exposure to foreign cells, macromolecules and RNA. In particular, it inhibits the proliferation of infected cells and has a stimulatory activity on the immune system. The specific antiviral activity of homogeneous Hu-IFN 8 is believed to be between 3 x 10 and 1 x 10 iu / mg (international units per milligrams of total protein) (see US-A-4289 689 and EP-A-94672) .
A causa della sua attività Hu-IFN β è ritenuto un promettente principio attivo non solo nel trattamento e profilassi di malattie virali come l'epatite B, 1'Herpes, l'influenza ecc. ma anche nel trattamento di situazioni tumorali come l'encefaloma e la leucemia. Due to its activity, Hu-IFN β is considered a promising active ingredient not only in the treatment and prophylaxis of viral diseases such as hepatitis B, Herpes, influenza, etc. but also in the treatment of tumor situations such as encephaloma and leukemia.
La produzione di Hu-IFN β può essere ottenuta da colture di fibroblasti umani tenuti in condizioni di superinduzione, ad esempio, con poli (I) poli (C) (acido poliribosinico e poliribocitidilico) . La susseguente purificazione è Fatta principalmente con metodi cromatografici. The production of Hu-IFN β can be obtained from human fibroblast cultures kept under superinduction conditions, for example, with poly (I) poly (C) (polyribosine and polyribocytidyl acid). The subsequent purification is done mainly by chromatographic methods.
Tuttavia a dispetto delle varie tecniche di purificazione impiegate le rese molto basse di produzione ottenute con i fibroblasti hanno impedito la disponibilità di larghe quantità di prodotto. However, in spite of the various purification techniques employed, the very low production yields obtained with the fibroblasts prevented the availability of large quantities of product.
Per superare tale problema Interferoni Beta umani ricombinanti (rHu-INF β) sono stati ottenuti mediante colture di organismi ospiti (scelti nel gruppo dei batteri, lieviti o cellule di mammifero) trasformati con un vettore ad espressione contenente il gene che codifica per Hu-INF β. To overcome this problem, recombinant human Beta Interferons (rHu-INF β) were obtained by culturing host organisms (selected from the group of bacteria, yeast or mammalian cells) transformed with an expression vector containing the gene encoding Hu-INF β.
La purificazione di rHU-IFN β segue nei principi quella dell'interferone naturale, anche se le condizioni sono spesso molto diverse per la presenza di proteine proprie della cellula ospite, di sostanze provenienti dal mezzo di coltura e per la diversa natura chimica di rHU-IFN β, dovuta alla diversa composizione glucosidica che ogni cellula ospite conferisce. Comunque fra le tecniche di purificazione più utilizzate ricordiamo : cromatografia per immunoaffinità con anticorpi monoclonali [J.Utsumi et al., J.Biochem. 101, pag. 1199 - 1208 (1987)]; cromatografia in fase inversa [J.Utsumi et al., J.Biochem. l8l, pag 545 “ 553 (1989)]; cromatografia con fasi stazionarie chelanti metalli (MCC) (US-A-4551 271). The purification of rHU-IFN β follows in principle that of natural interferon, even if the conditions are often very different due to the presence of host cell proteins, substances coming from the culture medium and the different chemical nature of rHU- IFN β, due to the different glucosidic composition that each host cell confers. However, among the most used purification techniques we remember: chromatography for immunoaffinity with monoclonal antibodies [J.Utsumi et al., J.Biochem. 101, p. 1199-1208 (1987)]; reverse phase chromatography [J.Utsumi et al., J.Biochem. 18l, page 545 “553 (1989)]; metal chelating stationary phase chromatography (MCC) (US-A-4551 271).
Recentemente cellule tumorali di ovaia di criceto cinese (CHO) sono state usate per la produzione di beta interferone umano ricombinante (CHO-rHU-IFN β) [H.S.Conradt et al., J.Biol.Chem. Recently Chinese hamster ovary (CHO) cancer cells have been used for the production of recombinant human interferon beta (CHO-rHU-IFN β) [H.S.Conradt et al., J.Biol.Chem.
