IT8948555A1

IT8948555A1 - STABILIZATION AND MAINTENANCE OF THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE NERVOUS GROWTH FACTOR BY MEANS OF NATURAL GANGLIOSIDES OR THEIR DERIVATIVES.

Info

Publication number: IT8948555A1
Application number: IT1989A48555A
Authority: IT
Inventors: Valle Francesco Della; Aurelio Romeo; Lanfranco Callegaro; Alberta Leon
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1989-11-14
Filing date: 1989-11-14
Publication date: 1991-05-14
Also published as: NO904949L; FI905627A0; NO904949D0; HU907121D0; YU216290A; HU206632B; PT95885A; IT1238347B; ZA909121B; HUT56282A; IT8948555A0; PE24091A1; IE904099A1; NZ236075A; KR910009731A; IE68042B1; IL96345A0

Description

mento per la loro fabbricazione. ment for their manufacture.

BACKGROUND DELL'INVENZIONE BACKGROUND OF THE INVENTION

I gangliosidi, glicosfingolipidi contenenti acide sialico, sono normali costituenti di tutte le membrane cellulari dei mammiferi e si trovano con le pi? alta concentrazione nel tessuto nervoso. La localizzazione dei gangliosidi nello strato esterno della membrana piasmatica suggerisce che abbiano un ruolo importante nel riconoscimento, nella crescita e nella differenziazione cellulare. E' noto che la composizione di gangliosidi e altri glicolipidi coniugati della superficie cellulare cambia durante la differenziazione e la maturazione cellulare. Quattro gangliosidi GM1, GD1a, GD1b e GT1b costituiscono l?80-90% dei gangliosidi totali in un cervello umano normale. Gangliosides, glycosphingolipids containing sialic acid, are normal constituents of all mammalian cell membranes and are found with the pi? high concentration in the nervous tissue. The localization of gangliosides in the outer layer of the piasmatic membrane suggests that they play an important role in cell recognition, growth and differentiation. The composition of gangliosides and other conjugated cell surface glycolipids is known to change during cell differentiation and maturation. Four gangliosides GM1, GD1a, GD1b and GT1b make up 80-90% of the total gangliosides in a normal human brain.

Una molecola gangliosidica ? costituita da ur gruppo principale sialosiloligosaccaride idrofile e una parte ceramide idrofobica che consiste di una sfingosina acilata all?azoto con acidi grassi. I gangliosidi sono efficaci nel produrre cambiamenti plastici nei neuroni, inclusa la promozione della crescita neuritica in colture cellulari e la crescita assonica nel sistema nervoso centrale e periferico . A ganglioside molecule? consisting of a hydrophilic sialosyloligosaccharide main group and a hydrophobic ceramide part consisting of a nitrogen acylated sphingosine with fatty acids. Gangliosides are effective in producing plastic changes in neurons, including promoting neuritic growth in cell cultures and axon growth in the central and peripheral nervous systems.

Diventa sempre pi? evidente che non solo lo sviluppo ma anche la riparazione del sistema nervoso sono controllati da segnali extracellulari agenti sulle molecole della superficie cellulare. Becomes more and more? It is evident that not only the development but also the repair of the nervous system are controlled by extracellular signals acting on the molecules of the cell surface.

Nonostante studi dettagliati sulla manifestazione e funzione dei glicolipidi sulla superficie cellulare neuronaie siano ancora agli inizi, i gangliosidi sembrano avere un ruolo preminente nella regolazione sia dello sviluppo che della riparazione neuronali. Durante lo sviluppo, le caratteristiche dei gangliosidi cerebrali subiscono evidenti cambiamenti, sia quantitativi che qualitativi. E' stato riportato che la somministrazione dei gangliosidi in vivo facilita la rigenerazione nervosa e la guarigione funzionale del sistema nervoso periferico (SNP) dopo una malattia (Ceccarelli B. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 71:275, Plenum Press, New York, 1976; Gorio A. et al. Neuroscience 8:417, 1983). E* stato anche riportato che la somministrazione dei gangliosidi, in particolare del monosialoganglioside GM1, (terminologia secondo Svennerholm J. Neurochemistry 10, 613, 1963), migliora le conseguenze del danno al sistema nervoso centrale (SNC) (Toffano G. et al.. Brain Res. Although detailed studies on the manifestation and function of glycolipids on the neuronal cell surface are still in their infancy, gangliosides appear to play a prominent role in regulating both neuronal development and repair. During development, the characteristics of cerebral gangliosides undergo noticeable changes, both quantitative and qualitative. In vivo administration of gangliosides has been reported to facilitate nerve regeneration and functional healing of the peripheral nervous system (PNS) after illness (Ceccarelli B. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 71: 275, Plenum) Press, New York, 1976; Gorio A. et al. Neuroscience 8: 417, 1983). It has also been reported that the administration of gangliosides, in particular the monosialoganglioside GM1, (terminology according to Svennerholm J. Neurochemistry 10, 613, 1963), improves the consequences of damage to the central nervous system (CNS) (Toffano G. et al. Brain Res.

261:163, 1983; Cuello A.C. et al., Dev. Brain Res 376:373, 1986). Varie recenti osservazioni indicano che i gangliosidi possono avere una funzione modulatoria nella regolazione dell?attivit? di fattori neuronotrofici in vitro. Ad esempio, ? stato riportato che il ganglioside GM1 somministrato esogenamente ? in grado di potenziare la crescita, stimolata dal fattore di crescita nervoso (NGF), di assoni in cellule PC-12 (Matta S.G et al., Dev. Brain Res., 27:243, 1986) e, analogamente, il GM1 potenzia la crescita neuritica, indotta dall'NGF, di neuroni gangliari di origine embrionica dorsale e gangli simpatetici (Skaper S.D. et al., Int. J. Dev. Neurosci. 3:187, 1985; Skaper S.D. et al., Dev. Brain Res. 23:19, 1985). Di recente sono stati intrapresi studi per valutare la possibilit? che il GM1 in vivo influenzi l'attivit? dell'NGF (Cuello A.C. et al., in: A new intramembrane integrative mechanism 62, Kjell Kuxe and L. Agnati Editore, 1987). I risultati di questi studi suggeriscono che il fattore neuronotrofico NGF abbia presumibilmente un ruolo primario nel mantenimento della sopravvivenza cellulare in seguito a malattie del sistema nervoso centrale In modo interessante ? stato riportato che il trattamento con GM1 facilita la sopravvivenza della cellula neuronaie, non solo dei neuroni dopaminergici e noradrenergici, ma anche dei neuroni colinergici noti essere rispondenti all'NGF. 261: 163, 1983; Cuello A.C. et al., Dev. Brain Res 376: 373, 1986). Various recent observations indicate that gangliosides may have a modulatory function in the regulation of activity? of neuronotrophic factors in vitro. For example, ? GM1 ganglioside has been reported exogenously administered? able to enhance the growth, stimulated by nerve growth factor (NGF), of axons in PC-12 cells (Matta S.G et al., Dev. Brain Res., 27: 243, 1986) and, similarly, GM1 enhances NGF-induced neuritic growth of dorsal embryonic ganglion neurons and sympathetic ganglia (Skaper S.D. et al., Int. J. Dev. Neurosci. 3: 187, 1985; Skaper S.D. et al., Dev. Brain Res . 23:19, 1985). Studies have recently been undertaken to evaluate the possibility? that the GM1 in vivo influences the activity? of the NGF (Cuello A.C. et al., in: A new intramembrane integrative mechanism 62, Kjell Kuxe and L. Agnati Editore, 1987). The results of these studies suggest that the neuronotrophic factor NGF presumably plays a primary role in maintaining cell survival following central nervous system disease. Interestingly? GM1 treatment has been reported to facilitate neuronal cell survival, not only of dopaminergic and noradrenergic neurons, but also of cholinergic neurons known to be responsive to NGF.

L?assoluta necessit? dell'NGF per la sopravvivenza dei neuroni simpatetici e l'appropriata innervazione a bersaglio durante lo sviluppo costituisce la principale evidenza del ruolo trofico essenziale di questo fattore di crescita sulle sue cellule bersaglio. E' stata riscontrata una notevole correlazione tra i livelli di NGF e la distribuzione di neuroni colinergici magnocellulari. Sono stati riscontrati livelli relativamente alti di NGF nel range di quelli osservati nel tessuto simpatico periferico notato come bersaglio sia nelle regioni innervate dai neuroni colinergici magnocellulari che nelle regioni contenenti i loro corpi cellulari, come l'ippocampo. Questa relazione fra l'integrit? del sistema colinergico proencefalico basale e la funzione cognitiva potrebbe valere anche nel caso dell'uomo. Una delle principali caratteristiche neuropatologiche del morbo di Alzheimer ? rappresentata dalla perdita drastica di neuroni colinergici magnocellulari, sebbene altri sistemi trasmettitoriali subiscano varie mutazioni. Perci? gli eventuali legami fra l'NGF e la fisiopatologia e la potenziale terapia per il morbo di Alzheimer sono ora da considerare .in maniera reale. The absolute necessity? of NGF for the survival of sympathetic neurons and the appropriate target innervation during development constitutes the main evidence of the essential trophic role of this growth factor on its target cells. A remarkable correlation was found between NGF levels and the distribution of magnocellular cholinergic neurons. Relatively high levels of NGF were found in the range of those observed in peripheral sympathetic tissue noted as targets both in regions innervated by magnocellular cholinergic neurons and in regions containing their cell bodies, such as the hippocampus. This relationship between integrity? of the basal forebrain cholinergic system and cognitive function could also apply to humans. One of the main neuropathological features of Alzheimer's disease? represented by the drastic loss of magnocellular cholinergic neurons, although other transmission systems undergo various mutations. So? the possible links between NGF and pathophysiology and the potential therapy for Alzheimer's disease are now to be considered in a real way.

La possibilit? di produrre NGF umano con metodi biotecnologici del DNA ricombinante ? il prerequisito per un'indagine sperimentale. Per quanto riguarda le conseguenze terapeutiche, i benefici in seguito a lesioni sperimentali del sistema colinergico suggeriscono che un aumento nella disponibilit? di NGF per questi neuroni, sia tramite applicazione esogena che tramite stimolazione della produzione endogena possa essere sostanziale. Lo sviluppo dei metodi biotecnologici ha messo a disposizione un numero crescente di proteine e loro peptidi con potenziali usi terapeutici. Queste macromolecole presentano particolari e complessi problemi di somministrazione del farmaco. Per ora, la sola soluzione per la somministrazione sistemica di questi polipeptidi farmacologicamente attivi ? l'iniezione subcutanea o intramuscolare o intracranica, in particolare per l'NGF. Regimi di trattamento che richiedono pi? iniezioni giornaliere o settimanali presentano vari svantaggi, compresi i bassi livelli di accondiscendenza da parte dei pazienti e farmacocinetiche sfavorevoli, in particolare per le terapie di sostituzione delle proteine. Uno degli scopi della ricerca in questo campo ? lo sviluppo di metodi chimici per aumentare la stabilit? delle proteine, senza perdita di attivit? biologica. La tecnologia dei liposomi ha sviluppato vari prodotti biologici. Tuttavia questi prodotti biologici presentano vari problemi, come la scarsa specificit? delle sostanze chimiche utilizzate nell'intrappolamento delle proteine, la loro aspecifica interazione in vivo con gli organi, la scarsa riproducibilit? lotto a lotto di questi complessi e la mancanza di cognizione delle farmacocinetiche dei composti chimici utilizzati nel-1 'intrappolamento delle proteine. The possibility? to produce human NGF by biotechnological methods of recombinant DNA? the prerequisite for an experimental investigation. As for the therapeutic consequences, the benefits following experimental lesions of the cholinergic system suggest that an increase in availability? of NGF for these neurons, both through exogenous application and through stimulation of endogenous production can be substantial. The development of biotechnological methods has made available an increasing number of proteins and their peptides with potential therapeutic uses. These macromolecules present particular and complex problems of drug administration. For now, the only solution for the systemic administration of these pharmacologically active polypeptides? subcutaneous or intramuscular or intracranial injection, especially for NGF. Treatment regimes that require more? daily or weekly injections have various disadvantages, including low levels of patient compliance and unfavorable pharmacokinetics, particularly for protein replacement therapies. One of the aims of the research in this field? the development of chemical methods to increase stability? of proteins, without loss of activity? biological. Liposome technology has developed various biological products. However, these organic products have various problems, such as low specificity? of the chemicals used in the trapping of proteins, their non-specific interaction in vivo with organs, the poor reproducibility? batch by batch of these complexes and the lack of knowledge of the pharmacokinetics of the chemical compounds used in protein entrapment.

Valutando i problemi e la potenziale applicazione farmaceutica del fattore neuronotrofico da un lato e l'attivit? biologica in vivo dei gangliosidi dall'altro lato, ? stato possibile approntare un complesso stabile dei due composti, biologicamente attivo, rispondente a quelle esigenze di specificit?, stabilit? e biodisponibilit? selettiva sopra messe in risalto. Tali qualit? si possono mettere in evidenza in modelli sperimentali di tipo cellulare e animali. By evaluating the problems and the potential pharmaceutical application of the neuronotrophic factor on the one hand and the activity? biological in vivo of gangliosides on the other hand,? was it possible to prepare a stable complex of the two compounds, biologically active, responding to those needs of specificity, stability? and bioavailability? selective over emphasis. Such qualities? they can be highlighted in experimental cellular and animal models.

La presente invenzione riguarda perci? in prima linea dei complessi tra la subunit? 0 del fattore neuronotrofico NGF e un ganglioside naturale o un analogo semisintetico di un ganglioside, ottenibile per la messa a contatto dei due componenti sciolti in un mezzo acquoso a temperatura ambiente in ambiente leggermente alcalino. Il rapporto in peso tra le due componenti pu? variare entro ampi limiti, di preferenza tra 1:100.000 e 1:10 di fattore neuronotrofico e ganglioside. Entro tali limiti hanno particolare importanza quei complessi con un rapporto neuronotrofico:ganglioside di 1:1000. The present invention therefore relates to? in the forefront of the complexes between the subunit? 0 of the neuronotrophic factor NGF and a natural ganglioside or a semisynthetic analogue of a ganglioside, obtainable by putting the two components dissolved in an aqueous medium at room temperature in a slightly alkaline environment into contact. The weight ratio between the two components can? vary within wide limits, preferably between 1: 100,000 and 1:10 of neuronotrophic factor and ganglioside. Within these limits, complexes with a neuronotrophic: ganglioside ratio of 1: 1000 are of particular importance.

La subunit? 0 del fattore di crescita nervoso (0NGF) da usarsi secondo la presente invenzione pu? essere isolata da tessuti umani o animali, per esempio da mammiferi, o da brodi di coltura cellulare nel caso di impiego di 0NGF umano ottenuto mediante la tecnica del DNA ricombinante: si usano di preferenza preparati ottenuti da tessuti placentali umani o dal liquido seminale bovino. Il 0NGF pu? per? anche essere preparato attraverso tecniche di biologia molecolare, per esempio con le tecnologie del DNA ricombinante. The subunit? 0 of the nerve growth factor (0NGF) to be used according to the present invention can? be isolated from human or animal tissues, for example from mammals, or from cell culture broths in the case of use of human 0NGF obtained by the recombinant DNA technique: preparations obtained from human placental tissues or from bovine seminal fluid are preferably used. The 0NGF can? for? also be prepared through molecular biology techniques, for example with recombinant DNA technologies.

I nuovi complessi, secondo la presente invenzione, possiedono lo stesso tipo di attivit? biologica del fattore di crescita fiNGF, come pu? essere dimostrato per esempio da esperimenti condotti in vitro su una linea cellulare PC-12. Essi possono quindi venire usati terapeuticamente in tutti i casi in cui giovano preparati a base di fiNGF, per esempio nell'invecchiamento del sistema nervoso. I nuovi complessi possono d'altronde anche essere usati terapeuticamente o profilatticamente laddove pu? essere indicata l'azione propria dei gangliosidi i cui nuovi complessi pure mantengono l?attivit?, per esempio l'attivit? immunochimica, come si pu? notare per esempio nell'azione del complesso fiNGF con il ganglioside GM1 contro gli anticorpi policlonali anti GM1. The new complexes, according to the present invention, possess the same type of activity? biological growth factor fiNGF, how can? be demonstrated for example by in vitro experiments on a PC-12 cell line. They can therefore be used therapeutically in all cases where fiNGF-based preparations are beneficial, for example in the aging of the nervous system. On the other hand, the new complexes can also be used therapeutically or prophylactically wherever it can? be indicated the action of the gangliosides whose new complexes also maintain the activity, for example the activity? immunochemistry, how can you? note for example in the action of the fiNGF complex with GM1 ganglioside against anti GM1 polyclonal antibodies.