262, pag. 1^600 14605 (1987): Y.Chermajobsky et al., DNA 3. Pag. 297 ~ 308 (1984); F.Mc Cormick et al., Mol.Cell.Biol. 4, pag.166-172 (1984)], queste cellule offrono il vantaggio di permettere di ottenere la proteina espressa nel mezzo di coltura con una composizione in carboidrati in larga misura simile a quella delle proteine naturali da fibroblasti. 262, p. 1 ^ 600 14605 (1987): Y.Chermajobsky et al., DNA 3. Pages 297 ~ 308 (1984); F. Mc Cormick et al., Mol.Cell.Biol. 4, pp. 166-172 (1984)], these cells offer the advantage of allowing to obtain the protein expressed in the culture medium with a carbohydrate composition largely similar to that of natural fibroblast proteins.
I metodi di purificazione di CHO-rHu-IFN β sono analoghi a quelli utilizzati per i casi precedentemente indicati, cioè : cromatografie di affinità con Blue Sepharose, di immuno affinità con anticorpi monoclonali e fase inversa [(J.Utsumi et al., J.Biochem. 181, pag.545 - 553 (1989)]; cromatografie di adsorbimento su CPG e in scambio ionico (0.Protasi et al., Domanda di brevetto italiano 19699 A/90). The purification methods of CHO-rHu-IFN β are similar to those used for the cases indicated above, that is: affinity chromatographs with Blue Sepharose, immuno affinity with monoclonal antibodies and reverse phase [(J. Utsumi et al., J . Biochem. 181, pages 545 - 553 (1989)]; adsorption chromatography on CPG and ion exchange (0. Protasi et al., Italian patent application 19699 A / 90).
Nel caso di interferoni ricombinanti le tecniche di purificazione suddette non soddisfano appieno le esigenze di una produzione su larga scala in quanto l'uso di cromatografie per affinità o immuno-affinità, che permette di ottenere proteine omogenee, risulta molto oneroso in termini economici, di gestione del processo e di validazioni. Questi problemi sono enormemente ridotti se si usano fasi stazionarie di origine inorganica o sintetica, che però, fino ad ora, non hanno permesso di ottenere un prodotto Hu-IFN β ricombinante di purezza desiderata. Si è cercato quindi di accoppiare stadi cromatografici di purificazione che, utilizzando matrici inorganiche quali CPG e matrici sintetiche quali Superose IDA da utilizzare in MCC, permettano di ottenere CHO-rHu IFN β con una purezza comparabile con quella della cromatografia in affinità, ma con i vantaggi sopra indicati, propri di queste fasi. Tuttavia la possibilità di accoppiare le tecniche cromatografiche CPG e MCC in serie ha trovato finora un serio ostacolo nel fatto che l'eluizione del prodotto adsorbito su CPG deve essere fatta a pH* acido mentre il successivo adsorbimento in MCC richiede un pH neutro e d'altro canto è noto che variazioni di pH da valori acidi a valori neutri portano ad una completa disattivazione del CHO-rHu-INF β [Y.K.Tan et al., J.Biol.Chem. 254, pag. 8067 - 8073 (1979)]. L'aggiunta di additivi quali albumina di siero umano, polietilenglicole etc., che riducono il livello di disattivazione, hanno lo svantaggio di ostacolare le successive fasi di purificazione e di dover quindi essere rimossi. ;Inoltre bisogna considerare che l'eluizione dell' Hu-INP β in MCC è fatta normalmente o con soluzioni contenenti agenti complessanti forti (cioè capaci di staccare il metallo legato alla colonna) (JP-A-8281505) o con soluzioni a pH acido (US-A-4551271)· 0ra entrambi questi metodi presentano vari svantaggi, infatti nel primo caso l'agente complessante contenuto nell'eluente rimuove oltre all'Hu-INF β anche il metallo pesante che va ad inquinare il prodotto purificato ed obbliga a rigenerare la colonna dopo ogni corsa; il secondo metodo comporta un minore recupero in attività biologica ed inoltre la raccolta del prodotto purificato avviene in ambiente acido e quindi inadatto ad essere usato come iniettabile direttamente. In letteratura [W. von Muenchausen et al., J.Interferon Res. 8, pag. PI - 47 (1988)] è riportato pure l'uso di soluzioni di imidazolo (agente complessante debole) come eluente su Chelating Sepharose Fast Flow IDA Me<2+ >(Pharmacia) come fase stazionaria, ma anche in questo