L'attivit? biologica dei nuovi complessi fiNGF-gangliosidi e loro derivati pu? essere dimostrata su animali da esperimento come descritto nell'esempio 1 per il caso del complesso fiNGF-GM1. The activity? biology of the new fiNGF-ganglioside complexes and their derivatives pu? be demonstrated on experimental animals as described in Example 1 for the case of the fiNGF-GM1 complex.

Analoghi semisintetici gangliosidi sono per esempio derivati funzionali, come esteri o amidi dei gruppi carbossilici sialici, descritti per esempio nel brevetto USA 4,713,374 del 15/12/1987, esteri interni, come quelli descritti nel brevetto USA 4,593,091 e nel brevetto europeo 0072722. Inoltre sono derivati funzionali i derivati peracilati ai gruppi idrossilici sialici, saccaridici ed eventualmente ceramidici pure descritti nel suddetto brevetto USA 4,713,374..Analoghi semisintetici dei gangliosidi sono i cosidetti lisogangliosidi, cio? gangliosidi deacilati all'azoto sfingosinico e o de-N-acetil-gangliosidi e -lisogangliosidi, in cui ? deacilato anche l'azoto del residuo neuraminico, inoltre derivati analoghi ai gangliosidi in cui al posto dei gruppi acilici derivati da acidi grassi superiori, come il paimitico o lo stearico, figurano gruppi acilici derivanti da qualsiasi altro acido della serie alifatica o aromatica o aliciclica o eterociclica, eventualmente anche sostituiti da gruppi funzionali, in modo speciale da gruppi polari. In altri analoghi semisintetici possono essere presenti, oltre ai gruppi acilici "non naturali? ora menzionati, anche gruppi acilici diversi dal gruppo acetilico all'azoto neuramico. Tutti questi composti e i loro derivati funzionali come esteri, amidi esteri interni e derivati peracilati sono conosciuti e/o descritti nei brevetti US 4,593,091, US 4,476,119, US 4,716,223, EP 0072722 e nella corrispondente domanda italiana depositata il 28.07.82 con n. 48898A/82, dal titolo "Metodo per la preparazione di derivati gangliosidici e loro uso in preparazioni farmaceutiche"; nei brevetti IT 1199116, US 4,713,374 e US 4,849,113 e nella corrispondente domanda europea depositata il 26.06.85 con n. 85401291.1, dal titolo "Nuovi derivati di gangliosidi"; nelle domande italiane di brevetto dal titolo "Nuovi derivati di lisogangliosidi" , (dep. 02.12.88 con n. 48618A88), "Analoghi semisintetici di gangliosidi", (dep. Semisynthetic analogues of gangliosides are for example functional derivatives, such as esters or amides of the sialic carboxylic groups, described for example in US patent 4,713,374 of 12/15/1987, internal esters, such as those described in US patent 4,593,091 and in European patent 0072722. Furthermore they are functional derivatives the peracylated derivatives with sialic, saccharide and possibly ceramide hydroxyl groups also described in the aforementioned US patent 4,713,374. nitrogen deacylated gangliosides sphingosine and or de-N-acetyl-gangliosides and -lysogangliosides, in which? also deacylated the nitrogen of the neuraminic residue, moreover derivatives analogous to gangliosides in which instead of acyl groups derived from higher fatty acids, such as paimitic or stearic, there are acyl groups deriving from any other acid of the aliphatic or aromatic or alicyclic series or heterocyclic, possibly also replaced by functional groups, especially by polar groups. In other semisynthetic analogs, in addition to the "non-natural" acyl groups just mentioned, acyl groups other than the acetyl group to the neuramic nitrogen may also be present. All these compounds and their functional derivatives such as esters, internal starch esters and peracylated derivatives are known and / or described in patents US 4,593,091, US 4,476,119, US 4,716,223, EP 0072722 and in the corresponding Italian application filed on 28.07.82 with no. 48898A / 82, entitled "Method for the preparation of ganglioside derivatives and their use in pharmaceutical preparations" ; in the patents IT 1199116, US 4,713,374 and US 4,849,113 and in the corresponding European application filed on 26.06.85 with n. 85401291.1, entitled "New derivatives of gangliosides"; in the Italian patent applications entitled "New derivatives of lysogangliosides", ( dep. 02.12.88 with n. 48618A88), "Semisynthetic analogues of gangliosides", (dep.

27.07.89 con n. 4B246A89), "Nuovi derivati di dilisogangliosidi " (dep. 27.07.89 con n. 48247A89) e "Gangliosidi modificati e loro derivati funzionadep. 14 nov 1983 con n. 48554A89). 27.07.89 with n. 4B246A89), "New derivatives of dilisogangliosides" (dep. 27.07.89 with n. 48247A89) and "Modified gangliosides and their functional derivatives. Dep. 14 Nov 1983 with n. 48554A89).

I gangliosidi che servono di base per la preparazione dei nuovi complessi sono di preferenza quelli scelti dal gruppo formato dai gangliosidi sopramenzionati costituenti la maggior parte di quelli cerebrali, e cio? GM1, GD1a, GD1b e GT1b. Anche i suddetti derivati funzionali e gli analoghi semisintetici derivano soprattutto da questi gangliosidi . The gangliosides that serve as basis for the preparation of the new complexes are preferably those chosen from the group formed by the aforementioned gangliosides making up the majority of the cerebral ones, and that is to say? GM1, GD1a, GD1b and GT1b. The above functional derivatives and the semisynthetic analogues also derive mainly from these gangliosides.

Sono da mettere in risalto particolarmente i complessi derivanti dai seguenti esteri e amidi del ganglioside GM1, gli esteri alifatici derivanti da alcoli con un massimo di 8 atomi di carbonio, come per esempio l'acool metilico, etilico, propilico, isopropilico, gli alcoli butilici, amilici e gli alcoli esilici, come alcool esilico normale e l'alcool ottilico normale, le amidi alifatiche derivanti da amine con un massimo di 8 atomi di carbonio, come per esempio metilamina, etilamina, propilamina, esilamina o ottilamina. The complexes deriving from the following esters and starches of GM1 ganglioside, aliphatic esters deriving from alcohols with a maximum of 8 carbon atoms, such as for example methyl, ethyl, propyl, isopropyl alcohol, butyl alcohols , amyl and hexyl alcohols, such as normal hexyl alcohol and normal octyl alcohol, aliphatic starches derived from amines with up to 8 carbon atoms, such as methylamine, ethylamine, propylamine, hexylamine or octylamine.

Fra i derivati peracilati agli idrossili gangliosidici sono da menzionare in particolare gli acetati, i propionati, i butirrati, i valerianati, i succinati, i maionati. Among the peracylated derivatives to the ganglioside hydroxyls, acetates, propionates, butyrates, valerianates, succinates and mayionates should be mentioned in particular.

Il procedimento di preparazione dei nuovi complessi tra le dette proteine e i gangliosidi o i loro derivati consiste essenzialmente nel porre a contatto le due componenti in soluzione acquosa, in presenza o meno di altri solventi organici, come ad esempio alifatici inferiori o chetoni inferiori o dialchilaminati inferiori o solfossidi, cio? temperatura ambiente o un poco sopraelevata, per esempio a 50?C, e in mezzo leggermente alcalino, per esempio in presenza di basi inorganiche o organiche, come in modo speciale l'ammoniaca, o le amine alifatiche inferiori, o idrati alcalini o alcalino-terrosi o i corrispondenti carbonati o acetati. In tali condizioni si formano evidentemente i sali dei gangliosidi che essendo solubili in acqua contribuiscono a facilitare la reazione di condensazione. Anche la proteina (fattore neuronotrofico) pu? essere.sciolta in un solvente acquoso, come un acetato alcalino, o pu? anche essere sospesa nella soluzione del ganglioside. La durata di reazione varia da alcune ore fino ad alcuni giorni, ma ? di regola di circa 12-24 ore. Il complesso tra proteina e derivato gangliosidico pu? essere isolato dalla miscela di reazione con tecniche di per s? conosciute, come quelle illustrate nell'esempio 1, e pu? essere individuato, soprattutto mediante la sua attivit? biologica e il riconoscimento immunochimico con anticorpi monoclonali e policlonali specifici per la proteina, sistemi di sedimentazione mediante ultracentrifugazione. The preparation process of the new complexes between said proteins and gangliosides or their derivatives essentially consists in putting the two components in contact in aqueous solution, in the presence or absence of other organic solvents, such as lower aliphatics or lower ketones or lower dialkylaminates or sulfoxides, that is? room temperature or a little elevated, for example at 50 ° C, and in slightly alkaline medium, for example in the presence of inorganic or organic bases, especially ammonia, or lower aliphatic amines, or alkaline or alkaline hydrates. earthy or the corresponding carbonates or acetates. Under these conditions, the salts of the gangliosides are evidently formed which, being soluble in water, help to facilitate the condensation reaction. Even the protein (neuronotrophic factor) can? be dissolved in an aqueous solvent, such as an alkaline acetate, or it can also be suspended in the ganglioside solution. The duration of the reaction varies from a few hours to a few days, but? usually around 12-24 hours. The complex between protein and ganglioside derivative can? be isolated from the reaction mixture by techniques per se? known, such as those illustrated in example 1, and can? be identified, especially through its activity? biological and immunochemical recognition with monoclonal and polyclonal antibodies specific for the protein, sedimentation systems by ultracentrifugation.