caso, ed anche a basse concentrazioni di imidazolo nell'eluente, si ha un continuo rilascio di metallo e quindi gli svantaggi suddetti. ;Descrizione dettagliata dell'invenzione ;Il processo secondo la presente invenzione consente la purificazione di CHO-rHU-IFN β in larga scala ovviando agli inconvenienti sopra riportati grazie all'uso di una fase stazionaria cationica forte o debole che consente di aumentare il pH di una soluzione di CHO-rHu-IFN β proveniente da un passaggio su colonna CPG (quindi come detto a pH acido), rendendola adatta per un passaggio su colonna MCC, senza alcuna perdita di attività dell'interferone. ;Il processo secondo la presente invenzione prevede un primo stadio di purificazione su una colonna cromatografica impaccata con particelle di vetro a porosità controllata (CPG). ;Il supernatante proveniente da una coltura di cellule CHO trasformate con un vettore ad espressione contenente il gene di Hu-IFN β è prima filtrato, ottenendo una soluzione ad attività specifica di 1 - 2 x 10<5 >iu/mg a una concentrazione di 1 -2 x 10<5 >iu/ml, poi è caricato su una colonna di CPG alla velocità di flusso lineare di 1 - 3 cm/min ed in quantità pari a 30-70 x 10<6 >iu di CHO-rHu-IFN β per grammo di fase stazionaria. La colonna è quindi sottoposta ai seguenti lavaggi : acqua, pH 7; NaCl; acqua. pH 7· I prodotti rimasti adsorbiti dopo i lavaggi, fra cui il CHO-rHu-IFN β, sono eluiti con una soluzione di acido acetico a concentrazione compresa tra 1 e 50 mM alla velocità di flusso lineare di O.25-I cm/min. ;Dopo questa fase si ottiene una soluzione di CHO-rHu-IFN β ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 x 10<6 >iu/ml ed un'attività specifica di 1-5 x 10<7 >iu/mg. ;L'eluito della colonna CPG con acido acetico è caricato su una colonna a scambio cationico, ad esempio CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) o CM-Fractogel (Merck), precondizionata con acetato di sodio, pH 4.0, oppure con una soluzione diluita di acido acetico, alla velocità di flusso lineare compresa tra 1 - 10 cm/min, in quantità comprese tra 4 - 6 x 10<8 >per mi di fase stazionaria. ;La miscela dei prodotti rimasti adsorbiti sulla colonna in scambio ionico, tra cui il CHO-rHU-IFN β, viene successivamente eluita con una soluzione ad alta forza ionica contenente NaCl > 0.2 M, tampone fosfato di sodio pH 7 ed eventualmente un agente complessante debole, come per esempio imidazolo (1- 12 mM), ottenendo una soluzione di CHO-Hu-IFN β ad attività specifica compresa tra 1 - 5 x 10<7 >iu/mg e una concentrazione compresa fra 10 - 40 x 10<6 >iu/ml. ;Questa soluzione è caricata tal quale, se già contiene l'agente complessante debole, o con una eventuale aggiunta di tale agente complessante debole, in quantità tali da ottenere una concentrazione finale compresa tra 1 e 12 mM, su una colonna contenente come fase stazionaria una resina polimerica capace di complessare metalli, in cui l'agente complessante della resina è, ad esempio, l'acido imminodiacetico (IDA), come Chelating Superose IDA-Me<2>+, alla velocità di flusso lineare compresa tra 1 e 3 cm/min ed in quantità comprese tra 2.5 - 4 x 10<9 >iu/ml di fase stazionaria. ;Con questo eluente di carica CHO-rHu-IFN β rimane adsorbito, mentre gran parte delle impurezze sono eluite via. ;Terminata la carica, la colonna MCC è sottoposta ad un lavaggio con una soluzione 15 mM di agente complessante debole, 0,5 M NaCl, 20 mM tampone fosfato di sodio pH7. In questa fase una quantità di CHO-rHu-IFN β < 3% è eluita insieme con le ultime impurezze adsorbite su MCC. Qualora lo si desideri questo CH0-Hu-IFN fS può essere recuperato aggiungendolo tal quale a un crudo di colture di CHO prima del passaggio sulla colonna CPG. L'eluizione dalla colonna MCC è effettuata con una soluzione > 20 mM agente complessante debole fino ad una concentrazione compatibile con le condizioni cromatografiche, 0,5 M NaCl, 20 mM tampone fosfato di sodio pH J .Q. ;L'interferone raccolto nell'eluato risulta essere omogeneo all'analisi RP-HPLC e SDS-PAGE con un'attività specifica tra 3 5 x 10<8 >iu/mg e ad una concentrazione tra 20 - 30 x 10<6 >iu/ml . ;Qualora lo si desideri è possibile eliminare l'agente complessante debole presente nell’eluato con i normali metodi di rimozione di sali descritti in letteratura quali cromatografia per esclusione molecolare, ultrafiltrazione, ecc. In alternativa un metodo conveniente è quello di eluire il CH0-rHu IFN β dalla colonna MCC con eluenti contenenti l'agente complessante debole a pH 4, farlo adsorbire su una colonna in scambio ionico identica a quelle utilizzate dopo la cromatografia con CPG, lavare la colonna con H2O a pH 7 ed infine eluire l'interferone rimasto adsorbito con una soluzione di 0.15 M NaCl, 0.1 M tampone fosfato di sodio pH 7» idonea per essere direttamente iniettabile. Alla soluzione eluita è aggiunta albumina di siero umano in quantità da 0.1 a 1.0 mg per milione di unità di liofilizzato. ;Il prodotto cosi ottenuto risulta stabile ed adatto per la preparazione di prodotti farmaceutici utili per il trattamento di infezioni virali e tumori e come immunomodulatore. ;L'attività antivirale di CHO-rHu-INF β è calcolata in base alla ’ riduzione dell'effetto citopatico utilizzando il virus VSV (vescicular stomatitis virus) e la linea cellulare umana HT-10-80 [J.A.Armstrong, Meth in Enziomol.78, pag. 381 - 387 (1981)]. Parte sperimentale ;;ESEMPIO 1 ;Purificazione di CHO-rHu-IFN β. ;1000 1 di una soluzione di CHO-rHu-IFN β con un'attività specifica di 1x 10<5 >iu/mg e alla concentrazione di 120.000 iu/ml in CHO-rHU-IFN β, ottenuta da una coltura su microcarrier della linea cellulare Chiron CHOB-IFNg 454. derivata dalla treansfezione della linea CH0 D x Bll con il plasmide pSAD 2B IFNg 1, è caricata alla velocità di flusso di 50 1/h in una colonna (252 id x 50 mm) impaccata con la fase stazionaria CPG-500 (Elettro Nucleonics) volume della colonna (Ve) 2500 mi. ;Terminata la carica, la colonna è lavata con 3 Ve di acqua a pH 7, poi con 3 Ve di una soluzione di 1.4 M NaCl ed infine con 10 Ve di acqua a pH 7· ;La miscela di prodotti rimasti adsorbiti in colonna tra cui CHO-rHu-IFN B è eluita con 16 Ve di una soluzione di 5mM AcOH, pH3-2, alla velocità di flusso di 12.51/h. ;Quest'ultimo eluato, raccolto in un unico recipiente e contenente CHO-rHU-IFN |S alla concentrazione di 2,4 x 10<6 >iu/ml e con un’attività specifica di 1-3 x 10<7 >iu/mg, è caricata tal quale e alla velocità di flusso di 1.251/h su una colonna (100 id x 25 mm) impaccata con la fase stazionaria CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (Ve, 200 mi) precondizionata con una soluzione acquosa di acido acetico 5 oM. La colonna è poi lavata con 10 Ve di acqua, pH 7· ;Tutti i prodotti rimasti adsorbiti in colonna, tra cui CHO-rHu-INF β, sono eluiti con 30 Ve di una soluzione di imidazolo 10 mM, 0.5 M NaCl, 20 mm tampone fosfato di sodio, pH 7-Questa fase di eluente, raccolta in un unico recipiente e contenente CHO-rHu-IFN β alla concentrazione di 16 x 10<6 >iu/ml con un'attività specifica 1.5 x 10<7 >iu/mg, è caricata alla velocità di flusso di 0.9 1/h su una colonna (35 id x 30 mm) impaccata con la fase stazionaria Chelating Superose IDA Cu<2 >(Pharmacia) (Ve, 29 mi). ;La colonna è lavata con 2 Ve di una soluzione di imidazolo 15 mM, 0.5 M NaCl. 20 mM tampone fosfato di sodio pH 7-Nell'eluato di questo lavaggio sono state trovate 2.5 x 10<7 >iu/ml di CHO-rHu-IFN β. ;CHO-rHu-IFN (S rimasto adsorbito dopo quest'ultimo lavaggio è eluito dalla colonna con 100 Ve di una soluzione di imidazolo 30 mM, 0.5 M NaCl, 20 mM tampone fosfato di sodio a pH 7· In quest' ultima fase l'eluente è raccolto in un unico recipiente e contiene CHO-rHu-IFN β puro >98%, come determinato dall’analisi RP-HPLC e SDS-PAGE con un'attività specifica di 3-8 x 10<8 >iu/mg ed una concentrazione di 20 x 10<6 >iu/ml. ;La resa globale del processo di purificazione è 48»8%. La soluzione dopo un’aggiunta di albumina in quantità pari a 0.5 mg per milione di unità, è liofilizzata e conservata a -20<*>C. In the case of recombinant interferons, the aforementioned purification techniques do not fully satisfy the