Oggetto della presente invenzione sono pure le preparazioni farmaceutiche comprendenti come sostanze attive uno o pi? dei nuovi complessi tra unit? ? del fattore neuronotrofico e un gangliosi de o uno dei suoi derivati o analoghi semisintetici sopra menzionati, e in particolare quelli messi in rilievo. Tali preparazioni farmaceutiche possono essere destinate all'uso orale, rettale, parentale, locale. Esse sono quindi in forma solida o semisolida, per esempio confetti, compresse, opercoli gelatinosi, capsule, supposte, capsule di gelatina molle. Per l?uso parentale si possono usare forme predestinate alla somministrazione intramuscolare, sottocutanea o atte a infusioni o iniezioni endovenose o intracerebrali e si possono quindi presentare come soluzioni dei composti attivi e come polveri liofilizzate dei composti attivi da unirsi ad uno o pi? recipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico e convenienti per gli usi suddetti e di osmolarit? compatibile con i liquidi fisiologici. Per l'uso locale entrano in considerazione preparazioni in forma di spray, per esempio spray nasali, creme o unguenti per uso topico. The object of the present invention are also pharmaceutical preparations comprising as active substances one or more? of the new complexes between units? ? of the neuronotrophic factor and a gangliosis of or one of its derivatives or semisynthetic analogues mentioned above, and in particular those highlighted. Such pharmaceutical preparations can be intended for oral, rectal, parental, local use. They are therefore in solid or semi-solid form, for example sugared almonds, tablets, gelatinous capsules, capsules, suppositories, soft gelatin capsules. For parental use, it is possible to use forms predestined for intramuscular, subcutaneous administration or suitable for intravenous or intracerebral infusions or injections and can therefore be presented as solutions of the active compounds and as lyophilized powders of the active compounds to be joined to one or more? containers or diluents acceptable from the pharmaceutical point of view and convenient for the above uses and osmolarity? compatible with physiological fluids. For local use, preparations in the form of sprays, for example nasal sprays, creams or ointments for topical use, are considered.

Le preparazioni dell'invenzione possono essere destinate alla somministrazione all?uomo e all'animale. Esse contengono di preferenza da 0.01% al 10% di componente attivo per le.soluzioni, gli spray, gli unguenti e le creme e dall'1% al 100% e preferibilmente da 5% al 50% del composto attivo per i preparati in forma solida. Il dosaggio da somministrarsi dipender? dall'indicazione, dall?effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta. The preparations of the invention can be intended for administration to humans and animals. They preferably contain from 0.01% to 10% of active component for solutions, sprays, ointments and creams and from 1% to 100% and preferably from 5% to 50% of the active compound for preparations in form solid. The dosage to be administered will depend? the indication, the desired effect and the chosen route of administration.

L'invenzione comprende pure l'uso terapeutico di tutti i nuovi complessi dei gangliosidi o dei derivati con l'unit? ? del fattore di crescita neuronotrofico NGF per le indicazioni gi? sopra menzionate. I dosaggi giornalieri all'uomo per via iniettiva (sottocutanea o intramuscolare o intracerebrale) variano da 0.05 mg a 5 mg di sostanza attiva per kg di peso corporeo. The invention also includes the therapeutic use of all new ganglioside complexes or derivatives with the unit? ? of the neuronotrophic growth factor NGF for the indications already? mentioned above. Human daily dosages by injection (subcutaneous or intramuscular or intracerebral) vary from 0.05 mg to 5 mg of active substance per kg of body weight.

I seguenti esempi illustrano la preparazione dei nuovi composti, il procedimento per la loro preparazione, le preparazioni farmaceutiche e il loro uso. The following examples illustrate the preparation of the new compounds, the process for their preparation, the pharmaceutical preparations and their use.

ESEMPIO 1 EXAMPLE 1

MATERIALI E METODI MATERIALS AND METHODS

L'NGF murino (subunit? ?) viene purificato secondo il metodo descritto in Angeletti P.V. et al., Nati. Acad. Sci. USA 64 , 787, 1969. Studi in vitro vengono condotti usando cellule fetali "dissociate" da radice di ganglio dorsale di pollo E8 (DRG E-8), come descritto in Skaper S.D. et al., Exp. Neurol. The murine NGF (subunit?) Is purified according to the method described in Angeletti P.V. et al., born. Acad. Sci. USA 64, 787, 1969. In vitro studies are performed using fetal cells "dissociated" from chicken dorsal ganglion root E8 (DRG E-8), as described in Skaper S.D. et al., Exp. Neurol.

76:655, 1982. Lo studio degli anticorpi NGF, prodotti contro NGF murino, per l?inibizione dell?attivit? biologica dell'NGF (subunit? ?), viene valutato usando il modello in vitro sopra menzionato. L'immunoreattivit? del GM1, dell'NGF (subunit? B) e del complesso GM1-NGF (subunit? B) ? misurata tramite tecnica di immunoblot. 76: 655, 1982. The study of NGF antibodies, produced against murine NGF, for the inhibition of activity? biological analysis of the NGF (subunit?), is evaluated using the in vitro model mentioned above. Immunoreactivity? of the GM1, of the NGF (subunit? B) and of the GM1-NGF complex (subunit? B)? measured by immunoblot technique.

Anticorpi policlonali NGF contro NGF murino (subunit? B) sono purificati tramite cromatografia per affinit? usando NGF murino 2,5S legato a Sepharose 4B come descritto in K. Stoeckel et al., J. Neurochem. 26:1207, 1976. Polyclonal NGF antibodies against murine NGF (subunit B) are purified by affinity chromatography. using 2.5S murine NGF bound to Sepharose 4B as described in K. Stoeckel et al., J. Neurochem. 26: 1207, 1976.

Anticorpi policlonali GM1 contro il monosialoganglioside GM1 sono purificati tramite cromatografia per affinit? con GM1 immobilizzato su Sepharose 4B. La sedimentazione isopicnica dell'NGF (subunit? B) e dei complessi gangliosidici viene condotta come descritto in Ulrich-Bott B. et al., Journal of Lipid Research 25* 1233, 1984. GM1 polyclonal antibodies against GM1 monosialoganglioside are purified by affinity chromatography. with GM1 immobilized on Sepharose 4B. The isopycnic sedimentation of NGF (subunit B) and ganglioside complexes is carried out as described in Ulrich-Bott B. et al., Journal of Lipid Research 25 * 1233, 1984.

Il monosialoganglioside GM1 (ad esempio 50 mg) viene sciolto in CHCl3/MeOH (rapporto 2:1). Il solvente ? quindi evaporato con flusso di azoto. Il monosialoganglioside GM1 ? stato risospeso in 50 mM NH4OH, pH 8,5 per un'ora. La concentrazio ne di monosialoganglioside GM1, per esempio a 10 mg/ml, ed NGF (subunit? B) murino altamente purificato, ? stata sciolta in 50 mM di acetato di sodio, pH 5,0, e tenuta in incubazione per ottenere un rapporto in peso BNGF-GM1 di 1:1000. La miscela ? stata tenuta in incubazione a pH 8,5 sotto agitazione magnetica, per esempio per tutta la notte a temperatura ambiente. Gli stessi risultati sono stati ottenuti a 4?C. Il complesso biologico BNGF-GM1 ? stato purificato dal BNGF non reagito tramite cromatografia a scambio anionico, per esempio su una colonna analitica Mono Q ed equilibrato con 50 mM NH4OH, pH 8,5. L'eluzione del complesso BNGF-GM1 ? stata eseguita usando un acetato di ammonio con gradiente 0-1,0 M in 50mM NH4OH, pH 8,5. La portata del flusso ? risultata di lml/min. GM1 monosialoganglioside (e.g. 50 mg) is dissolved in CHCl3 / MeOH (ratio 2: 1). The solvent? then evaporated with nitrogen flow. GM1 monosialoganglioside? was resuspended in 50 mM NH4OH, pH 8.5 for one hour. The concentration of GM1 monosialoganglioside, for example at 10 mg / ml, and highly purified murine NGF (subunit B),? was dissolved in 50 mM of sodium acetate, pH 5.0, and incubated to obtain a BNGF-GM1 weight ratio of 1: 1000. The mixture ? was incubated at pH 8.5 under magnetic stirring, for example overnight at room temperature. The same results were obtained at 4 ° C. The biological complex BNGF-GM1? been purified from unreacted BNGF by anion exchange chromatography, for example on a Mono Q analytical column and equilibrated with 50 mM NH4OH, pH 8.5. The elution of the BNGF-GM1 complex? was performed using a 0-1.0 M gradient ammonium acetate in 50mM NH4OH, pH 8.5. The extent of the flow? result of lml / min.

11 BNGF non reagito ? stato eluito con il volume libero. Il complesso 11 BNGF not reacted? been eluted with the free volume. The complex

BNGF-GM1 ? stato eluito in un range di 15-18 minu ti con una concentrazione di 0,15-0,25 M di acetato di ammonio. In queste condizioni sperimentali 12 microgrammi di NGF (subunit? B) sono stati legati a 1 mg di monosialoganglioside GM1. BNGF-GM1? was eluted over a range of 15-18 minutes with a concentration of 0.15-0.25 M ammonium acetate. Under these experimental conditions 12 micrograms of NGF (subunit B) were linked to 1 mg of GM1 monosialoganglioside.

Le caratteristiche chimiche, immunochimiche e biologiche del complesso BNGF-GM1 sono state valutate in vitro come segue: The chemical, immunochemical and biological characteristics of the BNGF-GM1 complex were evaluated in vitro as follows:

a) il complesso purificato BNGF-GM1 ha mantenuto nella tecnica di immunoblot 1?immunoreattivit? contro gli anticorpi policlonali purificati prodotti contro l'NGF murino (subunit? ?) (Fig. 1)? a) the purified BNGF-GM1 complex maintained in the immunoblot technique 1? immunoreactivit? against purified polyclonal antibodies produced against murine NGF (subunit?) (Fig. 1)?

b) Il complesso purificato fiNGF-GMl ha mostrato un'attivit? biologica sul DRG-E8. b) The purified fiNGF-GM1 complex showed an activity? biological on the DRG-E8.

c) L?attivit? biologica del complesso fiNGF-GMl ? stata inibita dagli anticorpi policlonali purificati per affinit? alla concentrazione di 60 ?g/ml e dall'anticorpo monoclonale alla concentrazione di 500 ?g/ml. c) The activity? biology of the fiNGF-GM1 complex? been inhibited by affinity purified polyclonal antibodies? at the concentration of 60? g / ml and by the monoclonal antibody at the concentration of 500? g / ml.

L'attivit? biologica del fiNGF senza GM1 ? stata inibita dagli anticorpi policlonali purificati per affinit? alla concentrazione di 30 ?g/ml e dall'anticorpo monoclonale alla concentrazione di 100 ?g/ml. The activity? biology of fiNGF without GM1? been inhibited by affinity purified polyclonal antibodies? at the concentration of 30? g / ml and by the monoclonal antibody at the concentration of 100? g / ml.

d) Per mezzo della tecnica di immunoblot, la stessa banda, correlata con il complesso fiNGF-GMl biologicamente attivo, ha mostrato una reattivit? oltre che contro anticorpi policlonali prodotti sia contro l'NGF (subunit? fi) anche contro il monosialoganglioside GM1. d) By means of the immunoblot technique, the same band, correlated with the biologically active fiNGF-GM1 complex, showed a reactivity? as well as against polyclonal antibodies produced both against NGF (subunit? fi) also against GM1 monosialoganglioside.

e) L'attivit? biologica valutata sul DRG-E8 del fiNGF-GMl, ? stata mantenuta dopo l'incubazione del fiNGF-GMl sia in un tampone a basso pH sia alla presenza di ioni bivalenti (ad esempio, 40 mM CaCl2)? e) The activity? biological evaluated on the DRG-E8 of fiNGF-GMl,? been maintained after the incubation of fiNGF-GM1 both in a low pH buffer and in the presence of divalent ions (e.g. 40 mM CaCl2)?

f) La stabilit? del complesso BNGF-GM1 ? stata mantenuta in presenza di siero umano, a 37?C per 96 ore. f) The stability of the BNGF-GM1 complex? was kept in the presence of human serum at 37 ° C for 96 hours.

g) L'attivit? biologica del complesso BNGF-GM1 ? stata mantenuta dopo digestione con enzima proteolitico (ad esempio, pepsina al 2%, w/w, per 16 ore, pH 2,0 a temperatura ambiente). Nelle stesse condizioni l'enzima proteolitico aveva distrutto l'attivit? del BNGF senza GM1. g) The activity? biology of the BNGF-GM1 complex? was maintained after digestion with proteolytic enzyme (e.g., 2% pepsin, w / w, for 16 hours, pH 2.0 at room temperature). Under the same conditions, the proteolytic enzyme had destroyed the activity? of the BNGF without GM1.

h) L'attivit? biologica del complesso BNGF-GM1 ? stata mantenuta dopo la sua conservazione a diverse temperature (ad esempio, 4?C, 37?C, 45?C). Nelle stesse condizioni di conservazione, per quanto riguarda tempo e concentrazione di proteine, il BNGF senza monosialoganglioside GM1, aveva completamente perso la sua attivit? biologica. h) The activity? biology of the BNGF-GM1 complex? been kept after its storage at different temperatures (e.g., 4? C, 37? C, 45? C). Under the same storage conditions, as regards time and protein concentration, the BNGF without monosialoganglioside GM1, had completely lost its activity. biological.

i) Il complesso BNGF-GM1, valutato per sedimentazione isopicnica, sedimenta ad una densit? di 1,298 g/cm3. i) The BNGF-GM1 complex, evaluated by isopycnic sedimentation, settles at a density? of 1.298 g / cm3.

FIGURA 1 FIGURE 1

Immunoblot con il complesso GM1-NGF (subunit? ?) dopo reazione con iminunoglobuline anti NGF murino (subunit? ?), purificate per affinit?. Immunoblot with the GM1-NGF complex (subunit?) After reaction with murine anti-NGF iminunoglobulins (subunit?), Purified by affinity.

Corsa A: complesso GM1-NGF prima della purificazione cromatografica. Run A: GM1-NGF complex before chromatographic purification.

Corsa B: complesso asialo GMl-BNGF. Race B: Asian GMl-BNGF complex.

Corsa C: NGF murino, subunit? ?, nella sua forma dimerica Run C: murine NGF, subunit? ?, in its dimeric form

L?incubazione sopra descritta tra il GM1 e il BNGF ? stata compiuta per 2 ore a temperatura ambiente. Nelle stesse condizioni ? avvenuta l'incubazione fra asialo GM1 ed NGF. The incubation described above between GM1 and BNGF? been carried out for 2 hours at room temperature. Under the same conditions? the incubation between Asialo GM1 and NGF took place.