needs of large-scale production as the use of affinity or immuno-affinity chromatography, which allows to obtain homogeneous proteins, is very expensive in economic terms, process and validation management. These problems are greatly reduced if stationary phases of inorganic or synthetic origin are used, which however, until now, have not allowed to obtain a recombinant Hu-IFN β product of desired purity. We therefore tried to couple purification chromatographic stages which, using inorganic matrices such as CPG and synthetic matrices such as Superose IDA to be used in MCC, allow to obtain CHO-rHu IFN β with a purity comparable to that of affinity chromatography, but with advantages indicated above, typical of these phases. However, the possibility of coupling the CPG and MCC chromatographic techniques in series has so far found a serious obstacle in the fact that the elution of the product adsorbed on CPG must be done at acid pH * while the subsequent adsorption in MCC requires a neutral and d 'pH. on the other hand it is known that pH variations from acidic to neutral values lead to a complete deactivation of CHO-rHu-INF β [Y.K.Tan et al., J.Biol.Chem. 254, p. 8067 - 8073 (1979)]. The addition of additives such as human serum albumin, polyethylene glycol etc., which reduce the level of deactivation, have the disadvantage of hindering the subsequent purification steps and therefore having to be removed. ; Furthermore it must be considered that the elution of Hu-INP β in MCC is normally done either with solutions containing strong complexing agents (i.e. capable of detaching the metal bound to the column) (JP-A-8281505) or with solutions at acid pH (US-A-4551271) Both of these methods have various disadvantages, in fact in the first case the complexing agent contained in the eluent removes in addition to the Hu-INF β also the heavy metal which pollutes the purified product and forces to regenerate the column after each run; the second method involves a lower recovery in biological activity and furthermore the collection of the purified product takes place in an acidic environment and therefore unsuitable to be used as a direct injectable. In literature [W. von Muenchausen et al., J. Interferon Res. 8, p. PI - 47 (1988)] the use of imidazole solutions (weak complexing agent) as eluent on Chelating Sepharose Fast Flow IDA Me <2+> (Pharmacia) as stationary phase is also reported, but also in this case, and also at low concentrations of imidazole in the eluent, there is a continuous release of metal and therefore the aforementioned disadvantages. ; Detailed description of the invention; The process according to the present invention allows the purification of CHO-rHU-IFN β on a large scale, obviating the above drawbacks thanks to the use of a strong or weak cationic stationary phase which allows to increase the pH of a solution of CHO-rHu-IFN β coming from a passage on a CPG column (therefore as said at acid pH), making it suitable for a passage on an MCC column, without any loss of interferon activity. The process according to the present invention provides a first purification stage on a chromatographic column packed with glass particles with controlled porosity (CPG). ; The supernatant from a CHO cell culture transformed with an expression vector containing the Hu-IFN β gene is first filtered, yielding a specific activity solution of 1 - 2 x 10 <5> iu / mg at a concentration of 1 -2 x 10 <5> iu / ml, then it is loaded on a CPG column at the linear flow rate of 1 - 3 cm / min and in a quantity equal to 30-70 x 10 <6> iu of CHO-rHu -IFN β per gram of stationary phase. The column is then subjected to the following washings: water, pH 7; NaCl; water. pH 7 The products which remained adsorbed after washing, including CHO-rHu-IFN β, are eluted with a solution of acetic acid at a concentration between 1 and 50 mM at a linear flow rate of O.25-I cm / min. ; After this step, a solution of CHO-rHu-IFN β is obtained at a concentration between 1 and 10 x 10 <6> iu / ml and a specific activity of 1-5 x 10 <7> iu / mg. ; The eluate of the CPG column with acetic acid is loaded onto a cation exchange column, for example CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) or CM-Fractogel (Merck), preconditioned with sodium acetate, pH 4.0, or with a solution diluted acetic acid, at the linear flow rate between 1 - 10 cm / min, in quantities ranging between 4 - 6 x 10 <8> per ml of stationary phase. ; The mixture of the products remaining adsorbed on the ion exchange column, including CHO-rHU-IFN β, is subsequently eluted with a high ionic strength solution containing NaCl> 0.2 M, sodium phosphate buffer pH 7 and possibly a complexing agent weak, such as imidazole (1- 12 mM), obtaining a solution of CHO-Hu-IFN β with a specific activity between 1 - 5 x 10 <7> iu / mg and a concentration between 10 - 40 x 10 < 6> iu / ml. ; This solution is loaded as it is, if it already contains the weak complexing agent, or with a possible addition of this weak complexing agent, in quantities such as to obtain a final concentration between 1 and 12 mM, on a column containing as stationary phase a polymeric resin capable of complexing metals, in which the complexing agent of the resin is, for example, iminodiacetic acid (IDA), such as Chelating Superose IDA-Me <2> +, at a linear flow rate between 1 and 3 cm / min and in quantities between 2.5 - 4 x 10 <9> iu / ml of stationary phase. With this charge eluent CHO-rHu-IFN β remains adsorbed, while most of the impurities are eluted away. Once the charge is complete, the MCC column is washed with a 15 mM solution of weak complexing agent, 0.5 M NaCl, 20 mM sodium phosphate buffer pH7. In this phase a quantity of CHO-rHu-IFN β <3% is eluted together with the last impurities adsorbed on MCC. If desired, this CH0-Hu-IFN fS can be recovered by adding it as such to a raw CHO culture before passing over the CPG column. Elution from the MCC column is carried out with a solution> 20 mM weak complexing agent up to a concentration compatible with the chromatographic conditions, 0.5 M NaCl, 20 mM sodium phosphate buffer pH J .Q. ; The interferon collected in the eluate appears to be homogeneous by RP-HPLC and SDS-PAGE analysis with a specific activity between 3 5 x 10 <8> iu / mg and at a concentration between 20 - 30 x 10 <6> iu / ml. ; If desired, it is possible to eliminate the weak complexing agent present in the eluate with the normal salt removal methods described in the literature such as molecular exclusion chromatography, ultrafiltration, etc. Alternatively, a convenient method is to elute the CH0-rHu IFN β from the MCC column with eluents containing the weak complexing agent at pH 4, make it adsorb on an ion exchange column identical to those used after chromatography with CPG, wash the column with H2O at pH 7 and finally elute the remaining adsorbed interferon with a solution of 0.15 M NaCl, 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7, suitable to be directly injectable. Human serum albumin is added to the eluted solution in quantities ranging from 0.1 to 1.0 mg per million units of lyophilisate. The product thus obtained is stable and suitable for the preparation of pharmaceutical products useful for the treatment of viral infections and tumors and as an immunomodulator. ; The antiviral activity of CHO-rHu-INF β is calculated based on the reduction of the cytopathic effect using the VSV virus (vescicular stomatitis virus) and the human cell line HT-10-80 [J.A. Armstrong, Meth in Enziomol. 