L'attivit? biologica in vivo del complesso BNGF-GM1 ? stata valutata in modelli animali, nei quali l?attivit? biologica del BNGF ? stata soppressa con un composto chimico. In breve, sono stati impiegati topi Sprague-Dawley di entrambi i sessi appena nati. Tutte le iniezioni sistemiche sono state eseguite subcutaneamente con 0,01 ml/g di peso corporeo. Soluzioni di solfato di vinblastina (VNB) sono state preparate con soluzione fisiologica e una dose di 0,15 mg/kg ? stata somministrata a topi al terzo giorno di vita. I topi trattati con VNB sono stati suddivisi in tre gruppi: al gruppo 1 ? stata iniettata una soluzione salina, al gruppo 2 il BNGF (ad esempio, 0,1 mg/kg di BNGF), al gruppo 3 il complesso BNGF-GMl (ad esempio, 0,1 mg/kg di BNGF e 30 mg/kg di monosialoganglioside GM1). Gli animali sono stati soppressi al sesto giorno di vita. I cuori sono stati rapidamente asportati, congelati in ghiaccio secco e poi mantenuti a -80?C fino al momento dell'uso. E? stata quantificata la noradrenalina (NA) nel cuore. Come riportato in Fig. 2, la somministrazione di VNB causa una ingente perdita nel contenuto di NA nel cuore (gruppo 1), un effetto significativamente antagonizzato con la somministrazione sia del BNGF senza GM1 (gruppo 2) che del complesso BNGF-GM1. Inoltre, questi risultati indicano che il complesso BNGF-GM1 ? biologicamente efficace sul sistema simpatico in vivo e quando confrontato con il BNGF possiede una pi? alta attivit? biologica. The activity? in vivo biological analysis of the BNGF-GM1 complex? has been evaluated in animal models, in which the activity? biological of the BNGF? been suppressed with a chemical compound. Briefly, newborn Sprague-Dawley mice of both sexes were employed. All systemic injections were performed subcutaneously with 0.01 mL / g body weight. Vinblastine sulfate (VNB) solutions were prepared with saline and a dose of 0.15 mg / kg? was given to mice on the third day of life. VNB-treated mice were divided into three groups: to group 1? a saline solution was injected, group 2 the BNGF (for example, 0.1 mg / kg of BNGF), group 3 the BNGF-GMl complex (for example, 0.1 mg / kg of BNGF and 30 mg / kg of monosialoganglioside GM1). The animals were killed on the sixth day of life. The hearts were quickly excised, frozen in dry ice and then kept at -80 ° C until use. AND? norepinephrine (NA) in the heart was quantified. As reported in Fig. 2, the administration of VNB causes a large loss of NA content in the heart (group 1), a significantly antagonized effect with the administration of both BNGF without GM1 (group 2) and the BNGF-GM1 complex. Furthermore, these results indicate that the BNGF-GM1 complex? biologically effective on the sympathetic system in vivo and when compared with the BNGF it possesses a pi? high activity biological.

Figura 2 Figure 2

Effetti del complesso GM1-BNGF nel prevenire la riduzione di NA indotta da VNB nel cuore di topi al 6? giorno di vita. Effects of the GM1-BNGF complex in preventing VNB-induced NA reduction in the heart of 6 mice? day of life.

Si veda l?esempio 1 per il protocollo del trattamento, il metodo impiegato, la codificazione dei gruppi di animali. See example 1 for the treatment protocol, the method used, the coding of the groups of animals.

ESEMPIO 2 EXAMPLE 2

Il complesso NGF-ganglioside ? tra il monosialoganglioside GM1 e il NGF (subunit? B) umano ottenuto per tecnologia del DNA ricombinante, ottenuto in modo del tutto analogo a quello descritto nell'esempio n. 1. Le propriet? in vitro e in vivo di questo complesso sono le stesse riportate nell'esempio 1. The NGF-ganglioside complex? between the monosialoganglioside GM1 and the human NGF (subunit B) obtained by recombinant DNA technology, obtained in a completely similar way to that described in example n. 1. The properties in vitro and in vivo of this complex are the same as reported in example 1.

ESEMPIO 3 EXAMPLE 3

Si prepara il complesso tra il ganglioside GD1a e il BNGF, purificato per esempio da ghiandole submascellari nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell?esempio 1. The complex between the ganglioside GD1a and the BNGF is prepared, purified for example from submaxillary glands under the same experimental conditions reported in example 1.

Il GDla-BNGF mantiene l?attivit? biologica valutata sul DRG-E8. Questo complesso valutato per sedimentazione isopicnica sedimenta ad una densit? di 1,3496 g/cm<3>. The GDla-BNGF maintains the activity? biological evaluated on DRG-E8. This complex, evaluated by isopycnic sedimentation, settles at a density? of 1.3496 g / cm <3>.

ESEMPIO 4 EXAMPLE 4

Si prepara il complesso tra il ganglioside GDlb e il BNGF, purificato per esempio da ghiandole submascellari nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell?esempio 1. The complex between the ganglioside GDlb and the BNGF is prepared, purified for example from submaxillary glands under the same experimental conditions reported in example 1.

Il GDlb-BNGF mantiene l?attivit? biologica valutata sul DRG-E8. Questo complesso valutato per sedimentazione isopicnica sedimenta ad una densit? di 1,3596 g/cm<3>. The GDlb-BNGF maintains the activity? biological evaluated on DRG-E8. This complex, evaluated by isopycnic sedimentation, settles at a density? of 1.3596 g / cm <3>.

ESEMPIO 5 EXAMPLE 5

Il complesso tra il ganglioside GTlb e il BNGF, purificato per esempio da ghiandole submascellari, viene ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. The complex between the ganglioside GTlb and the BNGF, purified for example from submaxillary glands, is obtained under the same experimental conditions reported in example 1.

Il GTlb-BNGF mantiene l'attivit? biologica valutata sul DRG-E8. Questo complesso valutato per sedimentazione isopicnica sedimenta ad una densit? di 1,3700 g/cm<3>. The GTlb-BNGF maintains the activity? biological evaluated on DRG-E8. This complex, evaluated by isopycnic sedimentation, settles at a density? of 1.3700 g / cm <3>.

ESEMPIO 6 EXAMPLE 6

Si prepara il complesso fra l'estere interno del GM1 e la subunit? ? dell'NGF nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. Do you prepare the complex between the internal ester of GM1 and the subunit? ? of the NGF under the same experimental conditions reported in example 1.

ESEMPIO 7 EXAMPLE 7

Si prepara il complesso fra l'estere metilico del GM1 e la subunit? ? dell'NGF nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell?esempio 1. Do you prepare the complex between the methyl ester of GM1 and the subunit? ? of NGF under the same experimental conditions reported in example 1.

ESEMPIO 8 EXAMPLE 8

Si prepara il complesso fra l'estere etilico del GM1 e la subunit? B dell'NGF nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. The complex is prepared between the ethyl ester of GM1 and the subunit? B of the NGF under the same experimental conditions reported in example 1.

ESEMPIO 9 EXAMPLE 9

Si prepara il complesso fra l'estere isopropilico del GM1 e la subunit? B dell'NGF nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell?esempio 1. The complex between the isopropyl ester of GM1 and the subunit is prepared. B of the NGF under the same experimental conditions reported in example 1.

ESEMPIO 10 EXAMPLE 10

Si prepara il complesso fra l'estere terziarbutilico del GM1 e la subunit? B dell'NGF nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. Do you prepare the complex between the tertiarbutyl ester of GM1 and the subunit? B of the NGF under the same experimental conditions reported in example 1.

ESEMPIO 11 EXAMPLE 11

Si prepara il complesso fra l'estere benzilico del GM1 e la subunit? B dell'NGF nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. Do you prepare the complex between the benzyl ester of GM1 and the subunit? B of the NGF under the same experimental conditions reported in example 1.

ESEMPIO 12 EXAMPLE 12

Il complesso fra il derivato metilamide del GM1 e la subunit? B dell'NGF viene ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. The complex between the methylamide derivative of GM1 and the subunit? B of the NGF is obtained under the same experimental conditions reported in Example 1.

ESEMPIO 13 EXAMPLE 13

Il complesso fra il derivato etilamide del GM1 e la subunit? B dell?NGF viene ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. The complex between the ethylamide derivative of GM1 and the subunit? B of the NGF is obtained under the same experimental conditions reported in Example 1.

ESEMPIO 14 EXAMPLE 14

Il complesso fra il derivato benzilamide del GM1 e la subunit? ? dell?NGF viene ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. The complex between the benzylamide derivative of GM1 and the subunit? ? of NGF is obtained under the same experimental conditions reported in Example 1.

ESEMPIO 15 EXAMPLE 15

Il complesso fra il derivato isopropilamide del GM1 e la subunit? ? dell'NGF viene ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali riportate nell'esempio 1. The complex between the isopropylamide derivative of GM1 and the subunit? ? of NGF is obtained under the same experimental conditions reported in example 1.