78, p. 381 - 387 (1981)]. Experimental part ;; EXAMPLE 1; Purification of CHO-rHu-IFN β. ; 1000 1 of a solution of CHO-rHu-IFN β with a specific activity of 1x 10 <5> iu / mg and at a concentration of 120,000 iu / ml in CHO-rHU-IFN β, obtained from a culture on microcarrier of Chiron cell line CHOB-IFNg 454. derived from the transfection of the CH0 D x Bll line with the pSAD 2B IFNg 1 plasmid, it is loaded at the flow rate of 50 1 / h in a column (252 id x 50 mm) packed with the phase stationary CPG-500 (Electro Nucleonics) column volume (Ve) 2500 ml. ; Once the charge is complete, the column is washed with 3 Ve of water at pH 7, then with 3 Ve of a solution of 1.4 M NaCl and finally with 10 Ve of water at pH 7; wherein CHO-rHu-IFN B is eluted with 16 Ve of a solution of 5mM AcOH, pH3-2, at the flow rate of 12.51 / h. ; The latter eluate, collected in a single vessel and containing CHO-rHU-IFN | S at a concentration of 2.4 x 10 <6> iu / ml and with a specific activity of 1-3 x 10 <7> iu / mg, is loaded as is and at a flow rate of 1.251 / h on a column (100 id x 25 mm) packed with the stationary phase CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (Ve, 200 ml) preconditioned with an aqueous solution of acetic acid 5 oM. The column is then washed with 10 Ve of water, pH 7; All the products remaining adsorbed in the column, including CHO-rHu-INF β, are eluted with 30 Ve of a solution of 10 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mm sodium phosphate buffer, pH 7-This eluent phase, collected in a single vessel and containing CHO-rHu-IFN β at a concentration of 16 x 10 <6> iu / ml with a specific activity 1.5 x 10 <7> iu / mg, is loaded at a flow rate of 0.9 1 / h onto a column (35 id x 30 mm) packed with the stationary phase Chelating Superose IDA Cu <2> (Pharmacia) (Ve, 29 ml). The column is washed with 2 Ve of a 15 mM, 0.5 M NaCl imidazole solution. 20 mM sodium phosphate buffer pH 7-2.5 x 10 <7> iu / ml of CHO-rHu-IFN β were found in the eluate of this wash. ; CHO-rHu-IFN (S remained adsorbed after this last washing is eluted from the column with 100 Ve of a solution of imidazole 30 mM, 0.5 M NaCl, 20 mM sodium phosphate buffer at pH 7 The eluent is collected in a single vessel and contains pure CHO-rHu-IFN β> 98%, as determined by RP-HPLC and SDS-PAGE analysis with a specific activity of 3-8 x 10 <8> iu / mg and a concentration of 20 x 10 <6> iu / ml.; The overall yield of the purification process is 48.8%. The solution, after an addition of albumin in a quantity equal to 0.5 mg per million units, is lyophilized and stored at -20 <*> C.
ESEMPIO 2 EXAMPLE 2
Purificazione di CHO-rHu-IFN β e rimozione di imidazolo. Purification of CHO-rHu-IFN β and removal of imidazole.
Si procede in modo identico a quanto descritto nell'ESEMPIO 1 eccetto che l'eluizione di CHO-rHU IFN β dalla colonna Superose -IDA-Cu<2+ >è fatta con 100 Ve di una soluzione 30 mM imidazolo, 0.5 M NaCl, 20 mM tampone fosfato pH 4. L’eluato, raccolto in un unico recipiente con un'attività specifica 3-8 x 10<8 >e una concentrazione di 18,5 x 10<6 >iu/ml, è poi caricato alla velocità di flusso di 1,25 1/h in una colonna (100 id x 25 mm) impaccata con la fase stazionaria CM-Sepharose Fast Flow (Ve, 200 mi) . La colonna è quindi lavata con 10 Ve di H2O pH7 ed infine l'interferone rimasto adsorbito è eluito con 15 Ve di una soluzione di 0.15 M NaCl, 0,1 M tampone fosfato pH 7-0, alla velocità di flusso di 0.751/h. In quest 'ultima fase l'eluente è raccolto in un unico recipiente e contiene CHO-rHuIFN (S puro >98%, come determinato dall'analisi RP-HPLC e SDS-PAGE con un'attività specifica di 3-8 x 10<8 >iu/mg ed una concentrazione di 19 x 10<6 >iu/ml. We proceed in the same way as described in EXAMPLE 1 except that the elution of CHO-rHU IFN β from the Superose -IDA-Cu <2+> column is made with 100 Ve of a solution of 30 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM phosphate buffer pH 4. The eluate, collected in a single vessel with a specific activity 3-8 x 10 <8> and a concentration of 18.5 x 10 <6> iu / ml, is then loaded at the rate flow rate of 1.25 1 / h in a column (100 id x 25 mm) packed with the stationary phase CM-Sepharose Fast Flow (Ve, 200 ml). The column is then washed with 10 Ve of H2O pH7 and finally the remaining adsorbed interferon is eluted with 15 Ve of a solution of 0.15 M NaCl, 0.1 M phosphate buffer pH 7-0, at the flow rate of 0.751 / h . In this last step the eluent is collected in a single vessel and contains CHO-rHuIFN (pure S> 98%, as determined by RP-HPLC and SDS-PAGE analysis with a specific activity of 3-8 x 10 < 8> iu / mg and a concentration of 19 x 10 <6> iu / ml.
La resa globale del processo di purificazione è 46,4%. La soluzione dopo un'aggiunta di albumina in quantità pari a 0.5 mg per milióne di unità, è liofilizzata e conservata a -20°C. The overall yield of the purification process is 46.4%. The solution, after an addition of albumin in a quantity equal to 0.5 mg per million unit, is lyophilized and stored at -20 ° C.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02156490A IT1243418B (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Process for the purification of recombinant human beta- interferon, beta-interferon thus purified and pharmaceutical compositions which contain it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02156490A IT1243418B (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Process for the purification of recombinant human beta- interferon, beta-interferon thus purified and pharmaceutical compositions which contain it |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT9021564A0 IT9021564A0 (en) | 1990-09-25 |
| IT9021564A1 true IT9021564A1 (en) | 1992-03-25 |
| IT1243418B IT1243418B (en) | 1994-06-10 |
Family
ID=11183673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT02156490A IT1243418B (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Process for the purification of recombinant human beta- interferon, beta-interferon thus purified and pharmaceutical compositions which contain it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1243418B (en) |
-
1990
- 1990-09-25 IT IT02156490A patent/IT1243418B/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT9021564A0 (en) | 1990-09-25 |
| IT1243418B (en) | 1994-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101163297B1 (en) | Purification of pegylated polypeptides | |
| IL145381A (en) | Medical preparations for the treatment of alpha-galactosidase a deficiency | |
| NZ202190A (en) | Human immune interferon : production by recombinant dna technology | |
| CA2129533A1 (en) | Improved alpha interferon composition and method for its production from human peripheral blood leukocytes | |
| EP0118808B1 (en) | Purification of interferon | |
| US8779110B2 (en) | Purification of low isoelectric point isoforms of darbepoietin | |
| CN101260145B (en) | Technique for separating and purifying recombination human serum albumin and fusion protein thereof | |
| JPS5821691A (en) | Purifying method of interferon | |
| JPH0112760B2 (en) | ||
| US5244655A (en) | Process for the purification of recombinant human beta interferon, beta interferon thus purified and pharmaceutical compositions which contain it | |
| WO2011063195A2 (en) | Purification of modified cytokines | |
| CN101491682A (en) | PEG-IFN omega conjugate and preparation technique thereof | |
| KR100524872B1 (en) | Processes for the purification of interferon beta | |
| IT9021564A1 (en) | PROCESS FOR THE PURIFICATION OF HUMAN BETA-INTERFERONE RECOMBINANT BETA-INTERFERONE SO PURIFIED AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THAT CONTAIN IT. | |
| EP0328132B1 (en) | Therapeutic agent for thrombocytopenia | |
| US20070264710A1 (en) | Process for Purifying Human Thrombopoietin with High Content of Sialic Acid | |
| EP0446850B1 (en) | Process for purifying recombinant human beta-interferon | |
| KR100524871B1 (en) | Processes for the purification of interferon beta | |
| WO2005054287A1 (en) | Process for producing human interferon alpha | |
| WO2023024214A1 (en) | Method for purifying fusion protein of recombinant human serum albumin | |
| EP0985040A1 (en) | Preparation of glycosylated tumor necrosis factor | |
| JPH05186367A (en) | Therapeutic agent for hyperlipemia | |
| JPS6317898A (en) | Purification of lymphotoxin compound |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted | ||
| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19970427 |