Tutti i conplessi ottenuti fra i diversi derivati dei gangliosidi e la subunit? ? del fattore di crescita nervoso hanno dimostrato attivit? biologica valutata sulle colture DRG-E8. All the complexities obtained between the different derivatives of gangliosides and the subunit? ? of the nerve growth factor have shown activity? biological evaluated on DRG-E8 crops.

PREPARAZIONI FARMACEUTICHE PHARMACEUTICAL PREPARATIONS

La formulazione delle preparazioni farmaceutiche contenenti il complesso ganglioside-BNGF comprende metodi gi? conosciuti per la preparazione di composizioni accettabili dal punto di vista farmaceutico, somministrabili al paziente, le quali permettono che una quantit? effettiva del complesso sia combinata in una miscela con un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. Veicoli adatti e la loro formulazione comprendente altre proteine sono descritte, per esempio, nel libro "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Questi veicoli comprendono "formulazioni di deposito" iniettabili. The formulation of pharmaceutical preparations containing the ganglioside-BNGF complex includes methods already? known for the preparation of pharmaceutically acceptable compositions, administrable to the patient, which allow a quantity of complex is combined in a blend with a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and their formulation comprising other proteins are described, for example, in the book "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). These vehicles include injectable "depot formulations".

In base a quanto sopra, la formulazione farmaceutica comprende, sebbene non in maniera esclusiva, soluzioni del complesso GMl-BNGF o polvere liofilizzata del complesso GMl-BNGF in associazione a uno o pi? veicoli o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, e contenuti in mezzi tamponati a pH idoneo, ed isosmotici con i liquidi fisiologici. Le diverse formulazioni del complesso GMl-BNGF ? da considerarsi un esempio di preparazione farmaceutica utilizzabile anche per un complesso ganglioside derivitizzato-BNGF, formulazione che ? funzione dell'attivit? biologica e della via di somministrazione desiderata. La Tabella 1 mostra, per soli scopi illustrativi e senza porre limitazioni alla stessa, esempi delle formulazioni che possono essere preparate sotto forma di soluzioni per il trattamento delle disfunzioni del sistema nervoso. Nel caso di preparazioni liofilizzate, possono essere utilizzati eccipienti di sostegno come per esempio, ma non esclusivamente, mannitolo o glieina e saranno fornite idonee soluzioni tamponate del volume desiderato in modo da ottenere adeguate soluzioni tamponate isotoniche aventi il pH desiderato. Soluzioni simili possono essere usate per le preparazioni farmaceutiche del complesso GM1-BNGF in soluzioni isotoniche del volume desiderato e includono, ma non esclusivamente, l'uso di soluzioni tamponate fisiologiche con fosfato o citrato a concentrazioni idonee in modo da ottenere ogni volta preparazioni farmaceutiche isotoniche del pH desiderato, per esempio, pH neutro. On the basis of the above, the pharmaceutical formulation comprises, although not exclusively, solutions of the GM1-BNGF complex or lyophilized powder of the GM1-BNGF complex in association with one or more? pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and contained in buffered media at a suitable pH, and isosmotic with physiological liquids. The different formulations of the GM1-BNGF complex? to be considered an example of a pharmaceutical preparation that can also be used for a derivitized ganglioside-BNGF complex, a formulation which? function of the activity? biological and the desired route of administration. Table 1 shows, for illustrative purposes only and without limiting it, examples of the formulations that can be prepared in the form of solutions for the treatment of nervous system dysfunctions. In the case of lyophilized preparations, supporting excipients such as, but not exclusively, mannitol or gliein can be used and suitable buffered solutions of the desired volume will be provided in order to obtain adequate isotonic buffered solutions having the desired pH. Similar solutions can be used for pharmaceutical preparations of the GM1-BNGF complex in isotonic solutions of the desired volume and include, but are not limited to, the use of physiological buffered solutions with phosphate or citrate at suitable concentrations in order to obtain isotonic pharmaceutical preparations every time. of the desired pH, for example, neutral pH.

Sempre per scopi illustrativi, le Tabelle 2 e 3 mostrano esempi di possibili preparazioni farmaceutiche per il trattamento di disfunzioni del sistema nervoso. Le preparazioni farmaceutiche esposte nella Tabella 3, sistema n? 4 e sistema n? 5, sono preparazioni composte da due fiale per ogni singola dose. La prima fiala contiene la sostanza attiva avente una composizione in peso di circa 0,01% al 50% di sostanza attiva insieme ad un eccipiente accettabile dal punto di vista farmacologico, come per esempio la glieina o il mannitolo. La seconda fiala contiene un solvente preparato con il volume desiderato di soluzione tamponata fisiologica con fosfato o citrato. Il contenuto delle due fiale viene mescolato al momento dell'uso e la sostanza attiva liofilizzata si scioglie rapidamente fino all'ottenimento di una soluzione iniettabile. La Tabella 3 mostra anche un possibile esempio di preparazione farmaceutica per iniezione subcutanea (sistema n? 5). Again for illustrative purposes, Tables 2 and 3 show examples of possible pharmaceutical preparations for the treatment of dysfunctions of the nervous system. The pharmaceutical preparations shown in Table 3, system n? 4 and system n? 5, are preparations consisting of two ampoules for each single dose. The first vial contains the active substance having a composition by weight of about 0.01% to 50% active substance together with a pharmacologically acceptable excipient, such as glyein or mannitol. The second vial contains a solvent prepared with the desired volume of phosphate or citrate buffered saline. The contents of the two vials are mixed at the moment of use and the lyophilized active substance dissolves rapidly until an injectable solution is obtained. Table 3 also shows a possible example of a pharmaceutical preparation for subcutaneous injection (system # 5).

La formulazione farmaceutica comprende inoltre, ma senza essere limitata ad esse, supposte per la somministrazione rettale con eccipienti lipofilici, ad esempio, idrosolubili, autoemulsivi, come glicogelatina o simili. In queste preparazioni, il complesso GMl-BNGF pu? essere presente in quantit? varianti fra lo 0,001% e 1'1% in peso dell'intero eccipiente. Le supposte possono anche contenere, senza essere limitate ad esse, quantit? idonee di acetilsalicilato . The pharmaceutical formulation further comprises, but is not limited to, suppositories for rectal administration with lipophilic excipients, for example, water-soluble, auto-emulsifying, such as glycogelatine or the like. In these preparations, the GMl-BNGF complex can? be present in quantity? varying between 0.001% and 1% by weight of the entire excipient. Suppositories can also contain, without being limited to them, quantities? suitable for acetylsalicylate.

La Tabella 4 elenca, per soli scopi illustrativi, eventuali preparazioni in forma di supposte per il trattamento di disfunzioni del sistema nervoso. Il dosaggio delle preparazioni farmaceutiche del complesso GMl-SNGF ed i tempi di somministrazione dipendono dall'effetto desiderato (determinato nei trials clinici) e dalla via di somministrazione, per esempio, il dosaggio ed il tempo di somministrazione possono essere simili (ma non esclusivamente) a quelli normalmente usati in studi con altri agenti neuronotrofici. Table 4 lists, for illustrative purposes only, any preparations in the form of suppositories for the treatment of dysfunctions of the nervous system. The dosage of the pharmaceutical preparations of the GM1-SNGF complex and the timing of administration depend on the desired effect (determined in clinical trials) and on the route of administration, for example, the dosage and time of administration may be similar (but not exclusively). to those normally used in studies with other neuronotrophic agents.

TABELLA 1 TABLE 1

Esempi di composizioni farmaceutiche per soluzioni iniettabili . Examples of pharmaceutical compositions for injectable solutions.

PREPARAZIONE n? 1 - un'ampolla da 2 ml contiene: PREPARATION n? 1 - a 2 ml ampoule contains:

PREPARAZIONE n? 2 - un'ampolla da 2 ml contiene: PREPARATION n? 2 - a 2 ml ampoule contains:

L'unit? biologica ? definita nel lavoro di Fenton, E.L., Expl. Celi Res. 59:383, 1970. The unit organic? defined in the work of Fenton, E.L., Expl. Cell Res. 59: 383, 1970.

TABELLA 2 TABLE 2

Esempi di sistemi di composizioni farmaceutiche. Examples of systems of pharmaceutical compositions.

SISTEMA n? 1 SYSTEM n? 1

a) una fiala da 2 ml contiene: a) a 2 ml vial contains:

b) una fiala di solvente da 2 mi contiene: b) a 2 ml vial of solvent contains:

SISTEMA n? 2 SYSTEM n? 2

a) un' ampolla da 2 ml contiene: a) a 2 ml ampoule contains:

b) una fiala di solvente da 2 ml contiene: b) a 2 ml vial of solvent contains:

SISTEMA n? 3 SYSTEM n? 3

a) un*ampolla da 3 ml contiene: a) one * 3 ml ampoule contains:

b) una fiala di solvente da 3 ml contiene; b) a 3 ml vial of solvent contains;

TABELLA 3 TABLE 3

SISTEMA n? 4 SYSTEM n? 4

a) una fiala da 3 ml contiene: a) a 3 ml vial contains:

b) una fiala di solvente da 3 ml contiene: b) a 3 ml vial of solvent contains:

SISTEMA n? 5 (Esempio per l'iniezione sottocutanea) a) un'ampolla da 2 ml contiene: SYSTEM n? 5 (Example for subcutaneous injection) a) a 2 ml ampoule contains:

b) una fiala di solvente da 2 ml contiene: b) a 2 ml vial of solvent contains:

TABELLA 4 TABLE 4

Esempi di composizioni farmaceutiche sotto forma di supposte per via rettale. Examples of pharmaceutical compositions in the form of rectal suppositories.

PREPARAZIONE n? 1 PREPARATION n? 1

PREPARAZIONE n? 2 PREPARATION n? 2

PREPARAZIONE n? 3 PREPARATION n? 3

PREPARAZIONE n? 4 PREPARATION n? 4

Essendo l'invenzione cos? descritta, ? chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'invenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell'ambito delle seguenti rivendicazioni. Since the invention is so? described,? It is clear that these methods can be modified in various ways. These modifications are not to be considered as divergences from the spirit and perspectives of the invention and all those modifications which would appear evident to an expert in the field are included in the scope of the following claims.

Claims

CLAIMS There? which claims: 1) A complex between the subunit? B of the neuronotrophic factor NGF and a natural ganglioside or a semisynthetic analogue of a ganglioside or a salt thereof, obtainable by putting the two components dissolved in contact in an aqueous medium, at room temperature or low in a slightly alkaline environment.

2) A complex according to claim 1, wherein the weight ratio between the neuronotrophic factor and the ganglioside varies from 1: 100,000 to 1:10.

3) A complex according to claim 2, in which the weight ratio between neuronotrophic factor and ganglioside? approximately 1: 1000.

4) A complex according to one of claims 1-3, in which the ganglioside component? consisting of a natural ganglioside chosen from the group formed by the gangliosides GM1, GDla, GDlb and GTlb.

5) A complex according to one of claims 1-3, in which the ganglioside component? consisting of a functional derivative of a ganglioside.

6) A complex according to revision 5, in which the functional derivative? an ester or amide of the sialic carboxyl groups.

7) A complex according to claim 5, in which the functional derivative? an internal ester of a ganglioside.

8) A complex according to claim 5, in which the functional derivative? a peracylated derivative to the hydroxyl groups of the ganglioside.

9) A complex according to one of claims 1-3, in which the ganglioside component? consisting of a lysoganglioside.

10) A complex according to one of claims 1-3, in which the ganglioside component? consisting of a de-N-acetyl-ganglioside or -lysoganglioside.

11) A complex according to one of claims 1-3, in which the ganglioside component? consisting of derivatives of gangliosides in which the sphingosine acyl group? replaced by an acyl group deriving from an acid other than those present in natural gangliosides and chosen from the aliphatic, aromatic, alicyclic or heterocyclic series and which can? also be replaced by functional groups.

12) A complex according to one of claims 1-3 and 11, in which the ganglioside component? consisting of derivatives of gangliosides in which the acyl group deriving from an acid other than those present in natural gangliosides and chosen from the aliphatic, aromatic, alicyclic or heterocyclic series and which can? also be replaced by functional groups.

13) A complex according to one of claims I-3, in which the ganglioside component? consisting of derivatives of gangliosides in which both or only one of the sphingosine and neuraminic amide groups are acylated by an acid other than those present in natural gangliosides and chosen from the aliphatic, aromatic, alicyclic or heterocyclic series and which can be replaced by functional groups.

14) A complex according to one of claims II-13, in which the functional groups substituting the acyl groups are polar groups.

15) A complex according to one of claims 5-14, wherein the basic ganglioside of said semisynthetic derivatives or ganglioside analogues? chosen from the group formed by the gangliosides GM1, GD1a, GD1b and GT1b.

16) A complex according to claim 1 in which the ganglioside component? an aliphatic ester with up to 8 carbon atoms of GM1 ganglioside.

17) A complex according to claim 1, whose ganglioside component? an amide derived from an aliphatic amine with a maximum of 8 carbon atoms, of the ganglioside GM1.

18) A complex according to claim 1 in which the ganglioside component? peracetylate, a perpropionylate, a perbutyrate, a pervaleryanylate, a persuccinylate or a permalonylate, of GM1 ganglioside.

19) A complex according to one of the claims 1-18, in which the subunit? ? nerve growth factor? was obtained by recombinant DNA technologies.

20) A complex according to one of the claims 1-18, in which the subunit? ? nerve growth factor? was obtained by purification from human placental tissues.

21) A complex according to one of the claims 1-18, in which the subunit? ? nerve growth factor? was obtained from bovine seminal fluid.

22) A compound according to one of claims 1-21 consisting of the NGF-GM1 complex.

23) A compound according to one of claims 1-21 consisting of the NGF-GDla complex.

24) A compound according to one of claims 1-21 consisting of the NGF-GDlb complex.

25) A compound according to one of claims 1-21 consisting of the NGF-GTlb complex.

26) A compound according to one of claims 1-21 consisting of the NGF-internal ester complex of GM1.

27) A compound according to one of claims 1-21 consisting of any one of the complexes described in the illustrative examples.

28) A process for the preparation of a complex claimed in claim 1, in which the subunit? ? of the neuronotrophic factor? NGF and the ganglioside component in an aqueous medium, with or without other organic solvents, at room temperature or low in a slightly alkaline environment.

29) A process according to claim 28, in which lower aliphatic alcohols or lower ketones or lower dialkylamides or diethyl sulfoxide are used as organic solvents.

30) A process according to one of claims 28-29, in which one operates in the presence of organic or inorganic bases.

31) A process according to claim 30, in which ammonia or a lower aliphatic amine or an alkaline or alkaline earth hydrate or the corresponding carbonates or acetates are used 32) A complex between subunits? ? of the neuronotrophic factor NGF and a natural ganglioside or a semisynthetic analogue of a ganglioside according to one of claims 1-27 with a view to their therapeutic use. 33) A pharmaceutical preparation containing as an active ingredient a complex between the subunit? ? of the neuronotrophic factor NGF and a natural ganglioside or a semisynthetic analogue of a ganglioside. 34) A pharmaceutical preparation according to claim 33 containing any of the complexes described in one of claims 1-21. 35) A pharmaceutical preparation according to one of claims 33 and 34 containing a pharmaceutically acceptable carrier. 36) The therapeutic use of a complex between the subunits? ? of the neuronotrophic factor NGF and a ganglioside according to one of claims 1-37. 37) The therapeutic use of a complex between the subunit? ? of the neuronotrophic factor NGF and a ganglioside according to claim 36 for the treatment of neuropathological conditions comprising administering a quantity to the patient. effective of the aforementioned complex. The use of a complex between the subunit? ? of the neuronotrophic growth factor NGF and a ganglioside according to one of claims 36-37 where the neuropathological condition? aging of the nervous system. 39) The use of a complex between the subunit? ? of the neuronotrophic factor NGF and a ganglioside according to one of claims 36 and 37 where the neuropathological condition? a chronic neurodegenerative disease or a chronic immunological disease affecting the nervous system. 40) The use of a complex between the subunit? ? of the neuronotrophic growth factor NGF and a ganglioside according to one of claims 1-27 for the preparation of a pharmaceutical product for the treatment of neuropathological conditions. 41) The use of a complex between the subunit? ? of the neuronotrophic factor NGF and a ganglioside according to claim 40 for the treatment of neuropathological conditions caused by the aging of the nervous system / or of chronic neurodegenerative diseases or of chronic immunological diseases that attack the nervous system.